DE2462952C2

DE2462952C2 -

Info

Publication number: DE2462952C2
Application number: DE19742462952
Authority: DE
Inventors: Werner Dr.Rer.Nat. Guethlein; Walter Dr.Rer.Nat. Rittersdorf; Hugo Dr.Rer.Nat. 6800 Mannheim De Tiedemann; Peter Dr.Rer.Nat. 6940 Weinheim De Vogel; Wolfgang Dr.Rer.Nat. 6800 Mannheim De Werner
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1974-12-21
Filing date: 1974-12-21
Publication date: 1987-10-01

Description

Die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit Oxidationsindikatoren unter Katalyse durch Peroxidase oder peroxidatisch wirksame Stoffe zu farbigen Verbindungen spielt in der analytischen Chemie eine besondere Rolle, weil sie außer dem Nachweis von Wasserstoffperoxid und Peroxidasen auch die Bestimmung einer Reihe von Stoffen gestattet, die mit Sauerstoff und einer Oxidase unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren. Im folgenden seien als Beispiele einige dieser Stoffe und in Klammern die entsprechenden Oxidasen aufgezählt: Glucose (Glucoseoxidase), Galactose (Galactoseoxidase), L-Aminosäure (L-Aminosäureoxidase), Cholesterin (Cholesterinoxidase) und Harnsäure (Uricase). Es sind dies vor allem Stoffe, deren Nachweis und Bestimmung in der medizinischen Diagnostik und in der Lebensmittelchemie von großer Bedeutung sind.The reaction of hydrogen peroxide with oxidation indicators with catalysis by peroxidase or peroxidatively effective Substances to colored compounds play in the analytical Chemistry plays a special role because in addition to the detection of Hydrogen peroxide and peroxidases also determine one Range of substances allowed with oxygen and one Oxidase react to form hydrogen peroxide. in the The following are some of these substances as examples and in Brackets list the corresponding oxidases: Glucose (glucose oxidase), galactose (galactose oxidase), L-amino acid (L-amino acid oxidase), cholesterol (cholesterol oxidase) and uric acid (uricase). These are mainly fabrics their detection and determination in medical diagnostics and are of great importance in food chemistry.

Als Nachweisreaktion für Peroxidasen kommt die Methode insbesondere für die Bestimmung von Hämoglobin infrage, wobei man auch anstelle von Wasserstoffperoxid organische Hydroperoxide als Oxidationsmittel verwenden kann.The method comes in particular as a detection reaction for peroxidases for the determination of hemoglobin, where organic hydroperoxides are also used instead of hydrogen peroxide can use as an oxidizing agent.

Gemäß ihrer großen Bedeutung in der medizinischen Schnelldiagnostik sind für fast alle der oben genannten Reaktionen sogenannte Schnellteste beschrieben, die eine qualitative oder quantitative Bestimmung einzelner Reaktionskomponenten ermöglichen. Dabei werden saugfähige Träger oder Filme verwendet, die alle Reagenzien enthalten und bei denen nach dem Kontakt mit der Untersuchungsflüssigkeit die Farbreaktion abläuft, wenn die fragliche Substanz anwesend ist. Die gebildete Farbe wird mit Hilfe von Farbvergleichstafeln beurteilt oder an Remissionsphotometern gemessen, so daß aus der Farbintensität auf eine Konzentration der reagierenden Substanz geschlossen werden kann.Because of its importance in rapid medical diagnostics are for almost all of the above reactions so-called rapid tests described, which a qualitative or quantitative determination of individual reaction components enable. Absorbent carriers or films are used which contain all reagents and for which after contact with the test liquid the color reaction expires when the substance in question is present. The educated Color is assessed with the help of color comparison charts or on Remission photometers measured so that from the color intensity concluded a concentration of the reacting substance can be.

