DE1617741B1

DE1617741B1 - Process for the production of a glycopeptide from the gastric mucosa or duodenum of pigs

Info

Publication number: DE1617741B1
Application number: DE1967P0043062
Authority: DE
Inventors: Gianfranco Dr Bertellini; Adriano Dr Butti; Giuseppe Dr Prino
Original assignee: PREPHAR PROSPECTION DE RECH S
Current assignee: PREPHAR PROSPECTION DE RECH S
Priority date: 1966-09-29
Filing date: 1967-09-26
Publication date: 1971-01-07
Also published as: MY7100041A; YU31438B; ES345550A1; CH494739A; GB1166939A; AT275029B; BE704537A; SU539507A3; IL28649A; NO123051B; NL6713286A; GR34664B; DK116308B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur dingungen das Material schnell zerstört wird. Aus den Herstellung eines Glycopeptides aus Magenschleim- gleichen Gründen ist bei: hohen pH-Werten (über 9) haut oder Zwölffingerdarm von Schweinen. eine besonders sorgfältige Kontrolle der angewandtenThe present invention relates to a method for conditions the material is destroyed quickly. From the Production of a glycopeptide for gastric mucus reasons is at: high pH values (over 9) skin or duodenum of pigs. a particularly careful control of the applied

Die Existenz von Makromolekülen von zusammen- Temperatur und der Zeitdauer des Erhitzens erfordergesetzter Natur, die zwischen Proteinen und Poly- 5 lieh. Am Ende der Hydrolyse kann es zweckmäßig sacchariden Hegen, in tierischen Organen ist allgemein sein, die Ausfällung aller organischen Substanzen mit bekannt. Diese Substanzen sind als Glycoproteide saurem Charakter wie den schwefelhaltigen Mucopolybezeichnet worden. sacchariden zu bewirken. Wenn demnach die Hydro-The existence of macromolecules of combined temperature and time required for heating Nature that borrowed between proteins and poly-5. At the end of the hydrolysis it can be expedient sacchariden Hegen, in animal organs is common to be the precipitation of all organic substances with known. These substances are known as glycoproteins of acidic character like the sulphurous mucopoly been. effect saccharides. If the hydro

Die Struktur dieser Makromoleküle kann in grober lyse bei alkalischem pH-Wert durchgeführt worden ist, Annäherung als die Kombination von einem oder io kann die Mischung wieder durch Zugabe einer mehreren Molekülen eines Polysaccharides mit einem schwachen Säure (z. B. Essigsäure) auf einen sauren oder mehreren Molekülen eines Proteins vermutet pH-Wert gebra'cht werden, wodurch die Ausfällung werden. Diese Kombination ist auf Grund von kova- dieser Substanzen bewirkt wird. Das Filtrat wird dann lenten Bindungen gegeben, und aus diesem Grundeist von den Proteinabfällen durch Behandlung mit einem die gesamte Struktur nicht ein Addukt oder ein Korn- 15 Enzym (z. B. Papain) bei einem geeigneten pH-Wert plex, sondern vielmehr ein einziges Molekül. Bei befreit. Es kann auch zweckmäßig sein, vor der einigen Arten von Glycoproteiden kann der Proteid- enzymatischen Behandlung eine vorhergehende Ausanteil vorherrschen, während in anderen Arten der fällung des größten Teiles der Proteinabfälle durch Polysaccharidteil die Oberhand hat. Der letztere Typus Zugabe eines geeigneten Reagenzes, wie Trichloressigwird deshalb in der Regel als Glycopeptid bezeichnet. 20 säure zu bewirken. Durch Verdünnung des Filtrates, Zu dieser Klasse gehören einige Substanzen, die eine das nach diesen Behandlungsschritten erhalten wird, sehr große biologische Bedeutung haben, wie bei- mit organischen Lösungsmitteln (Alkohol oder Aceton) spielsweise diejenigen, die die Blutgruppen charakteri- wird das rohe. Glycopeptid in Form eines weißen bis sieren. · ■ bräunlichen Pulvers erhalten. In den Beispielen wirdThe structure of these macromolecules can be roughly analyzed at alkaline pH, Approaching the combination of a or io can be added to the mixture again by adding a several molecules of a polysaccharide with a weak acid (e.g. acetic acid) on an acidic one or several molecules of a protein suspected pH are used, causing the precipitation will. This combination is due to cova- these substances is effected. The filtrate is then lenten bonds, and for this reason is from the protein waste by treatment with a the entire structure is not an adduct or a grain enzyme (e.g. papain) at an appropriate pH plex, but rather a single molecule. At exempt. It can also be useful in front of the Some types of glycoproteins may be preceded by enzymatic treatment predominate, while in other types of precipitation most of the protein wastes through Polysaccharide part has the upper hand. The latter type will add a suitable reagent such as trichloroacetic acid therefore usually referred to as a glycopeptide. 20 acidic effect. By diluting the filtrate, This class includes some substances that are obtained after these treatment steps, have very great biological importance, such as with organic solvents (alcohol or acetone) For example, those who characterize the blood groups will be the raw. Glycopeptide in the form of a white up sate. · ■ get brownish powder. In the examples,

