DE19512531C1 - Kulturgefäß für Zellkulturen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Kulturgefäß für Zellkulturen mit einem die Zellkultur aufnehmenden Produktionsmodul, mit einem ein Nährmedium aufnehmenden Versorgungsmodul, mit einer zwischen dem Produktionsmodul und dem Versorgungsmodul angeordneten Dialysemembran und mit einer das Produktionsmodul teilweise begrenzenden, gasdurchlässigen Gasaustauschmembran.

Ein derartiges Kulturgefäß ist aus der deutschen Patentanmeldung DE-A1 42 29 325 bekannt. Das dort beschriebene Kulturgefäß weist ein Produktionsmodul auf, dessen Seitenwände von einem Kreisring aus stabilem Kunststoff gebildet sind und dessen eine, nach außen weisende Stirnseite von einer Silikonmembran begrenzt ist und dessen andere Stirnseite von einer plana­ ren Dialysemembran überspannt wird. Das Produktionsmodul ist mechanisch mit einem Versor­ gungsmodul verbunden, wobei die Innenräume beider Module durch die Dialysemembran von­ einander getrennt sind. Das Produktionsmodul dient zur Aufnahme der zu kultivierenden Zell­ kultur, das Versorgungsmodul zur Aufnahme von Nährstoffen für die Zellkultur. Durch die Dialy­ semembran hindurch werden Nährstoffe von dem Versorgungsmodul in das Produktionsmodul transportiert und umgekehrt, Stoffwechselprodukte von dem Produktionsmodul in das Versor­ gungsmodul abtransportiert. Hierzu ist die Porosität der Dialysemembran so eingestellt, daß weder die Zellen, noch die von der Zellkultur produzierten Zellprodukte das Produktionsmodul verlassen können. Die in dem Produktionsmodul enthaltene Zellkultur wird über die gasdurch­ lässige Gasaustauschmembran mit Sauerstoff versorgt; gleichzeitig werden gasförmige Stoff­ wechselprodukte über die Gasaustauschmembran abgeführt. Hierdurch reichern sich im Pro­ duktionsmodul die Zellen an, so daß mit dem bekannten Kulturgefäß Zell-Konzentrationen von beispielsweise 10⁷ Zellen pro ml, und in Folge davon auch hohe Zellprodukt-Dichten, erreichbar sind.

Das bekannte Zellkulturgefäß ist zwar für die Erzeugung hoher Zelldichten und Zellproduktdich­ ten gut geeignet. Für die Ermittlung geeigneter Zellkulturen oder für die Optimierung der Wachstumsbedingungen für eine bestimmte Zellkultur sind jedoch häufig lange Versuchsreihen erforderlich. Die Durchführung derartiger Versuchsreihen ist bei Verwendung des bekannten Kulturgefäßes relativ zeit- und kostenaufwendig.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und preiswertes Kulturgefäß be­ reitzustellen, das für Versuchszwecke optimiert ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Dadurch, daß das Produktionsmodul mehrere, räumlich voneinander getrennte Zellkulturkam­ mern umfaßt, ist es möglich, eine der Anzahl der Zellkulturkammern entsprechende Anzahl von Zellkulturproben gleichzeitig zu kultivieren. Die räumliche Trennung der Zellkulturkammern von­ einander verhindert eine Durchmischung der Zellkulturproben. Die Begrenzung der Zellkultur­ kammern durch die Dialysemembran einerseits und durch die Gasaustauschmembran anderer­ seits gewährleistet sowohl eine optimale Versorgung der jeweiligen Zellkulturen mit Nährstoffen und mit Sauerstoff als auch die Abführung gasförmiger und nicht gasförmiger Zellmetabolite. Dabei können die Wachstumsbedingungen für alle Zellkulturproben gleich oder vergleichbar eingestellt werden. Dies wird dadurch erreicht, indem nur ein Versorgungsmodul, das heißt nur ein Nährmedium, für die Versorgung aller Zellkulturproben vorgesehen ist. Gleichermaßen kann die Gasaustauschmembran für alle Zellkulturkammern gleich ausgebildet sein.