Als Oxidationsindikatoren für diese Schnellteste sind eine Reihe von Verbindungen in der Literatur und in Patenten beschrieben, jedoch haben sich in der Praxis nur wenige durchgesetzt. Es handelt sich hierbei fast ausschließlich um Verbindungen der Benzidinreihe und zwar von diesen wiederum insbesondere um o-Tolidin. Trotz der weiten Verbreitung dieses Indikators und seiner unzweifelhaften Vorteile gegenüber den anderen bekannten Indikatoren hat o-Tolidin jedoch auch Nachteile. Zum einen ist die Substanz in den Rezepturen für die Schnellteste nicht immer optimal haltbar, was zu unerwünschten Verfärbungen und Empfindlichkeitseinbußen bei längerer Lagerung führen kann. Zum anderen ist das bei der Indikator-Reaktion entstehende blaugrüne Radialkation nicht sehr stabil, da es relativ leicht unter Weiteroxidation in das braune Chinodiimin übergeht. Die Reaktionsfarben haben daher durch die braune Nebenfärbung z. T. einen "schmutzigen" Charakter, zudem verändern sie sich rasch und sind daher meist schon kurz nach der vorgeschriebenen Ablesezeit nicht mehr richtig auswertbar. Bei Serienanalysen und für die Dokumentation ist dies ein entscheidender Nachteil. Man kann zwar das Radikalkation mit anionischen Netzmitteln in gewissem Umfang stabilisieren, diese sind jedoch nicht immer anwendbar, da sie auf die Oxidasen für die Primärreaktion destabilisierend wirken können.As oxidation indicators for these rapid tests are one Series of compounds described in the literature and in patents, however, only a few have prevailed in practice. These are almost exclusively connections the benzidine series, and in particular of these to o-tolidine. Despite the widespread use of this Indicator and its undoubted advantages over the other known indicators also have disadvantages. For one, the substance is in the recipes for the Rapid tests are not always optimally stable, which leads to undesirable Discoloration and loss of sensitivity when stored for a long time can lead. On the other hand, this is the indicator reaction resulting blue-green radial cation is not very stable since it relatively easy with further oxidation in the brown quinodiimine transforms. The reaction colors therefore have a brown color Secondary coloring z. T. a "dirty" character, also change they change quickly and are therefore usually shortly after the prescribed Reading time can no longer be correctly evaluated. At Series analyzes and for documentation is a crucial one Disadvantage. You can use the radical cation To some extent stabilize anionic wetting agents, however, these are not always applicable because they apply to the Oxidases for the primary reaction have a destabilizing effect can.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß man Schnellteste der obigen Art erhält, die haltbarer sind und die stabilere Farbstoffradikale liefern, wenn man anstelle von o-Tolidin 3,3′, 5,5′-Tetraalkylbenzidine der allgemeinen Formel I It has now surprisingly been found that one of the fastest tests of the above type, which are more durable and the more stable dye radicals deliver if instead of o-tolidine 3,3 ', 5,5'-tetraalkylbenzidines of the general formula I

in der R₁, R₂, R₃, R₄ gleich oder verschieden sind und geradkettige oder verzweigte niedere Alkylgruppen mit 1-6, vorzugsweise 1-4 Kohlenstoffatomen bedeuten,
verwendet.in which R₁, R₂, R₃, R₄ are the same or different and represent straight-chain or branched lower alkyl groups with 1-6, preferably 1-4 carbon atoms,
used.

Um genügend empfindliche Schnellteste zu erhalten, ist es jedoch notwendig ein 2-stufiges Imprägnierungsverfahren anzuwenden, da eine einfache Übertragung der bekannten Rezepturen bzw. ein Imprägnieren des für den Naßtest nach Holland et al. verwendeten Reagenzes auf ein saugfähiges Papier unempfindliche und deshalb als Schnellteste unbrauchbare Vorrichtungen ergibt.For enough sensitive rapid tests however, it is necessary to obtain one 2-stage impregnation process to be used, as one easy transfer of the known recipes or impregnation for the wet test according to Holland et al. used Reagent on an absorbent paper insensitive and therefore results in unusable devices as quick tests.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher Schnellteste zum Nachweis und zur Bestimmung von (a) Wasserstoffperoxid oder von Substanzen, die unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren oder von (b) Peroxidase oder von peroxidatisch wirkenden Stoffen, indem man die Reaktion von Wasserstoffperoxid mit 3,3′, 5,5′-Tetraalkylbenzidinen der Formel I in Abwesenheit einer Peroxidase ausnutzt, die durch Imprägnieren eines saugfähigen Papiers mit (1) einer Peroxidase oder einer Substanz, die unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagiert, zusammen mit einem Puffer gelöst in Wasser oder gelöst in einer Wasser/Ethanol-Mischung und (2) nachfolgendes Imprägnieren des saugfähigen Papiers mit 3,3′, 5,5′-Tetraalklylbenzidin der Formel I gelöst in einem organischen Lösungsmittel hergestellt werden, sowie das Verfahren zu ihrer Herstellung.The present invention therefore relates to rapid tests for the detection and determination of (a) hydrogen peroxide or of substances which react to form hydrogen peroxide or of (b) peroxidase or of peroxidatively active substances by the reaction of hydrogen peroxide with 3,3 ', 5,5'-Tetraalkylbenzidinen of formula I in the absence of a peroxidase, which by impregnating an absorbent paper with (1) a peroxidase or a substance that reacts to form hydrogen peroxide, together with a buffer dissolved in water or dissolved in a water / Ethanol mixture and (2) subsequent impregnation of the absorbent paper with 3,3 ', 5,5'-tetraalklylbenzidine of the formula I dissolved in an organic solvent, and the process for their preparation.

Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formel I sind bekannt (DT-AS 1 495 705), jedoch sind bisher lediglich 3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin (V. R. Holland et al., Tetrahedron 30, 3299-3302 [1974]) und 3,3′, 5,5′-Tetraäthylbenzidin (R. Stroh et. al., Angew. Chem. 69, 124-131 [1957]) näher charakterisiert. Die aus der Struktur zu erwartende prinzipielle Eignung von 3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin zum Nachweis von okkultem Blut im Stuhl und Harn ist in der genannten Arbeit von V. R. Holland et. al. beschrieben, wobei als Vorteil gegenüber Tolidin die geringere Cancerogenität hervorgehoben wird. Die unerwartet größere Stabilität des Amins und seines Radikalkations in Schnelltesten wurde von Holland jedoch nicht gefunden, da er entsprechende Versuche nicht durchgeführt hat. Für solche Versuche bestand auch kein Anlaß, da der Benutzer von Schnelltesten die Reagenzien nicht direkt handhabt und somit die Frage der Cancerogenität dafür praktisch keine Rolle spielt.Processes for the preparation of compounds of formula I are known (DT-AS 1 495 705), but so far only 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine (V.R. Holland et al., Tetrahedron 30, 3299-3302 [1974]) and 3,3 ′, 5,5′-tetraethylbenzidine (R. Stroh et. al., Angew. Chem. 69, 124-131 [1957]). The basic suitability of. Expected from the structure 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine for the detection of occult blood in the stool and urine is in the work of V. R. Holland et. al. described, being an advantage over Tolidin's lower carcinogenicity is highlighted. The unexpectedly greater stability of the amine and its radical cation in rapid tests, however, was not found by Holland, because he didn’t do any experiments. There was no reason for such attempts because the user the reagents are not handled directly by rapid tests and thus the question of carcinogenicity plays practically no role in this.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind auch für Schnellteste zum Halogenid- bzw. Pseudohalogenid-Nachweis in Körperflüssigkeiten im Rahmen einer großen Gruppen von Chromogenen miterfaßt (Can. Pat. Nr. 818 344). Diese Schnellteste enthalten noch Kupfer-(II)-Verbindungen, welche mit den Halogeniden unter Bildung von Kupfer-(II)-halogeniden und freien Halogenen reagieren, die ihrerseits die Benzidin-Verbindungen oxidieren. Diese Oxidation führt offenbar zu den gleichen farbigen Radikalkationen wie die peroxidase-katalysierte Oxidation mit Hydroperoxiden. In dem genannten Patent wird von den zahlreichen beanspruchten Benzidin-Abkömmlingen o-Tolidin (3,3′-Dimethylbenzidin) bevorzugt, woraus zu schließen ist, daß die nicht beispielhaft beschriebenen 3,3′, 5,5′-Tetraalkylbenzidine für Schnellteste weniger geeignet sind.The compounds of general formula I are also for rapid tests for halide or pseudohalide detection in body fluids included in a large group of chromogens (Can. Pat. No. 818 344). These quick tests still contain Copper (II) compounds which form with the halides of copper (II) halides and free halogens react, which in turn oxidize the benzidine compounds. This oxidation apparently leads to the same colored radical cations like peroxidase-catalyzed oxidation with hydroperoxides. In the cited patent, many are claimed Preferred benzidine derivatives o-tolidine (3,3'-dimethylbenzidine), from which it can be concluded that those not described by way of example 3,3 ', 5,5'-tetraalkylbenzidines for rapid tests are less suitable.

Die größte Stabilität der Verbindungen der allgemeinen Formel I und ihrer Radikalkationen ist weiterhin insofern überraschend, als der elektronendrückende Einfluß der zusätzlichen Alkylgruppen eher eine gesteigerte Oxidierbarkeit und damit eine Weiterreaktion zum braunen Chinondiimin hätte erwarten lassen. The greatest stability of the compounds of general formula I and their radical cations is still surprising in that as the electron-depressing influence of the additional alkyl groups rather an increased oxidizability and thus one Further reaction to the brown quinone diimine would have been expected.

Um einen genügend empfindlichen Schnelltest zu erhalten, ist es erforderlich, den erfindungsgemäßen 2-Stufen-Prozeß für die Imprägnierung zu verwenden und die zusätzlichen Puffer, Lösungsvermittler und Netzmittel in die Mischung einzubeziehen.To get a sufficiently sensitive quick test, it is necessary to use the 2-step process according to the invention to use for the impregnation and the additional Buffer, solubilizer and wetting agent in the mixture to involve.

