DE1442188A1

DE1442188A1 - Process for the production of L-glutamic acid by fermentation

Info

Publication number: DE1442188A1
Application number: DE19621442188
Authority: DE
Inventors: Keizo Goto; Akimoto Toru Irima; Ryoji Kodaira; Kyoichi Mayai; Isao Tsuruo
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1961-11-01
Filing date: 1962-10-30
Publication date: 1968-11-21
Also published as: GB1020283A; CH439315A

Description

A 1330A 1330

AcJAHI KAbEI KOGYO KABÜSHIKIKAISHA, No.25-1, 1-chome, Dojima-hamadori, Kita-ku, OSaKA CIi¹Y / JAPANAcJAHI KAbEI KOGYO KABÜSHIKIKAISHA, No.25-1, 1-chome, Dojima-hamadori, Kita-ku, OSaKA CIi ¹ Y / JAPAN

Verfahren zur Gewinnung von L-Glutaminsäure duroh Vergärung Process for the production of L-glutamic acid by fermentation

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von L-Glutaminsäure durch Vergärung oder Fermentation.The invention relates to a method for obtaining L-glutamic acid by fermentation or fermentation.

Hauptgegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Kultivierung von Mikroorganismen, welche zur Art Microbacterium, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, etc. gehören und welche die Fähigkeit besitzen, unter entsprechenden Uährbedingungen L-Glutaminsäure zu erzeugen. Hierbei werden durch die für diese Mikroorganismen charakteristische biologischeThe main subject of the invention is a method of cultivation of microorganisms belonging to the species Microbacterium, Bacillus, Brevibacterium, Corynebacterium, etc. and which have the ability under appropriate Uährbedingungen Generate L-glutamic acid. Here are through the biological characteristic of these microorganisms

Katalysatorwirkung Kohlehydrate wirksam in L-G-lutarainsäure umgewandelt.Catalyst effect Carbohydrates effective in L-G-lutaraic acid converted.

Es ist "bekannt, daß bei dem "Verfahren zur Herstellung von L-G-lutaminsäure unter Yerv/endung eines Mikroorganismus,, wie ,,. dies in der japanischen Patentschrift 263 709 "beschrieben ist, Biotin, das der Wachs turas faktor eines zur Bildung von L-Grlut amins äure befähigten Mikroorganismus ist, in ein Kulturmedium zugegeben wird, und zwar in einer Men^e, welche kleiner ist, als sie für die maximale Vermehrung dieser Mikroorganismen erforderlich wäre. Bei der Kultivierung oder Züchtung erfolgt dann eine Ansammlung von L-G-lut amins äure in dem Kulturmedium in merklicher Menge.It is "known that in the" process for the production of L-G-lutamic acid with the ending of a microorganism ,, like ,,. this is described in Japanese Patent Specification 263 709 ", Biotin, which the wax turas factor one for the formation of L-Grlut amic acid capable microorganism is added to a culture medium, in a quantity which is smaller is than it would be necessary for the maximum reproduction of these microorganisms. When culturing or breeding takes place then an accumulation of L-G-lut amic acid in the culture medium in a noticeable amount.

Die Erfinder des vorliegenden Verfahrens haben, ohne sich an das Bekannte gebunden zu fühlen, nach dem quantitativen Einfluß verschiedener Faktoren geforscht, welche für das Wachstum L-G-lutaminsäure produzierender Bakterien erforderlich sind, und dabei Bedingungen und liege aufgespürt, welche der Herstellung von L-Glutaniinsäure förderlich sind. Als Ergebnis ihrer Untersuchungen fanden die Erfinder, ohne sich von den bisher bevorzugten Bedingungen bzw. von der ungenügenden Biotinanlieferurgfür das Wachstum der L-G-lutaiainsäure produzierenden Bakterien leiten zu lassen, ein Verfahren, bei welchem in einem Kulturmedium gezüchtete Bakterien verwendet werden, wobei dem Medium aber Biotin oder eine biotinhaltige The inventors of the present process, without feeling bound by the known, have after the quantitative influence researched various factors which are necessary for the growth of L-G-lutamic acid producing bacteria are, and thereby conditions and are tracked down which are conducive to the production of L-glutaniic acid. As a result The inventors found their investigations without departing from the previously preferred conditions or from the unsatisfactory ones Biotin supplier for the growth of L-G-lutaic acid producing Letting bacteria guide, a process in which Bacteria grown in a culture medium can be used, but the medium is biotin or a biotin-containing one

BAD ORIGINAL AOOftnQ /0720 "■·■"■' BAD ORIGINAL AOOftnQ / 0720 "■ · ■" ■ '

natürliche Substanz in einer solchen Menge zugegeben wird, daß sich eine maximale Vermehrung der Bakterien unter niedriger Kohlehydratkonzentration ergibt. Dadurch wird es möglich gemacht, L-Glutaminsäure in effektiver Weise aus Kohlehydrat allein oder Kohlehydrat und ammoniakähnlichen Stickstoffquellen oder Harnstoff auf Grund der physiologischen Eigentümlichkeiten dieser Bakterien zu gewinnen.natural substance is added in such an amount that a maximum proliferation of the bacteria under lower Carbohydrate concentration results. This makes it possible to extract L-glutamic acid from carbohydrate in an effective manner alone or carbohydrate and ammonia-like nitrogen sources or urea due to the physiological peculiarities to attract these bacteria.

