DE1442075B2 - METHOD FOR OBTAINING BCG CULTURES - Google Patents
METHOD FOR OBTAINING BCG CULTURESInfo
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Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von BCG-Kulturen in technischem Maßstab. Das abgeschwächte Mycobacterium tuberculosis var. BCG (Bac. Calmette-Guerin) wird als Lebendvaccine zur Immunisierung gegen Tuberculose verwendet. Auch B CG-Zellextrakte weisen eine gewisse immunisierende Wirkung auf. Für die Herstellung der Vaccine und Zellextrakte in großem Maßstab sollten entsprechend große, einheitliche und lebensfähige Zellmengen zur Verfugung stehen. Das war aber bisher nicht der Fall. BCG ist hinsichtlich der Züchtung sehr empfindlich. Es gelang bisher nicht, BCG in technischem Maßstab in den üblichen Fermentern aus rostfreiem Stahl unter Belüftung und Rühren herzustellen, da BCG unter diesen Bedingungen nicht oder nur sehr langsam wuchs.The invention relates to a process for obtaining BCG cultures on an industrial scale. The attenuated Mycobacterium tuberculosis var. BCG (Bac. Calmette-Guerin) is called live vaccine used for immunization against tuberculosis. B CG cell extracts also show a certain degree of immunizing effect on. For the production of vaccines and cell extracts on a large scale you should Correspondingly large, uniform and viable amounts of cells are available. But that was so far not the case. BCG is very sensitive to breeding. So far, BCG has not succeeded in technical Manufacture scale in the usual fermenters made of stainless steel with aeration and stirring, because BCG did not grow or only very slowly under these conditions.
So konnte BCG beispielsweise nicht in Fermentern mit den in Bergeys Manual 1957, S. 701, 702, beschriebenen glycerinhaltigen Nährmedien oder mit den in der deutschen Patentschrift 931525 beschriebenen Polyglycolester enthaltenden Nährmedien gezüchtet werden. _ For example, BCG could not be used in fermenters with those described in Bergeys Manual 1957, pp. 701, 702 glycerol-containing nutrient media or with those described in German patent 931525 Culture media containing polyglycol esters are grown. _
Es wurde nun gefunden, daß die Zusammensetzung der Nährlösung, speziell hinsichtlich der Kohlenstoffquellen und des Zusatzes von oberflächenaktiven Stoffen, sowie geringe Belüftung und Rührung für die Züchtung von BCG in technischem Maßstab von ausschlaggebender Bedeutung sind.It has now been found that the composition of the nutrient solution, especially with regard to the carbon sources and the addition of surfactants, as well as low aeration and agitation for the Breeding of BCG on an industrial scale are of paramount importance.
Es zeigte sich, daß die Kombination von Glycerin mit Polyoxyäthylensorbitanhydridmonooleat optimales Wachstum des BCG in Fermentern ermöglicht. Die Anteile der beiden Komponenten hängen von den übrigen Nährlösungsbestandteilen ab. Glycerin wird in Konzentrationen von 20 bis 100 g/Liter Nährlösung, Polyoxyäthylensorbitanhydridmonooleat in solchen von 1 bis 20 g/Liter beigefügt. Die übrigen Nährlösungsbestandteile, Stickstoffquellen, Salze, Spurenelemente, entsprechen im wesentlichen den in der Literatur für die Züchtung von BCG angegebenen Medien. Die Belüftung soll schwach sein, nämlich 0,1 bis 0,5 Vol. Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute betragen. Auch die Rührung soll niedrig gehalten werden, nämlich bei etwa 50 bis 100 Umdrehungen pro Minute. Die Inkubationstemperatur in den Fermentern beträgt vorzugsweise 370C. Zur Beimpfung der Fermenter dienen 6 bis 9 Tage alte, bei 37° C inkubierte Schüttelkulturen; man beimpft mit 2 bis 5 Volumprozent Schüttelkultur.It was found that the combination of glycerol with polyoxyethylene sorbitol anhydride monooleate enables optimal growth of the BCG in fermenters. The proportions of the two components depend on the other components of the nutrient solution. Glycerin is added in concentrations of 20 to 100 g / liter nutrient solution, polyoxyethylene sorbitan anhydride monooleate in concentrations of 1 to 20 g / liter. The remaining nutrient solution components, nitrogen sources, salts, trace elements, essentially correspond to the media specified in the literature for the cultivation of BCG. The ventilation should be weak, namely 0.1 to 0.5 vol. Air per vol. Nutrient solution per minute. The agitation should also be kept low, namely at around 50 to 100 revolutions per minute. The incubation temperature in the fermenters is preferably 37 0 C. For inoculation of the fermenter are used 6 to 9 day old, at 37 ° C incubated shake; one inoculates with 2 to 5 volume percent shaking culture.