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren 25 über einige chemische Analysen dieses Produktes bezur Herstellung eines Glycopeptides aus Magen- richtet, welches sich besonders durch die Abwesenheit Schleimhaut oder Zwölffingerdarm von Schweinen, das von Uronsäuren und die Anwesenheit von nur einer gemäß der Erfindung dadurch gekennzeichnet ist, daß Spur Schwefel auszeichnet.The present invention now relates to a method 25 for some chemical analysis of this product Production of a glycopeptide from stomach, which is particularly characterized by its absence Pig mucous membrane or duodenum, that of uronic acids and the presence of only one according to the invention is characterized in that trace distinguishes sulfur.

man die tierischen Organe in Wasser bei 50 bis 100° C . Die anschließenden Reinigungsbehandlungen beabwährend 10 bis 45 Minuten bei pH 1,2 bis 4,5 oder 8,5 30 sichtigen insbesondere^ von dem Rohprodukt, welches bis 9,5 hydrolysiert, die sauren Mucopolysaccharide nach dem obenerwähnten Schema erhalten wurde, durch Säurezugabe abtrennt, das Filtrat mit Aceton Verunreinigungen von salzartigem.. Charakter zu ent- oder Alkohol versetzt, den Niederschlag nach Wieder- fernen und ein Material zu erzeugen, welches eine konauflösung in Wasser durch Papain oder Trypsin enz-y- ■ stante analytische Zusammensetzung aufweist,
matisch abbaut und anschließend die Glycopeptide ,35.., Die Reinigung kann im wesentlichen nach zwei mit Alkohol oder Aceton ausfällt. Methoden durchgeführt werden:the animal organs in water at 50 to 100 ° C. The subsequent cleaning treatments for 10 to 45 minutes at pH 1.2 to 4.5 or 8.5, in particular, remove the acidic mucopolysaccharides obtained according to the above-mentioned scheme from the crude product, which hydrolyzes up to 9.5, by adding acid, the filtrate with acetone to remove impurities of salty character or add alcohol, the precipitate after removal and to produce a material which has a con-dissolution in water by papain or trypsin enz-y- ■ constant analytical composition,
automatically degrades and then the glycopeptides, 35 .., The purification can essentially after two precipitates with alcohol or acetone. Methods to be carried out:

Das gemäß dem Verfahren der Erfindung herge- Entweder mittels Dialyse (die Verunreinigungen sindThat produced according to the method of the invention either by means of dialysis (which are impurities

stellte Glycopeptid hat sich als nützlich bei der pharma- leicht dialysierbar) oder durch Überleitung über ein zeutischen Anwendung zur Heilung von Entzündungs- Ionen-Austauscherharz des sauren Typus oder des gekrankheiten im allgemeinen und von Geschwüren im 40 mischten Typus,Kjind in diesem Falle wird die Reinibesonderen erwiesen. gung dadurch erzielt, daß von dem stark saurenfigured glycopeptide has been found to be useful in pharma- ceutical easily dialyzable) or by conduction over a Zeutischen application for the healing of inflammatory ion exchange resin of the acid type or the diseases in general and from ulcers of the mixed type, Kjind in this case becomes the pure particular proven. obtained by the fact that of the strongly acidic

