DE1492145A1

DE1492145A1 - Process for the fermentative production of tetracycline

Info

Publication number: DE1492145A1
Application number: DE1965S0097588
Authority: DE
Inventors: Slavomil Hejdanek; Palkoska Dipl-Ing Josef; Stejskal Dr Josef; Culik Dr Karel; Herold Dipl-Ing Milos
Original assignee: Spofa Vereinigte Pharma Werke
Current assignee: Spofa Vereinigte Pharma Werke
Priority date: 1964-06-13
Filing date: 1965-06-11
Publication date: 1969-07-17
Also published as: DK109922C; NL6507555A; GB1106628A; CH461027A; FR1449736A; AT263213B; BE665377A; BR6570384D0

Description

PatentanwaltPatent attorney Dip!.Phys.Dr.WaiihsrJunlus ¹⁶' f^{11 1968} Dip! .Phys.Dr.WaiihsrJunlus ¹⁶ 'f ^{11 1968}

3 Hannover, Abbes*, ao ^r · J/Ha.3 Hanover, Abbes *, ao ^ r · J / Ha.

Aktenzeichen: P H 92 145. O
Anmelder ί Spofa ...
Mein Zeichen: 9839File number: PH 92 145. O
Applicant ί Spofa ...
My reference: 9839

Verfahren zur fermentativen Herstellung von TetracyclinProcess for the fermentative production of tetracycline

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Tetracyclin durch Kultivierung von Chlortetracyclin sowie auch Tetracyclin erzeugenden Mikroorganismen des Genus Streptomyces in einem flüssigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen_; Mineralnährsalze, Halogenierungsinhibitoren und Stimulatoren, wie Benzylrhodanid in einer Menge von 2-15 mcg/ml enthält.The present invention relates to a method for the fermentative production of tetracycline by cultivating chlortetracycline and also tetracycline-producing microorganisms of the genus Streptomyces in a liquid nutrient medium which contains assimilable carbon and nitrogen sources _; Mineral nutrient salts, halogenation inhibitors and stimulators such as benzyl rhodanide in an amount of 2-15 mcg / ml.

Dieses Antibiotikum wird teils auf chemischem Wege durch Dechlorierung des Chlortetracycline gewonnen, teils biosynthetisch mit Hilfe von geeigneten Produktionsmikroorganismen erzeugt. Einige Actinomyceten produzieren z.B. in üblichen Kultivierungsmedien, welche Chloride enthalten, überwiegend Tetracyclin (britisches Patent Nr. 787 895). Es sind ferner Verfahren beschrieben worden, bei welchen die Mikroorganis--This antibiotic is obtained partly chemically by dechlorination of the chlortetracycline, partly biosynthetically generated with the help of suitable production microorganisms. For example, some actinomycetes produce in usual Culture media containing chlorides, predominantly tetracycline (British Patent No. 787 895). There are also Process have been described in which the microorganism

909829/1361 - 2 -^{8AD 0R1G}'^NAL 909829/1361 - 2 - ^{8AD 0R1G} ' ^NAL

H92U5H92U5

men der Actinomycetengruppe, die überwiegend Chlortetracyclin neben Tetracyclin erzeugen, durch gewisse Eingriffe in die Zusammensetzung des Nährmediums oder in den Produktionsmetabolismus zur Herabsetzung der Chlortetracyclinbildung und zur Steigerung der Tetracyclinbildung geführt werden. Da die Chlortetracyclinbildung durch Gegenwart von Chloriden im Nährmedium bedingt ist, kann man den entsprechenden Eingriff verhältnismäßig einfach so durchführen, daß man als Nährmediumbestandteile solche Stoffe auswählt, welche einen besonders niedrigen Chloridgehalt aufweisen. Ein gewisser Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, daß die meisten Nährmediumbestandteile, welche für die Höhe der Gesamtproduktion der Tetracyclinantibiotika von Grundbedeutung sind, eine beträchtliche Chloridmenge enthalten. Die Ersetzung dieser Bestandteile, bzw. die Zubereitung eines synthetischen chloridfreien Mediums oder Verwendung von anderen Rohstoffen mit einem besonders niedrigen Chloridgehalt führt zu niedrigeren Ausbeuten (USA-Patent Nr. 2 734 018). Üblicherweise wird deshalb der Chloridgehalt des Nährmediums nur teilweise herabgesetzt und dem Nährmedium werden Chlorierungsinhibitoren, z»B. Kaliumbromid, zugegeben. Auf demselben Prinzip beruhen die Methoden, bei welchen entweder das Nährmedium oder seine einzelnen Bestandteile durch geeignete Chlorionenentfernungsverfahren behandelt werden. So z.B. führt die Fällung der Chlorionen mit Hilfe von Silber- oder QuaDksilberionen tatsächlich zur Verminderung ihrer Konzentration, gleichzeitigmen of the actinomycete group, the predominantly chlortetracycline produce in addition to tetracycline, through certain interventions in the composition of the nutrient medium or in the production metabolism led to a reduction in chlorotetracycline formation and to an increase in tetracycline formation will. Since the chlortetracycline formation by presence is caused by chlorides in the nutrient medium, the corresponding intervention can be carried out relatively easily, that one selects as nutrient medium constituents those substances which have a particularly low chloride content. A certain disadvantage of this method is that most of the nutrient medium components, which for the The amount of total tetracycline antibiotic production, which is of primary importance, contains a significant amount of chloride. The replacement of these components, or the preparation of a synthetic chloride-free medium or Using other raw materials with a particularly low chloride content leads to lower yields (USA patent No. 2 734 018). The chloride content of the nutrient medium is therefore usually only partially reduced and the nutrient medium are chlorination inhibitors, eg. Potassium bromide, added. The methods are based on the same principle, in which either the nutrient medium or its individual components are treated by suitable chlorine ion removal processes. For example, the precipitation of the Chlorine ions with the help of silver or quaDksilver ions actually to decrease their concentration, at the same time

