DE1517733B

DE1517733B - Process for the production of a bacterial preparation suitable for the inoculation of legume seeds

Info

Publication number: DE1517733B
Authority: DE
Inventors: Per Staffan Sodertalje Dehn (Schweden)
Original assignee: Astra AB
Current assignee: AstraZeneca AB

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zui Herstellung eines für die Impfung von Leguminosen-Samen geeigneten Bakterienpräparates. Diese frei in der Erde lebenden Bakterien besitzen die Fähigkeit, die Wurzeln von Pflanzen, die zu der Familie Leguminosae gehören, S zu befallen. Dabei bilden sich an den Wurzeln der Leguminosen Knötchen, und unter bestimmten Bedingungen kennen diese Knötchen den Stickstoff der Luft in eine organisch gebundene Form umwandeln. Diese Tatsache benutzt man in der Landwirtschaft zur Bodenverbesserung. . .The invention relates to a method of manufacture a bacterial preparation suitable for the inoculation of legume seeds. These free in the earth living bacteria have the ability to remove the roots of plants belonging to the Leguminosae family, S. to infect. In the process, nodules form on the roots of the legumes, and under certain conditions know these nodules convert the nitrogen in the air into an organically bound form. This Fact is used in agriculture for soil improvement. . .

Weiterhin ist bekannt, daß bestimmte Rhizobium-Stämme mit bestimmten Leguminosen eine Stickstoff bindende Symbiose bilden. Beispielsweise bindet Rhizobium trifoli Stickstoff mit Klee, nicht aber mit Erbsen und Wicken, und Rhizobium leguminosarum bindet Stickstoff bei Erbsen und Bohnen, nicht aber bei Klee.It is also known that certain Rhizobium strains form a nitrogen-binding symbiosis with certain legumes. For example binds Rhizobium trifoli nitrogen with clover, but not with peas and vetches, and Rhizobium leguminosarum binds nitrogen in peas and beans, but not in clover.

Die deutsche Patentschrift 1 056 082 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Azotobakter-Präparates durch Züchtung von Azotobakter-Kulturen in einem Kulturmedium und anschließende Trocknung der Bakterienkultur. Es zeigte sich aber in der Vergangenheit, daß ein entsprechendes Verfahren für die Gewinnung von Rhizobium-Präparaten nicht geeignet ist, da die Trockenpräparate ihre Aktivität ganz oder zum größten Teil verloren haben. Daher war man bisher der Auffassung, daß Phizobium-Präparate nur in feuchter Form, wie in Verbindung mit feuchter Erde oder feuchtem Torf, lagerfähig seien und in den Handel kommen könnten, nicht dagegen in der Form von Trockenpräparaten. Dies aber hatte seinerseits die. nachteilige Folge, daß mit solchen feuchten Präparaten die Leguminosen-Samen nicht vorgeimpft werden konnten, sondern das Impfen vom Landwirt selbst unmittelbar vor dem Auslegen der Saat erfolgen mußte. Dies führte nicht nur zu einer zusätzlichen Arbeitsbelastung des Landwirtes, sondern oftmals auch zu mangelhaften Ergebnissen, wenn nämlich der Landwirt nicht darauf achtete, daß die so geimpften Samen nur bei feuchtem Wetter ausgelegt werden durften, oder er versehentlich die geimpften Samen bis zum Auslegen einige Zeit liegen ließ,'so daß sie austrocknen konnten.German patent specification 1 056 082 describes a method for producing an azotobacter preparation by growing azotobacter cultures in a culture medium and subsequent drying the bacterial culture. However, it has been shown in the past that a corresponding procedure for the Obtaining Rhizobium preparations is not suitable because the dry preparations completely or their activity have lost for the most part. Therefore, it was previously of the opinion that Phizobium preparations only in moist form, such as in connection with moist earth or moist peat, can be stored and sold could come, but not in the form of dry preparations. But this in turn had the. disadvantageous consequence that the legume seeds are not pre-inoculated with such moist preparations but the farmer himself vaccinated immediately before sowing the seeds had to. This not only led to an additional workload for the farmer, but also often to unsatisfactory results, namely if the farmer did not pay attention to the fact that the seeds so inoculated were only allowed to be laid out in damp weather, or he accidentally removed the inoculated seeds until they were laid out for a while so that they could dry out.