Im wesentlichen besteht das Verfahren gemäß der Charakter der Verunreinigungsmaterialien Gebrauch Erfindung aus einer milden hydrolytischen Behandlung .. gemacht wird. In den Beispielen sind beide Reinigungsund einer anschließenden Entfernung des Haupt- verfahren erläutert. Die Ausbeuten der Reinigungsanteiles von Protein- und Mucopolysaccharidischen .45 operation, unabhängig von dem angewandten VerAbfällen durch Fällung und anschließende Proteölyse . .fahren, schwanken zwischen 65 und 75 Gewichtsmittels Enzymen. Es ist in diesem Zusammenhang' ",prozent, und das so erhaltene Produkt liegt in Form interessant, daß gemäß Vorveröffentlichungen in-der'' eines farblosen, geruchlosen und amorphen Pulvers Literatur betreffend andere Arten von Verbindungen vor. Die Phosphor- und Schwefelgehalte des gereinigdie enzymatische Pröteolyse vollständig die Protein- 50 ten Produktes sind praktisch vernachlässigbar. Außerketten, die als Verunreinigungen vorhanden sind, zef-''..'■ "dem sind nicht vorhanden Uronsäuren, während auf stört, jedoch den peptidischen Anteil nicht ändert, der der anderen Seite Hexosamine im Bereich von 40 bis das Extraktionsprodukt charakterisiert, 50 %, Aminosäuren im Bereich von 13 bis 18%»Essentially, the procedure is according to the nature of the contaminant materials of use Invention of a mild hydrolytic treatment .. is made. In the examples both are cleaning and a subsequent removal of the main proceedings. The yields of the purification portion of protein and mucopolysaccharidic operations, regardless of the waste used by precipitation and subsequent proteolysis. .drive, vary between 65 and 75 weight average enzymes. It is in this context '", percent, and the product so obtained lies in the form Interesting that according to previous publications in-the '' of a colorless, odorless and amorphous powder Literature on other types of compounds. The phosphorus and sulfur levels of the purified enzymatic proteolysis completely the protein products are practically negligible. Out chains, which are present as impurities, zef - '' .. '■ "dem are not present uronic acids while on interferes, but does not change the peptidic fraction, the other side hexosamines in the range from 40 to characterizes the extraction product, 50%, amino acids in the range from 13 to 18% »

Die hydrolytische Behandlung wird mit einem Organ Hexosen im Bereich von 27 bis 31 % und Derivate von durchgeführt, das vorher zerkleinert und in Wasser 55 Neuraminsäure im. Bereich von 4 bis 6% anwesend angeschlämmt wurde. Sie kann bei einem pH-Wert sind.The hydrolytic treatment is carried out with an organ ranging from 27 to 31% and derivatives of hexoses carried out, the previously crushed and in water 55 neuraminic acid im. Range of 4 to 6% present was slurried. You can be at pH.

innerhalb eines großen Bereiches durchgeführt werden. Das Produkt scheint auf Grund der analytischencan be carried out within a large area. The product seems due to the analytical

Es werden erhöhte Temperaturen von zwischen etwa Untersuchungen einheitlich zu sein (Elektrophorese, 50 und 100°C für einen Zeitraum von etwa 10 bis Papiercromatography usw.), und es wird durch 45 Minuten angewandt. Aus Gründen einer bequemen 60 Kupfersulf at in alkalischem Medium (Biuret Reagenz) Durchführung des Verfahrens und einer einfachen inquantitativer Ausbeute gefällt.
Kontrolle wird eine Hitzebehandlung durch Erwärmen Die erwähnten analytischen Daten gestatten, dasThere will be elevated temperatures of between about exams to be uniform (electrophoresis, 50 and 100 ° C for a period of about 10 to paper chromatography, etc.) and it will be applied through 45 minutes. For the sake of a convenient 60 copper sulfate in an alkaline medium (biuret reagent) implementation of the process and a simple inquantitative yield precipitated.
Control will allow heat treatment by heating. The analytical data mentioned allow that

auf den Siedepunkt, d. h. auf Temperaturen von etwa Produkt zu den Glycopeptiden zu klassifizieren, wäh* 100° C bevorzugt. Der pH-Wert kann auf Werte einge- rend auf der anderen Seite die Anwesenheit von stellt werden, die im Bereich von etwa 1,2 bis 4,5 oder 6g Hexosaminen, die nicht von Uronsäuren begleitet sind, 8,5 bis 9,5 liegen, und zwar durch geeignete Zugabe und die Abwesenheit von schwefelhaltigen Gruppen von Säuren oder Alkalien. Insbesondere Werte über aller Art ein charakteristisches Merkmal für denpolypH 10 sollen vermieden werden, da unter diesen Be- saccharidischen Teil dieser Substanz darstellen.on the boiling point, d. H. to classify on temperatures of about product to the glycopeptides, while * 100 ° C preferred. The pH value can be reduced to values on the other hand the presence of which are in the range of about 1.2 to 4.5 or 6g hexosamines, which are not accompanied by uronic acids, 8.5 to 9.5 by appropriate addition and the absence of sulfur-containing groups of acids or alkalis. In particular, values above all types are a characteristic feature of the polypH 10 should be avoided, since these represent saccharidic part of this substance.