Das Verfahren zur Gewinnung von BCG-Kulturen in technischem Maßstab durch Züchten von BCG unter aeroben Bedingungen in einer Nährlösung, welche eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie anorganische Salze enthält, ist somit dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung in einem Fermenter unter Verwendung einer Nährlösung, die 20 bis 100 g Glycerin/Liter als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie 1 bis 20 g Polyoxyäthylensorbitanhydridmonooleat/Liter enthält, durchführt, wobei man mit 0,1 bis 0,5 Vol. Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute belüftet und mit etwa 50 bis 100 Umdrehungen pro Minute rührt.The process of obtaining BCG cultures on an industrial scale by growing BCG under aerobic conditions in a nutrient solution, which is a carbon and nitrogen source as well as inorganic Contains salts is thus characterized in that cultivation is carried out in a fermenter using a nutrient solution containing 20 to 100 g glycerine / liter as a carbon and energy source and 1 to 20 g Contains polyoxyethylene sorbitan anhydride monooleate / liter, carries out, with 0.1 to 0.5 vol. Air per vol. Nutrient solution per minute aerated and with about Stirring from 50 to 100 revolutions per minute.
Vorteilhafterweise soll die Nährlösung neben Albumin als Stickstoffquelle 50 bis 80 g Glycerin und 1 bis 5 g Polyoxyäthylensorbitanhydridmonooleat pro Liter enthalten.Advantageously, the nutrient solution should in addition to albumin as a nitrogen source 50 to 80 g of glycerol and 1 to 5 g of polyoxyethylene sorbitan anhydride monooleate per liter contain.
In weiterer Ausgestaltung soll die Nährlösung neben synthetischen Stickstoffquellen etwa 50 g Glycerin und 10 bis 15 g Polyoxyätnylensorbitanhydridmonooleat pro Liter enthalten.In a further embodiment, the nutrient solution should be about 50 g of glycerine and synthetic nitrogen sources Contain 10 to 15 g of polyoxyethylene sorbitol anhydride monooleate per liter.
Das Wachstum der Kultur wird tubidimetrisch verfolgt, z. B. indem die Lichtabsorption bei 655 πιμ. in einem photoelektrischen Kolorimeter gemessen wird.The growth of the culture is followed tubidimetrically, e.g. B. by the light absorption at 655 πιμ. in a photoelectric colorimeter is measured.
Man erntet bei einer optischen Dichte von 2 bis 10, entsprechend etwa 1 bis 5 g Zelltrockengewicht pro Liter Kulturlösung. Diese Dichte ist nach 5 bis 15 Tagen erreicht. Für die Propagation in höhere Fermentstufen verwendet man Kulturen mit einer optischen Dichte von 1 bis 3, wie sie nach etwa 4- bis 6tägiger Inkubation erhalten wird.You harvest at an optical density of 2 to 10, corresponding to about 1 to 5 g of dry cell weight per Liter of culture solution. This density is reached after 5 to 15 days. For propagation in higher Fermentation stages use cultures with an optical density of 1 to 3, as they are after about 4 to 6 days of incubation is obtained.
Wenn die gewünschte Dichte erreicht ist, werden die Bakterien von der Nährlösung abgetrennt, .beispielsweise
durch Zentrifugieren. Sie können zwecks Herstellung von BCG-Vaccine gefriergetrocknet oder zur
Gewinnung von Zellextrakten aufgearbeitet werden. Falls die BCG-Kulturen zur Herstellung von Vaccinen
verwendet werden sollen, müssen sie einen möglichst großen Gehalt an Lebendzellen (im Verhältnis
zur Gesamtzahl der Zellen) aufweisen und ferner relativ unempfindlich sein gegenüber Einflüssen von Temperatur,
Druck, Suspensionsmittel usw., wie sie bei der Herstellung und Lagerung der Vaccine auftreten.