Die Erfinder impften ein Kulturmedium der in untenstehender Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung unter verschiedenen Kohlehydratkonzentrationen mit Bakterien, beispielsweise Hicrobacterium ammoniaphilum, welche zu einer Erzeugung von L-Glutaminsäure befähigt sind und welche Biotin benötigen, und zwar in einer Menge von 5 x 10 Keim-gezüchteter und ausgewaschener Bakteriumzellen der erwähnten Bakterien pro ml. Bei der Züchtung derselben suchten die Erfinder nach derjenigen Menge, welche für eine maximale Vermehrung der Bakterien hinsichtlich Biotin erforderlich ist. Das Ergebnis hiervon ist in Tabelle 1 aufgeführt. Es bestätigte sich jedoch, daß die für das Wachstum des Bakteriums erforderliche Biotinmenge nicht gleichförmig ist, sondern in hohem Maße variiert, je nach der Kohlehydratkonzentration in dem Kulturmedium. Es wurde also gefunden, daß die die maximale Vermehrung gebende Biotinmenge graduell von 1 bis 2 μ g/l bis 20 μ§/ΐ wächst, wenn die Kohlehydratkonzentration in dem Kulturmedium von 1 bis 15Jf ansteigt. Ferner wurde gefunden, daß das zuvor erwähnte Ergebnis ein.The inventors inoculated a culture medium of the composition shown in Table 1 below from among various Carbohydrate concentrations with bacteria such as Hicrobacterium ammoniaphilum, which are capable of producing L-glutamic acid and which require biotin, and although in an amount of 5 x 10 germ-grown and washed out Bacterial cells of the mentioned bacteria per ml. In cultivating the same, the inventors searched for the one Amount that is required for the maximum reproduction of the bacteria in terms of biotin. The result of this is in Table 1 listed. However, it was confirmed that the amount of biotin required for the growth of the bacterium was not sufficient is uniform but varies greatly depending on the concentration of carbohydrates in the culture medium. So it was found that the amount of biotin giving the maximum increase gradually increases from 1 to 2 μg / l to 20 μ§ / ΐ when the carbohydrate concentration increases increases from 1 to 15Jf in the culture medium. It was also found that the aforementioned result was a.

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Phänomen ist, welches, wenn auch in etwas unterschiedlicher Weise, gemeinhin niclrc nur in solchen Testproben "beobachtet wird, in denen Microbacterium ammoniaphilum zur Anwendung kommt, sondern auch in den oben erwähnten ÜEestversuchen, welche unter Verwendung verschiedener Bakterienarten ausgeführt wurden. Das obige Ergebnis läßt sich auch auf den "Fall anwenden, in welchem Mais-Quellflüssigkeit (corn steep liquor), welche gewöhnlich als Biotinquelle zur Anwendung kommt, bei der Erzeugung von L-G-lutaminsäure durch Bakterien verwendet wird; das gleiche läßt sich hinsichtlich anderer biotinhaltiger natürlicher Substanzen sagen.Phenomenon is which, albeit in slightly different ways Way, commonly not observed only in such test samples " in which Microbacterium ammoniaphilum is used, but also in the above-mentioned ÜEestversuche, which using various types of bacteria. The above result can also be applied to the "case in which corn steep liquor, which is usually used as a source of biotin, is used used in the production of L-G-lutamic acid by bacteria will; the same can be said of other natural substances containing biotin.

Table 1

Konzentration
an Glukoseconcentration
of glucose

(g/l)(g / l)

Menge an Biotin im Zeitpunkt maximaler VermehrungAmount of biotin at the time of maximum reproduction

(μβ/1)(μβ / 1)

Menge an Mais-Quellflüssigkeit zur Zeit maximaler VermehrungAmount of corn swelling liquid at the time of maximum propagation

(g/1)(g / 1)

1
2
5
7.51
2
5
7.5

1 21 2

10 1010 10

2 52 5

0.20.2

0.50.5

0.5
1.0
2
20.5
1.0
2
2

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(b.w.)(b.w.)

BAD ORIGINALBATH ORIGINAL

Konzentration · Menge an Biotin im Menge an Mais-Quell-Concentration Amount of biotin in the amount of corn source

an Glukose ' Zeitpunkt maxima- flüssigkeit zur Zeitat glucose 'point in time maximum fluid at the time

ler Vermehrung nacimaler Vermehrungof increase of nacimal increase

(g/l) (μg/l) (g/1)(g / l) (μg / l) (g / 1)

10 10-20 210 10-20 2

15 20 215 20 2

Zusammensetzung des Kulturmediums:Composition of the culture medium:

Glukose wie in Tab. 1 oben angegebenGlucose as indicated in Tab. 1 above

KH₂PO₄ 3 g/l (HH₄)₂S0₄ 1 g/lKH ₂ PO ₄ 3 g / l (HH ₄ ) ₂ S0 ₄ 1 g / l

Harnstoff 12 g/l L-Cystin 0.05 g/lUrea 12 g / l L-cystine 0.05 g / l

MgSO₄.7H₂O 0.5 g/lMgSO ₄ .7H ₂ O 0.5 g / l

MnSO₄-4H₂O 0.01 g/lMnSO ₄ -4H ₂ O 0.01 g / l

*7H₂O 0.01 g/100 ml* 7H ₂ O 0.01 g / 100 ml

Biotin wie in Tab. 1 oben angegebenBiotin as indicated in Tab. 1 above

Mais-Quellflüssigkeit wie in Tab. 1 oben angegebenCorn swelling liquid as indicated in Tab. 1 above

pH 6.8pH 6.8

Hierauf unternahmen es die Erfinder, L-Glutaminsäure produzierende Bakterien in einem Kulturmedium zu züchten, zu welchem
Biotin in einer solchen Menge zugefügt war, wie sie für die
Erzielung der maximalen Vermehrung dieser Bakterien bei den
entsprechenden Kohlehydratkonzentrationen ausreichend war. Anschließend wurde der Kulturbrühe, die die bakteriellen Zellen enthielt, Kohlehydrat zugegeben. Ein Vergleich des Bildungs-The inventors then set about cultivating L-glutamic acid producing bacteria in a culture medium to which
Biotin was added in such an amount as was necessary for that
Achieving the maximum reproduction of these bacteria in the
appropriate carbohydrate concentrations was sufficient. Carbohydrate was then added to the culture broth containing the bacterial cells. A comparison of educational