Gegebenenfalls können zur Farbstabilisierung verwendete anionische Netzmittel durch weniger aktive ersetzt oder ganz weggelassen werden. So können die Tetraalkylbenzidine beispielsweise verwendet werden in Testpapieren zum Nachweis von Glucose im Harn, von Blut im Harn, von Cholesterin im Serum, Wasserstoffperoxid in Milch oder in Testfilmen zur Bestimmung von Glucose in Blut und Serum und in vielen anderen Testen. Alle diese Teste zeichnen sich dadurch aus, daß die Farbreaktionen leuchtender, stabiler und z. T. besser abgestuft sind als bei der Verwendung von o-Tolidin, da die blaugrünen bis grünen Färbungen der Radikalkationen der Tetraalkylbenzidine nicht durch Anteile der braunen Chinondiimine "verschmutzt" sind.If necessary, can be used for color stabilization anionic wetting agents replaced by less active ones be left out entirely. So the tetraalkylbenzidines used for example in test papers for detection of glucose in the urine, of blood in the urine, of cholesterol in the Serum, hydrogen peroxide in milk or in test films Determination of glucose in blood and serum and in many others Testing. All of these tests are characterized by this from that the color reactions are brighter, more stable and z. T. are better graded than when using o-tolidine because the blue-green to green colorations of the radical cations of tetraalkylbenzidines not through shares of the brown quinone diimines are "dirty".

Bei den in den folgenden Beispielen beschriebenen Schnelltesten treten die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Tetraalkylbenzidine besonders hervor, wobei einzelne Vertreter der Verbindungsklasse gegebenenfalls noch besonders vorteilhafte Wirkungen haben können: So zeigt sich die gesteigerte Haltbarkeit der Tetraalkylbenzidine gemäß Formel I gegenüber o-Tolidin insbesondere bei der Lagerung von Testpapieren zum Nachweis von Blut im Harn. Die gesteigerte Stabilität der Radikalkationen führt dazu, daß Messung in einem relativ langen Zeitraum vorgenommen werden kann. Die Verwendung von Tetraäthylbenzidin beim Harnglucose-Test führt zu Testpapieren, bei denen die Reaktionsfarbe tagelang nahezu unverändert bleibt, was für Früherkennungsaktionen, bei denen die Probeanden die benutzten Teststreifen an eine zentrale Auswertungsstelle senden, von besonderer Bedeutung ist.With the rapid tests described in the following examples occur the properties of the tetraalkylbenzidines according to the invention particularly prominent, with individual representatives of the compound class may have particularly advantageous effects: This shows the increased shelf life of tetraalkylbenzidines according to formula I compared to o-tolidine, especially during storage of test papers for the detection of blood in the urine. The leads to increased stability of the radical cations cause measurement in a relatively long time Period can be made. The use of tetraethylbenzidine in the urine glucose test leads to test papers in which the reaction color remains almost unchanged for days, which is Early detection campaigns in which the probands used the Send test strips to a central evaluation center, from is of particular importance.

An den folgenden Beispielen soll die Erfindung näher erläutert werden: The invention is explained in more detail in the following examples will:

Example 1 Test paper for the detection of blood in the urine

Filterpapier (Schleicher und Schüll Nr. 23SL) wird nacheinander mit folgenden Lösungen imprägniert und bei 40°C getrocknet:Filter paper (Schleicher and Schüll No. 23SL) is used one after the other impregnated with the following solutions and dried at 40 ° C:

Solution 1

1,2 molarer Citratpuffer vom pH 5,25 35,0 ml Äthylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz 0,1 g Dioctylnatriumsulfosuccinat 0,5 g 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid (ca. 70%ig) 1,6 g Phosphorsäuretrimorpholid 12,7 g Äthanol 30,0 ml dest. Wasser ad100,0 ml1.2 molar citrate buffer, pH 5.25 35.0 ml Ethylenediaminetetraacetic acid, disodium salt 0.1 g Dioctyl sodium sulfosuccinate 0.5 g 2,5-dimethylhexane-2,5-dihydroperoxide (approx. 70%) 1.6 g Phosphoric acid trimorpholide 12.7 g Ethanol 30.0 ml least Water ad100.0 ml

Solution 2

3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin 0,3 g Phenanthridin 0,2 g Toluol ad100,0 ml3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine 0.3 g Phenanthridine 0.2 g Toluene ad100.0 ml

Man erhält ein weißes Testpapier, welches sich beim Eintauchen in bluthaltigen Urin nach ca. 5-20 Sekunden blaugrün verfärbt. Sind die Erythrozyten intakt, so sind die Papiere blaugrün gesprenkelt. Ist Hämolyse eingetreten, oder befindet sich von vornherein freies Hämoglobin im Urin, so werden die Papiere gleichmäßig blaugrün gefärbt. Die Empfindlichkeit liegt bei ca. 5 Erythrozyten/mm³ oder der entsprechenden Menge Hämoglobin. Eine niedrige Zahl intakter Erythrozyten kann unter Umständen noch einzelne blaugrüne Punkte auf dem Testpapier hervorrufen. Die Empfindlichkeit gegenüber Myoglobin entspricht der von Hämoglobin. A white test paper is obtained which, when immersed in blood-containing Urine turns blue-green after approx. 5-20 seconds. Are the erythrocytes intact, the papers are speckled blue-green. Has hemolysis occurred or there is free hemoglobin in the urine from the outset, so the papers are dyed evenly blue-green. The sensitivity lies at approx. 5 erythrocytes / mm³ or the corresponding amount of hemoglobin. A low number of intact erythrocytes may still be single Create blue-green dots on the test paper. The sensitivity towards myoglobin corresponds to that of hemoglobin.

