DE1944000A1

DE1944000A1 - Iso-adenosine -3'-$'-monophosphoric acid - and its salts

Info

Publication number: DE1944000A1
Application number: DE19691944000
Authority: DE
Inventors: Georges Cehovic; Issac Marcus; Theodore Posternak; Sathiavathy Vengadabady
Original assignee: Agence National de Valorisation de la Recherche ANVAR
Current assignee: Bpifrance Financement SA
Priority date: 1969-08-29
Filing date: 1969-08-29
Publication date: 1971-03-18

Abstract

Iso-adenosine-3'-5'-monophosphoric acid and its salts are prepared by converting the (non-cyclic) iso-AMP into the p-nitrophenylester with p-nitrophenol in presence of di-cyclohexylcarbon-diimide and subsequent treatment with potassium t-butoxide. This "cyclic iso-AMP" is superior to "cyclic AMP" as second intracellular hormone carrier.

Description

Iso-adenosin -3'-5-mono-phosphorsäure und ihre Salze Die Erfindung betrifft die Iso-adenosin-3'-5'-mono-phosphorsäure (abgekürzt "zyklisches Isowelches der Formel entspricht, und ihre Salze.Iso-adenosine -3'-5-mono-phosphoric acid and its salts The invention relates to iso-adenosine-3'-5'-mono-phosphoric acid (abbreviated to "cyclical isowelches of the formula corresponds, and their salts.

Wie die Adenosin-3'-5'-mono-phosporsäure (zyklisches AMP), von der bekannt ist, daßsie die Wirkung eines zweiten intrazellularen Trägers für eine große Anzahl von Hormonen besitzt, bewirkt das zyklische Iso-AMP die Dispersion der Melanophoren in der Haut des Frosches in vitro und die Ausdehnung der Nelanophoren in der Haut der Eidechse in vitro und erhöht die Freisetzungvon Thyreotrophormon (TSH) durch die Hypophyse der Ratte in vitro. Bei allen diesen Tests zeigte es sich jedoch unerwarteterweise, daß das zyklische Iso-AMP wesentlich besser als das Besisnukleotid (zuklisches AMP) wirkte. Like the adenosine 3'-5'-monophosphoric acid (cyclic AMP), from the is known to have the effect of a second intracellular carrier for a large Number of hormones, the cyclic Iso-AMP causes the dispersion of the melanophores in the skin of the frog in vitro and the expansion of the nelanophores in the skin the lizard in vitro and increases the release of thyroid hormone (TSH) through the pituitary gland of the rat in vitro. However, all of these tests unexpectedly showed that the cyclic iso-AMP is much better than the besisnucleotide (additional AMP) worked.

Die therapeutische Wirkungen des zykliscken AMP sind in dem BSM 2.883M, sowie in dem BSM 3249M beschrieben. The therapeutic effects of cyclical AMP are described in BSM 2.883M, as well as in the BSM 3249M.

Erfindungsgemäß kann das zyklische Iso-AMP durch Umformen des (nicht zyklischen) Iso-AMP durch Einwirkung vonp-Nitrophenol in Anwesenheit von di-Cyclohexylkarbo-di -imid in p-Nitrophenolester und anschließendes Behandeln dieses Esters mit Kalium-tertiobutoxyd hergestellt werden. According to the invention, the cyclic Iso-AMP can be formed by reshaping the (not cyclic) Iso-AMP by the action of p-nitrophenol in the presence of di-cyclohexylcarbo-di -imide in p-nitrophenol ester and subsequent treatment of this ester with potassium tert-butoxide getting produced.

Im folgenden wird ein Beispiel der Herstellung von zyklischem Iso-AMP beschrieben. The following is an example of the manufacture of cyclic Iso-AMP described.

Herstellung von Iso-adenosin-3'-5'-phosphorsäure (zyklisches Iso-AMP) und ihren Salzen.Production of iso-adenosine-3'-5'-phosphoric acid (cyclic iso-AMP) and their salts.