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zustandes von L-Glutaminsäure zeitigte das Ergebnis, daß bei einer Kohlehydratkonzentration von 1 bis Z°/o die Bildung von L-Glutaminsäure in merklicher Menge beobachtet werden konnte, daß aber in dem Falle, in dem die Züchtung in einem Kulturmedium mit einer Ausgangskohlehydratkonzentration von 5 bis 10$ durchgeführt wurde, das Kohlehydrat unökonomisch verbraucht wurde, und daß, was weit wesentlicher ist, die in diesem Kulturmedium gewachsenen Bakterien nur eine geringfügige oder überhaupt keine Fähigkeit aufwiesen, L-Glutaminsäure zu produzieren. state of L-glutamic acid produced the result that at a carbohydrate concentration of 1 to 2 % the formation of L-glutamic acid could be observed in a noticeable amount, but that in the case where the cultivation in a culture medium with an initial carbohydrate concentration of 5-10 $, the carbohydrate was consumed uneconomically and, more importantly, the bacteria grown in this culture medium had little or no ability to produce L-glutamic acid.

Die Erfindung besteht infolgedessen in erster Linie darin, daß Biotin, Mais-Quellflüssigkeit oder eine andere biotinhaltige natürliche Substanz in einer Menge, die für die Erzielung maximaler Vermehrung der betreffenden Bakterien ausreicht, einem Kulturmedium zugefügt wird, dem seinerseits wiederum 1 bis 2$ Kohlehydrat beigegeben wird. Dabei vermehren sich die Bakterien maximal und es wachsen hervorragende Bakterien in großer Menge. Weiterhin wird gemäß der Erfindung ein Kohlehydratmaterial oder ein Kohlehydrat und eine ammoniakähnliche Stickst of fqjzelle oder Harnstoff allein allmählich der diese Bakterien enthaltenden Kulturbrühe gleichzeitig oder mit Unterbrechungen zugegeben., um aerobische Bedingungen zu erhalten. Dabei wird das Kohlehydrat in wirksamer Weise in L-Glutaminsäure durch die katalytische Wirkung dieser Bakterien umgewandelt.The invention therefore consists primarily in the fact that biotin, corn swelling liquid or another biotin-containing natural substance is added to a culture medium in an amount sufficient to achieve maximum reproduction of the bacteria in question, to which in turn 1 to 2 $ carbohydrate is added will. The bacteria multiply to the maximum and excellent bacteria grow in large quantities. Further, according to the invention, a carbohydrate material or a carbohydrate and an ammonia-like nitrogen cell or urea alone is gradually added to the culture broth containing these bacteria simultaneously or intermittently to maintain aerobic conditions. The carbohydrate is effectively converted into L-glutamic acid by the catalytic action of these bacteria.

BAD ORIQIMAL 8 0980S/0 72 0BATH ORIQIMAL 8 0980S / 0 72 0

Dies bedeutet, daß sich die Erfindung von den bekannten Methoden unterscheidet, bei denen während der Fermentation von L-Glutaminsäure das gesamte Kohlehydrat, das das Substrat 'der L-Glutaminsäure wird, in dem Kulturmedium vorliegt, und zwar ausgehend von dem Zeitpunkt, zu dem die Fermentation beginnt. Die Erfindung weist das charakteristische Merkmal auf, daß die Kultivierung nach der Produktion von L-Glutaininsäure unter derartigen Nährbedingungen begonnen wird, welche die maximale Vermehrung der Bakterien im Bereich von 1 bis 2°/o ergeben. Dabei wachsen zunächst die Bakterien in ausreichender Menge, wie es für die Anhäufung von L-Glutaminsäure erforderlich ist. Dies trägt dazu bei, den unökonomischen Verbrauch an Kohlehydrat, beispielsweise seine Umwandlung in Milch- oder andere organische Säuren, auf ein Minimum herabzudrücken. Es folgt die Vermehrung der Bakterien unter niederer Kohlehydratkonzentration, wobei jedoch noch ein solcher Wachstumsfaktor vorliegt, wie er für das Gedeihen des betreffenden Bakteriums ausreicht. Weiterhin trägt das erfindungsgemäße Vorgehen dazu bei, die vollständige Assimilation des erwähnten Kohlehydrates in die Bestandteile der Bakterien im Verlauf einer Energiegewinnung zu beschleunigen. Dabei wird das dem Kulturmedium zugegebene Kohlehydrat in äußerst wirksamer Weise lediglich für das Wachstum der Bakterien verbraucht. Auf diese V/eise wird eine Züchtung während 14 bis 20 Stunden bewirkt. Wenn hierauf die Vermehrung der bakteriellen Zellen in das Gleichgewichtsstadium eintritt, wird das_fgesamte oder ein Teil des übrigen Kohlehy-This means that the invention differs from the known methods in which, during the fermentation of L-glutamic acid, all of the carbohydrate which becomes the substrate of L-glutamic acid is present in the culture medium, starting from the point in time at which fermentation begins. The invention has the characteristic feature that the cultivation is started after the production of L-glutainic acid under such nutrient conditions which give the maximum multiplication of the bacteria in the range of 1 to 2 %. The bacteria initially grow in sufficient quantities, as is necessary for the accumulation of L-glutamic acid. This helps to keep the uneconomical consumption of carbohydrate, for example its conversion into lactic or other organic acids, to a minimum. The bacteria then multiply with a low concentration of carbohydrates, although there is still a growth factor that is sufficient for the bacterium in question to thrive. Furthermore, the procedure according to the invention contributes to accelerating the complete assimilation of the mentioned carbohydrate into the constituents of the bacteria in the course of energy production. The carbohydrate added to the culture medium is used extremely effectively only for the growth of the bacteria. In this way, cultivation is effected for 14 to 20 hours. If then the proliferation of the bacterial cells enters into the state of equilibrium, is the _f all or part of the remaining Kohlehy-