I 617 741I 617 741

3 43 4

Pharmakologische Versuche an Laboratoriumstieren wiederholte Zugabe von 2 n-Natriumhyxkoxidlosung haben ergeben, daß dieses Glycopeptid in einer Dosis auf 8,6 gehalten. Am Ende dieser Periode wurden zu' von 12,5, 25 oder 50 mg/kg inhibierend wirkt auf das nächst 250 ml 80%iger Essigsäure zugegeben und anlokale Ödem durch Carragenin und Serotonin, die schließend eine solche Menge an Trichloressigsäure Diffusion von Blue Evans in den intradermalen 5 (etwa 160 g), als ausreicht, um den pH-Wert auf 1,8 zu Schwielen durch Serotonin, Dextran· und Bradykinin bringen. Der gebildete Niederschlag wurde durch sowie das Wachstum von Baumwoll-Kügelchen- Zentrifugieren entfernt, und das klare Filtrat wurde Granulomen bei der Ratte. Bei einer Dosis von 100 mg/ mit dem vierfachen Volumen an Aceton verdünnt. Der kg vermindert das untersuchte Produkt den Prozent- gebildete Niederschlag wurde durch Filtration gesamsatz an Ratten, die befallen sind, und die Schwere am io melt, mit Aceton gewaschen, unter Vakuum getrocknet Pylorus-ligation-Geschwür gemäß S h a y und an und gemahlen. Auf diese Weise wurden 47 g eines »Fast«-Geschwür. Darüber hinaus kann es die Wisder- Pulvers erhalten, welches nach Einstellung des pH-Werherstellung der Funktionsfähigkeit von entzündeten tes auf 5,7 wie im Beispiel 1 beschrieben der Papain-Gliedern (Arthritis durch AgNO₃) beschleunigen. Proteolyse unterworfen wurde. Das nach diesem Ver-Pharmacological tests on laboratory animals, repeated addition of 2N sodium hydroxide solution, have shown that this glycopeptide is kept at a dose of 8.6. At the end of this period, an inhibitory effect of 12.5, 25 or 50 mg / kg was added to the next 250 ml of 80% acetic acid and local edema due to carrageenin and serotonin, which then led to such an amount of trichloroacetic acid diffusing from Blue Evans the intradermal 5 (about 160 g) as sufficient to bring the pH to 1.8 to calluses by serotonin, dextran · and bradykinin. The precipitate formed was removed by centrifugation and growth of cotton bead, and the clear filtrate became granulomas in the rat. At a dose of 100 mg / diluted with four times the volume of acetone. The kg reduced the investigated product the percentage formed precipitate was melted by filtration of the whole of rats, which are infested, and the severity on the io, washed with acetone, dried under vacuum pyloric ligation ulcer according to S hay and on and ground. In this way, 47 g of an "almost" ulcer was found. In addition, it can contain the wisder powder, which, after adjusting the pH value, accelerates the functionality of inflamed tes to 5.7 as described in Example 1 of the papain limbs (arthritis due to AgNO ₃ ). Has been subjected to proteolysis. That after this

Die folgenden Beispiele erläutern, die Erfindung, 15 fahren erhaltene Rohprodukt wog 20 g. Dieses Pro-The following examples illustrate the invention. The crude product obtained weighed 20 g. This pro

ohne daß sie in irgendeiner Weise beschränkend dukt hatte die folgenden analytischen Werte: P = 4%;without being in any way limiting it had the following analytical values: P = 4%;

wirken. N = 6,2%.works. N = 6.2%.