9 0 9 8 2 9 / 1 3 8 1 BAD ORlG^lNAL - 3 -9 0 9 8 2 9/1 3 8 1 BAD ORlG ^INAL - 3 -

H92H5H92H5

aber tritt das technische Problem der Entfernung von überschüssigen toxischen Silber- und Quecksilberionen auf, wodurch die Wirtschaftlichkeit dieses Prozeeses beeinträchtigt wird (USA-Patent Nr. 2 790 946? britisches Patent Nr. 773 453).but there is the technical problem of removing excess toxic silver and mercury ions on, which affects the economy of this process (U.S. Patent No. 2,790,946? British Patent No. 773,453).

Bei anderen Arbeitsweisen, welche sich zur Verminderung des Chlorionengehaltes der Ionenaustauscherharze bedienen, kommt es vor, daß gleichzeitig mit den Chlorionen auch Salzanione und organische Substanzen unbekannter Zusammensetzung entfernt werden? infolgedessen können wieder geringere Gesamtausbeuten an Antibiotika auftreten.In other working methods that use ion exchange resins to reduce the chlorine ion content, it happens that simultaneously with the chlorine ions also salt anions and organic substances of unknown composition be removed? as a result, lower overall yields of antibiotics can occur again.

Ein weiteres Verfahren, welches die Chlortetracyclinbildung während der Fermentation unterdrückt und die Tetracyclinbildung erhöht, beruht im Zusatz von Bromiden (USA-Patent Nr. 2 739 924), Fluoriden (französisches Patent Nr. 1 232 928) oder von bromierten organischen Verbindungen, wodurch die Ausnutzung der Chloride durch den Produktionsmikroorganismus gehindert wir d. Die Gegenwart von einer größeren Bromidmenge im fermentierten Medium hat die Bildung des Bromtetracyolins zur Folge, welohes aber eine unerwünschte Verunreinigung darstellt.Another method that suppresses the formation of chlortetracycline during fermentation and the formation of tetracycline increased, based on the addition of bromides (USA patent No. 2,739,924), fluorides (French patent No. 1,232,928) or of brominated organic compounds, thereby reducing the utilization of the chlorides by the production microorganism we hindered d. The presence of a larger amount of bromide in the fermented medium leads to the formation of the Bromtetracyolins result, which is an undesirable one Represents pollution.

Hohe, zur Erreichung von beinahe ausschließlicher Tetracyclinproduktion erforderliche Bromidkonzentrationen wirken schon auf den Mikroorganismus toxisch und erniedrigen die Ausbeute (USA-Patent Nr. 2 739 924). Bei der FermentationHigh, to achieve almost exclusive tetracycline production required bromide concentrations already have a toxic effect on the microorganism and reduce the Yield (U.S. Patent No. 2,739,924). During fermentation

909829/1381 , ^₁₁. _M 909829/1381, ^ ₁₁ . _M.

" ⁴ " BAD ORlGWAL" ⁴ " BAD ORIGWAL

H92U5H92U5

mit bromierten organischen Verbindungen* muß mit höheren Kosten bei der Herstellung dieser Rohstoffe gereohnet werden. with brominated organic compounds * must with higher Costs are incurred in the production of these raw materials.

Sehr verbreitet ist auch das Verfahren, welohes sich zur Chlorierungsinhibition der chemisch definierbaren ötickstoff- und auch überwiegend schwefelhaltigen organischen Verbindungen bedient. Es ist eine Reihe solcher als Ohlorierungsinhibitoren geeigneter Verbindungen bekannt. Man kann mit Hilfe derselben eine merkwürdige Verschiebung der Antibiotikaproduktion zugunsten des hohen Tetraoyelingehaltes erzielen. Da es zur Erreichung fast ausschließlicher Tetracyclinproduktion durch Einwirkung genannter Inhibitoren notwendig ist, dieselben in das Medium in einer solchen Konzentration, welche schon den Produktionsmikroorganismus toxisch beeinflusst, zuzugeben, kombiniert man üblicherweise die Einwirkung dieser Inhibitoren mit einem schon genannten Chlorierungsinhibitionsverfahren (australisches Patent Nr. 222 312). Es wurden auch direkte Fermentationsverfahren zur Gewinnung des Tetracycline beschrieben, und zwar in Nährmedien, welche das entfettete Mehl aus Baumwollsamenendosperm in Kombination mit deionisiertem Maisextrakt und Bäckerhefe enthalten (USA-Patent Nr. 2 763 591), wobei die Ausbeuten unter Anwendung von entchloriertem Maisextrakt mehr als zweimal so hoch sind als ohne diesen Rohstoff. Es ist auch eine ähnliche Anwendung (USA-Patent Nr. 2 776 des Mehles aus Baumwollsamenendoeperm und Bäckerhefe in. Kombination mit zwei weiteren stickstoffhaltigen Rohstoffen,The procedure which is used for Chlorination inhibition of the chemically definable nitrogen and also mainly used sulfur-containing organic compounds. There are a number of such as chlorination inhibitors suitable compounds known. With the help of this one can see a remarkable shift in the production of antibiotics in favor of the high tetraoyelin content. As it is used to achieve almost exclusive tetracycline production by the action of said inhibitors is necessary, the same in the medium in such a Adding a concentration that has a toxic effect on the production microorganism is usually combined the action of these inhibitors with an already mentioned chlorination inhibition process (Australian patent No. 222 312). Direct fermentation processes have also been used for the production of the tetracycline described, in nutrient media, which the defatted flour from cottonseed endosperm in combination with deionized corn extract and baker's yeast (USA Patent No. 2,763,591), the Yields using dechlorinated corn extract are more than twice as high as without this raw material. There is also a similar application (U.S. Patent No. 2,776 of the flour from cottonseed doeperm and baker's yeast in. Combination with two other nitrogenous raw materials,