Nach dreitägiger Temperaturbelastung bei 60° sind die Testpapiere ganz schwach gelblich gefärbt, ihre Empfindlichkeit ist im wesentlichen gleich geblieben, lediglich die Reaktionszeiten haben sich auf ca. 60-90 Sekunden verlängert. Ein Testpapier der gleichen Zusammensetzung mit o-Tolidin anstelle von Tetramethylbenzidin ist nach der gleichen Belastung gelbbraun verfärbt, die Empfindlichkeit liegt etwa bei 20 Erythrozyten/mm³.After three days of temperature exposure at 60 ° the test papers are very pale yellowish in color, their sensitivity is essentially stayed the same, just have the response times extends to about 60-90 seconds. A test paper of the same Composition with o-tolidine instead of tetramethylbenzidine is discolored yellow-brown after the same exposure, the sensitivity is about 20 erythrocytes / mm³.

Papiere gleicher Empfindlichkeit und Stabilität, die lediglich etwas langsamer und mit rein grüner Farbe reagieren, erhält man bei Verwendung äquimolarer Mengen von 3,3′, 5,5′-Tetraäthyl-, 3,3′-Dimethyl-5,5′-diäthyl- oder 3,3′, 5,5′-Tetraisopropylbenzidin. Die bisher nicht beschriebenen Verbindungen 3,3′-Dimethyl-5,5′- diäthylbenzidin und 3,3′, 5,5′-Tetraisopropylbenzidin können beispielsweise nach dem Verfahren der DT-AS 1 495 705 aus o-Tolidin und Äthylen bzw. aus Benzidin und Propylen hergestellt werden.Papers of the same sensitivity and stability, the only you get a little slower and react with a purely green color when using equimolar amounts of 3.3 ′, 5,5′-tetraethyl, 3,3'-dimethyl-5,5'-diethyl or 3,3 ', 5,5'-tetraisopropylbenzidine. The previously not described compounds 3,3'-dimethyl-5,5'- diethylbenzidine and 3,3 ', 5,5'-tetraisopropylbenzidine can for example according to the method of DT-AS 1 495 705 o-tolidine and ethylene or made from benzidine and propylene will.

Example 2 Test paper for the detection of blood in the urine

Ersetzt man in der Rezeptur von Beispiel 1 das Dioctylnatriumsulfosuccinat durch die gleiche Menge Lauroylsarkosin oder läßt das oberflächenaktive Mittel ganz weg, wo erhält man Testpapiere, die zwar weniger empfindlich sind als die gemäß Beispiel 1, die aber immer noch empfindlicher sind als entsprechende Papiere mit o-Tolidin. Die Farbreaktionen mit einem Harn, der 50 hämolysierte Erythrozyten/mm³ enthält, sind in untenstehender Tabelle zusammengefaßt.In the formulation of Example 1, the dioctyl sodium sulfosuccinate is replaced by the same amount of lauroyl sarcosine or leaves the surface active Medium way away, where can you get test papers that are less sensitive are than those according to Example 1, but are still more sensitive as corresponding papers with o-tolidine. The color reactions with one Urine containing 50 hemolyzed erythrocytes / mm³ is shown below Table summarized.

Example 3 Test paper for the detection of glucose in the urine

Filterpapier (Schleicher & Schüll 597 NF) wird mit Lösungen folgender Zusammensetzung getränkt und bei 50°C getrocknet:Filter paper (Schleicher & Schüll 597 NF) comes with solutions as follows Soaked composition and dried at 50 ° C:

Solution 1

Glucoseoxidase (70 U/mg)222 mg Peroxidase (70 U/mg) 28 mg Morpholinoäthanolsulfonat-Puffer (pH 6, 1,0 m) 50 ml Tartrazin 80 mg Polyvinylpyrrolidin300 mg Wasser, dest., ad100 mlGlucose oxidase (70 U / mg) 222 mg Peroxidase (70 U / mg) 28 mg Morpholino ethanol sulfonate buffer (pH 6, 1.0 m) 50 ml Tartrazine 80 mg Polyvinyl pyrrolidine 300 mg Water, dist., Ad100 ml

Solution 2

3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin600 mg Äthanol, ad100 ml3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine 600 mg Ethanol, ad100 ml