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~⁸~ 14421B8~ ⁸ ~ 14421B8

drates zugegeben. In diesem Stadium kann jedoch, wie in dem nachstellenden Probebeispiel angegeben, bei Befolgung einer konventioneilen Methode eine gewisse Anhäufung von L-Glutaminsäure beobachtet werden, während bei dem Vorgehen gemäß der Erfindung keine oder nur eine geringfügige Anhäufung von L-Glutaminsäure beobachtbar ist. Dementsprechend kann von den Bakterien im Zeitpunkt, zu welchem das Kohlehydrat zugegeben wird, nicht immer behauptet werden, dai3 sie die physiologische Verfassung besäßen, wie sie für die Bildung von L-G-lutalginsäure erforderlich wäre. Diese Bildung kann jedoch beobachtet v/erden, wenn die Vermehrung der Bakterien in gewissem Ausmaß Platz greift, nachdem das Kohlehydrat zugegeben ist. Hierauf wächst dj,e Anhäufung von L-Glutaminsäure in überraschender V/eise. Auf Grund dieser Tatsache kann gesagt werden, daß die Bakterien die Fähigkeit zur Bildung von L-Jlutaminsäure innerhalb von 10 Stunden zeigen, nachdem das Kohlehydrat zugegeben ist. Das Verfahren der Erfindung verfolgt also, wie oben festgestellt, eine Abtrennung des Vermehrungsprozesses der Bakterien von dem Anhäufungsprozeß der L-Glutaminsäure durch vollständige Durchführung des größeren Teils der Vermehrung der Bakterien vor der Zelt, zu der das Kohlehydrat zugegeben wird. Die Erfindung ermöglicht es also, die Ausbeute an L-Glutaminsäure in unerwarteter Weise im Vergleich mit den üblichen Verfahren zu steigern. Weiterhin ist es gemäß der Erfindung möglich, L-Glutaminsäure in sehr hoher Ausbeute, bezogen auf Kohlehydrat, zu gewinnen, und zwar durch Steuerung der Bildung von Neben-drates admitted. However, at this stage, as in the following sample example given, if a conventional method is followed, a certain accumulation of L-glutamic acid can be observed, while with the procedure according to the invention no or only a slight accumulation of L-glutamic acid is observable. Accordingly, from the bacteria at the time at which the carbohydrate is added it cannot always be asserted that it is physiological Constitution as they are for the formation of L-G-lutalgic acid would be required. However, this formation can be observed when the bacteria multiply to some extent takes effect after the carbohydrate is added. Thereupon the accumulation of L-glutamic acid grows surprisingly. on Based on this fact it can be said that the bacteria have the ability to form L-jlutamic acid within 10 hours show after the carbohydrate is added. The method of the invention thus follows, as stated above, one Separation of the bacterial multiplication process from the accumulation process of L-glutamic acid through complete implementation the greater part of the bacteria multiplying in front of the tent to which the carbohydrate is added. The invention So it allows the yield of L-glutamic acid in unexpected Way to increase compared with the usual method. Furthermore, according to the invention, it is possible to use L-glutamic acid in a very high yield, based on carbohydrate, by controlling the formation of secondary

BAD ORIGiNALORIGINAL BATHROOM

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produkten., duroh Zugabe eines Kohlehydrates zu der Kulturbrühe schrittweise und in geringer Menge, sowie durch Kultivierung derselben unter Einstellung der Kohlehydratkonzentration in der Kulturbrühe bei einem vorbestimmten Wasserniveau. Ferner liegt die Bedeutung der Erfindung darin, daß die Fermentation der L-Grlutaminsäure, welche bisher im Stadium der sogenannten Waehstumskultur (growing culture) durchgeführt wurde, in einem Stadium der Zellensuspension der Bakterien zum Erfolg geführt wurde. Dies zeigt auch die Möglichkeit einer kontinuierlichen Fermentation an.products., by adding a carbohydrate to the culture broth gradually and in small amounts, as well as by cultivating them with adjustment of the carbohydrate concentration in the culture broth at a predetermined water level. Furthermore, the importance of the invention is that the fermentation the L-grlutamic acid, which so far in the stage of the so-called Growing culture was carried out in a stage of the cell suspension of the bacteria to success was conducted. This also indicates the possibility of continuous fermentation.

Weitere Einzelheiten der Erfindung werden anhand des nachstehenden Prüfbeiöpieles erläutert.Further details of the invention will become apparent from the following Examination example explained.

Test example:

2|5 μ g/l Biotin,- was der für die Erzielung maximaler Vermehrung der als Probebeispiel verwendeten Bakterienart Microbacterium ammoniaphilum erforderlichen Menge entspricht - wurden in ein Kulturmedium der in Tabelle 2 angegebenen Zusammensetzung bei der gegebenen Kohlehydratkonzentration eingeführt; es wurde in einen 500 ml-Schüttelzüchtkolben getrennt in einer Menge von 80 ml eingegossen! erhitzt und mit der üblichen Methode2 | 5 μg / l biotin, - what is needed to achieve maximum reproduction the bacterial species Microbacterium used as a sample example ammoniaphilum corresponds to the required amount - were in a culture medium of the composition given in Table 2 was introduced at the given carbohydrate concentration; it was in a 500 ml shake flask separated in one amount poured from 80 ml! heated and using the usual method

sterilisiert j hierauf wurde mit 5 x 10 Keim-gezüchteter und ausgewaschener bakterieller Zellen des erwähnten Bakteriuss geimpft vwä «Ina Eütttlitichtung bei 30 C vorgenommen. Fernersterilized and then inoculated with 5 × 10 germ-grown and washed-out bacterial cells of the bacterium mentioned, and then inoculated at 30.degree . Further