Aus der deutschen Patentschrift 658 764 ist weiterhin ein Verfahren zur Züchtung von für die Butylalkohol-Aceton-Gärung geeigneten Bakterien bekannt, indem man nach einer Hitzebehandlung die Bakterien auf Nährböden mit alkalischer Reaktion ohne Erhitzen weiter züchtet und gegebenenfalls beide Züchtungsarten mehrere Male wiederholt. Auch hier handelt es sich aber um andere Bakterienstämme, die im Gegensatz zu Rhizobium-Bakterien zur Sporenbildung befähigt sind. Eine Übertragung dieses bekannten Ver- _ fahrens auf Rhizobium-Stämme konnte nicht nahegelegen haben, da man entsprechend den obigen Aus-. führungen der Auffassung war, daß Rhizobium-Bakterien durch Austrocknen in ihrer Gesamtheit zerstört würden.From the German patent specification 658 764 a method for the cultivation of for the butyl alcohol-acetone fermentation is furthermore suitable bacteria known by the bacteria on after a heat treatment Continue to cultivate culture media with an alkaline reaction without heating and, if necessary, repeat both cultivation types several times. Here too it is however, it is a matter of other bacterial strains which, in contrast to Rhizobium bacteria, are capable of spore formation are. A transfer of this known method to Rhizobium strains could not be obvious have, since one according to the above Aus. Leaders believed that Rhizobium bacteria would be destroyed in their entirety by drying out.

Aufgabe der Erfindung war es nunmehr, ein für die Impfung von Leguminosen-Samen geeignetes Bakterienpräparat in der Form eines Trockenpräparates zu erhalten, mit Hilfe dessen die Impfung der Leguminosen-Samen bereits beim Samenhändler erfolgen kann, was mit feuchten Präparaten nicht möglich ist, da die Samen beim Händler trockengehalten werden müssen oder wenigstens nach der Impfung wieder austrocknen.The object of the invention was now to provide a for Vaccination of legume seeds suitable bacterial preparation in the form of a dry preparation received, with the help of which the legume seeds can be vaccinated at the seed dealer, which is not possible with moist preparations, as the seeds have to be kept dry at the dealer or at least dry out again after the vaccination.

Die Erfindung baut nun auf der Erkenntnis auf, daß innerhalb einer Population von Rhizobium-Bakterien ein Unterschied der Fähigkeit, trockenen und heißen Bedingungen zu widerstehen, vorliegt und daß Rhizobium-Bakterien als unterschiedliche Stämme verschiedener Widerstandsfähigkeit auftreten.The invention is now based on the knowledge that within a population of Rhizobium bacteria there is a difference in the ability to withstand dry and hot conditions and that Rhizobium bacteria occur as different strains of different resistance.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung eines für die Impfung von Leguminosen-Samen geeigneten Bakterien-Präparates ist dadurch gekennzeichnet, daß man Rhizobium-Bakterien mit guten Befall- und Stickstoffbindungsfähigkeiten in Verbindung mit einer bestimmten Leguminosen-Art in an sich bekannter Weise auf einem Kulturmedium züchtet, die so erhaltene Bakterienkultur bei einer Temperatur von höchstens 95° C trocknet und sodann das Züchten und Trocknen der Bakterienkultur wenigstens noch einmal wiederholt. Zweckmäßig trocknet man jeweils mindestens 7 Tage.The method according to the invention for the production of a suitable for the inoculation of legume seeds Bacterial preparation is characterized in that one Rhizobium bacteria with good Infestation and nitrogen fixation abilities in connection with a certain type of legume in cultivates in a manner known per se on a culture medium, the bacterial culture thus obtained in a Temperature of at most 95 ° C dries and then the cultivation and drying of the bacterial culture at least repeated once more. It is advisable to dry for at least 7 days.

