DE1648817C3 - Process and diagnostic means for the determination of hydroperoxides or peroxidatically active substances - Google Patents
Process and diagnostic means for the determination of hydroperoxides or peroxidatically active substancesInfo
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Description
R3 R 3
R4 I R,R 4 IR,
(D(D
2020th
Chromogen Substanzen der allgemeinen Forin welcher bedeutet R1 eine Hydroxy- oder Aminogruppe, welche gegebenenfalls einen ein- oder mehrfach durch Hydroxy-, Amino- und Alkoxygruppen substituierten aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen oder aromatischen Rest tragen, R2, R3 und R5 Wasserstoff oder eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe und R4 Wasserstoff oder den Rest R1. oder Gemische solcher Substanzen verwendet.Chromogenic substances of the general formula in which R 1 denotes a hydroxy or amino group, which optionally carry an aliphatic, araliphatic, cycloaliphatic, heterocyclic or aromatic radical which is mono- or polysubstituted by hydroxy, amino and alkoxy groups, R 2 , R 3 and R 5 is hydrogen or an amino, hydroxy or alkoxy group and R 4 is hydrogen or the radical R 1 . or mixtures of such substances are used.
2. Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, bestehend aus Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz und einem Chromogen. dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel 1 gemäß Anspruch 1 enthalten sind.2. Diagnostic means for the determination of hydroperoxides or substances that are released of hydroperoxide react, consisting of peroxidase or a peroxidatically active Substance and a chromogen. characterized in that substances are used as chromogen of the general formula 1 according to claim 1 are included.
3. Diagnostisches Mittel zur Bestimmung von Hämoglobin oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen, bestehend aus Hydroperoxid oder Hydroperoxid bildenden Substanzen und einem Chromogen. dadurch gekennzeichnet, daß als Chromogen Substanzen der allgemeinen Formel 1 gemäß Anspruch 1 enthalten sind.3. Diagnostic agent for the determination of hemoglobin or other peroxidatically active Substances consisting of hydroperoxide or hydroperoxide-forming substances and a chromogen. characterized in that substances of the general formula are used as chromogen 1 according to claim 1 are included.
Es sind eine Reihe von Verbindungen bekannt, die von Wasserstoffperoxid und Peroxidase als Katalysator zu einem Farbstoff oxidiert werden. Substanzen, die bevorzugt verwendet werden sind z. B. Benzidin, o-Dianisidin, o-Tolidin, Guajakol usw. Diese Verbindungen sind aber teilweise nicht sehr stabil und können nach den neuesten Erkenntnissen gesundheitsschädlich sein, so daß ihre Handhabung nicht ungefährlich erscheint.A number of compounds are known that use hydrogen peroxide and peroxidase as a catalyst oxidized to a dye. Substances that are preferably used are e.g. B. benzidine, o-dianisidine, o-tolidine, guaiacol, etc. However, some of these compounds are not very stable and can be harmful according to the latest findings, so that their handling is not seems harmless.
Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, Substanzen zu finden, die als Chromogene für ein Verfahren der obengenannten Art geeignet und zugleich stabil und unschädlich sind.The invention is therefore based on the object to find substances that are used as chromogens for a Process of the above type are suitable and at the same time stable and harmless.
Es wurde nun überraschenderweise eine Substanzgruppe gefunden, die zum Teil bessere Indikator-Eigenschaften als die bisher verwendeten Benzidinkörper zeigt. Die Substanzklasse ist geeignet, Wasserstoffperoxid und andere Hydroperoxide sowohl in optischen Tests, als auch mit Hilfe von Reagenzpapieren und Reagenzfilmen zu bestimmen.Surprisingly, a group of substances has now been found, some of which have better indicator properties than the previously used benzidine bodies shows. The substance class is suitable, hydrogen peroxide and other hydroperoxides both in optical tests and with the aid of reagent papers and to determine reagent films.