Auf die gleiche Weise werden Testpapiere hergestellt, die äquimolare Mengen 3,3′, 5,5′-Tetraäthylbenzidin bzw. o-Tolidin enthalten. Die Reaktionsfarben dieser Testpapiere mit glucosehaltigen Harnen ca. 60- 120 sec. nach dem Eintauchen sind in untenstehender Tabelle zusammengefaßt. Beim Tetramethylbenzidin bleiben diese Farben ca. 10-15 min. konstant, beim Trocknen bekommen sie einen mehr bläulichen Charakter und bleiben in dieser Form tagelang stabil. Die Farben mit Tetraäthylbenzidin verblassen beim Trocknen geringfügig ohne den Farbwert zu ändern und sind dann über Tage stabil. Die mit o-Tolidin erhaltenen Farben beginnen schon nach 5-10 Min. zu vergilben und zu verblassen und sind nach dem Trocknen in ca. 2-4 Std. je nach Glucosekonzentration ganz verblaßt oder schwach olivbraun. Test papers, the equimolar ones, are produced in the same way Amounts of 3,3 ', 5,5'-tetraethylbenzidine or o-tolidine contain. The Reaction colors of these test papers with glucose-containing urine approx. 60- 120 seconds after immersion are summarized in the table below. With tetramethylbenzidine, these colors remain for approx. 10-15 min. constant, when drying they get a more bluish tinge Character and remain stable in this form for days. The Colors with tetraethylbenzidine fade on drying slightly without changing the color value and then are stable for days. The colors obtained with o-tolidine start to yellow and fade after only 5-10 minutes and after drying in about 2-4 hours depending on Glucose concentration completely faded or slightly olive brown.

Example 4 Test papers for the detection of hydrogen peroxide

Filterpapier wird mit folgenden Lösungen getränkt und bei 40°C getrocknet.Filter paper is soaked with the following solutions and at 40 ° C dried.

Solution 1

Trinatriumcitrat, Dihydrat 225 mg Citronensäure, Monohydrat 175 mg Peroxidase (70 U/mg) 50 mg Natriumalginat 150 mg Polyoxyaethylensorbitanmonolaurat (Tween 20)1300 mg Vinylpyrrolidin-Vinylacetat-Mischpolymerisat 375 g Wasser, dest., ad 100 mlTrisodium citrate, dihydrate 225 mg Citric acid, monohydrate 175 mg Peroxidase (70 U / mg) 50 mg Sodium alginate 150 mg Polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween 20) 1300 mg Vinyl pyrrolidine / vinyl acetate copolymer 375 g Water, dist., Ad 100 ml

Solution 2

3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin 500 mg Aceton, ad 100 ml3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine 500 mg Acetone, ad 100 ml

Das so gefertigte Testpapier gibt mit Wasserstoffperoxid in wäßrigen Lösungen, beispielsweise Milch, blaugrüne Farbreaktionen bis herunter zu Konzentrationen von 0,1 mg %. The test paper made in this way is filled with hydrogen peroxide in aqueous solutions, for example milk, blue-green Color reactions down to concentrations of 0.1 mg%.

Example 5 Test paper for the detection of cholesterol and cholesterol esters in serum

Filterpapier (Schleicher & Schüll 597 NF, Ind.) wird mit Lösungen folgender Zusammensetzung getränkt und bei 40°C getrocknet:Filter paper (Schleicher & Schüll 597 NF, Ind.) Comes with solutions impregnated with the following composition and dried at 40 ° C:

Solution 1

1 molarer Citratpuffer pH 7 20,0 ml Cholesterinoxidase (60 U/mg) 0,1 g Cholesterinesterase (18 U/mg) 0,25 g Peroxidase (70 U/mg) 0,05 g Wasser, dest., ad100,00 ml1 molar citrate buffer pH 7 20.0 ml Cholesterol oxidase (60 U / mg) 0.1 g Cholesterol esterase (18 U / mg) 0.25 g Peroxidase (70 U / mg) 0.05 g Water, dist., Ad100.00 ml

Solution 2

3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin 0,28 g Polyäthylenoctylphenoläther (Trixton X 1CO) 0,5 g Methylenchlorid, ad100,0 ml3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine 0.28 g Polyethylene octylphenol ether (Trixton X 1CO) 0.5 g Methylene chloride, ad100.0 ml

Die so erhaltenen Testpapiere reagieren mit Seren, die Cholesterin und/oder Cholesterinester enthalten, mit grünen Farbtönen, deren Intensität der Konzentration des Cholesterins entspricht. Entsprechende Testpapiere, die anstelle von Tetramethylbenzidin o-Tolidin enthalten, reagieren ebenfalls mit grünen Farbtönen, die aber weniger intensiv sind. The test papers thus obtained react with sera that Contain cholesterol and / or cholesterol esters with greens Shades whose intensity is the concentration of cholesterol corresponds. Appropriate test papers instead of Containing tetramethylbenzidine o-tolidine also react with green tones that are less intense.