Beispiel 1 B e i s ρ i e 1 3Example 1 B e i s ρ i e 1 3

10,2 kg tiefgefrorener, fettfreier Zwölffingerdarm 20 1 kg tiefgefrorener, fettfreier Zwölffingerdarm vom vom Schwein wurden in einer Fleischhackmaschine Schwein wurde in einer Fleischhackmaschine zerzerkleinert, die mit einer durchlöcherten Platte mit kleinert, welche mit einer durchlöcherten Platte ausge-Löchern von 1,1 mm Durchmesser versehen war. Das stattet war, die 1,1 mm Löcher aufwies. Das Material Material wurde in 10 Litern Wasser suspendiert und wurde in 1 Liter Wasser suspendiert und, nachdem der unter Rühren 15 Minuten lang gekocht. Während 25 pH-Wert durch Zugabe von 80%iger Essigsäure auf 4 dieser Behandlung wurde der pH-Wert der Lösung auf eingestellt worden war, unter Rühren gekocht.
9,2 gehalten, in dem wiederholt 3 η-Natriumhydroxid- Die Mischung wurde 15 Minuten lang sieden gelösung zugegeben wurde. Am Ende dieser Periode lassen. Dann wurde sie abkühlen gelassen und zentriwurde der pH-Wert durch Zugabe von 80%iger Essig- ' fugiert. Das Filtrat wurde mit 10 g Natriumacetat besäure (etwa 600 ml) auf 4,7 eingestellt. Die Mischung 30 handelt und dann mit dem vierfachen Volumen Aceton wurde auf 30° C abkühlen gelassen und nach Zugabe verdünnt. Der Niederschlag wurde durch Dekantieren von 10 Litern Aceton und 1 kg Filterhilfe filtriert, in- abgetrennt, mit Aceton gewaschen, im Vakuum gedem durch ein Tuch durchlaufen gelassen wurde. Auf trocknet und gemahlen. Es wurden so 11 g eines diese Weise wurden 22 Liter des Filtrates erhalten. Pulvers erhalten, welches der proteolytischen Papain-Diese wurden weiter verdünnt mit 55 Litern Aceton. 35 behandlung wie im Beispiel 1 beschrieben unterworfen Auf diese Weise wurde ein Produkt ausgefällt, welches wurde, nachdem der pH-Wert auf 5,7 eingestellt wordurch Dekantieren gesammelt wurde, mit Aceton ge- den war.10.2 kg of frozen, fat-free duodenum 20 1 kg of frozen, fat-free duodenum from pork were chopped up in a meat chopper Diameter was provided. That was equip that had 1.1 mm holes. The material material was suspended in 10 liters of water and was suspended in 1 liter of water and, after stirring, boiled for 15 minutes. While the pH was adjusted to 4 by adding 80% acetic acid to this treatment, the pH of the solution was boiled with stirring.
9.2 maintained by repeatedly adding 3 η-sodium hydroxide The mixture was boiling solution for 15 minutes. Leave at the end of this period. Then it was allowed to cool and the pH was centrifuged by adding 80% vinegar. The filtrate was adjusted to 4.7 with 10 g of sodium acetate (about 600 ml). The mixture is 30 and then with four times the volume of acetone was allowed to cool to 30 ° C and diluted after addition. The precipitate was filtered by decanting 10 liters of acetone and 1 kg of filter aid, separated off, washed with acetone and allowed to pass through a cloth in vacuo. On dry and ground. There was thus obtained 11 g of each of them, thus 22 liters of the filtrate were obtained. Powder obtained, which of the proteolytic papain- These were further diluted with 55 liters of acetone. 35 Subjected to treatment as described in Example 1 In this way, a product was precipitated which, after the pH value had been adjusted to 5.7 by decanting, was collected with acetone.

waschen, unter Vakuum getrocknet und gemahlen Das gemäß diesem Verfahren erhaltene Rohproduktwashing, dried under vacuum and ground The crude product obtained according to this process

wurde. Das Gewicht des so erhaltenen trockenen wog 5,2 g. Dieses Produkt hatte die folgenden analyti-became. The weight of the dry thus obtained was 5.2 g. This product had the following analytical

Pulvers betrug etwa 3 kg. , 40 sehen Werte: P = 2,5%; N = 6,03%.Powder was about 3 kg. , 40 see values: P = 2.5%; N = 6.03%.

Dieses Pulver wurde in 9 Litern Wasser dispergiert.This powder was dispersed in 9 liters of water.

Der pH-Wert der Lösung wurde mit 2 η-Salzsäure auf B e 1 s ρ 1 e 1 4
5,7 eingestellt. Dann wurden 20 g Natriumchlorid und 1 kg tiefgefrorener, fettfreier Zwölffingerdarm vom 20 g Papain zugegeben. Anschließend wurde die Schwein wurde in einer Fleischhackmaschine. zerMischung unter Rühren 24 Stunden lang auf 60° C er- 4.5 kleinert, die eine Lochplatte mit 1,1 mm Löchern enthitzt. Nach Beendigung der Papainbehandlung wurden hielt. Das Material wurde in 1 Liter Wasser suspen-50 g Filterhilfe zugegeben, und das Gemisch wurde diert und, nachdem der pH-Wert durch Zugabe von filtriert, indem es durch ein Tuch durchlaufen gelassen Trichloressigsäure auf einen Wert von 1,7 eingestellt wurde. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck worden war, auf 50° C erhitzt. Das Gemisch wurde (50 mm Hg) auf ein Volumen von 3 Litern eingeengt. 50 30 Minuten lang auf dieser Temperatur unter Rühren Anschließend wurde mit 2,7 Litern Aceton behandelt, gehalten und dann abkühlen gelassen und anschließend Es wurde auf diese Weise ein Niederschlag erhalten, zentrifugiert. Das Filtrat wurde mit 15 g Natriumder durch Dekantieren gesammelt, mit Aceton ge- acetat behandelt, und dann mit dem vierfachen waschen und unter Vakuum getrocknet wurde. Volumen Aceton verdünnt. Der Niederschlag wurdeThe pH of the solution was adjusted to B e 1 s ρ 1 e 1 4 with 2 η hydrochloric acid
5.7 set. Then 20 g of sodium chloride and 1 kg of frozen, fat-free duodenum of 20 g of papain were added. Then the pork was put in a meat mincer. The mixture is reduced to 60 ° C for 24 hours while stirring and 4.5 heats a perforated plate with 1.1 mm holes. After the papain treatment was finished, they were stopped. The material was suspended in 1 liter of water - 50 g of filter aid and the mixture was dated and, after the pH was filtered by the addition of trichloroacetic acid, adjusted to a value of 1.7 by passing it through a cloth. The filtrate was heated to 50 ° C under reduced pressure. The mixture was concentrated (50 mm Hg) to a volume of 3 liters. 50 at this temperature for 30 minutes with stirring. Thereafter, it was treated with 2.7 liters of acetone, held and then allowed to cool, and then a precipitate was obtained in this way, centrifuged. The filtrate was collected with 15 g of sodium which was collected by decantation, treated with acetone acetate, and then washed four times and dried under vacuum. Volume of acetone diluted. The precipitate was