909829/1381909829/1381

U92U5U92U5

und zwar mit Sojabohnenmehl und Maiskeimmehl beschrieben· Der Unterschied im Einfluß der einzelnen Rohstoffe wird in diesem Falle nicht hervorgehoben und ihr Chlorionengehalt ist auch nicht angeführt, es scheint jedoch, daß die Kombination von mehreren Stickstoffquellen mit Erfolg, was den Nährwert betrifft, den Maisextrakt, der wegen seines hohen Chlorionengehaltes entchloriert werden mußte, zu ersetzen vermag.namely with soybean meal and corn flour described · The difference in the influence of the individual raw materials is in this case not emphasized, nor is their chlorine ion content given, but it appears that the combination of several nitrogen sources with success, as far as the nutritional value is concerned, the corn extract, which had to be dechlorinated because of its high chlorine ion content, too able to replace.

Im französischen Patent Nr. 1 279 692 wird ein Verfahren beschrieben, welches für den Streptomyces-Stamm Nr. 88 spezifisch ist. Bei der Kultivierung dieses Stammes wird der Tetracyclinanteil an der Gesamtproduktion allgemein durch Zugabe des Hafermehls erhöht. Die Zahlenangaben über die Erhöhung fehlen, gemäß Angaben über die Ausbeuten des Tetracycline nach der Isolierung scheint jedoch das Verhältnis von Tetracyclin zu Chlortetracyclin nioht zu hoch zu sein.In French patent no. 1,279,692 a method which is specific for Streptomyces strain # 88. When cultivating this strain will the tetracycline proportion of total production is generally increased by adding the oatmeal. The figures above the increase is absent, but according to information on the yields of the tetracycline after isolation, the ratio seems to be from tetracycline to chlortetracycline not to be too high.

Wie ferner bekannt ist, beeinflusst die Auswahl der Stickstoffquelle die Biosynthese des Tetracycline auch in entgegengesetzter Richtung, durch Zugabe des Erdnussmehles kann man im Gegenteil die Erhöhung der Chlortetracyclinproduktion zum Nachteil des Tetracyolins erzielen. Der Mechanismus des Einflusses der Stickstoffquellen auf die Förderung oder Hemmung der Chlorierung des Tetracyclinmoleküls ist nirgends in den genannten Literaturangabe erörtert, wenn auch klarAs is also known, the selection of the nitrogen source affects the biosynthesis of the tetracycline also works in the opposite direction, by adding the peanut flour you can on the contrary, the increase in chlortetracycline production to the detriment of tetracyoline. The mechanism the influence of nitrogen sources on the production or Inhibition of the chlorination of the tetracycline molecule is nowhere discussed in the cited references, albeit clearly

9 0 9 8 2 9/1381 ~ ⁶ _B*D9 0 9 8 2 9/1381 ~ ⁶ _B * D

U92U5U92U5

ist, daß die Hauptrolle der natürliche Chlorionengehalt der benutzten Stickstoffquelle spielt.is that the main role is played by the natural chlorine ion content of the nitrogen source used.

Pur die Tetracyclinerzeugung wurden noch weitere Quellen des organisch gebundenen Stickstoffs empfohlen (USA-Patente Nr. 2 739 924, 2 949 406, 2 763 591), z.B. Kasein, hydrolysiert oder nicht hydrolysiert, Fleischmehl, Sojabohnenmehl, Fleischextrakte, Leberkuchen, Harnstoff, Ammoniumverbindungen, Getreide-Destillationsrückstände, Maie extrakt, Weizenextrakt, Molke oder iuolkekonzentrate, Maisgluten sauer hydrolysiert, Weizengluten sauer hydrolysiert, Pepton, Abfälle, Brauhei'e, Baumwollsamenmehl, Milchalbumin, Trypton, Melasse, Erdnußmehl, Aminosäuren, Asparagin, Palmkern-, Kokos- oaer Leinschrotmehl und Sonnenblumensamenmehl. Pur the Tetracyclinerzeugung further sources of organically bound nitrogen were recommended (US Patent Nos. 2,739,924, 2,949,406, 2,763,591), for example, casein, hydrolyzed or hydrolyzed meat meal, soybean meal, meat extracts, liver cake, urea, ammonium compounds , Grain distillation residues, corn extract, wheat extract, whey or iuolke concentrates, acid hydrolyzed corn gluten, acid hydrolyzed wheat gluten, peptone, waste, brewing heat, cottonseed flour, milk albumin, tryptone, molasses, peanut flour, amino acids, asparagine, palm kernel coconut, Flax meal and sunflower seed meal.

lieben diesen Möglichkeiten der Tetracyclinerzeugung hat man auch besondere Mikroorganismen durch Mutationen von Streptomyceten erzeugt. So hat man beispielsweise einen Mikroorganismus gezüchtet, welcher in einer mehr als 90j£igen Ausbeute Tetracyclin zu produzieren imstande ist und welcher an Tetracyclin etwa das Doppelte produziert, was andere Streptomyceten, wie sie normalerweise für die Produktion benutzt werden, an Antibiotikum erzeugen. Dieser Mikroorganismus wird durch Mutation eines normalerweise Chlortetracyclin bildenden Stammes des Streptomyces aureofaciens durch folgende Behandlungen in der angegebenen Reihenfolgelove these possibilities of tetracycline production one has also special microorganisms produced by mutations of Streptomycetes. For example, you have a microorganism bred, which in a yield of more than 90 years Tetracycline is able to produce and which of tetracycline produces about twice what others Streptomycetes, as they are normally used for production, of antibiotics. This microorganism is caused by mutation of a strain of Streptomyces aureofaciens which normally produces chlorotetracycline by the following treatments in the order given