Example 6

Die folgenden Vergleichstests wurden ausgeführt, um die Effizienz und die Stabilität der erfindungsgemäß hergestellten Indikator-Teststreifen zu prüfen im Vergleich zu konventionellen Zusammensetzungen, die o-Tolidin als Indikator enthalten.The following comparative tests were carried out to determine the Efficiency and stability of the manufactured according to the invention Indicator test strips to be compared to conventional compositions that use o-tolidine as an indicator contain.

Ein für die Erfindung repräsentativer Glucose-Teststreifen wurde wie folgt hergestellt:A glucose test strip representative of the invention was made as follows:

Filterpapier (Schleicher & Schüll 2312) wurde nacheinander mit den nachstehenden Lösungen imprägniert und bei 40°C getrocknet:Filter paper (Schleicher & Schüll 2312) was used in succession impregnated with the solutions below and at 40 ° C dried:

Solution 1

Glucoseoxidase (56 U/mg) 0,54 g Peroxidase (70 U/mg) 0,4 g Hydrolysiertes Collagen 2,5 g Tartrazin 0,9 g dest. Wasser, ad100 mlGlucose oxidase (56 U / mg) 0.54 g Peroxidase (70 U / mg) 0.4 g Hydrolyzed collagen 2.5 g Tartrazine 0.9 g least Water, ad100 ml

Die Lösung wurde mit Ameisensäure auf pH 5 eingestellt.The solution was adjusted to pH 5 with formic acid.

Solution 2

3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin 0,6 g Dioctylnatriumsulfosuccinat 0,5 g Äthanol, ad100 ml3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine 0.6 g Dioctyl sodium sulfosuccinate 0.5 g Ethanol, ad100 ml

Das gleiche Verfahren wurde angewandt, um eine weitere für die Erfindung repräsentative Zusammensetzung herzustellen, die 0,1 g Nonisol (Polyethylenglycol-100-monolaurate) anstelle von Dioctylnatriumsulfosuccinat als Netzmittel enthielt. The same procedure was used to create another one for the Invention to produce representative composition that 0.1 g nonisol (polyethylene glycol 100 monolaurate) instead of Contained dioctyl sodium sulfosuccinate as a wetting agent.

Zu Vergleichszwecken wurde ein kommerzielles Produkt gleicher Zusammensetzung mit Nonisol als Netzmittel verwendet, das aber als Chromogen o-Tolidin anstelle des in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen gebrauchten 3,3′, 5,5′-Tetramethyl benzidins enthielt.For comparison purposes, a commercial product became the same Composition with nonisol used as a wetting agent but as chromogen o-tolidine instead of that in the invention Compositions used 3,3 ', 5,5'-tetramethyl contained gasoline.

Die jeweiligen erfindungsgemäßen Testpapiere färbten sich nach Eintauchen in glucosehaltigen Urin innerhalb von etwa 20-60 Sekunden blaugrün, wobei die Farbintensität dem Glucosegehalt des Urins, der zwischen 0 und 2000 mg Glucose/ml lag, proportional war. Die Färbung bleibt mehr als 1 Stunde konstant.The respective test papers according to the invention recolored Immerse in urine containing glucose within about 20-60 seconds blue-green, the color intensity of the Urinary glucose content between 0 and 2000 mg glucose / ml was proportional. The coloring stays for more than 1 hour constant.

Die Vergleichszusammensetzung mit o-Tolidin ergab Teststreifen, die nach Eintauchen in dieselben glucosehaltigen Urinproben nach 20-60 Sekunden ebenfalls abgestufte blaugrüne Färbungen ergab, die sich jedoch nach 5-10 Minuten bräunlich verfärbten und deshalb nach einiger Zeit sehr schwer bestimmbare Graduierungen der Farbtiefe ergaben.The comparison composition with o-tolidine gave test strips, after immersion in the same urine samples containing glucose after 20-60 seconds also graduated blue-green colorations resulted, which, however, turned brownish after 5-10 minutes and therefore very difficult to determine after some time Gradations in color depth resulted.

Zusätzlich wurden Stabilitätstests ausgeführt, in denen die erfindungsgemäßen Teststreifen mit den o-Tolidin enthaltenden Teststreifen nach 3-tägiger Lagerung bei 100% rel. Luftfeuchtigkeit in einem geschlossenen Gefäß bei 20°C (Experiment A) und bei 60°C (Experiment B) verglichen wurden. Die erfindungsgemäßen Teststreifen blieben hellgelb und geeignet zum Gebrauch als Glucose-Indikatoren, während die nach dem Stand der Technik hergestellten o-Tolidin-haltigen Testpapiere sich stark verfärbten, speziell in Experiment B, was sie für den klinischen Gebrauch unbrauchbar machte.In addition, stability tests were carried out in which the Test strips according to the invention with those containing o-tolidine Test strips after 3 days of storage at 100% rel. humidity in a closed vessel at 20 ° C (experiment A) and at 60 ° C (Experiment B) were compared. The Test strips according to the invention remained light yellow and suitable for use as glucose indicators, while after the State-of-the-art test papers containing o-tolidine became very discolored, especially in Experiment B, what they were for made clinical use unusable.