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wurde die Kultivierung als Kontrast zu diesem Tastversuch, und parallel damit mit 100 ml Kulturmedium ausgeführt, veloh.es getrennt in einem 500 ml-Kolben eingegossen wurde; dieses Kulturmedium hatte dieselbe Zusammensetzung wie das oben erwähnte, die Glukose-Konzentration allein war jedoch speziell bei 60 g/l (übliches Verfahren) angesetzt. Die Keim-gezuchteten bakteriellen Zellen sind solche, wie sie einer Schüttelzüchtung während 24 Stunden bei 30° 0 in einem Kulturmedium unterworfen werden. Das Kulturmedium bestand aus 50 ml/l Mais-Quellflüssigkeit; 50 ml/l V/eizenprotein-hydolisierter Flüssigkeit, aus welcher L-Glutaminsäure aufgesammelt worden war (diese Restflüssigkeit wird im nachstehenden als Aminosäure-Flüsuigkeit bezeichnet); 1 g/l KH₂EO^ und 1 g/l MgSO₄₁-7HgO. Nachdem auf diese Weise eine Schüttelkultivierung während 16 Stunden ausgeführt war, erreichte das Y/achstum des Bakteriums das Endstadium der logarithmischen Vermehrungsperiode. Die Glukose-Konzentration in dem Kulturmedium wurde kleiner als 0,05$, 20 ml an sterilisierter Lösung mit einem Gehalt an 5 g Glukose wurde aseptisch zugegeben, so daß sich die Gesamtmenge an zugegebener Glukose auf 60 g/l stellte; die Schüttelkultur wurde während waterer 72 Stunden bei 30° 0 fortgesetzt. Die L-Glutaminsäureanhäufung im Verlauf des Fortschreitens der Züchtung ist, im Vergleich zwischen der erfindungsgemäßen Methode und dem üblichen Verfahren, wie in Tabelle 2 dargestellt. If the cultivation was carried out as a contrast to this tactile experiment, and in parallel with it with 100 ml of culture medium, it was poured separately into a 500 ml flask; this culture medium had the same composition as that mentioned above, but the concentration of glucose alone was specifically set at 60 g / l (usual method). The germ-cultured bacterial cells are those subjected to shake cultivation for 24 hours at 30 ° C. in a culture medium. The culture medium consisted of 50 ml / l corn swelling liquid; 50 ml / l V / egg protein-hydrolyzed liquid from which L-glutamic acid was collected (this residual liquid is referred to below as amino acid liquid); 1 g / l KH ₂ EO ^ and 1 g / l MgSO ₄₁ -7HgO. After shaking cultivation was carried out in this way for 16 hours, the growth of the bacterium reached the end stage of the logarithmic growth period. The glucose concentration in the culture medium became less than 0.05 $, 20 ml of sterilized solution containing 5 g of glucose was added aseptically so that the total amount of added glucose was 60 g / l; the shaking culture was continued for 72 hours at 30 ° 0. The L-glutamic acid accumulation in the course of the progress of cultivation is as shown in Table 2 in comparison between the method of the present invention and the conventional method.

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'I C.'I C.

Tabel

Züchtzeit (h)Breeding time (h)

Verfahren gemäß der ErfindungMethod according to the invention

(mg/ml)(mg / ml)

Übliches Verfahren (mg/ml)Usual procedure (mg / ml)

4040

17.217.2

17.917.9

23.523.5

19.019.0

8888

23.323.3

19.119.1

Zusammensetzung des Kulturmediums:Composition of the culture medium:

GlukoseGlucose 12.5 g/l,12.5 g / l, KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 3.75 g/l,3.75 g / l, MgSO₄.7H₂OMgSO ₄ .7H ₂ O 0.625 g/l,0.625 g / l, MnSO₄.4H₂₀ MnSO ₄ .4H ₂₀ 0.0125 g/i,0.0125 g / i, FeSO₄-7H₂OFeSO ₄ -7H ₂ O 0.0125 g/l,0.0125 g / l, (HH₄)₂S0₄ (HH ₄ ) ₂ S0 ₄ 1.25 g/l,1.25 g / l, Harnstoffurea 15 g/1 und15 g / 1 and L-CystinL-cystine 0.1 g/l.0.1 g / l.

Gemäß der Erfindung ist es also möglich, obwohl die Fermentation unter Verwendung eines Kohlehydrates und anderer Bestandteile des Kulturmediums in durchaus der gleichen Menge wie bei dem konventionellen Verfahren durchgeführt wurde, die MengeThus, according to the invention, although fermentation was carried out using a carbohydrate and other components of the culture medium in quite the same amount as in the conventional method, it is possible to use the amount

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der anzusammelnden L-Glutaminsäure dadurch zu steigern, daß das Verfahren lediglich so durchgeführt wird, daß ein Kohlehydrat auf dem erfindungsgemäßen Y/ege zugegeben wird. Y/enn bei diesem Prüfversuch die Menge des in der Kulturbrühe vorliegenden Biotins zu der Zeit gemessen wurde, bei welcher Glukose zugegeben wurde, wobei die Messung durch eine bakteriumsquantitavie Methode erfolgte, so war diese Biotinmenge geringer als 0.005 n^g/rnl, was lediglich einen spurenhaften Unterschied im Bereich der Meßgenauigkeit bedeutet. Ferner war zu dieser Zeit die Anhäufung von L-Glutaminsaure nahezu nicht beobachtbar. Innerhalb 30 stunden, nachdem eine Glukoselösung zugegeben war, wurde etwa 30$>ige Vermehrung der Bakterien beobachtet. Be,r Prozeß nach der Zugabe einer G.lukoselb"sung kam als das E-Glutaminsäure-bildende Stadium dargestellt werden, in welchem das Kohlehydrat durch die katalytische Wirkung der Bakterien in.Abwesenheit von Biotin in !-Glutaminsäure umgewandelt werden soll.to increase the accumulated L-glutamic acid in that the process is carried out merely in such a way that a carbohydrate is added to the Y / ege according to the invention. Y / enn at in this test the amount of that present in the culture broth Biotins was measured at the time that glucose was added, the measurement being by a bacterium quantita- ve Method, this amount of biotin was less than 0.005 n ^ g / ml, which was only a slight difference in the range of measurement accuracy means. Furthermore, the accumulation of L-glutamic acid was almost not observable at that time. About 30 hours of proliferation of the bacteria was observed within 30 hours after a glucose solution was added. Be, r process after the addition of a G.lukoselmung came as the E-glutamic acid-forming Stage are represented in which the carbohydrate by the catalytic action of the bacteria in the absence of biotin can be converted into! -glutamic acid target.