Die Iso-adenosin-5' -phosphorsäure (Iso-AMP) wurde nach den Angaben von Leonard und Laursen (Biochemistry, 4 354 (1965)) hergestellt. The iso-adenosine-5'-phosphoric acid (Iso-AMP) was made according to the information by Leonard and Laursen (Biochemistry, 4,354 (1965)).

150 mg Iso-AMP in Form von sorgfältig getrockneter freier Säure wurden in einer Mischung von 2 ml Pyridin und 2 ml Dimethylformamid gelöst. Dies wurde mit 0,104 ml Tri-n-butylamin, 557 mg p-Nitrophenol und 824 mg Dicyclohexyl-carbodiimid versetzt. Es wurde 48Stunden lang unter Dunkelheit gerührt. Das Nukleotid ging nunmehr in Lösung uber. Mittels Chromatographie auf Papier (0,5 M Ammonium-äthanol-acetat; Vol.-Verhältnis 5:2) wurden 3 Substanzen festgestellt: Der p-Nitrophenylester des Iso-AMP, das entsprechende symmetrische Pyrophosphat und p Nitrophenol im Überschuß. Die Lösung wurde zur Throckne (lasec) abgedampft und der Rückstand wurde in 10 ml Wasser aufgenommen. 150 mg of Iso-AMP in the form of carefully dried free acid were used dissolved in a mixture of 2 ml of pyridine and 2 ml of dimethylformamide. That was with 0.104 ml of tri-n-butylamine, 557 mg of p-nitrophenol and 824 mg of dicyclohexyl-carbodiimide offset. It was stirred in the dark for 48 hours. The nucleotide went now in solution about. Using chromatography on paper (0.5 M ammonium ethanol acetate; Volume ratio 5: 2) 3 substances were found: The p-nitrophenyl ester des Iso-AMP, the corresponding symmetrical pyrophosphate and p-nitrophenol in excess. The solution was evaporated to dryness (lasec) and the residue was dissolved in 10 ml Water absorbed.

Nach dem Filtern wurden das p-Nitro-phenol und das Dicyclc-hexyl-carbodiimid im Überschuß durch 5malige Extraktion mit je 10 ml Äther entfernt. Die wässrige Lösung wurde auf eine Säule (40 cm Länge und 2,8 cm Durchmesser) mit DEAE-Zellulose in Form von Bicarbonat gegossen. Die Säule wurde mit 500 ml doppelt destilliertem Wasser gewaschen und anschließend wurde durch Konzentrationsgefälle mithilfe von Wasser eluiert, das stufenweise mit Träthylammoniumbicarbonat 0,1 M (7,5 pH) versetzt wurde (insgesamt wurden 3 1 Gemisch verwendet). Man erhielt Fraktionen von 20 ml. Wie die Chromatographie auf Papier zeigte, war der p-Nitrophenylester des Iso-AMP in den Fraktionen Nr. 45 bis 80 enthalten. Diese Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne abgedampft und mehrere Male zur Beseitigung des Triäthylamins zusammen mit Methanol abgedampft. Ausbeute 76 bis 80 % nach der Dosierung des gesamten Phosphors; max 256 m/u; max 19600.After filtering, the p-nitro-phenol and the dicyclic-hexyl-carbodiimide removed in excess by extraction 5 times with 10 ml of ether each time. The watery Solution was applied to a column (40 cm length and 2.8 cm diameter) with DEAE cellulose poured in the form of bicarbonate. The column was double distilled with 500 ml Water was washed and then it was reduced by concentration gradient using Eluted water, which is gradually mixed with träthylammonium bicarbonate 0.1 M (7.5 pH) (a total of 3 liters of mixture were used). Fractions of 20 ml were obtained. As chromatography on paper showed was the p-nitrophenyl ester of the Iso-AMP contained in fractions no. 45 to 80. These fractions were combined and evaporated to dryness and combined several times to remove the triethylamine evaporated with methanol. Yield 76 to 80% after metering in all of the phosphorus; max 256 m / u; max 19600.