Die Substanzen sind physiologisch sehr gut verträglich und besitzen die folgende allgemeine Formel IThe substances are physiologically very well tolerated and have the following general formula I
R4.R 4 .
R5 R 5
R.,R.,
R1 R 1
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroperoxiden bzw. von Substanzen, die unter Freisetzung von Hydroperoxid reagieren, sowie von Peroxidase bzw. peroxidatisch wirkenden Substanzen mit Hilfe eines Chromogens unter Verwendung der Reaktion der Hydroperoxide mit Peroxidase bzw. den peroxidatisch wirksamen Substanzen durch Auswertung der Verfärbung. Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein diagnostisches Mittel zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.The invention relates to a method for determining hydroperoxides or substances which react to release hydroperoxide, as well as peroxidase or peroxidatically acting substances with the help of a chromogen using the reaction of the hydroperoxides with peroxidase or the peroxidatically active substances by evaluating the discoloration. the The invention also relates to a diagnostic means for carrying out such a method.
Von besonderem diagnostischem Interesse ist der Nachweis von Glucose im Harn, Blut und Serum bei Diabetes sowie der Nachweis peroxidatisch wirkender Substanzen, wie Hämoglobin im Harn und Blut und der Nachweis von Hydroperoxiden z. B. in der Milchwirtschaft, Kosmetik und Polymerchemie.The detection of glucose in urine, blood and serum is of particular diagnostic interest in diabetes as well as the detection of substances with a peroxidic effect, such as hemoglobin in the urine and Blood and the detection of hydroperoxides e.g. B. in the dairy industry, cosmetics and polymer chemistry.
in welcher bedeutet R1 eine Hydroxy- oder Aminogruppe. welche gegebenenfalls einen ein- oder mehrfach durch Hydroxy-, Amino- und Alkoxygruppen substituierten aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen, heterocyclischen oder aromatischen Rest tragen, R2, R3 und R5 Wasserstoff oder eine Amino-, Hydroxy- oder Alkoxygruppe und R4 Wasserstoff, oder den Rest R1.in which R 1 denotes a hydroxy or amino group. which optionally carry an aliphatic, araliphatic, cycloaliphatic, heterocyclic or aromatic radical which is mono- or polysubstituted by hydroxy, amino and alkoxy groups, R 2 , R 3 and R 5 are hydrogen or an amino, hydroxy or alkoxy group and R 4 is hydrogen , or the radical R 1 .
ELs ist bekannt, daß Substanzen gemäß 1 im alkalischen vorzugsweise im ammoniak-alkalischen Medium Haare farben können, wenn größere Mengen Wasserstoffperoxid (3 bis 10%) anwesend sind; vgl. DT-AS 1141 748, DT-AS 11 42 045, DT-AS 11 49 496, Fette-Seifen-Anstrichmittel 67, (1965), S. 222 bis 227. Es war jedoch nicht vorherzusehen, daß diese Verbindungsklasse im neutralen bis schwach sauren pH-Bereich sehr geringe Mengen Wasserstoffperoxid (bis etwa 0,0005% I und peroxidatisch wirkende Substanzen durch starke Farbreaktionen, welche je nach Anwendungsart außerdem noch verschieden nuanciert sind, anzeigen würde. Die Empfindlichkeit der Substanzen 1 gegenüber Wasserstoffperoxid bzw. Systemen, die Wasserstoffperoxid freisetzen, steigt jedenfalls um mehr als 3 Zehnerpotenzen, wenn Peroxidase anwesend ist. Gleichzeitig verkürzt sich die beim Haarfärben übliche Reaktionszeit von etwa 10 bis 30 Minuten (zum Teil auch bei erhöhter Temperatur bis 60' C) bei der erfindungsgemäßen Verwendung auf I Minute und weniger (jeweils bei Zimmertemperatur). ELs are known that substances according to 1 in the alkaline Preferably in an ammonia-alkaline medium, hair can be colored if larger quantities Hydrogen peroxide (3 to 10%) is present; see DT-AS 1141 748, DT-AS 11 42 045, DT-AS 11 49 496, Fette-Seifen-Anstrichmittel 67, (1965), pp. 222 to 227. However, it was not foreseeable that this class of compounds In the neutral to weakly acidic pH range, very small amounts of hydrogen peroxide (up to about 0.0005% I and peroxidic substances through strong color reactions, which depending on Application type are also still differently nuanced. The sensitivity of the Substances 1 compared to hydrogen peroxide or systems that release hydrogen peroxide increase in any case by more than 3 powers of ten when peroxidase is present. At the same time the with is shortened Hair coloring usual reaction time of about 10 to 30 minutes (sometimes even at elevated temperature up to 60 ° C) when used according to the invention to 1 minute and less (in each case at room temperature).