909829/138 1 - η _ BAD ORIG'NAL909829/138 1 - η _ BAD ORIG'NAL

_₇_ H92H5_ ₇ _ H92H5

erhalten: UV-Bestrahlung, Röntgenbestrahlung, UV-Bestrahlung in Gegenwart von Benzylrhodanid, Röntgenbestrahlung, Tiefkühlung, Streptomycin-Behandlung, Inkubation auf einem synthetischen Nährboden und Behandlung mit Coenzym A und Röntgenbestrahlung in Gegenwart von Kaliumcyanid. (DAS 1 128 599). Bekannt geworden sind auch neben den physikalischen Mitteln zur Durchführung von Mutationen chemische mutagene Mittel, welche unter den Bezeichnungen "nitrogen mustards", "sulfur mustards" bekannt geworden sind, aber auch Kobalt-Ionen, Colchicin, polynukleare Kohlenwasserstoffe u.a. Diese mutagenen Mittel werden zur Züchtung von Mikroorganismen benutzt, welche in einem Herstellungsverfahren für Antibiotika eingesetzt werden, bei welchem gleichzeitig in derselben Fermentations brühe mindestens zwei Arten·von Streptomyceten mit dem Erfolg angewandt werden, daß gleichzeitig mehrere Tetracyclin-Antibiotika erhalten werden, und zwar Tetracyclin, Chlortetracyclin, Bromtetracyolin, Oxytetracyclin, 6-Demethyltetracyclin und T-Chlor-ö-demethyltetracyclin. Hierbei finden Chlorierungsinhibitoren keine Anwendung. (USA-Patentschrift 2 998 352). Die Züchtung neuer Mikroorganismen mit ganz bestimmten besonderen Eigenschaften ist aber mit großen Schwierigkeiten und großem Aufwand verbunden. obtained: UV irradiation, X-ray irradiation, UV irradiation in the presence of benzyl rhodanide, X-ray irradiation, Freezing, streptomycin treatment, incubation on synthetic medium and treatment with Coenzyme A and X-ray irradiation in the presence of potassium cyanide. (DAS 1 128 599). Are also known in addition to the physical means for performing Mutations are chemical mutagenic agents known under the names "nitrogen mustards" and "sulfur mustards" but also cobalt ions, colchicine, polynuclear hydrocarbons, etc. These mutagenic agents are used to grow microorganisms that are used in a manufacturing process for antibiotics be, in which at the same time in the same fermentation broth at least two types of streptomycetes with the success that several tetracycline antibiotics are used simultaneously be obtained, namely tetracycline, chlortetracycline, bromotetracycline, oxytetracycline, 6-demethyltetracycline and T-chloro-δ-demethyltetracycline. Chlorination inhibitors are not used here. (U.S. Patent 2,998,352). The breeding of new microorganisms with very specific special properties is but associated with great difficulty and effort.

Mittel, wie man sie zur Mutierung von Mikroorganismen anwendet, können nicht bei der Produktion von Antibiotika An-Means used to mutate microorganisms cannot be used in the production of antibiotics.

909829/1381909829/1381

U92U5U92U5

wendung finden. Denn derartige Mittel wirken eo stark toxisch, daß βie bei der Anwendung sämtliche vegetativen Mikroorganismen und im allgemeinen mehr als 99$ der Sporen vernichten. Aue dem Rest der am leben bleibenden Sporen wird dann der neue Mikroorganismus gezüchtet, wobei dieser Züchtungsvorgang im allgemeinen viele Male wiederholt werden muß. So eignen sich auch die fälschlicherweise als "Senföle" bezeichneten Typen des Dichlordiäthylamins und des Dichlordiäthylsulfids, welche für die Mutation von Streptomycetenstämmen benutzt werden, keineswegs zur Verwendung als Chlorierungsinhibitoren, da sie in der Fermentationsbrühe den Großteil der Mikroorganismen abtöten würden. find application. Because such means work eo strong toxic that βie in the application all vegetative Microorganisms and generally more than $ 99 of spores destroy. The new microorganism is then grown using the rest of the spores that remain alive Growing process must generally be repeated many times. So they are also wrongly suitable as "Mustard oils" denoted types of dichlorodiethylamine and dichlorodiethyl sulfide which are responsible for the mutation of Streptomycete strains are used, in no way for use as chlorination inhibitors as they are in the fermentation broth would kill most of the microorganisms.

Auf der Suche nach einer geeigneten Stickstoffquelle, welche leicht und in genügender Menge zugänglich ist und die Anforderungen bei der Tetracyclinerzeugung auf gärtechnischem Wege erfüllt, wurden einige neue Rohstoffe gefunden mit einer derartig ausgeprägten Eigenschaft, daß sie bereits in niedrigen Konzentrationen den Einbau des Halogens bei der Biosynthese der Tetracyclinantibiotika hemmten, und zwar wie beim Chlortetracyclin so auch beim Bromtetracyolin« Die Hemmwirkung erwies sich im breiten Maße als unabhängig auf den Tetracyclinantibiotika produzierenden benutzten Streptomyces-Stamm. Sie ist markant nioht nur bei den Stämmen, welche in Hährmedien mit genügender Chlorionenmenge bevorzugt Chlortetraoyclin erzeugen, sondern auch"Looking for a suitable nitrogen source which is easily accessible and in sufficient quantity and the requirements for tetracycline production on fermentation technology Fulfilled ways, some new raw materials have been found with such a distinctive property that they are already in low concentrations inhibited the incorporation of halogen in the biosynthesis of tetracycline antibiotics, and as with chlortetracycline so also with bromotetracyoline « The inhibitory effect was found to be largely independent of the tetracycline antibiotic producing used Streptomyces strain. It is noticeable only in the strains which have been grown in suspension media with a sufficient amount of chlorine ions preferentially produce chlorotetraoycline, but also "