Die Lösung wurde zur Trockne abgedampft. Der Rückstand, der das Triäthylammoniumsalz des Esters darstellte, wurde auf P205 unter starkem Vakuum getrocknet. Man erhielt 186 mg. Man löste in 20 ml wasserfreiem Dimethylsulfoxyd und versetzte mit 2 ml einer Lösung 1 M von Kalium-t-butoxyd in wasserfreiem t-Butylalkohol, wodurch sich zyklisches Iso-AMP unter Frelsetzung von p-Nitrophenat bildete. The solution was evaporated to dryness. The residue, which is the triethylammonium salt of the ester was dried on P205 under strong vacuum. One received 186 mg. It was dissolved in 20 ml of anhydrous dimethyl sulfoxide and mixed with 2 ml a solution 1 M of potassium t-butoxide in anhydrous t-butyl alcohol, whereby cyclic iso-AMP formed with the release of p-nitrophenate.

Nach 3 Stunden bei normaler Temperatur wurde das 10-fache der theoretischen Menge von im Vakuum bei 650 getrocknetem DOWEX 50 (Form NH4 ) hinzugegebenO Nach Rühren und Filtern wurde das Harz mit 0,2 M Ammoniak bis zur vollständigen Eluierung des zyklischen Nukleotids gewaschen. Der Ammoniak wurde unter Vakuum abgedampft und es wurde, wie oben angegeben, auf einer DEAE-Zellulose-Säule fraktioniert. Die Rohre Nr. 70 bis 100 enthielten das zyklische Nukleotid. Ihr Inhalt wurde unter Vakuum zur Trockne abgedampft. Es wurde mit 0,5 ml Methanol aufgenommen und mit 2,5 ml einer Natriumperchloratlösung to,5 M (in Aceton) versetzt; die vollständige Ausfällung erhieltbian durch Zugabe von 5 ml wasserfreiem Aceton. Das Natriumsalz wurde zentrifugiert und mit wasserfreiem Aceton gewaschen. Ausbeute (aufgrund der Mengenbestimmung des Phosphors und der UV-absorption) 56%; #max 278 mµ; # max 14800 (in wässriger Lösung bei 7,0 pH).After 3 hours at normal temperature it became 10 times the theoretical Amount of DOWEX 50 (form NH4), dried in vacuo at 650, was added Stir and filter the resin with 0.2 M ammonia until elution was complete of the cyclic nucleotide washed. The ammonia was evaporated under vacuum and it was fractionated on a DEAE cellulose column as indicated above. the Tubes # 70 to 100 contained the cyclic nucleotide. Your content was under Vacuum evaporated to dryness. It was taken up with 0.5 ml of methanol and with 2.5 ml of a sodium perchlorate solution to, 5 M (in acetone) are added; the full Precipitation was obtained by adding 5 ml of anhydrous acetone. The sodium salt was centrifuged and washed with anhydrous acetone. Yield (due to the Determination of the amount of phosphorus and the UV absorption) 56%; #Max 278 mµ; # max 14800 (in aqueous solution at 7.0 pH).

Das Produkt wurde anschließend durch Ausfällen in konzentrierter wässriger LIsung mittels Silbernitrat in geringem Überschuß gereinigt. Der Niederschlag wurde mit 50%-igem Äthanol gewaschen. Die Elementaränalyse dieses Silbersalzes ergab korrekte Ergebnisse. Durch Zersetzung in wässriger Suspension mittels Schwefelwasserstoff erhielt man eine Lösung von zyklischem Iso-AMP in Form von freier Säure. The product was then concentrated by precipitation Purified aqueous solution using silver nitrate in a slight excess. The precipitation was washed with 50% ethanol. Elemental analysis of this silver salt revealed correct results. By decomposition in aqueous suspension using hydrogen sulfide a solution of cyclic iso-AMP was obtained in the form of free acid.

Diese war amorph. Durch Neutralisierung mittels anorganischer oder organischer Base erhielt man die entsprechenden Salze.This was amorphous. By neutralization using inorganic or organic base, the corresponding salts were obtained.

Claims

Claim

Iso-adenosine-3'-5'-mono-phosphoric acid according to the formula: and their salts.