Die Innenvolumina der einzelnen Zellkulturkammern können im Vergleich zum bekannten Pro­ duktionsmodul für Versuchszwecke relativ klein ausgebildet sein. Da für die Versorgung aller Zellkulturproben auch nur ein Versorgungsmedium erforderlich ist, spart die "Mehrfach-Kultivie­ rung" mehrerer Zellkulturproben in einem Versuch somit Zeit und Kultur-Medium. Es fallen dar­ überhinaus auch weniger Kosten für das Kulturgefäß an, da nur ein einziges Produktionsmodul, das üblicherweise nach einmaliger Verwendung weggeworfen würde oder aufwendig zu reini­ gen wäre, für die "Mehrfach-Kultivierung" benötigt wird.

Die Dialysemembran ist aus mehreren, voneinander getrenn­ ten Einzelmembranen ausgebildet, und zwischen jeder Zellkulturkammer und dem Versor­ gungsmodul ist eine Einzelmembran angeordnet. Die räumliche Trennung der Zellkulturkammern voneinander wird dadurch sichergestellt. Da jede Zellkulturkammer zum Versorgungsmodul hin durch eine Einzelmembran abgeschlossen ist, besteht nicht die Gefahr einer Inkubation durch benachbarte Zellkulturen oder Zellkulturprodukte, wie diese bei einer allen Zellkulturkammern gemeinsamen Dialysemembran auftreten könnte.

Darüber hinaus erlauben es die voneinander getrennten Einzelmembranen, diese mit unterschiedlichen Eigenschaften, insbesondere unterschiedlichen Porositäten auszubilden. Dadurch können in einem Versuch der Einfluß der unterschiedlichen Dialysemembran-Eigenschaften auf das Zellwachstum in den verschiedenen Zellkulturkammern ausgetestet werden.

Ein Kulturgefäß, bei dem mindestens drei Zellkulturkammern vorgesehen sind, ist für Testzwec­ ke besonders gut geeignet. Bewährt haben sich in dieser Hinsicht Kulturgefäße mit drei bis zehn Zellkulturkammern.

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, das Kulturgefäß um eine Rotationsachse rotierbar auszubil­ den und die Zellkulturkammern im gleichen Abstand von der Rotationsachse zueinander orts­ fest anzuordnen. Bei dieser Ausführungsform des Kulturgefäßes ist gewährleistet, daß die Ver­ sorgungsbedingungen für alle Zellkulturkammern bzw. die darin enthaltenen Zellkulturen gleich sind.

Die Zellkulturkammern weisen Sei­ tenwände auf, die, mit Ausnahme der Dialysemembran und der Gasaustauschmembran, in einem allen Zellkulturkammern gemeinsamen Formteil ausgebildet sind. Vorteilhafterweise ist das Formteil einstückig ausgebildet. Es ist leicht in das Produktionsmodul einsetzbar oder kann auch zusammen mit diesem aus einem Stück gefertigt sein. Ein derartiges Formteil kann bei­ spielsweise vorteilhaft durch Spritzguß gefertigt werden und ist besonders leicht und preisgün­ stig herstellbar. Es hat sich als günstig erwiesen, das Formteil aus einem formstabilen Kunst­ stoff auszubilden. In dem Fall bieten die stabilen Seitenwände genügend Halt, um daran die Dialyse- und die Gasaustauschmembran zu befestigen.

Alternativ dazu hat es sich auch als günstig erwiesen, die Seitenwände der Zellkulturkammern und die Gasaustauschmembran einstückig auszubilden. Bei dieser Ausführungsform wird die mechanische Stabilität der Seitenwände durch eine ausreichend große Wandstärke gewährlei­ stet, während im übrigen für den Gasaustausch im Bereich der Gasaustauschmembran eine re­ lativ dünne Wandstärke vorgesehen ist. Ein derartiges Bauteil kann vorteilhaft durch Spritzguß aus einem Stück gefertigt werden und ist besonders leicht und preisgünstig herstellbar.