Auch in dem lalle, in welchem die Operation in derselben Weise wie bei dem oben beschriebenen Versuch durchgeführt wurde, und zwar unter Verwendung eines Kulturmediums, zu dem Mais-Quellflüssigkeit anstelle des in obigem Beispiel verwendeten Biotins in einer Menge von 2.0 bis 5.0 ml/l zugegeben war, erwies es sich als möglich, L-Glutaminsäure in einer weit höls*en Ausbeute als bei dem üblichen Vorgehen anzusammeln. Dementsprechend braucht nicht eigens festgestellt zm werden, daß die erfindungsgemäße Methode zur Herstellung von !-GlutaminsäureAlso in the case in which the operation was carried out in the same manner as in the above-described experiment, using a culture medium to which corn swelling liquid was added instead of the biotin used in the above example in an amount of 2.0 to 5.0 ml / l was added, it was found possible to accumulate L-glutamic acid in far less yield than the usual procedure. Accordingly, need not separately stated zm are that the method according to the invention for producing! Glutamic acid

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in vorteilhafter Weise für eine gewerbliche Verwertung geeignet ist. Bei dem konventionellen Verfahren zur Gewinnung von L-G-lutaminsäure unter Zugabe der Gesamtmenge an Kohlehydrat, welche der Fermentation der L-G-lutaminsäure, ausgehend vom Be-•ginn der Fermentation an, dient, und selbst unter Zugabe von Biotin in einer solchen Menge, wie sie die Vermehrung der Bakterien unvollständig macht, ist die für den Kohlehydratmetabolismus erforderliche Zeit länger, da die Kohlehydratkonzentration in dem Kulturmedium höher wird. Darüber hinaus ist, was noch wesentlicher ist, der unökononiische Verbrauch des Kohlehydrates groß, so daß es unmöglich wird, die Ansammlung von L-Glutaiuinsäure unmittelbar zu steigern. Demgegenüber wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren das Kohlehydrat erst nach vollständiger Vermehrung der Bakterien zugegeben, so daß die Bakterien ihre Fähigkeit erweisen, L-Glutauiinsäure in höchstem Maße zu entwickeln. En ist deshalb möglich, den unökonomischen Verbrauch an Kohlehydrat zu reduzieren. Dabei erniedrigt sich, selbst wenn die Menge des zuzufügenden Kohlehydrates ansteigt, dessen Umwandlungswirkungsgrad in L-Glutaminsäure nicht. Dies kann in Übereinstimmung mit demjenigen Fall gesagt werden, in dem ein Kohlehydrat, welches der Fermentation von L-Glutaminsäure dient, gleichzeitig nach Vermehrung der bakteriellen Körper zugegeben wird, oder selbst mit dem Falle, in dem das Kohlehydrat in Unterbrechungen in kleiner Menge zugefügt wird.advantageously suitable for commercial use is. In the conventional process for obtaining L-G-lutamic acid with the addition of the total amount of carbohydrate, which of the fermentation of L-G-lutamic acid, starting from the beginning the fermentation is used, and even with the addition of biotin in such an amount as it is the propagation of the Making bacteria incomplete, the time required for carbohydrate metabolism is longer because the carbohydrate concentration increases becomes higher in the culture medium. Furthermore, what is more essential is the uneconomic consumption of the Carbohydrates are large so that it becomes impossible to immediately increase the accumulation of L-glutamic acid. In contrast, will in the method according to the invention, the carbohydrate is added only after the bacteria have fully reproduced, so that the Bacteria prove their ability to produce L-glutauic acid to the highest degree Develop dimensions. En is therefore possible to reduce the uneconomical consumption of carbohydrate. In doing so, even if the amount of carbohydrate to be added increases, its conversion efficiency into L-glutamic acid does not. this can be said in accordance with the case where a carbohydrate which is the fermentation of L-glutamic acid serves, at the same time as the bacterial body is added after multiplication, or even with the case in which the Carbohydrate is added in small amounts intermittently.

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Das erfindungsgemäß verwendete Kohlehydrat schließt Kohlehydrat ein, das im Zusammenhang mit der "betreffenden Bakterienart verwendbar ist} weiterhin kommen außer Glukose kohlehydrathaltige Substanzen in Frage, beispielsweise Fruktose, Sukrose, Melasse, saures (acidic) oder enzymatisches Hydrolysat von Stärke, etc. The carbohydrate used in the present invention includes carbohydrate one related to the "species of bacteria in question is usable} continue to come in addition to glucose containing carbohydrates Substances in question, for example fructose, sucrose, molasses, acidic or enzymatic hydrolyzate of starch, etc.

Wie oben im einzelnen festgestellt, ist das hier vorgeschlagene Verfahren zur Gewinnung von L-Glutaminsäure vollständig neu und betrifft die Verwendung bakterieller Zellen eines zur Ausbildung von !-Glutaminsäure befähigten Mikroorganismus als Katalysator, und zwar in Form lebender Zellen, durch welche ein Kohlehydrat äußert effektiv in !-Glutaminsäure umgewandelt wird.As stated in detail above, the process proposed herein for obtaining L-glutamic acid is complete new and relates to the use of bacterial cells of a microorganism capable of producing! -glutamic acid as a catalyst, namely in the form of living cells, through which a carbohydrate is effectively converted into! -glutamic acid will.