Günstigerweise wird das Züchten und Trocknen so oft wiederholt, bis mindestens 90°/„ der Bakterien beim Trocknen an Luft überleben. Das Trocknen kann beispielsweise durch Überführen der Bakterienkultur auf ein Trockenmittel, beispielsweise mit hygroskopischen Eigenschaften, wie Kieselsäuregel, durchgeführt werden. Auch können andere herkömmliche Trockenverfahren angewendet werden, wie beispielsweise Belüften mit einem geeigneten, gegebenenfalls erhitzten Gas oder Gasgemisch oder auch Vakuumtrocknen oder Sprühtrocknen. Auch kann man, wenn erwünscht, Wärmestrahlung allein oder in Verbindung mit einer anderen Methode anv enden. Schließlich ist es auch möglich, Ultraviolettlichttestrahlung anzuwenden, wobei man gegen Sonneneinstrahlung resistente Bakterienpräparate erhält.The cultivation and drying are expediently repeated until at least 90% of the bacteria survive drying in air. The drying can be carried out, for example, by transferring the bacterial culture on a desiccant, for example with hygroscopic properties, such as silica gel will. Other conventional drying methods such as aeration can also be used with a suitable, optionally heated gas or gas mixture or vacuum drying or spray drying. If desired, thermal radiation can also be used alone or in conjunction with a use another method. Finally, it is also possible to use ultraviolet light radiation, whereby bacterial preparations resistant to solar radiation are obtained.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand einiger Beispiele weiter erläutert.In the following the invention is further illustrated by means of a few examples.

Eine Zahl von Rhizobium-Stämmen aus verschiedenen Impfgruppen ist in den unten aufgeführten Tabellen gezeigt, wobei alle gute Befall- und Stickstoffbindungsfähigkeiten in Verbindung mit der verwendeten Leguminosen-Art besaßen. Diese Stämme wurden getrennt auf Kulturmedien nach Dorn gezüchtet (s. beispielsweise Marta Dorn: Über den Einfluß phytopathogener Pilze auf die Entwicklung und Infektionskraft von drei Rhizobium-Arten, Zentralblatt für Bakteriologie, 109, S. 120, 1956). Die Stämme wurden dann unter aseptischen Bedingungen auf der einen Seite von semipermeablen Membranen verschmiert; die Membranen wurden dann mit der beschmierten Seite nach oben auf das gleiche Kulturmedium gelegt, dem 2°/₀ Agar-Agar zugesetzt war, um ein festes Kulturmedium zu erhalten. Nach 3- bis 5tägiger Bebrütung bei 28° C wurden die Membranen mit der daranhängenden Bakterienmasse unter aseptischen Bedingungen in halb mit trockenem Kieselsäuregel mit Feuchtigkeitsindikator gefüllte Präparatröhren übergeführt,'-in denen man die Bakterien 2 Tage bei 28° C trocknen ließ, worauf die Temperatur dann auf 70° C gesteigert und 7 Tage auf dieser Höhe gehalten wurde. Die Membranen mit den Bakterien wurden dann wieder auf Agar-Platten mit Doms Kulturmedium gebracht, wobei die die Behandlung überlebenden Bakterien sich vermehrten und Kolonien bildeten. Diese wurden als Mutterkulturen für das zur Impfung von Leguminosen-Samen verwendete Material und die nachfolgenden Vergleichsversuche benutzt. Natürlich ist es auch möglich, das Verfahren zu wiederholen, und die Zeit sowie auch die Temperatur der Behandlung können variiert werden, je nach der speziellen Resistenz des AusgangsmaterialsA number of Rhizobium strains from different vaccination groups are shown in the tables below, all of which had good infestation and nitrogen-fixing abilities in connection with the legume species used. These strains were grown separately on culture media according to Dorn (see for example Marta Dorn: On the influence of phytopathogenic fungi on the development and infectious power of three Rhizobium species, Zentralblatt für Bakteriologie, 109, p. 120, 1956). The logs were then smeared on one side of semipermeable membranes under aseptic conditions; the membranes were then placed with the smeared side up on the same culture medium to which 2 ° / ₀ agar was added to obtain a solid culture medium. After 3 to 5 days of incubation at 28 ° C, the membranes with the bacterial mass attached were transferred under aseptic conditions to preparation tubes half filled with dry silica gel with a moisture indicator, in which the bacteria were allowed to dry for 2 days at 28 ° C, whereupon the temperature then increased to 70 ° C and held at this level for 7 days. The membranes with the bacteria were then placed back on agar plates with Dom's culture medium, whereby the bacteria that survived the treatment multiplied and formed colonies. These were used as mother cultures for the material used for inoculating legume seeds and the subsequent comparative experiments. Of course, it is also possible to repeat the process, and the time as well as the temperature of the treatment can be varied, depending on the specific resistance of the starting material