Vorzugsweise ist jede Zellkulturkammer mit einer verschließbaren Öffnung versehen. Die Öff­ nung ermöglicht die Entnahme von Zellkulturen und Zellprodukten oder das Beimpfen der Zell­ kultur und gewährleistet danach wieder ein dichtes Verschließen.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in der Zeichnung dargestellt und werden nachfolgend näher erläutert: In der Zeichnung zeigen im einzelnen:

Fig. 1 in schematischer Darstellung ein auf einem Ständer angeordnetes, erfindungs­ gemäßes Kulturgefäß für Zellkulturen in einer Seitenansicht,

Fig. 2 eine Draufsicht auf ein Produktionsmodul mit drei Zellkulturkammern,

Fig. 3 einen Schnitt durch das in Fig. 2 dargestellte Produktionsmodul entlang der Linie A-A,

Fig. 4 eine Draufsicht auf eine weitere Ausführungsform des Produktionsmoduls bei einem erfindungsgemäßen Kulturgefäß mit fünf Zellkulturkammern und

Fig. 5 einen Schnitt entlang der Linie B-B des in Fig. 4 gezeigten Produktionsmoduls, teilweise als auseinandergezogener Schnitt von Einzelteilen.

In Fig. 1 ist die Bezugsziffer 1 einem erfindungsgemäßen Kulturgefäß insgesamt zugeordnet. Das im wesentlichen zylinderförmige Kulturgefäß 1 ist um seine Zylinderachse rotierbar. Es ist modulartig aus einem Produktionsmodul 2 und aus einem Versorgungsmodul 3 aufgebaut. Das Produktionsmodul 2 ist in Form eines ca. 1 cm hohen Kreisringes 4 aus einem stabilen Kunst­ stoff gebildet, dessen nach außen weisende Stirnseite von einer Silikonmembran 5 überspannt ist. Zur Halterung des Produktionsmoduls 2 an dem Versorgungsmodul 3 ist der Kreisring 4 mit langen Schnapphaken 6 versehen, die über einem umlaufenden Ringwulst 7 des oberen Ran­ des des Versorgungsmoduls 3 einrasten. Dabei gewährleistet ein (nicht dargestellter) Dichtring eine gas- und flüssigkeitsdichte Verbindung von Produktionsmodul 2 und Versorgungsmodul 3.

Außerdem ist der Kreisring 4 mit um seinen Umfang gleichmäßig verteilten kurzen Haken 27 versehen, die nach innen gerichtete Zähne 28 (siehe Fig. 3) aufweisen. Im Produktionsmodul 2 sind insgesamt drei räumlich voneinander getrennte Zellkulturkammern angeordnet, die nach­ folgend anhand der Fig. 2 und 3 näher erläutert werden. Das Befüllen der Zellkulturkam­ mern mit einer Zellsuspension geschieht jeweils durch einen der drei Luer-Lock-Anschlüsse, die mittels Kappen 8 verschließbar sind. Der untere Rand des Versorgungsmoduls 3 ist mit einer über die Zylinderfläche vorstehenden, umlaufenden Abrollkante 9 versehen. Gleichermaßen wirkt der Kreisring 4 des Produktionsmoduls 2, der mit einem glatten umlaufenden und eben­ falls über der Zylinderfläche des Versorgungsmoduls 3 vorstehenden Rand ausgebildet ist. Beim Rollen um seine Zylinderachse liegt das Kulturgefäß 1 nur auf der Abrollkante 9 und dem Kreisring 4 auf; die Zylinderfläche des Versorgungsmoduls 3 wird dabei nicht beansprucht. Zum Befüllen des Versorgungsmoduls 3 ist dieses mit einer durch eine Schraubkappe 10 verschließ­ baren Einfüllöffnung versehen.