Die Ausbeute an rohen Glycoproteinen betrug etwa 55 durch Dekantieren abgetrennt, mit Aceton gewaschen,The yield of crude glycoproteins was about 55 separated by decantation, washed with acetone,

66 g. Dieses Produkt hatte die folgenden Eigen- getrocknet und unter Vakuum gemahlen. Es wurden 66 g. This product had the following self-dried and ground under vacuum. There were

schäften: P = 3,63 %; S = 0,21 %; N = 5,91 %; so 9 g eines Pulvers erhalten, welches, wie im Beispiel 1shafts: P = 3.63%; S = 0.21%; N = 5.91%; so obtained 9 g of a powder which, as in Example 1

Acetyl-Gruppen: 7,12%; Viskosität (in 1% Lösung) beschrieben, der proteolytischen PapainbehandlungAcetyl groups: 7.12%; Viscosity (in 1% solution) described the proteolytic papain treatment

bei 20° C = 1,2699 cP; pH (1 % Lösung) = 6,9. . unterworfen wurde, nachdem der pH-Wert auf 5,7 ein-at 20 ° C = 1.2699 cP; pH (1% solution) = 6.9. . was subjected after the pH to 5.7

; ·. · . ßo gestellt worden war.; ·. ·. ßo had been put.

B e 1 s ρ 1 e 1 2 Das gemäß diesem Verfahren erhaltene RohproduktB e 1 s ρ 1 e 1 2 The crude product obtained according to this process

3,8 kg tiefgefrorene Magenschleimhaut vom Schwein wog 4,8 g.3.8 kg of frozen pig gastric mucosa weighed 4.8 g.

wurden in einer Fleischhackmaschine zerkleinert, die Dieses Produkt hatte die folgenden analytischenwere minced in a meat chopper, which This product had the following analytical

mit einer durchlöcherten Platte versehen war, welche Werte: P = 2,6%; N = 6,1%·was provided with a perforated plate, which values: P = 2.6%; N = 6.1%

Löcher von 1,1 mm Durchmesser aufwies. Das Mate- 65Had holes of 1.1 mm in diameter. The mate- 65

rial wurde in 7,5 Litern Wasser suspendiert und 15 Mi- Beispiels
nuten lang unter Rühren gekocht. Während dieser 100 g rohes Glycoprotein, wie es nach den in BeiBehandlung wurde der pH-Wert der Lösung durch spielen 1 bis 4 beschriebenen Verfahren erhalten wurde,rial was suspended in 7.5 liters of water and 15 Mi- example
utes long cooked while stirring. During this 100 g of crude glycoprotein, as it was obtained according to the method described in Treatment, the pH of the solution was obtained by playing 1 to 4,

wurden in 1 Liter Wasser suspendiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren von unlöslichen Teilen befreit, und das Filtrat wurde mit 2 n-Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt. Die so erhaltene Lösung wurde der Dialyse mit entionisiertem Wasser bei 20° C durch eine Zellulosemembran von 0,03 mm Stärke für einen Zeitraum von "48 Stunden ausgesetzt. Am Ende dieser Behandlung hatte die Lösung ein Volumen von 2 Litern erreicht. Die Lösung wurde auf das. "ursprüngliche Volumen (1000 ml) unter vermindertem Druck (50 mm Hg) konzentriert, mit 5 g Natriumchlorid behandelt und mit 1200 ml Aceton oder 2500 ml Methanol verdünnt. Der entstandene Niederschlag wurde durch Dekantieren gesammelt, mit dem für die Fällung verwendeten Lösungsmittel gewaschen, unter Vakuum getrocknet und gemahlen. Die Ausbeute betrug 69 g.were suspended in 1 liter of water. The suspension was obtained by centrifuging insoluble parts freed, and the filtrate was adjusted to pH 7.8 with 2N sodium hydroxide. The thus obtained The solution was dialysis with deionized water at 20 ° C. through a cellulose membrane of 0.03 mm Exposed to starch for a period of “48 hours. At the end of this treatment, the solution had a Volume of 2 liters achieved. The solution was reduced to its original volume (1000 ml) Pressure (50 mm Hg) concentrated, treated with 5 g of sodium chloride and with 1200 ml of acetone or 2500 ml of methanol diluted. The resulting precipitate was collected by decanting, washed with the solvent used for the precipitation, dried under vacuum and ground. The yield was 69 g.