Zusätzliche für die Erfindung repräsentative Teststreifen für Blut im Urin wurden wie folgt hergestellt: Additional test strips representative of the invention for blood in the urine were prepared as follows:

Filterpapier (Schleicher & Schüll Nr. 23SL) wurde nacheinander imprägniert mit den folgenden Lösungen und bei 40°C getrocknet:Filter paper (Schleicher & Schüll No. 23SL) was used in succession impregnated with the following solutions and at 40 ° C dried:

Solution 1

1,2 molarer Citratpuffer vom pH 5,25 25,0 ml Äthylendiamintetraessigsäure, Dinatriumsalz 0,5 g Dioctylnatriumsulfosuccinat 0,5 g 2,5-Dimethylhexan-2,5-dihydroperoxid (ca. 70%ig) 1,6 g Phosphorsäuretrimorpholid 12,7 g Phenanthridin 0,25 g Methanol 30,0 ml dest. Wasser, ad100 ml1.2 molar citrate buffer, pH 5.25 25.0 ml Ethylenediaminetetraacetic acid, disodium salt 0.5 g Dioctyl sodium sulfosuccinate 0.5 g 2,5-dimethylhexane-2,5-dihydroperoxide (approx. 70%) 1.6 g Phosphoric acid trimorpholide 12.7 g Phenanthridine 0.25 g Methanol 30.0 ml least Water, ad100 ml

Solution 2

3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin 0,28 g Toluol, ad100 ml3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine 0.28 g Toluene, ad100 ml

Ein Vergleichstest wurde in der gleichen Weise ausgeführt, aber mit 0,25 g o-Tolidin anstelle von 3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin.A comparative test was carried out in the same way, however with 0.25 g of o-tolidine instead of 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine.

Die entsprechenden Teststreifen wurden nahezu 4 Jahre in geschlossenen Gefäßen über Trockenmittel geschützt vor direktem Sonnenlicht aufbewahrt.The corresponding test strips have been in closed containers for almost 4 years stored protected from direct sunlight via desiccants.

Die 3,3′, 5,5′-Tetramethylbenzidin enthaltenden Zusammensetzungen entsprechend der vorliegenden Erfindung blieben alle im wesentlichen weiß, während die o-Tolidin enthaltenden Materialien beträchtliche bräunliche Verfärbungen zeigten.The compositions containing 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine remained in accordance with the present invention all essentially white, while those containing o-tolidine Materials showed considerable brownish discolouration.

Claims

1. Rapid test for the detection and determination of (a) hydrogen peroxide or of substances which react to form hydrogen peroxide or of (b) peroxidase or of peroxidatively active substances consisting of an absorbent paper containing (a) a peroxidase or a peroxidatic acting substance or (b) a peroxide or a substance which reacts to form hydrogen peroxide and a chromogen and, if appropriate, impregnated with buffer substances, solubilizers and wetting agents or other auxiliaries, characterized in that the rapid test as a chromogen is a 3.3 ′, 5,5'- tetraalkylbenzidine of the general formula I in which R₁, R₂, R₃, R₄ are the same or different and represent straight-chain or branched lower alkyl groups with 1-6, preferably 1-4 carbon atoms, and the impregnation of the absorbent paper is carried out in two stages, with the first stage with (a) a peroxidase or a peroxidatively active substance or (b) a peroxide or a substance that reacts to form hydrogen peroxide, and with a buffer dissolved in water or a water / ethanol mixture and in the 2nd stage with the the above chromogen has been impregnated in an organic solvent.

2. A method for producing a rapid test for the detection and determination of (a) hydrogen peroxide or of substances which react to form hydrogen peroxide or of (b) peroxidase or of peroxidatively active substances consisting of an absorbent paper containing (a) a Peroxidase or with a peroxidatively active substance or (b) a peroxide or a substance which reacts to form hydrogen peroxide, and a chromogen and optionally impregnated with buffer substances, solubilizers and wetting agents or other auxiliaries, characterized in that the impregnation of the absorbent Paper is carried out in two stages, in the first stage with (a) a peroxidase or a peroxidatively active substance or (b) a peroxide or a substance which reacts to form hydrogen peroxide, and with a buffer dissolved in water or a Water / ethanol mixture impregnated and in the 2nd stage with 3,3 ', 5,5'-tetraalk ylbenzidine of the general formula I in which R₁, R₂, R₃, R₄ are the same or different and represent straight-chain or branched lower alkyl groups having 1-6, preferably 1-4 carbon atoms, impregnated in an organic solvent.