Die Aufgabe der Erfindung wird somit dadurch gelöst, daß man in einem Verfahren der eingangs genannten Art als Chromogene Substanzen der obenangegcbcncn, allgemeinen Formel 1 oder Gemische solcher Substanzen verwendet.The object of the invention is thus achieved in that in a method of the initially named type as chromogenic substances of the abovementioned, general formula 1 or mixtures of such substances are used.
Die Bestimmung von Hydroperoxiden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist vorzugsweise für gekoppelte und ungekoppelte Enzymreaktionen ge-The determination of hydroperoxides by the method according to the invention is preferably for coupled and uncoupled enzyme reactions
eignet, beispielsweise für die Bestimmung von Glucose, Galactose, Aminosäuren, Harnsäure, Peroxiden, Hämoglobin, Peroxidase oder anderen peroxidatisch wirksamen Substanzen sowie von Enzymaktivitäten. Bei der Bestimmung von Glucose beispielsweise wird diese von Glucoseoxidase zu Gluconsäure oxidiert, wobei der Luftsauerstoff zu Wasserstoffperoxid reduziert wird. Das Wasserstoffperoxid oxidiert dann mittels Peroxidase oder einer peroxidatisch wirksamen Substanz den erfindungsgemäß verwendeten Indikator zum entsprechenden Farbstoff.suitable, for example, for the determination of glucose, galactose, amino acids, uric acid, peroxides, hemoglobin, Peroxidase or other peroxidatically active substances as well as enzyme activities. When determining glucose, for example, it is oxidized to gluconic acid by glucose oxidase, whereby the oxygen in the air is reduced to hydrogen peroxide. The hydrogen peroxide then oxidizes by means of peroxidase or a peroxidatically active substance those used according to the invention Indicator for the corresponding dye.
Weitere Beispiele für analytisch brauchbare Enzymsysteme, die unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagieren, sind L-Aminosäureoxidase + L-Aminosäuie, Uricase + Harnsäure, Xanthinoxidasc + Hypoxanthin bzw. Xanthin, Glycinoxidase + Glycin, Monoaminooxidase + Monoamin (wie Adrenalin, Mescalin usw.), Diamin-oxidase + Diamine (wie Histamin), Luciferase + Luciferin, D-Asparaginsäureoxidase + D-Asparaginsäure, Leber-Aldehydoxidase + Aldehyd, Galactoseoxidase + Galactose, Edsons Flavinenzym + Milchsäure.Further examples of analytically useful enzyme systems, which react to release hydrogen peroxide are L-amino acid oxidase + L-amino acid, uricase + uric acid, xanthine oxide as + Hypoxanthine or xanthine, glycine oxidase + glycine, monoamine oxidase + monoamine (such as Adrenaline, mescaline, etc.), diamine oxidase + diamine (such as histamine), luciferase + luciferin, D-aspartic acid oxidase + D-aspartic acid, liver aldehyde oxidase + Aldehyde, galactose oxidase + galactose, Edson's flavin enzyme + lactic acid.