Um derart beständige Lebendkulturen zu erhalten, verwendet man als Ausgangsmaterial bei dem obigen
Verfahren vorzugsweise Kulturen, die dadurcherhalten wurden, daß man eine BCG-Kultur den Bedingungen
der Herstellung und Lagerung der Vaccine unterwirft und die unter diesen.Bedingungen am besten beständigen
Einzelkulturen selektioniert. Bei der Herstellung lyophilisierter BCG-Vaccine geht man beispielsweise
so vor, daß man eine BCG-Kultur lyophilisiert, längere Zeit, beispielsweise 1 bis 6 Monate, bei einer eventuellen
Lagerungstemperatur der Vaccine, beispielsweise 37° C, lagert, dann suspendiert, die Suspension auf
einen festen Nährboden in solcher Konzentration aussät, daß die Kolonien getrennt wachsen, einzelne Einzell-Kolonien
in flüssigem Nährmedium vermehrt, dieWhen the desired density is reached, the bacteria are separated from the nutrient solution, for example by centrifugation. They can be freeze-dried for the production of BCG vaccines or processed to obtain cell extracts. If the BCG cultures are to be used for the production of vaccines, they must have the highest possible content of living cells (in relation to the total number of cells) and also be relatively insensitive to the effects of temperature, pressure, suspending agents, etc., as in the Manufacture and storage of the vaccine occur.
In order to obtain such stable live cultures, the starting material used in the above process is preferably cultures which have been obtained by subjecting a BCG culture to the conditions for the production and storage of the vaccines and selecting the individual cultures which are most stable under these conditions. When preparing lyophilized BCG vaccines, the procedure is, for example, that a BCG culture is lyophilized, stored for a prolonged period, for example 1 to 6 months, at a possible storage temperature of the vaccine, for example 37 ° C., then the suspension is suspended sows a solid nutrient medium in such a concentration that the colonies grow separately, individual single-cell colonies multiplied in liquid nutrient medium
1 442 Q751 442 Q75
3 43 4
so erhaltenen Einzell-Kulturen lyophilisiert, zur Fest- B e i s d i e 1 2
Stellung der Überlebensrate auf feste Nährböden aussät, die Einzell-Kulturen mit größter Überlebensrate Unter den im Beispiel 1 angegebenen Bedingungen
auswählt und als Ausgangsmaterial für das erfindungs- wird in einem 50-Liter-Fermenter eine BCG-Kultur in
gemäße Verfahren verwendet. 5 30 Liter einer Nährlösung gezüchtet, die pro Litersingle-cell cultures obtained in this way are lyophilized, to solidify the 1 2
Setting the survival rate on solid nutrient media sows the single-cell cultures with the highest survival rate under the conditions specified in Example 1 and uses a BCG culture in a 50-liter fermenter according to the method as the starting material for the invention. 5 30 liters of a nutrient solution grown per liter
Die Lyophilisierungstemperatur beträgt Vorzugs- folgende Zusammensetzung hat:The lyophilization temperature is preferably the following composition:
weise -15 bis -2O0C, der Druck 0,02 mm Hg. Die zu Glycerin 50 0 gwise -15 to -2O 0 C, the pressure 0.02 mm Hg. The glycerol to 50 0 g
lyophilisierende Bakteriensuspension soll möglichst Polyoxyäthylensorbit Lyophilizing bacterial suspension should, if possible, be polyoxyethylene sorbitol
schnell bei etwa -5O0C tiefgefroren werden (Tempera- anhydridmonooleat 15,0 gbe frozen quickly at about -5O 0 C (temperature anhydride monooleate 15.0 g