Das Versorgungsmodul 3 ist mit einem schlauchartigen Druckfinger 11 aus Silikon ausgestattet. Dieser ragt ausgehend von der dem Produktionsmodul 2 abgewandten Stirnseite des Versor­ gungsmoduls 3 annähernd parallel zu dessen Längsachse in das Innere des Versorgungsmo­ duls 3 hinein. Dabei verläuft die Längsachse des Druckfingers 11 nicht in der Zylinderachse des Kulturgefäßes 1, sondern daneben. Der Druckfinger 11 dient zum Druckausgleich innerhalb des Kulturgefäßes 1 und er trägt zur Durchmischung des Nährmediums im Versorgungsmodul 3 bei. Das Kulturgefäß ist auf einem Ständer 12 abgelegt.

Bei der in Fig. 2 dargestellten Draufsicht auf ein Produktionsmodul 13 sind innerhalb des Kreisringes 4 insgesamt drei, im Querschnitt kreisförmige Zellkulturkammern 14 zu erkennen. Das Volumen jeder Zellkulturkammer 14 beträgt ca. 5 ml. Die Seitenwände 18 der hülsenförmi­ gen Zellkulturkammern 14 sowie der Kreisring 4 bestehen aus einem formstabilen Polycarbo­ nat. Die Zellkulturkammern 4 sind über Stege 16 mit dem Kreisring 4 und über einen sternför­ migen Mittelsteg 17 untereinander verbunden. Sie bilden somit ein einstückiges, formstabiles Bauteil. In den Stegen 15 und in dem Mittelsteg 17 sind Öffnungen 18 zu den Zellkulturkam­ mern 14 vorgesehen, die mit Anschlußstutzen 24 (Fig. 3) für Luer-Lock-Anschlüsse versehen sind. In Fig. 2 sind die Kappen 8 zum Verschließen der Luer-Lock-Anschlußstutzen 24 zu se­ hen. Zur Belüftung weist jede Zellkulturkammer 14 jeweils zwei Luer-Lock-Anschlußstutzen 24 auf. Die nach außen weisende Stirnseite des Produktionsmoduls 13 wird, wie auch aus Fig. 3 ersichtlich, von einem Silikonformteil verschlossen, dem insgesamt die Bezugsziffer 19 zugeordnet ist. Das Silikonformteil 19 ist in den Kreisring 4 eingelegt. Es weist Bereiche unter­ schiedlicher Dicke auf. Der verdickte Außenrand des Silikonformteils 19 ist in Fig. 2 mit der Bezugsziffer 20, die im Bereich der Zellkulturkammern 14 als Gasaustauschmembran sehr dünn (ca. 0,5 mm) ausgebildeten Bereiche mit der Bezugsziffer 21 und die dazwischenliegen­ den Verbindungsbereiche, mit einer mittleren Wandstärke um 1 mm, mit der Bezugsziffer 22 bezeichnet. Die Zellkulturkammern 14 sind innerhalb des Produktionsmoduls 13 auf einem ge­ meinsamen Kreisring um die Rotationsachse 23 angeordnet.

Aus Fig. 3 geht die Anordnung und Halterung des Silikonformteils 19 innerhalb des Kreisrin­ ges 4 des Produktionsmoduls 13 hervor. Danach weist der verdickte Außenrand 20 des Silikon­ formteils 19 einen außen umlaufenden Kragen 25 auf, der auf einem Absatz 26 des Kreisringes 4 aufliegt. Über dem Kragen 25 des Silikonformteils 19 ist ein kreisförmiges Stützgitter 29 mit gleichem Außendurchmesser angeordnet. Zur exakten Positionierung des Stützgitters 29 auf dem Silikonformteil 19 ist letzteres mit einer umlaufenden Nut 30 und das Stützgitter 29 mit ei­ ner dazu passenden umlaufenden Feder 31 versehen. Die nach innen gerichtete Zähne 28 der um den Umfang des Kreisringes 4 gleichmäßig verteilten kurzen Haken 27 greifen über den Au­ ßenrand des Stützgitters 29 und pressen dieses sowie den Kragen 25 des darunter angeordne­ ten Silikonformteils 19 unter Bildung einer reib- und formschlüssigen Verbindung fest gegen den Absatz 26 des Kreisringes 4.