909829/1381 " ⁹ -909829/1381 " ⁹ -

-9- U92U5-9- U92U5

bei den Stämmen, welche unter gleichen Bedingungen überwiegend Tetracyclin produzieren. Die Hemmwirkung ist offenbar nicht auf einen speziellen Produktionsstamm beschränkt, jedoch ist der Wirkungsgrad bei Verwendung von verschiedenen Stämmen oder Mutanten unterschiedlich.in the case of the strains which predominantly produce tetracycline under the same conditions. The inhibiting effect is evident not limited to a particular production strain, however, the efficiency when using different ones Strains or mutants different.

Aufgrund dieser neuen Erkenntnisse wurde gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Tetracyclin ausgearbeitet, und zwar durch Kultivierung von Mikroorganismen des Genus Streptomyces, welche das Tetracyclin produzieren, in einem flüssigen Nährmedium, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Mineralnährsalze und Stimulatoren enthält. ,On the basis of these new findings, a method for fermentative production was developed according to the present invention elaborated by tetracycline, namely by cultivating microorganisms of the genus Streptomyces, which the Produce tetracycline in a liquid nutrient medium containing assimilable carbon and nitrogen sources, Contains mineral nutrients and stimulators. ,

Das Verfahren der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß man dem Nährmedium als einen Halogenierungsinhibitor des Tetracyclinmoleküls schwefelhaltige Pflanzenteile vom Genus Brassica, wie Ackersenf, Raps, Knoblauch, Weisskraut, Wasserrübe, oder daraus hergestellte schwefelhaltige Erzeugnisse oder Halberzeugnisse, insbesondere aus Ackersenf- und/oder Rapssamen in einer Menge von 0,01 - 5,0$ zusetzt.The method of the invention is characterized in that the nutrient medium is used as a halogenation inhibitor of the tetracycline molecule sulfur-containing plant parts from the genus Brassica, such as mustard, rapeseed, garlic, white cabbage, Water beet, or sulfur-containing products or semi-finished products made from it, in particular from field mustard and / or add rapeseed in an amount of $ 0.01-5.0.

Die hier angewandten Halogenierungsinhibitoren üben keinerlei Einfluß auf den Mikroorganismus selbst aus. Benutzt man einen Mikroorganismus, welcher bereits in der Fermentationsbrühe mit den von der Erfindung angegebenen Zusätzen benutzt ist und dort Tetraoyclinmoleküle erzeugt hat, in einer normalen Nährbrühe weiter, welche diese Zusätze nicht ent-The halogenation inhibitors used here have no effect whatsoever Influence on the microorganism itself. If a microorganism is used which is already used in the fermentation broth with the additives specified by the invention and has produced tetraoycline molecules there, in a normal nutrient broth which does not contain these additives.

909829/ 1381909829/1381

H92H5H92H5

- ίο -- ίο -

hält, so erzeugt der Mikroorganismus nun wieder Chlortetracyclinmoleküle. holds, the microorganism now produces chlorotetracycline molecules again.

Dem Nährmedium kann man ferner den Schrot nach Auspressen des Öles aus Ackersenf- oder Rapssamen oder das Rohöl nach der Rapssamenextraktion oder das Rohöl nach der Aufarbeitung des Ackersenfsamens zusetzen. Die genannten Halogenierungsinhibitoren werden dem Nährmedium in einer Menge von 0,01 bis 5# zugegeben und ausserdem kann auch Benzylrhodanid in einer Menge von 2 - 15/Ug/l ml zugesetzt werden.The meal can also be added to the nutrient medium after it has been pressed out of the oil from field mustard or rapeseed or the crude oil after the rapeseed extraction or the crude oil after processing of the field mustard seeds. The halogenation inhibitors mentioned are the nutrient medium in a Amount of 0.01 to 5 # added and also can also Benzyl rhodanide added in an amount of 2-15 / Ug / l ml will.

Es wurde festgestellt, daß unter den Glsamen Raps und * Ackersenf ausgeprägte Chlorierungsinhibitoren darstellen, und zwar sogar in Gegenwart von überschüssigen Chlorionen, welche den Mhrmedien in Form von NaCl zwecks Kontrolle in breiten Grenzen von 40 bis 400 mg Cl^Liter zugesetzt wurden. Zur Zubereitung der Mährmedien bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wurde kein entchloriertes Ausgangsmaterial verve/vjet. Als Wasser diente chloriertes Leitungswasser,It was found that among the Glsamen oilseed rape and * Mustard represent pronounced chlorination inhibitors, even in the presence of excess chlorine ions, which are added to the milling media in the form of NaCl for the purpose of control within wide limits of 40 to 400 mg Cl ^ liters added became. No dechlorinated starting material was used to prepare the mowing media in the method according to the invention verve / vjet. Chlorinated tap water was used as the water,

Auch die durch Aufarbeitung von Raps- und Ackersenfsamen gewonnenen Zwischenprodukte wiesen die Fähigkeit der Chlorierungsinhibierung auf, wenn auch in verschiedenem Grad, und zwar besonders Schrot bzw. Schrotmehl nach Aufarbeitung der Samen zum Öl und einzelne Ölfraktionen. Es wurde auch eine gewisse Abhängigkeit der Chlorierungsinhibierungsfähigkeit von dem Gehalt des organisch gebundenenAlso the processing of rapeseed and field mustard seeds obtained intermediates exhibited the ability to inhibit chlorination, albeit in different ways Degree, especially meal or meal after processing the seeds into oil and individual oil fractions. It also became a certain dependence of the chlorination inhibiting ability on the content of the organically bound