Dieses Produkt hatte die folgenden analytischen Werte: P= kein; S = 0,25%; N = 5,81%; CH₃CO = 9,75%; Viskosität (in 1% Lösung) bei 20°C ap = 1,6409 cP; Na = 0,71%; pH (1% Lösung) = 6,3; Hexosamine = 39,2%; Uronsäuren = keine; Proteine = 16,3% (FOLIN); Hexosen = 29,5%; Neuraminsäure-Derivate 4,55 %·This product had the following analytical values: P = none; S = 0.25%; N = 5.81%; CH ₃ CO = 9.75%; Viscosity (in 1% solution) at 20 ° C ap = 1.6409 cP; Na = 0.71%; pH (1% solution) = 6.3; Hexosamine = 39.2%; Uronic acids = none; Proteins = 16.3% (FOLIN); Hexoses = 29.5%; Neuraminic acid derivatives 4.55%

Example 6

. 100 g des gemäß den in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Verfahren erhaltenen Glycoproteids wur-, 'den in 1 Liter Wasser suspendiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren von unlöslichen Anteilen befreit, und das Filtrat wurde mit 150 ml eines stark sauren, — SO₃H-Gruppen enthaltenden Kationenaustauschers auf Polystyrolbasis bei Zimmertemperatur ^u/₂ Stunde lang behandelt. Das Harz wurde dann mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen, und die Waschflüssigkeiten wurden mit der Hauptlösung vereinigt. Dann wurden 5 g Natriumchlorid zugefügt, und die Lösung wurde durch Verdünnen mit 1320 ml Aceton gefällt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Dekantieren gesammelt und 3mal mit Aceton gewaschen. Der Niederschlag wurde dann in 750 ml Wasser wieder gelöst und der pH-Wert der Lösung durch Behandlung mit 2 n-NaOH auf 6,2 eingestellt. Dann wurden 3 g Natriumacetat zugegeben, und die wäßrige Lösung wurde¹ mit dem 2,5fachen Volumen Aceton verdünnt. Dabei wurde ein Niederschlag gebildet, der durch Dekantieren gesammelt, mit Aceton gewaschen, unter Vakuum getrocknet und gemahlen wurde. Die Ausbeute betrug 67 g.. 100 g of the glycoprotein obtained according to the processes described in Examples 1 to 4 were suspended in 1 liter of water. The suspension was removed by centrifugation from insoluble components, and the filtrate was washed with 150 ml of a strongly acidic, - SO ₃ H group-containing cation exchanger based on polystyrene at room temperature ^and treated / for ₂ hour. The resin was then washed with 100 ml of distilled water and the washes combined with the main solution. Then 5 g of sodium chloride was added and the solution was precipitated by diluting with 1320 ml of acetone. The precipitate formed was collected by decantation and washed 3 times with acetone. The precipitate was then redissolved in 750 ml of water and the pH of the solution was adjusted to 6.2 by treatment with 2N NaOH. Then 3 g of sodium acetate was added and the aqueous solution was ^{diluted 1} with 2.5 times the volume of acetone. A precipitate was formed which was collected by decantation, washed with acetone, dried under vacuum, and ground. The yield was 67 g.

Bei Arbeiten in industriellem Maßstab kann die Behandlung mit dem Ionen-Austauscherharz in geeigneterer Weise mittels eines Kolonnendurchlaufs durchgeführt werden. Das Verfahren selbst wird aber ■dabei im wesentlichen nicht geändert. Das Produkt hatte die folgenden analytischen Werte: P = 0,08%; -S = 0,2%; N = 6,03%; CH₃CO = 9,34%; Na = 0,43%; pH (1% Lösung) = 6,2; Hexosamine ■= 39,5%; Uronsäuren — keine; Hexosen = 29,5%; Viskosität (in 1% Lösung) bei 2O⁰C = 1,9189 cP; Proteine (FOLIN) = 14,0%; Neuraminsäure-Derivative = 5,33%.When working on an industrial scale, the treatment with the ion exchange resin can be suitably carried out by means of a column pass. However, the procedure itself is essentially not changed. The product had the following analytical values: P = 0.08%; -S = 0.2%; N = 6.03%; CH ₃ CO = 9.34%; Na = 0.43%; pH (1% solution) = 6.2; Hexosamine ■ = 39.5%; Uronic acids - none; Hexoses = 29.5%; Viscosity (in 1% solution) at 2O ⁰ C = 1.9189 cP; Proteins (FOLIN) = 14.0%; Neuraminic acid derivatives = 5.33%.