Im Bereich der Anschlußstutzen 24 ist das Silikonformteil 19 durchbrochen, um das Befüllen der Zellkulturkammern 14 zu ermöglichen. Auf ihrer der Gasaustauschmembran 21 abgewand­ ten Stirnseite sind die Zellkulturkammern 14 mittels einer kreisförmigen Dialysemembran 32 (zur Verdeutlichung in Fig. 3 übertrieben dick dargestellt) verschlossen. Dabei ist jeder Zellkul­ turkammer 14 eine eigene Dialysemembran 32 zugeordnet. Zur Befestigung der Dialysemem­ branen 32 sind becherförmige Haltekappen 33 vorgesehen, die über die Seitenwände 15 der Zellkulturkammern 14 gestülpt werden und dabei die jeweilige Dialysemembran 32 zwischen ih­ rem Außenmantel 34 und den Seitenwänden 15 flüssigkeitsdicht einklemmen. Der Boden der becherförmigen Haltekappen 33 weist eine zentrale Öffnung 35 auf, durch die die Dialysemem­ bran 32 vom Versorgungsmodul 3 aus zugänglich ist. Die Befestigung der Dialysemembran 32 mittels der Haltekappen 33 ist aus dem auseinandergezogenen Schnitt von Fig. 5 im Detail er­ sichtlich. Außer über den Reibschluß mit den Seitenwänden 15 der Zellkulturkammern 14 wer­ den die Haltekappen 33 zusätzlich mittels des Stützgitters 29 auf den Zellkulturkammern 14 gehalten.

Soweit nachfolgend in den Fig. 4 und 5 verwendete Bezugsziffern nicht näher erläutert sind, bezeichnen diese gleiche oder ähnliche Bauteile oder Bestandteile des Kulturgefäßes, wie sie anhand der Fig. 1 bis 3 vorstehend bespielhaft beschrieben sind.

Bei der Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kulturgefäßes gemäß den Fig. 4 und 5 sind insgesamt fünf, im Querschnitt kreisförmige Zellkulturkammern 14 innerhalb des Produkti­ onsmoduls 36 vorgesehen. Jede Zellkulturkammer 14 weist eine hülsenförmig ausgebildete Seitenwand 15 auf. Das Volumen jeder Zellkulturkammer 14 beträgt ca. 3 ml. Die Seitenwände 15 der Zellkulturkammern 14 bestehen ebenso wie der Kreisring 4 aus einem formstabilen Po­ lycarbonat. Die Zellkulturkammern 14 sind über die Stege 16 miteinander und mit dem Kreisring 4 verbunden. Der Kreisring 4, die Seitenwände 15 der Zellkulturkammern 14 und die Stege 16 sind aus einem Teil gefertigt.

Die nach außen weisende Stirnseite des Produktionsmoduls 36 und damit die entsprechenden Stirnseiten der darin angeordneten Zellkulturkammern 14 werden, wie aus Fig. 5 ersichtlich, von einem Silikonformteil 19 verschlossen. Der Außenrand 20 des Silikonformteils 19 ist ver­ dickt ausgebildet. Es ist außen mit einem umlaufenden Kragen 25 versehen, der auf einem Ab­ satz 26 des Kreisringes 4 aufliegt. Das Silikonformteil 19 wird um die Seitenwände 15 der Zell­ kulturkammern 14 herum geführt. Dabei umschließt es die der Dialysemembran 32 zugewande­ te Oberkante 37 jeder Seitenwand 15 und wird auf der Innenseite der Seitenwand 15 zur gege­ genüberliegenden Unterkante 38 der Seitenwand 15 geführt. Infolgedessen sind die Seitenwän­ de 14 der Zellkulturkammern 14 innen mit dem Silikonformteil 19 ausgekleidet. In dem Bereich dieser "Auskleidung" hat das Silikonformteil 19 eine Wandstärke von etwa 1 mm und ist da­ durch formstabil. In dem Bereich der Unterkante 3 überspannt das Silikonformteil 19 die Zellkul­ turkammern und ist dort zwecks eines guten Gasaustausches mit einer Dicke von nur ca. 0,1 mm ausgebildet. Dieser Bereich des Silikonformteils wirkt somit als Gasaustauschmembran, der in Fig. 5 die Bezugsziffer 21 zugeordnet ist. Auf der Gasaustauschmembran 21 sind Sep­ ten (nicht dargestellt) zur Entnahme aus und zum Befüllen der Zellkulturkammern 14 vorgesehen.