Die Erfindung wird anhand nachstehender Arbeitsbeispiele weiter erläutert. ·The invention is further illustrated by the following working examples. ·

Example 1;

Microbacterium ammoniaphilum (die neue Art ist in .... beschrieben) wurde in einem Kulturmedium einer Rüttelkultivie-r rung während 24 Stunden bei 30° C unterworfen. Das Kulturmedium bestand aus 50 ml/l Mais-Quellflüssigkeit; 50 ml/l Aminosäureflüssigkeit,· 1 g/l KH₂PO₄ und 1 g/l MgSO^·7Η₂0. Auf dieseMicrobacterium ammoniaphilum (the new species is described in ...) was subjected to shake cultivation for 24 hours at 30 ° C. in a culture medium. The culture medium consisted of 50 ml / l corn swelling liquid; 50 ml / l amino acid liquid, · 1 g / l KH ₂ PO ₄ and 1 g / l MgSO ^ · 7Η ₂ 0. On this

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Weise wurde eine Vorkulturbrühe hergestellt. 300 ml davon wurden hierauf in eine klein bemessene Kultivierungszelle mit 10 1 Fassungsvermögen eingeimpft, welche 5 1 Kulturmedium enthielt. Die Zusammensetzung dieses Kulturmediums erfaßte 10 g/l Glukose; .2 g/l KH₂PO₄; 0,5 g/l MgSO₄^H₂O; 0,01 g/l FeSO₄^H₂O; 0,02 g/l MnSO₄·4Η₂0; 1 g/l (KH₄)₂S0₄; 0,1 g/l I-Cystin und 2»5 μ g/l Biotin. Die Kulturbedingungen wurden so eingestellt, daß die Belüftung 7 1 je Minute, die Agitationsgesohwindigkeit 450 U/min, und die Temperatur 30° 0 betrugen. Sobald der Stickstoff* ab der 6. Stunde nach dem Beginn der Züchtung knapp wurde, wurde Stickstoff schrittweise eingespeist, und zwar durch Einblasen von Amnioniakgas. (Der pH-Wert betrug zu dieser Zeit 7,0 bis 8,0). Von der 16. Stunde an wurde mit der schrittweisen Zugabe von 50$ Glukoselösung begonnen; diese Lösung wurde in einer Menge von 28 ml je Stunde im Durchschnitt und in einer Gesamtmenge von 1400 ml ingesamt zugegeben. In 39 Stunden wurde die Ansammlung von L-Glutaminsäure maximal, nämlich 6317 mg/ml. Das Ausbeuteverhältnis der L-Glutaminsäure bezüglich der verwendeten Glukose betrug 51»A preculture broth was prepared. 300 ml of this were then inoculated into a small-sized cultivation cell with a capacity of 10 1, which contained 5 1 of culture medium. The composition of this culture medium included 10 g / l of glucose; .2 g / l KH ₂ PO ₄ ; 0.5 g / l MgSO ₄ ^ H ₂ O; 0.01 g / l FeSO ₄ ^ H ₂ O; 0.02 g / l MnSO ₄ · 4Η ₂ 0; 1 g / l (KH ₄ ) ₂ SO ₄ ; 0.1 g / l I-cystine and 2 »5 μg / l biotin. The culture conditions were set so that the aeration was 7 liters per minute, the agitation speed was 450 rpm, and the temperature was 30 °. As soon as the nitrogen * became scarce from the 6th hour after the start of the cultivation, nitrogen was gradually fed in by blowing in amnionia gas. (The pH at that time was 7.0 to 8.0). From the 16th hour the gradual addition of 50 $ glucose solution was started; this solution was added in an amount of 28 ml per hour on average and in a total amount of 1400 ml in total. In 39 hours, the accumulation of L-glutamic acid became maximal, namely 6317 mg / ml. The yield ratio of L-glutamic acid in relation to the glucose used was 51 »

Example 2:

Die Impfkultür aus Beispiel 1 wurde mit Bakterien der Art Nr. 129 Q des Ooryne-Typs geimpft (eine Art, welche in .... beschrieben ist)j es wurde während 24 Stunden bei 30° C unterThe inoculation culture from example 1 was inoculated with bacteria of the species No. 129 Q of the Ooryne type (a species which is described in ....) j it was under

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aerobisehen Bedingungen zum Zwecke der Herstellung einer Keim-Kultur "brühe kultiviert. Andererseits wurden 10 1 Kulturmedium, in dem die Ausgangskohlehydratkonzentration 1$ betrug, in eine klein ausgebildete Kulturzelle von 20 1 Fassungsvermögen eingebracht. Das Kulturmedium hatte folgende Zusammensetzung: 10 g/l Glukose; 2 g/l KH₂PO₄J 0,5 g/l MgSO₄·7H₂O; 5 ml/l Mais-Quellflüssigkeit; 4 g/l Harnstoff und 2 g/l (NH₄)₂S0₄· Hierauf wurde mit 500 ml der genannten Keim-Kulturbrühe geimpft und aerobisch unter Belüftung mit 10 1 je Minute und einer Agitationsgeschwindigkeit von 450 U/min, kultiviert. Die Stickstoffquelle, welche ab der 6. Stunde nach dem Beginn der Züchtung knapp wurde, wurde schrittweise durch Einblasen von Ammoniakgas nachgeliefert. (Der pHrWert betrug zu diesem Zeitpunkt 7,0 bis 8,0.) In der 16. Stunde nach Beginn der Kultivierung wurden 1,8 1 an 50$ Glukoselösung aseptisch zugefügt, so daß sich die Gesamtmenge des zugegebenen Kohlehydrates auf 1000 g einstellte. Die Kultivierung wurde hierauf weiter fortgesetzt. Auf diese Weise betrug die Menge der gebildeten L-Glutaminsäure nach 70 Stunden 38,4 mg/ml.On the other hand, 10 liters of culture medium in which the starting carbohydrate concentration was 1 $ was placed in a small-sized culture cell of 20 liters capacity. The culture medium had the following composition: 10 g / l of glucose ; 2 g / l KH ₂ PO ₄ J 0.5 g / l MgSO ₄ 7H ₂ O; 5 ml / l corn swelling liquid; 4 g / l urea and 2 g / l (NH ₄ ) ₂ S0 _{4 then} was inoculated with 500 ml of the above-mentioned germ culture broth and cultivated aerobically with aeration at 10 liters per minute and an agitation speed of 450 rpm In the 16th hour after the start of cultivation, 1.8 liters of 50 $ glucose solution was added aseptically, so that the total amount of the added carbohydrate was added adjust to 1000 g llte. The cultivation was then continued. In this way, the amount of L-glutamic acid formed was 38.4 mg / ml after 70 hours.