Die Auswertung der Verfärbung erfolgt in bekannter Weise, z. B. durch optische Ausmessung im Spektrophotometer oder bei Verwendung von Testpapierstreifen und Testfilmen durch Vergleich der Farbstärke mit Blindproben bekannter Zusammensetzung bzw. Farbtafeln.The discoloration is evaluated in a known manner, e.g. B. by optical measurement in the spectrophotometer or when using test paper strips and test films by comparing the color strength with blank samples of known composition or color tables.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die diagnostischen Mittel werden an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.The method according to the invention and the diagnostic Means are explained in more detail using the following examples.
Beispiel 1
Nachweis von Hydroperoxiden in Flüssigkeitenexample 1
Detection of hydroperoxides in liquids
3535
50 mg Peroxidase werden in 100 ml eines 0,1m Citrat- oder Phosphatpuffers von pH 5,6 gelöst und damit ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll) imprägniert. Danach werden 300 mg 2-Phenylamino-5-amino-pyridin-hydrochlorid in 100 ml Methanol gelöst und das Filterpapier nochmals imprägniert. Beim Eintauchen in Lösungen von Wasserstoffperoxid verschiedener Konzentrationen werden die Papiere entsprechend der Konzentration verschieden stark weinrot bis dunkel-blaurot gefärbt. Mit Wasserstoffperoxidlösungen von 5 -/'ml erhält man noch eine deutliche Farbreaktion.50 mg peroxidase are in 100 ml of a 0.1m Dissolved citrate or phosphate buffer of pH 5.6 and with it a filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) impregnated. Then 300 mg of 2-phenylamino-5-aminopyridine hydrochloride are added dissolved in 100 ml of methanol and the filter paper impregnated again. When immersed in solutions of hydrogen peroxide of different concentrations, the papers become different according to the concentration strong wine-red to dark blue-red in color. With hydrogen peroxide solutions of 5 - / 'ml obtained there is still a clear color reaction.
Beispiel 2
Nachweis von Glucose im HarnExample 2
Detection of glucose in urine
100 mg Glucoseoxidase und 50 mg Peroxidase und 300 mg 2-Dimethylamino-5-amino-pyridin-dihydrochlorid werden in 100 ml eines 0,1-m Citrat- oder Phosphatpuffers von pH 5,6 gelöst. Mit dieser Lösung imprägniert man ein Filterpapier (2316 der Firma Schleicher & Schüll). Beim Eintauchen in glucosehaltigem Harn zeigt das Papier je nach Glucosekonzentration verschieden starke blauviolette Töne. Schon bei 50 oig % Glucose ist eine deutliche Farbreaktion zu sehen.100 mg glucose oxidase and 50 mg peroxidase and 300 mg 2-dimethylamino-5-aminopyridine dihydrochloride are dissolved in 100 ml of a 0.1 M citrate or phosphate buffer of pH 5.6. With this solution a filter paper (2316 from Schleicher & Schüll) is impregnated. When immersed in glucose In urine, the paper shows different blue-violet tones depending on the glucose concentration. Nice at 50% glucose there is a clear color reaction to see.
Nachweis von Glucose im BlutDetection of glucose in the blood
90 g wäßrige Polyvinylpropionat-Dispersion, 1,30 g Natriumsalz einer Polymannuronsäure, 70 ml eines 0,5-m Citrat- oder Phosphatpuffers, 2 g organisches Natriumsulfonat, 32Ü mg Glucoseoxidase, 300 mg Peroxidase und 600 mg 2-Cyclohexylamino-5-amino-pyridin in 20 ml Methanol, werden zu einer homogenen Mischung verrührt, in einer Schichtdicke von 300 μ auf eine Folie aufgetragen und getrocknet. Bringt man auf den so hergestellten Film einen Tropfen Blut und entfernt diesen wieder nach etwa einer Minute, so färbt sich der Film je nach Glucosekonzentration rötlich bis braunrötlich.90 g aqueous polyvinyl propionate dispersion, 1.30 g Sodium salt of a polymannuronic acid, 70 ml of a 0.5 M citrate or phosphate buffer, 2 g of organic Sodium sulfonate, 32 mg glucose oxidase, 300 mg peroxidase and 600 mg 2-cyclohexylamino-5-aminopyridine in 20 ml of methanol, are stirred to a homogeneous mixture, in a layer thickness of 300 μ applied to a foil and dried. A drop of blood is placed on the film produced in this way and removes this again after about a minute, the film changes color depending on the glucose concentration reddish to brownish reddish.