und der erwünschten Resistenz des Bakterienpräparates. and the desired resistance of the bacterial preparation.

Nun wurde ein Vergleich zwischen den Ausgangsstämmen und dem so nach der Erfindung erhaltenen Bakterienpräparat durchgeführt. Die Bakterien wurden unter aseptischen Bedingungen in der zehnfachen Menge Wasser mit einer geeigneten Menge von inertem Klebstoff, in diesem Fall Montmorillonit oder Äthyl-hydroxyäthylcellulose, suspendiert. Diese Suspensionen wurden dann auf Samen und im Laboratorium auf Glasperlen mit einem Durchmesser von 2 mm untersucht. Durch die Zugabe von Klebstoff haften die Bakterien gut an den Samen und Glasperlen an. Die Glasperlen wurden an Stelle von Samen verwendet, wenn man quantitative Messungen der Abtötungsgeschwindigkeit unter Laboratoriumsbedingungen durchführte. Die Samen wurden verwendet, wenn man die Bildung von Knötchen und die Stickstoff-Fixierung untersuchte.A comparison was now made between the starting strains and that obtained in accordance with the invention Bacterial preparation carried out. The bacteria were aseptic in ten fold Amount of water with a suitable amount of inert glue, in this case montmorillonite or Ethyl hydroxyethyl cellulose, suspended. These suspensions were then on seeds and in the laboratory on glass beads with a diameter of 2 mm examined. By adding glue, the bacteria adhere well to the seeds and glass beads on. The glass beads were used in place of seeds when making quantitative measurements of the Killing rate performed under laboratory conditions. The seeds were used when examining nodule formation and nitrogen fixation.

Die oben gezeigten Versuche auf Glasperlen ergaben die folgenden Ergebnisse:The experiments on glass beads shown above gave the following results:

Zur Untersuchung des Selektionseffektes des Verfahrens nach der Erfindung wurde die Zeit der Abtötung von 99°/₀ verschiedener in der unten aufgeführten Tabelle angegebener Rhizobium-Stämme für den unbehandelten Ausgangsstamm und für einen bei 70⁰C während 7 Tagen selektierten Stamm bestimmt. Suspensionen der einzelnen Bakterienkulturen wurden auf Glasperlen mit 2 mm Durchmesser unter aseptischen Bedingungen übergeführt, dann ließ man sie trocknen und bei 28°C und einer relativen Feuchtigkeit von 50 bis 70°/₀ stehen. Verschiedene Suspensionen von unterschiedlicher Verdünnung wurden von jedem untersuchten Stamm hergestellt, da die Ausgangskulturen viel zu konzentriert waren. Die Ausgangskultur wurde auf das Zehnfache verdünnt, wobei Verdünnungen von 10⁵, 10⁶, 10⁷ und 10⁸ schätzungsweise eine Menge von 10000, 1000, 100 und 10 Zellen pro Milliliter ergaben. Jede Verdünnung war also zehnmal stärker als die vorangehende Verdünnung. Jeweils von dem unbehandelten Stamm und dem nach der Erfindung erhaltenen Bakterienpräparat wurden vier Suspensionen hergestellt, d. h. zusammen acht Suspensionen je untersuchten Rhizobium-Stamms. Jede Suspension wurde in einer Menge von 2,0 ml über 70 g (= etwa 3500 Stück) Glasperlen in einem 500-ml-Erlenmeyer-Kolben verteilt, der während der Versuchszeit von mehr als 2 Monaten bei 28°C und einer Feuchtigkeit von 50 bis 70°/₀ stehengelassen wurde. Unmittelbar am Anfang und in Intervallen von 7 bis 10 Tagen wurden Proben von etwa 100 Glasperlen von jedem Präparat abgezogen. Die Zahl lebender Zellen in jeder Probe wurde durch Lebendauszählung bestimmt (s. beispielsweise R. A. St a η ie r, M. Doudoroff und E. A. Adelberg, General Microbiology, MacMillan & Co., London, 1958).To investigate the selection effect of the method according to the invention, the time of killing was 99 ° / ₀ of different specified in the table below Rhizobium strains determined for the untreated starting strain and for a selected at 70 ⁰ C for 7 days strain. Suspensions of the individual bacterial cultures were transferred to glass beads 2 mm in diameter under aseptic conditions, then allowed to dry and stand _{at 28 ° C. and a relative humidity of 50 to 70 ° / 0.} Different suspensions of different dilutions were made from each strain examined, since the starting cultures were far too concentrated. The starting culture was diluted ten fold, with dilutions of 10 ⁵ , 10 ⁶ , 10 ⁷ and 10 ⁸ producing an estimated amount of 10,000, 1000, 100 and 10 cells per milliliter. Each dilution was ten times stronger than the previous dilution. Four suspensions were produced for each of the untreated strain and the bacterial preparation obtained according to the invention, ie a total of eight suspensions for each examined Rhizobium strain. Each suspension was distributed in an amount of 2.0 ml over 70 g (= about 3500 pieces) of glass beads in a 500 ml Erlenmeyer flask, which was stored at 28 ° C and a humidity of 50% for the test period of more than 2 months until 70 ° / _{0 was left to} stand. Immediately at the beginning and at 7-10 day intervals, samples of approximately 100 glass beads were withdrawn from each preparation. The number of living cells in each sample was determined by live counting (see, for example, RA St a η ie r, M. Doudoroff and EA Adelberg, General Microbiology, MacMillan & Co., London, 1958).

Die Glasperlen einer Probe wurden jeweils mit 5 ml Wasser unter aseptischen Bedingungen ¹Z₂ Stunde geschüttelt, wobei sich die Zellen von den Glasperlen lösten und in die Wasserphase gingen. Bestimmte Mengen dieser 5 ml wurden dann auf der Oberfläche von Agar-Kulturplatten verteilt, und man ließ die einzelnen Zellen zu sichtbaren Kolonien auf den Platten wachsen. Aus der Zahl der Kolonien auf den Platten, der Zahl der Glasperlen der Probe und der pro Platte verwendeten Menge der 5-ml-Wasserphase wurde die Zahl der lebenden Bakterien pro Glasperle der
rechnet:The glass beads of a sample were each shaken with 5 ml of water under aseptic conditions for ¹ Z ₂ hours, during which the cells detached from the glass beads and went into the water phase. Certain amounts of these 5 ml were then spread on the surface of agar culture plates, and the individual cells were allowed to grow into visible colonies on the plates. The number of living bacteria per glass bead was determined from the number of colonies on the plates, the number of glass beads in the sample and the amount of the 5 ml water phase used per plate
calculates:

Probe nach der folgenden Formel .be?Sample according to the following formula .be?