Die Halterung des Silikonformteils 19 am Kreisring 4 ist entsprechend der in Fig. 3 erläuterten Ausführungsform des Kulturgefäßes ausgeführt.

Auf ihrer der Silikonfolie 16 abgewandten Stirnseite ist jede Zellkulturkammer 14 mittels einer Dialysemembran 32 verschlossen. Dabei ist jeder Zellkulturkammer 14 eine eigene Dialysemembran 32 zugeordnet. Die Dialysemembranen 32 unterscheiden sich untereinander in ihrer Porosität. Diese Ausführungsform ist somit zum Austesten der Auswirkungen verschie­ dener Dialysemembraneigenschaften besonders geeignet. Aufgrund der gegenüber den Aus­ führungsformen gemäß der Fig. 1 bis 3 fehlenden Luer-Lock-Anschlüsse ist sie besonders günstig herstellbar.

Die Halterung der Dialysemembranen 32 erfolgt mittels Haltekappen 33, wie dies bei der Aus­ führungsform des Kulturgefäßes anhand Fig. 3 erläutert ist. Anstelle des in der dortigen Aus­ führungsform vorgesehenen Stützgitters 29 ist hier ein Stützring 39 vorgesehen.

Claims (6)

1. Kulturgefäß für Zellkulturen mit einem die Zellkultur aufnehmenden Produktionsmodul (2), und mit einem ein Nährmedium aufnehmenden Versorgungsmodul (3), mit einer zwischen dem Produktionsmodul (2) und dem Versorgungsmodul (3) angeordneten Dialysemem­ bran (32), und mit einer das Produktionsmodul (2) teilweise begrenzenden gasdurchläs­ sigen Gasaustauschmembran (21), wobei das Produktionsmodul (2) mehrere räumlich voneinander getrennte, sich zwischen Dialysemembran (32) einerseits und Gasaus­ tauschmembran (21) andererseits erstreckende Zellkulturkammern (14) umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß die Dialysemembran (21) aus mehreren, voneinander getrennten Einzelmembranen besteht, wobei zwischen jeder Zellkulturkammer (14) und dem Versor­ gungsmodul (3) eine Einzelmembran angeordnet ist, und daß die Zellkulturkammern (14) Seitenwände (15) aufweisen, die, mit Ausnahme der Dialysemembran (32) und der Gas­ austauschmembran (21), in einem allen Zellkulturkammern (14) gemeinsamen Formteil (4; 6; 16; 17; 26; 27; 28,) ausgebildet sind.

2. Kulturgefäß nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Einzelmembranen unter­ schiedliche Porositäten aufweisen.

3. Kulturgefäß nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß minde­ stens drei Zellkulturkammern (14) vorgesehen sind.

4. Kulturgefäß nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es um eine Rotationsachse rotierbar ausgebildet ist und daß die Zellkulturkammern zueinander orts­ fest im gleichen Abstand von der Rotationsachse angeordnet sind.

5. Kulturgefäß nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Seiten­ wände (15) der Zellkulturkammern (14) und die Gasaustauschmembran (21) einstückig ausgebildet sind.

6. Kulturgefäß nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß jede Zell­ kulturkammer (14) mit einer verschließbaren Öffnung (18) versehen ist.