Example 7

100 g des nach den in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Verfahren erhaltenen rohen Glycoproteids wurden in 1 Liter Wasser suspendiert. Die Suspension wurde durch Zentrifugieren von unlöslichen Anteilen befreit, und das Filtrat wurde mit 100 ml eines stark sauren Kationenaustauschers (Säureform, aktiviert mit 10% HCl) behandelt. Nach 30 Minuten langer Dauer dieser Behandlung wurde das Harz durch Filtration entfernt und mit 100 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Waschlaugen wurden- mit dem Filtrat vereinigt. Diese Lösung wurde wiederum mit 100 ml eines stark basischen Anionenaustauschers auf Polystyrolbasis mit — [NR₂Rⁱ]-Gruppen, wobei R¹ keine Methylgruppe ist (basische Form, aktiviert mit 5 % NaOH), für einen zusätzlichen Zeitraum von 30 Minuten behandelt. Das Harz wurde durch Filtration entfernt und mit 150 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeiten wurden mit dem Filtrat vereinigt, und der pH-Wert wurde durch Zugabe von ^:2 n-NaOH auf 6,2 gebracht. Dann wurden 5 g Natriumacetat zugefügt, und anschließend wurde mit dem gleichen Volumen Aceton verdünnt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Dekantieren gesammelt, mit Aceton gewaschen, im Vakuum getrocknet und gemahlen. Ausbeute: 70 g.100 g of the crude glycoprotein obtained by the process described in Examples 1 to 4 were suspended in 1 liter of water. The suspension was freed from insoluble matter by centrifugation, and the filtrate was treated with 100 ml of a strongly acidic cation exchanger (acid form, activated with 10% HCl). After 30 minutes of this treatment, the resin was removed by filtration and washed with 100 ml of distilled water. The wash liquors were combined with the filtrate. This solution was in turn treated with 100 ml of a strongly basic anion exchanger based on polystyrene with - [NR ₂ R ⁱ ] groups, where R ^{1 is} not a methyl group (basic form, activated with 5% NaOH), for an additional period of 30 minutes. The resin was removed by filtration and washed with 150 ml of distilled water. The washes were combined with the filtrate and the pH was brought to 6.2 ^{by the addition of: 2N NaOH.} Then 5 g of sodium acetate was added, followed by dilution with the same volume of acetone. The precipitate formed was collected by decantation, washed with acetone, dried in vacuo and ground. Yield: 70 g.

Beim Arbeiten im technischen Maßstab ist es bequemer, die Behandlung mit dem erwähnten Ionen^ Austauscherharz dadurch auszuführen, daß durch eine geeignete Kolonne durchlaufen gelassen wird, wobei jedoch keine wesentliche Modifikation dieses Prozesses vorgenommen wird.When working on an industrial scale, it is more convenient to use the above-mentioned ions ^ Carry out exchange resin in that is passed through a suitable column, wherein however, no substantial modification of this process is made.

Das erhaltene Produkt hatte die folgenden analytischen Werte: P = 0,04%; S = 0,11 %; Na = 0,27 %; Acetylgruppen—9,93%; N = 5,74%; Hexosamine = 40%; Uronsäuren = keine; Proteine (POLIN) = 14,5%, Hexosen = 31%; pH (1% Lösung) = 6,3; Viskosität (in 1% Lösung) bei 20°C = 1,9004; Neuraminsäure-Derivative = 5,20 %.The product obtained had the following analytical values: P = 0.04%; S = 0.11%; Na = 0.27%; Acetyl groups - 9.93%; N = 5.74%; Hexosamines = 40%; Uronic acids = none; Proteins (POLIN) = 14.5%, hexoses = 31%; pH (1% solution) = 6.3; Viscosity (in 1% solution) at 20 ° C = 1.9004; Neuraminic acid derivatives = 5.20%.

Claims

Patent claims:

1. Process for the preparation of a glycopeptide from gastric mucosa or duodenum Pigs, - d a d u r ch g ek e η η ζe i c h η et ', that the animal organs in water at 50 to 100 ° C for 10 to 45 minutes at pH 1.2 to 4.5 or 8.5 to 9.5 hydrolyzed, the acidic mucopolysaccharides are separated off by adding acid, the Fil · · entered with acetone or alcohol, the precipitate passed through after redissolving in water Enzymatically breaks down papain or trypsin and then. The glycopeptides with alcohol or Acetone precipitates.

2, method according to claim 1, thereby germinated draws that the glycopeptides obtainable according to claim 1 after redissolution in Water desalinated by dialysis or treatment with ion exchangers.