η =η =

M a-b M from

worin η die Zahl der lebenden Bakterien pro Glasperle der Probe, M die Zahl der Kolonien pro Platte, α die Zahl der Glasperlen der Probe und b die auf der Platte verteilte Menge der 5-ml-Wasserphase bedeutet. Die Versuchsbedingungen wurden so gewählt, daß M zwischen 10 und 200, α in der Größenordnung von 100 und b 0,1, 0,01, 0,001 oder 0,0001 ist. Durch Bestimmung von η unmittelbar nach der Behandlung der Glasperlen mit den Bakteriensuspensionen erhielt man auf diese Weise einen Ausgangswert n₀ zum Zeitpunkt 0 für die verschiedenen Stämme. Wiederholte Bestimmungen von η wurden dann in Intervallen von 7 bis 10 Tagen durchgeführt. Da die Bakterien nach und nach auf den Glasperlen absterben, hatte man zu erwarten, daß nach einer bestimmten Zeit η — 0,01 · K₀ wird. Dies bedeutet, daß nur 1 °/o der zum Zeitpunkt 0 lebende'n Zellen noch am Leben war oder daß die Bakterien zu 99 °/o abgetötet wurden.where η is the number of living bacteria per glass bead of the sample, M is the number of colonies per plate, α is the number of glass beads of the sample and b is the amount of 5 ml water phase distributed on the plate. The experimental conditions were chosen so that M is between 10 and 200, α is in the order of 100 and b is 0.1, 0.01, 0.001 or 0.0001. By determining η immediately after the treatment of the glass beads with the bacterial suspensions, an initial value n ₀ at time 0 was obtained for the various strains. Repeated determinations of η were then made at intervals of 7 to 10 days. Since the bacteria gradually die on the glass beads, one had to expect that after a certain time η - 0.01 · K ₀ . This means that only 1% of the cells living at time 0 were still alive or that 99% of the bacteria were killed.

_Je länger es dauert, daß dieser Abtötungsgrad erreicht wird, desto resistenter ist das Bakterienpräparat. Die folgende Tabelle I, in der die Zeiten in Tagen zur 99^O/_Oigen Abtötung, für verschiedene Stämme angegeben sind, zeigt, daß die nach der Erfindung hergestellten Bakterienpräparate viel resistenter und besser als die Ausgangsstämme sind, mit Ausnahme des Luzerne-Stammes, der schon bei Beginn eine große Resistenz besitzt._The longer it takes for this degree of destruction to be achieved, the more resistant the bacterial preparation is. The following Table I in which the times of strength in days for the 99 ^O / _O kill, are given for various strains shows that the bacterial preparations produced according to the invention, and are much more resistant better than the starting strains, with the exception of alfalfa strain which has a high level of resistance right from the start.

. Tabelle I. Table I. 3535 - -- - Rh. japonicum,Rh. Japonicum, Ausgangs-
stsmmInitial
stsmm Bakterien
präparat nachbacteria
preparation after 4° Sojastamm4 ° soy strain der Erfindungthe invention Rh. m^Iiloti, LuzerneRh. M ^ Iiloti, alfalfa 88th 5555 Rh. trifoli, KleestammRh. Trifoli, clover stem Rh. leguminosarum,Rh. Leguminosarum, 6565 6565 Erbsen-Wicken-StammPea vetch trunk 2020th 6565 45 Rh. phaseoli, Bohnen45 Rh.phaseoli, beans 88th 5555 stammtribe Rh. lupini, LupinenstammRh. Lupini, stem of lupine 88th 4646 77th 2222nd

Vergleichende Kulturversuche auf Samen wurden in der folgenden Weise durchgeführt:Comparative culture experiments on seeds were carried out in the following manner:

Stämme von drei Rhizobiumarten, Rhizobium trifoli, Rhizobium meliloti und Rhizobium leguminosarum, wurden als unbehandelte Ausgangsstämme als Rt, Rm und Rl sowie nach 7tägiger Selektierung nach der Erfindung bei 7O⁰C als Rt 7, Rm 7 und Rl 7 untersucht. Samen wurden zur Zeit 0 mit einer verdünnten Suspension der Ausgangsstämme und Bakterienpräparate nach der Erfindung geimpft, und von den getrockneten Samen wurde eine bestimmte Zahl verwendet, um verschieden lange vom Zeitpunkt 0 an zu wachsen. In jedem Fall wurden Proben zur Abschätzung der Bakterienzahl pro Samen entnommen. Die Zahl der gewachsenen Pflanzen, die Knötchen zeigten, wurde aufgezeichnet. In Tabelle II sind die Ergebnisse von sechs solchen Experimenten aufgezeichnet. In der letzten Spalte eines jeden Experimentes ist die Zahl lebender Bakterien pro Samen in bestimmten Zeitabständen nach der Impfung wieder-Strains of three Rhizobium species, Rhizobium trifoli, Rhizobium meliloti and Rhizobium leguminosarum were examined as untreated parent strains as Rt, Rm and Rl and after 7 days triage according to the invention at 7O ⁰ C as Rt 7, Rm and Rl 7. 7 Seeds were inoculated at time 0 with a dilute suspension of the starting strains and bacterial preparations according to the invention, and a certain number of the dried seeds was used to grow for different times from time 0. In each case, samples were taken to estimate the number of bacteria per seed. The number of plants grown showing nodules was recorded. Table II shows the results of six such experiments. The last column of each experiment shows the number of living bacteria per seed at certain time intervals after vaccination.