909829/1381 _.,„.,909829/1381 _., ".,

BAD. ORIGINALBATH. ORIGINAL

U92U5U92U5

Schwefele in dem Material oder in den Zwischenprodukten festgestellt. Am stärksten wirkt der Samen, etwas weniger der Schrot; die ölhaltigen Zwischenprodukte verschiedenartig je nach dem Eaffinierungsgrad und der Verarbeitungeweise bis zum raffinierten Rapsöl, welches wirkungslos ist, und zwar in Übereinstimmung mit dem Entfernen der Schwefel- und Stickstoffverbindungen. Es scheint, daß einige Naturstoffe Anteile von Verbindungen mit hohem Schwefel- und Stickstoffgehalt enthalten und daß diese Stoffe als natürliche Inhibitoren des Halogeneinbaues bei der Biosynthese der Tetracyclinantibiotika (Ohlortetracyelin-Tetracyclin), foemethylchlortetracyclin-Demethyltetracyclin, Bromtetracyelin-Tetracyclin usw.) wirken. Diese Theorie soll die Erfindung keineswegs beschränken, sie ist auch davon nicht abhängig, denn die genannten Rohstoffe enthalten Stoffgemische, welche sich als Antimetabolite ergänzen oder potenzieren können u.a., gegebenenfalls gleichzeitig als Quellen des assimilierbaren Kohlenstoffs und Stickstoffs oder weiterer spezifischen Stoffe dienen können.Sulfur in the material or in the intermediates established. The seeds have the strongest effect, the meal a little less; the oil-containing intermediate products of various kinds depending on the degree of refinement and processing method to refined rapeseed oil, which is ineffective, in accordance with the removal of the sulfur and nitrogen compounds. It seems that some natural substances contain proportions of compounds with high sulfur and Contain nitrogen content and that these substances act as natural inhibitors of halogen incorporation in biosynthesis the tetracycline antibiotics (Ohlortetracyelin-Tetracycline), foemethylchlortetracycline-demethyltetracycline, bromotetracycline-tetracycline etc.) work. This theory is in no way intended to limit the invention, nor is it one of it dependent, because the raw materials mentioned contain mixtures of substances that complement or potentiate each other as antimetabolites can, inter alia, optionally simultaneously as sources of assimilable carbon and nitrogen or other specific substances can serve.

Bei der Prüfung von weiteren Naturrohstoffen hat es sieh gezeigt, daß die gewisse bereits erwähnte spezifische Wirkung auch für andere schwefelhaltige Pflanzen oder Produkte charakteristisch ist, wie Knoblauch, Weißkraut, Wasserrübe (Pflanzen des Genus Brassioa) u.a. Im Vergleich mit Ülsamen ist die technische Anwendbarkeit dieser Rohstoffe beschränkt und durch ihre lagerungsfähigkeit bedingt.When testing other natural raw materials, it has to be seen showed that the certain specific effects already mentioned also apply to other sulfur-containing plants or products characteristic is how garlic, white cabbage, water beet (Plants of the genus Brassioa), among others, in comparison with oil seeds, the technical applicability of these raw materials limited and due to their storability.

909829/1381 - 12 -909829/1381 - 12 -

U92H5U92H5

Die Wirkung der erfindungsgemäßen Rohstoffe lässt sich durch Kombination mit einigen synthetischen, an eich bekannten Stimulatoren, insbesondere Benzylrhodanid, erhöhen, Dadurch kann ein gewisser ungünstiger Einfluß der Inhibitoren auf die Antibiotikaproduktion ausgeglichen werden.The effect of the raw materials according to the invention can be by combining it with some synthetic, well-known stimulators, especially benzyl rhodanide, In this way, a certain unfavorable influence of the inhibitors on antibiotic production can be compensated for.

AusführungsbeispieleEmbodiments

Beispiel 1 : Die Zubereitung des InokulumsExample 1: The preparation of the inoculum

Eine Konserve des Stammes Streptomyces BMK, sporuliert auf Hirse, wird mit 125 ml sterilem Wasser abgespült und mit 1 ml dieser Sporensuspension werden 80 ml eines Impfstoffmediums der I. Generation beimpft. Nach 24stündiger Kultivierung auf einem Schüttler wurden mit 4 ml dieses Impfmaterials der II. Generation wiederum 80 ml eines Mediums beimpft. Die Kultivierung der II. Generation auf dem Schüttler dauerte 24 Stunden. Das Medium für beide Generationen hatte folgende Zusammensetzung:A preserve of the Streptomyces BMK strain, sporulated on millet, is rinsed off with 125 ml of sterile water and with 1 ml of this spore suspension, 80 ml of a vaccine medium the 1st generation inoculated. After cultivation on a shaker for 24 hours, 4 ml of this Inoculation material of the 2nd generation inoculated in turn 80 ml of a medium. The cultivation of the 2nd generation on the shaker lasted 24 hours. The medium for both generations had the following composition:

SaccharoseSucrose 3030th gG S ο j ab ohnenmehlS ο j from without flour 2020th gG CaCO,CaCO, 44th e-e- (19H₄)₂SO₄ (19H ₄ ) ₂ SO ₄ ^:g ^: g Maisquellwasser (5Oj6ig)Corn spring water (5Oj6ig) 55 gG Leitungswassertap water 10001000 mlml

..f..f

Erzeugung des Tetracyclins: mit 80 ml des Inokulums der II.Generation werden 1000 ml eines Gärmediums folgenderGeneration of the tetracycline: with 80 ml of the inoculum of the 2nd generation 1000 ml of a fermentation medium are the following