Nachweis von Glucose in Serum mit einem
IndikatorgemischDetection of glucose in serum with a
Indicator mixture
90 g Polyvinylpropionat-Dispersion, 1,30 g Natriumsalz einer Polymannuronsäure, 70 ml eines 0,5-m Citrat- oder Phosphatpuffers, 2 g organische Natriumsulfonate, 320 mg Glucoseoxidase, 300 mg Peroxidase und Lösungen von 300 mg 2,3-Diamino-pyridin-hydrochlorid und 300 mg 2,6-Diamino-pyridin-hydrochlorid in jeweils 12 ml Wasser, werden zu einer homogenen Mischung verrührt, in einer Schichtdicke von 3(X) μ auf eine Folie aufgetragen und getrocknet. Bringt man auf einen so hergestellten Film einen Tropfe;i Serum und entfernt diesen wieder nach etwa einer Minute, so färbt sich der Film je nach Glucosekonzentration verschieden stark grün.90 g of polyvinyl propionate dispersion, 1.30 g of the sodium salt of a polymannuronic acid, 70 ml of a 0.5-m Citrate or phosphate buffer, 2 g organic sodium sulfonates, 320 mg glucose oxidase, 300 mg peroxidase and solutions of 300 mg of 2,3-diamino-pyridine hydrochloride and 300 mg of 2,6-diamino-pyridine hydrochloride in each 12 ml of water, are stirred to a homogeneous mixture, in a layer thickness of 3 (X) μ applied to a film and dried. If you bring one to a film made in this way Drop; i serum and remove it after about a minute, the film changes color depending on the glucose concentration different degrees of green.
Beispiel 5
Nachweis von Glucose in FlüssigkeitenExample 5
Detection of glucose in liquids
In der folgenden Tabelle sind die Farbreaktionen und Farbnuancen zusammengestellt, die eine Reihe weiterer Substanzen 1 mit Glucose (50 mg % und mehr) liefert, wobei die Testpapiere gemäß Beispiel 2 und die Filme gemäß Beispiel 3 hergestellt werden. Für die Tüpfelreaktionen wurden Lösungen analog Beispiel 2 verwendet. Bei Substanzen, die nicht wasserlöslich sind, wurden Lösungen in entsprechenden Lösungsmitteln oder Suspensionen eingesetzt.The following table summarizes the color reactions and color nuances that make up a number of supplies further substances 1 with glucose (50 mg% and more), the test papers according to Example 2 and the films according to Example 3 are produced. Solutions analogous to the example were used for the spot reactions 2 used. In the case of substances that are not soluble in water, solutions in appropriate solvents were used or suspensions are used.
Substanz ISubstance I.
2,3-Diamino-pyridin
2,6-Diamino-pyridin2,3-diamino-pyridine
2,6-diamino-pyridine
2,5-Diamino-pyridin-dihydrochlorid2,5-diamino-pyridine dihydrochloride
2,6-Dihydroxy-pyridin-hydrochlorid
2-PhenyIamino-5-amino-pyridin-hydrochlorid2,6-dihydroxypyridine hydrochloride
2-Phenylamino-5-aminopyridine hydrochloride
Fortsetzungcontinuation
Substanz ISubstance I.