Example 3:

500 ml einer Keim-Kulturbrühe, welche in derselben Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung von Bacillus giganteus n. s. p, (eine Art gemäß der japanischen Patentveröffentlichung Kr. .12 643/I96O) kultiviert war, wurden in ein Kulturmedium einge-500 ml of a germ culture broth prepared in the same manner as in Example 1 using Bacillus giganteus n. s. p, (a species disclosed in Japanese Patent Publication Kr. .12 643 / I96O) were cultivated in a culture medium.

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impft, in welchem die Ausgangskohlehydratkonzentration 1$ betrug. Dieses Kulturmedium hatte die folgende Zusammensetzung: 10 g/l Glukose; 7 g/l KH₂PO₄; 0,5 g/l MgSO₄; 4 ml/l Mais-Quellflüssigkeit; 4 g/l Harnstoff und 2 g/l (NIL)₂SCh. Die Züchtung verlief unter genau denselben Bedingungen wie in Beispiel 2. Die Stickstoffquelle, welche mit dem Fortschreiten der Kultivierung knapp wurde, wurde durch Zugabe von Harnstoff allmählich nachgeliefert. In der 16. Stunde wurden 1,8 1 an 5O9& Glukoselösung zugegeben und die Züchtung während 42 Stunden durchgeführt. Die Menge an gebildeter L-Glutaminsäure betrug 35,9 mg/ml.vaccinated in which the starting carbohydrate concentration was $ 1. This culture medium had the following composition: 10 g / l glucose; 7 g / l KH ₂ PO ₄ ; 0.5 g / l MgSO ₄ ; 4 ml / l corn swelling liquid; 4 g / l urea and 2 g / l (NIL) ₂ SCh. The cultivation proceeded under exactly the same conditions as in Example 2. The nitrogen source, which became scarce as the cultivation progressed, was gradually replenished by adding urea. In the 16th hour, 1.8 liters of 509 & glucose solution were added and the cultivation was carried out for 42 hours. The amount of L-glutamic acid formed was 35.9 mg / ml.

Example 4:

500 ml einer Keim-Kulturbrühe, welche in derselben Ϋ/eise wie in Beispiel 1 unter Verwendung von Microbacterium flavum var. Glutamicum Al¹GG 13 693 (die Art gemäß britischer Patentschrift 885 611) kultiviert war, wurden in ein Kulturmedium eingeimpft, in dem die Ausgangskohlehydratkonzentration 15ε betrug. Dieses Kulturmedium hatte die nachstehende Zusammensetzung: 10 g/l Glukose; 2 g/l KH₂PO₄; 0,5 g/l MgSO₄; 0,01 g/l FeSo₄^H₃O, 0,02 g/l MnS0₄«4H₂0; 0,1 g/l (MH₄)₂S0₄ und 1,4 g/l Harnstoff. Es wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 gezüchtet. In der 16. Stunde wurden 1,8 1 an 50$ Glukoselösung500 ml of a germ culture broth which was cultivated in the same Ϋ / ice as in Example 1 using Microbacterium flavum var. Glutamicum Al ¹ GG 13 693 (the type according to British patent specification 885 611) were inoculated into a culture medium in which the starting carbohydrate concentration was 15ε. This culture medium had the following composition: 10 g / l glucose; 2 g / l KH ₂ PO ₄ ; 0.5 g / l MgSO ₄ ; 0.01 g / l FeSo ₄ ^ H ₃ O, 0.02 g / l MnS0 ₄ «4H ₂ 0; 0.1 g / l (MH ₄ ) ₂ S0 ₄ and 1.4 g / l urea. It was grown under the same conditions as in Example 1. In the 16th hour, 1.8 liters of 50 $ glucose solution became

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zugegeben; die Kultivierung vrar&e vielter fortgesetzt. Die Menge an gebildeter L-Glutaminsäure betrug nach 73 Stunden 39,5 mg/ml.admitted; the cultivation vrar & e continued much more. the The amount of L-glutamic acid formed was after 73 hours 39.5 mg / ml.

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Claims

Patent claims

Process for the production of L-glutamic acid by fermentation, characterized in that! -Glutamic acid producing Bacteria are grown in a culture medium whose carbohydrate concentration is in the range of 1 to 2 $, further that at this time biotin or a biotin-containing natural Substance is added at least in such an amount as it is for the maximum increase in the range mentioned Carbohydrate concentration is required and that the number of bacteria is increased to the maximum level, as well that a carbohydrate is then added to the resulting culture broth in order to effectively accumulate L-grlutamic acid.

2. The method according to claim 1, characterized in that the resulting culture broth is a carbohydrate and a nitrogen source be added.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the bacteria Microbacterium ammoniaphilum; Bacteria Type Coryne Art No. 129 G; Bacillus giganteus and / or Microbacterium flavum var. Glutamicum can be used.

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4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the culture broth under fermentation gradually introducing carbohydrate and ammonia-like nitrogen.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the culture broth under fermentation gradually carbohydrate and urea are introduced.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that in the under fermentation culture "broth a carbohydrate is gradually introduced.

7. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized in that glucose, fructose, sucrose are used as carbohydrate substances.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized characterized that waste molasses as carbohydrate substances, acidic or enzymatic starch hydrolyzate be used.

9. The method according to claim T or 2, characterized in that that the culture medium biotin at least in such a. Amount is added as required for the maximum increase is.

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10. The method according to claim 1 or 2, characterized in that that the culture medium a biotin-containing natural substance is added at least in such an amount as it is necessary for maximum propagation.

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