Zusammensetzung beimpft ιComposition inoculates ι

ORKlMAt INSPECTEDORKlMAt INSPECTED

909829/ 1 38 1909829/1 38 1

U92H5U92H5

Saccharose 50 g Gemahlener Ackersenfsamen 5 gSucrose 50 g Ground mustard seeds 5 g

Sojabohnenmehl 40 gSoybean meal 40 g

Melasse 2,5 gMolasses 2.5 g

Maiequellwasser (50^ig) 5 gCorn spring water (50%) 5 g

(MH₄)₂SO₄ 6,3 g(MH ₄ ) ₂ SO ₄ 6.3 g

CaCO₃ 6,3 gCaCO ₃ 6.3 g

Dieses Medium wird 60 Minuten bei 120⁰O sterilisiert; der pH-Wert liegt im Bereich 6,7 - 7*0. Nach Beimpfen gibt man zu dem Medium 1 ml einer Benzylrhodanidlösung im Soja- oder Rapsöl. Diese Lösung wird durch Sterilisierung von 100 ml Öl und Zugabe von 5 g Benzylrhodanid unter aseptischen Bedingungen hergestellt. Es wird bei 28⁰C unter Rühren mit 900 Umdrehungen/Minute und unter Belüftung mit 0,4-1 Luftvolumen/Minute in einem Glastank 120 Stunden lang kultiviert. Die Schaumbildung wird durch Zusatz von Soja- oder Rapsöl gehemmt. Nach beendeter Fermentation weisen die Proben nach Ermittlung mit photokolorimetrischer Methode eine Ausbeute von 3950 /ug/ml Tetracyclinäquivalent und über 95j£ Tetracyclin auf, gemessen mit semiquantitativer ehromatographiseher Methode βThis medium is ^{sterilized at 120 0} O for 60 minutes; the pH value is in the range 6.7 - 7 * 0. After inoculation, 1 ml of a benzyl rhodanide solution in soybean or rapeseed oil is added to the medium. This solution is prepared by sterilizing 100 ml of oil and adding 5 g of benzyl rhodanide under aseptic conditions. It is cultured at 28 ⁰ C under stirring with 900 revolutions / minute and with aeration at 0.4-1 volume of air / minute in a glass tank 120 hours. Foam formation is inhibited by adding soy or rapeseed oil. After the fermentation has ended, the samples, as determined by the photocolorimetric method, have a yield of 3950 μg / ml tetracycline equivalent and over 95 μg tetracycline, measured using the semiquantitative Ehromatographic method β

Gleichzeitig wurde unter gleichen Bedingungen eineKontroll-. fermentation durchgeführt, wobei in das Medium der oben angeführten Zusammensetzung mit einem natürlichen Chlorionengehalt unter 100 mg/l 0,4 g NaCl/l zugegeben wurde. Ergebnis, der FermentationιAt the same time, under the same conditions, a control. fermentation carried out, being in the medium of the above composition with a natural chlorine ion content below 100 mg / l 0.4 g NaCl / l was added. Result, the fermentationι

909829/1381 -14-909829/1381 -14-

U92H5U92H5

3800 /ug/ml Tetracyclinäqüivalent und βθφ Tetracyclin.3800 / ug / ml tetracycline equivalent and βθφ tetracycline.

AIb weitere Kontrolle wurde eine parallele !Fermentation in einem Medium ohne Ackersenfsamen aber mit Zugabe von 0,4 g NaCl/ 1 durchgeführt. Ergebnis der Fermentation:As a further control, a parallel fermentation was carried out in a medium without field mustard seeds but with the addition of 0.4 g NaCl / l. Result of the fermentation:

3900 Ug/ml Tetracyclinäquivalent, 35^> Tetracyclin und 65# Chlortetracyclin.3900 Ug / ml tetracycline equivalent, 35 ^> Tetracycline and 65 # chlortetracycline.

Example 2:

Ein Gärmedium mit folgenden Bestandteilen:A fermentation medium with the following components:

Saccharose 50 gSucrose 50 g

Gemahlener Rapssamen 2,4 gGround rapeseed 2.4 g

Sojabohnenmehl 40 gSoybean meal 40 g

(NH₄)₂SO₄ 6,3 g(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 6.3 g

Melasse 2,5 gMolasses 2.5 g

Maisquellwasser (50#ig) 5,0 gCorn steep liquor (50 # ig) 5.0 g

CaCO₃ 6,3 gCaCO ₃ 6.3 g

wurde beimpft und in gleicher Weise wie im Beispiel 1 fermentiert. Die Endkonzentration des Y/irks toffee betrug 4200 fxg des Tetracyclinäquivalentes und über 95?t Tetracyclin. was inoculated and fermented in the same way as in Example 1. The final concentration of the yeast toffee was 4200 μg of the tetracycline equivalent and over 95 μt of tetracycline.

Gleichzeitig wurde unter denselben Bedingungen eine Kontrollfermentation geführt, wobei zu dem Medium der vorstehenden Zusammensetzung mit natürlichem ChIorionengehalt unter 100 mg/1 noch 0,4 g HaCl/l zugegeben wurde. Ergebnis der* Fermentation:At the same time, a control fermentation was carried out under the same conditions led to the medium of the above composition with natural chlorine ions below 100 mg / l, 0.4 g HaCl / l was added. Result of the * fermentation:

3600 fig/ml Tetracyclinäquivalent und 80# Tetracyclin· 909829/13813600 fig / ml tetracycline equivalent and 80 # tetracycline · 909829/1381

H92H5H92H5

Als weitere Kontrolle wurde parallel eine Fermentation ohne Rapssamen und mit 0,4 g NaCl/l geführt. Ergebnis der Fermentation:As a further control, fermentation without rapeseed and with 0.4 g NaCl / l was carried out in parallel. Result of fermentation:

4300 pg/ml Tetracyclinäquivalent, 4O# Tetracyclin und Chlortetracyclin.4300 pg / ml tetracycline equivalent, 4O # tetracycline and Chlortetracycline.