turabfall 3 bis 4° pro Minute). Die Lyophihsierung io Natriumacetat 10gdrop of 3 to 4 ° per minute). Lyophilization io sodium acetate 10g
wird in Gegenwart eines »Trocknungsmediums«, z. B. L-Asparagin 2Ό gis in the presence of a "drying medium", e.g. B. L-asparagine 2Ό g
einer wäßrigen Lösung von Dextran (5%), Natrium- Casein 10 gan aqueous solution of dextran (5%), sodium casein 10 g
glutamat (5 °/0) und Zucker (5 %) (vgl. Greaves, Hefeextrakt 3*0 gglutamate (5 ° / 0) and sugar (5%) (see FIG. Greaves, yeast extract 3 * 0 g
Ann.N.YAcad. Sei 85 S. 723 [I960]) vorgenommen. Kaliumphosphat', prim." '.'.'.'.'. 1^0 gAnn.N.YAcad. Sci. 85 p. 723 [1960]). Potassium phosphate ', prim. "'.'.'.'.'. 1 ^ 0 g
Das Lyophilisat enthalt 1 bis 2«/0 Wasser. *5 Natriumpho?phat, sek.,The lyophilizate contains "/ 0 water 1 to 2. * 5 sodium phosphate, sec.,
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen be- 12 H O 2 5εThe invention is illustrated in the following examples
schrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden Ferriammoniumcitrat ".'.'.'.'.'.'. lo'mgwrote. The temperatures are in degrees Celsius Ferriammonium Citrate ". '.'. '.'. '.'. Lo'mg
angegeben. Magnesiumsulfat, 7 H2O 10 mgspecified. Magnesium sulfate, 7H 2 O 10 mg
B e i s ρ i e 1 1 Calciumchlorid, 6 H2O 0,5 mgB eis ρ ie 1 1 calcium chloride, 6 H 2 O 0.5 mg
' τ . ' „ τ. ■ ,, . , Α .,. ., 20 Zinksulfat, 7 H2O 0,1 mg' τ . '" Τ . ■ ,,. , Α .,. ., 20 zinc sulfate, 7 H 2 O 0.1 mg
In einem 50-Liter-Fermenter (der m der Antibiotika- Kupfersulfat 5 H O 0 1 mgIn a 50 liter fermenter (the m the antibiotic copper sulfate 5 HO 0 1 mg
Produktion üblichen Bauweise) mit Luftverteiler, deionisiertes Wasser '.'.'.'.'.'.'.'.'. ad 1000 ml
Ruhrer und Temperaturregulator werden 30 LiterProduction usual construction) with air distributor, deionized water '.'. '.'. '.'. '.'. '. ad 1000 ml
Stirrer and temperature regulator are 30 liters
Nährlösung eingefüllt, welche pro Liter folgende Zu- Die Lösung wird 20 Minuten bei 120° und 1,2 atüNutrient solution filled in, which per liter of the following add- The solution is 20 minutes at 120 ° and 1.2 atm
sammensetzung hat: 25 autoklaviert.has composition: 25 autoclaved.
Glycerin 75 0 2 Nach 10 Tagen weist die Kulturlösung eine optischeGlycerin 75 0 2 After 10 days, the culture solution has an optical
Polyoxyäthylensorbit- '" ■ ' Dichte von 5,65 (bei 655 πιμ) auf, entsprechend etwaPolyoxyäthylensorbit- '"■' density of 5.65 (at 655 πιμ), corresponding to about
anhydridmonooleat 2,0 g 2,8 g Zelltrockengewicht pro Liter. ; anhydride monooleate 2.0 g 2.8 g dry cell weight per liter. ;
Albuminlösung 5«/oig ........ 50,0 g Verwendet man eine Nährlösung die statt GlycerinAlbumin Solution 5 "/ o ig ........ 50.0 g Using a nutrient solution instead of the glycerol
L-Apsaragin 20s 30 und Polyoxyathylensorbitanhydndmonooleat 10,0gL-asparagine 20s 30 and polyoxyethylene sorbitan anhydride monooleate 10.0g
Casein " " 10 2 Glucose und 15,0 g p-Isooctylpolyoxyäthylenphenol-Casein "" 10 2 glucose and 15.0 g of p-Isooctylpolyoxyäthylenphenol-
Kaiiumphösphat;primV:::::: i!og ™reres^thält'so ist die optische Dichte nach Kaiiumphösphat; primV :::::: i! O g ™ r eres ^ tholds ' so the optical density is after
Natriumphosphat, sek., IU lagen 0,2/.Sodium phosphate, sec., IU were 0.2 /.
12H2O 2,5g Beispiel 312H 2 O 2.5g Example 3
Ferriamoniumcitrat 10,0 mg 35 ., , . .. .. T. „ . . , ,„ T..Ferriamonium Citrate 10.0 mg 35 .,,. .. .. T. ". . ,, " T ..