2-(/i-Hydroxyäthylamino)-5-amino-pyridin-dihydro-2 - (/ i-Hydroxyäthylamino) -5-aminopyridine-dihydro-
chloridchloride
2-Bis-(/i-hydroxyäthylamino)-5-amino-pyridin-hydro-2-bis (/ i-hydroxyäthylamino) -5-aminopyridine-hydro-
chloridchloride
2-Cyclohexylamino-5-amino-pyridin2-cyclohexylamino-5-aminopyridine
2-(y-Dimethylamino-propyl-amino)-5-amino-pyridin2- (γ-Dimethylamino-propyl-amino) -5-aminopyridine
^-Dimethylamino-S-amino-pyridin-dihydrochlorid^ -Dimethylamino-S-aminopyridine dihydrochloride
5,5'-Diamino-bis-pyridyl-2-amin5,5'-diamino-bis-pyridyl-2-amine
2-()'-Methoxypropylamino)-5-amino-pyridin2 - () '- Methoxypropylamino) -5-aminopyridine
braun
blauviolett
rot
rötlichlight brown
Brown
blue-violet
Red
reddish
orange
blau
rot
rotbraunbrownish red
orange
blue
Red
red-brown
orange
blaugrau
rot
rotbraunorange
orange
blue-gray
Red
red-brown
Photometrischer Nachweis von GlucosePhotometric detection of glucose
16 mg Glucoseoxidase, 9 mg Peroxidase werden in 10 ml Phosphatpuffer von pH 6,0 gelöst. Je 1 ml dieser Lösung, 1 ml einer 0,0005-m wäßrigen Lösung von 2,5-Diamino-pyridin-dihydrochlorid, 1 ml der zu untersuchenden Glucoselösung mit physiologisch interessierenden Glucosekonzentrationen werden zusammenpipettiert und mit Phosphatpuffer (pH 6,0) auf 10 ml aufgefüllt. Die Extinktion dieser LOsung im Vergleich zu einer Blindprobe wird bei 435 nm gemessen und der Glucosegehalt an Hand einer vorher aufgestellten Eichkurve errechnet.16 mg glucose oxidase, 9 mg peroxidase are dissolved in 10 ml phosphate buffer of pH 6.0. 1 ml each of this Solution, 1 ml of a 0.0005-M aqueous solution of 2,5-diamino-pyridine-dihydrochloride, 1 ml of the to be examined Glucose solutions with physiologically interesting glucose concentrations are pipetted together and made up to 10 ml with phosphate buffer (pH 6.0). The absorbance of this solution in Comparison to a blank sample is measured at 435 nm and the glucose content on the basis of a previously calculated calibration curve.
Beispiel 7
Nachweis von Blut im UrinExample 7
Detection of blood in the urine
20 Ein Filterpapier (2312 der Firma Schleicher & Schüll) wird mit einer 0,1-m wäßrigen Lösung eines Phosphatpuffers (pH 7,0) imprägniert und getrocknet. Danach wird das Papier mit einer 0,5%igen methanolischen Lösung von 2-Phenylamino-5-aminopyridinhydrochlorid imprägniert und getrocknet. Bringt man auf ein so hergestelltes Testpapier einen Tropfen eines bluthaltigen Harns und einen Tropfen 3%iger Wasserstoffperoxidlösung, so verfärbt sich das Testpapier noch bei einer Konzentration 1:100000 von Weiß nach Rotviolett. 20 A filter paper (2312 of the firm Schleicher & Schull) is impregnated (pH 7.0) with a 0.1-M aqueous solution of a phosphate buffer and dried. The paper is then impregnated with a 0.5% strength methanolic solution of 2-phenylamino-5-aminopyridine hydrochloride and dried. If a drop of blood-containing urine and a drop of 3% hydrogen peroxide solution are placed on a test paper produced in this way, the test paper changes color from white to red-violet at a concentration of 1: 100,000.
Claims (1)
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DEB0093558 | 1967-07-20 | ||
| DEB0093558 | 1967-07-20 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE1648817A1 DE1648817A1 (en) | 1971-06-16 |
| DE1648817B2 DE1648817B2 (en) | 1976-01-02 |
| DE1648817C3 true DE1648817C3 (en) | 1976-08-05 |
Family
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