Example 3 *

Es wurde das Verfahren gemäß Beispiel 1 wiederholt. Statt der Konserve von Streptomyces BMK wurde eine Konserve mit der Species Streptomyoes Nr. 1717 verwendet.Ergebnis der FermentationsThe procedure of Example 1 was repeated. Instead of the canned Streptomyces BMK, a canned product was used of the species Streptomyoes No. 1717 used. Result the fermentation

3200 jmg/ml Tetracyclinäquivalent und Tetracyclingehalt zwischen 98-100 #.3200 jmg / ml tetracycline equivalent and tetracycline content between 98-100 #.

Diese hohe Ausbeute an Tetracyclin erleichtert seine Isolierung, ohne daß es notwendig ist, den Restgehalt des Chlortetracyclins zu eliminieren.This high yield of tetracycline facilitates its isolation without it being necessary to analyze the residual content of the Eliminate chlortetracycline.

Example 4s

Unter gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1 wurden weitere Versuche mit einem Grundmedium folgender Zusammensetzung durchgeführt:Under the same conditions as in Example 1, further tests were carried out with a basic medium of the following composition carried out:

SaccharoseSucrose 50,0 g50.0 g S ο j ab ohnenmehlS ο j from without flour 40,0 g40.0 g Melassemolasses 2,5 g2.5 g Maisquellwasser (50#ig)Corn steep water (50 #) 5,0 g5.0 g (HHJ₂SO₄ (HHJ ₂ SO ₄ 6,3 g6.3 g

909829/1381909829/1381

- 16 -- 16 -

H92H5H92H5

CaOO,CaOO,

Benzylrhodanid in Öllöeung LeitungswasserBenzyl rhodanide in an oil solution tap water

6,3 g
0,005 g6.3 g
0.005 g

παπα

Übersicht der Ausbeuten der Antibiotika und des Tetraoyclinanteile bei Verwendung von verschiedenen natürlichen öhlorierungsinhibitoren wird in folgender Tabelle wiedergegeben: Overview of the yields of the antibiotics and the tetraoycline components when using different natural chlorination inhibitors, the following table shows:

Zusatz zum Boden in g/l pg TO-Rapssamen HaOl ÄquivalentAddition to the soil in g / l pg TO rapeseed HaOl equivalent

Rapsschrot
5Rapeseed meal
5

0,40.4

4730 45404730 4540

TOTO

11 0,40.4 4240
38004240
3800 75
6075
60 1,71.7 -- 46304630 9595 33 0,40.4 3830
33003830
3300 95
8095
80 66th 0,40.4 2950
22502950
2250 90
9590
95 1010 0,40.4 2400
23002400
2300 100
95100
95

95 6095 60

0,40.4

41004100

8585

909829/ 1 381909829/1 381

- 17 -- 17 -

H92U5H92U5

Zusatz zum Boden in g/l /ag IC - f> TG Addition to the soil in g / l / ag IC - f> TG

Rapssehrot NaOl ÄquivalentRapeseed red NaOl equivalent

0 0,4 4100 200 0.4 4100 20

AokersenfsamenAoker mustard seeds

10 - 3450 9510-3450 95

0,4 3020 800.4 3020 80

Ackersenfschrot - 3840 90Field mustard meal - 3840 90

0,5 0,4 3750 650.5 0.4 3750 65

Rohes Rapeöl - 4380 90Raw rapeseed oil - 4380 90

20 χ) 0,4 4210 8020 χ) 0.4 4210 80

Rohes Ackereenföl - 3820 95 20 χ)Raw mustard oil - 3820 95 20 χ)

Knoblauch - 4150 90Garlic - 4 150 90

0,5 0,4 3900 600.5 0.4 3900 60

Kontrollecontrol

0 0,4 3900 350 0.4 3900 35

x) die als Bestandteil des Mediums und zum Entschäumen verwendete Gesamtmenge βx) the total amount β used as part of the medium and for defoaming

909829/ 1 38 1909829/1 38 1

Claims

18 H92U5 July 16, 1968 Dr.J / Ha. File number: P 14 92 145. O Applicant: Spofa ... My reference: 9839 Claims:

1. Process for the fermentative production of tetracycline by cultivating chlortetracyelin as well as tetra cyclin-producing microorganisms of the genus Streptomyces in a liquid nutrient medium that is assimilable Carbon and nitrogen sources, mineral nutrient salts, Halogenation inhibitors and stimulators, such as benzyl rhodanide in an amount of 2-15 mcg / ml, characterized,

that one can use the nutrient medium as a halogenation inhibitor of the tetracycline molecule sulfur-containing plant parts from the genus Brassica, such as mustard, rapeseed, garlic, white cabbage, Water beet or sulphurous products or semi-finished products made therefrom, in particular from field mustard and / or rapeseed in an amount of 0.01 - 5.05έ added.

2 method according to claim 1,
characterized,

that is added to the Hährmedium the shot after pressing out the oil from _v mustard seeds.

909829/ 1381909829/1381

U92H5

3. The method according to claim 1, characterized in that the meal after pressing the Uährmedium Adds oil from rapeseed.

4. The method according to claim 1, characterized in that that the crude oil is added to the milling medium after the rapeseed extraction.

5. The method according to claim 1, characterized in that that the crude oil is added to the culture medium after the field mustard seed has been worked up.

909829/1381909829/1381