gegeben. Die entsprechenden rechten Spalten geben die Zahl der Pflanzen von zehn Pflanzen wieder, die eine Knötchenbildung zeigten.given. The corresponding right-hand columns show the number of plants out of ten plants that showed nodulation.

Das Ergebnis in der Tabelle zeigt, daß es mit erfindungsgemäß erhaltenen Bakterienpräparaten möglich ist, Knötchenbildung nach einer beachtlich längeren Zeit zwischen Impfung und Aussäen zu erhalten als mit dem entsprechenden unbehandelten Ausgangsstamm. The result in the table shows that it is possible with bacterial preparations obtained according to the invention is to maintain nodule formation after a considerably longer time between inoculation and sowing than with the corresponding untreated parent strain.

Table II

(Fortsetzung Tabelle II)(Continuation of Table II)

TageDays

nachafter

derthe

Impfungvaccination

Zahl der
Bakterien
pro Samennumber of
bacteria
per seed

Pflanzenplant

mitWith

Rnötchen
pro zehn
PflanzenRoll
per ten
plant

Zahl der Bakterien pro SamenNumber of bacteria per seed

Pflanzenplant

mitWith

Knötchen pro zehn PflanzenNodules per ten plants

Samen von Trif olium pratense, Klee I Rt 1 Rt 7Seeds of Trif olium pratense, clover I Rt 1 Rt 7

Samen von Medicago sativa, Luzerne I Rm I Rm7Medicago sativa seeds, alfalfa I Rm I Rm7

11 8-10*8-10 * 99 2-10⁵ 2-10 ⁵ 1010 1010 00 00 l-10^s l-10 ^s 1010 2020th —- 00 8-10*8-10 * 99 3030th 7-10*7-10 * 1010 4040 6-10*6-10 * 99 9090 —- 88th

11 5 · 10⁴ 5 · 10 ⁴ 1010 7-10*7-10 * 1010 1010 2-10² 2-10 ² 66th 9-10³ 9-10 ³ 1010 2020th 00 00 2-10³ 2-10 ³ 1010 3030th —- 00 7-10² 7-10 ² 1010 4040 3-10² 3-10 ² 88th 9090 —- 77th

TageDays

nachafter

Impfungvaccination

Zahl der
Bakterien
pro Samennumber of
bacteria
per seed

Pflanzenplant

mitWith

Knötchen
pro zehn
PflanzenNodules
per ten
plant

Zahl der
Bakterien
pro Samennumber of
bacteria
per seed

Pflanzenplant

mitWith

Knötchen
pro zehn
PflanzenNodules
per ten
plant

Samen von Pisum sativum, Erbse
I Rl I R17Seeds of Pisum sativum, pea
I Rl I R17

11 2-10⁶ 2-10 ⁶ 1010 5-10*5-10 * 99 1010 4-10*4-10 * 22 2-10*2-10 * 1010 2020th 5-10³ 5-10 ³ 00 2-10*2-10 * 1010 3030th 00 1-10*1-10 * 88th 4040 8-10³ 8-10 ³ 77th 9090 —- 55

Claims

Patent claims:

1. Process for the production of a'for vaccination bacterial preparation suitable for legume seeds, characterized in that that one associates Rhizobium bacteria with good infestation and nitrogen-binding abilities with a certain legume species in a manner known per se on a culture medium cultivates, drying the bacterial culture obtained in this way at a temperature not exceeding 95 ° C and then repeating growing and drying the bacterial culture at least one more time.

2. The method according to claim 1, characterized in that one in each case at least 7 days dries.