Magnesiumsulfat, 7 H2O 10,0 mg '' Man beimpft 50-Liter-Fermenter, welche 30 LiterMagnesium sulphate, 7H 2 O 10.0 mg '' Man inoculates 50-liter fermenters, which contain 30 liters
Calciumchlorid, 6 H2O 0,5 mg . ^ ™ Beuspiel 2 genannten Nährlösung enthalten mitCalcium chloride, 6H 2 O 0.5 mg. ^ ™ Example 2 mentioned nutrient solution included with
7,-,,Uo11IfO+ Tun ■ λι ^Z 900ml einer Schuttelkultur, die in-Erlenmeyerkolben7, - ,, Uo 11 IfO + Tun ■ λι ^ Z 900ml of a shake culture, the in-Erlenmeyer flask
Kupfersulfat 5 H O 0 1 mg wie im ^eisPiel 1 beschrieben, aber in einer NährlösungCopper sulfate 5 HO 0 1 mg as described in the ^ eis P ie l 1, but in a nutrient solution
deionisiertes Wasser '.'.'.'.'.'.'.'.'. ad lOOo'ml *° von der im Bfs^1 2 angegebenen ZusammensetzungDeionized water '.'. '.'. '.'. '.'. '. ad 100o'ml * ° of the composition given in B f s ^ 1 2
gezogen wurde. Nach 4- bis 6tagiger Inkubation derwas pulled. After 4 to 6 days of incubation of the
Die Nährlösung wird vor dem Einfüllen, ohne Zu- Fermenter werden je 15 Liter der Kulturlösung inThe nutrient solution is poured in, without adding a fermenter, 15 liters of the culture solution are in each
satz der Aluminlösung, 20 Minuten bei 120° und 500-Liter-Fermenter mit 300 Liter Nährlösung über-set of aluminum solution, 20 minutes at 120 ° and 500 liter fermenter with 300 liters of nutrient solution
1,2 atü autoklaviert, dann die an zwei aufeinander- tragen. Die 500-Liter-Fermenter entsprechen im Bau1.2 atmospheres autoclaved, then the two on top of each other. The 500 liter fermenter is equivalent in construction
folgenden Tagen je 2 Stunden bei 56° inaktivierte, 45 den 50-Liter-Fermentern. Die Züchtung erfolgt beiThe following days, 45 the 50-liter fermenters were inactivated for 2 hours at 56 °. Breeding takes place at
durch ein Seitzfilter filtrierte Albuminlösung hinzu- 37°, bei einer Belüftung von 0,1 bis 0,5 Vol. Luft proAlbumin solution filtered through a Seitz filter added 37 °, with an aeration of 0.1 to 0.5 vol. Air per
gegeben. Man beimpft den Fermenter mit 900 ml einer Vol. Nährlösung pro Minute und unter Rühren mitgiven. The fermenter is inoculated with 900 ml of a volume of nutrient solution per minute and with stirring
9 Tage alten, in 500-ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 Umdrehungen pro Minute. Nach 7tägiger Inkuba-9 days old, in 500 ml Erlenmeyer flasks with 100 revolutions per minute each. After 7 days of incubation
100 ml Nährlösung auf einer rotierenden Schüttel- tion beträgt die optische Dichte 4 bis 6, entsprechend100 ml nutrient solution on a rotating shaker has an optical density of 4 to 6, correspondingly
maschine gezogenen BCG-Kultur, die eine optische 50 2 bis 4 g Zelltrockengewicht pro Liter Kulturlösung.machine-grown BCG culture, which has an optical 50 2 to 4 g dry cell weight per liter of culture solution.
Dichte von 0,3 bis 0,4 (Messung bei 655 ΐημ) aufweist Die Ausbeute kann durch Verlängerung der Züch-Has a density of 0.3 to 0.4 (measurement at 655 ΐημ) The yield can be increased by extending the cultivation
(die Nährlösung der Erlenmeyerkolben entspricht der tungsdauer noch wesentlich erhöht werden,
obigen, enthält jedoch statt 50 ml Albuminlösung pro(the nutrient solution of the Erlenmeyer flask corresponds to the duration of the maintenance can be increased significantly,
above, but contains instead 50 ml of albumin solution per
Liter 100 ml und kein Glycerin und Polyäthylensorbit- Beispiel 4
anhydridmonooleat). Die Züchtung erfolgt bei 37°, bei 55Liter 100 ml and no glycerin and polyethylene sorbitol- Example 4
anhydride monooleate). The cultivation takes place at 37 °, at 55
einem Luftumsatz von 0,25 Vol. pro Vol. Nährlösung Zwecks Herstellung von Suspensionen für die Am-an air turnover of 0.25 vol. per vol. nutrient solution For the production of suspensions for the am-
pro Minute und unter Rühren mit einem oblätterigen pullierung und Lyophilisierung wird eine nach denper minute and while stirring with a flat pulling and lyophilization one after the
Turbinenrührer mit 50 Umdrehungen pro Minute. vorangehenden Beispielen erhaltene Kultur auf 4° abge-Turbine stirrer with 50 revolutions per minute. culture obtained from previous examples to 4 °
Nach 10 Tagen weist die Kulturlösung eine optische kühlt und mit einer kontinuierlichen Zentrifuge zentri-After 10 days, the culture solution has an optical cools and is centrifuged with a continuous centrifuge
Dichte von 4,40 (bei 655 χημ.), d. h. ein Zelltrocken- 60 fugiert. Das so gewonnene BCG-Sediment wird mitDensity of 4.40 (at 655 χημ.), I.e. H. a cell dry 60 fused. The BCG sediment obtained in this way is used with
gewicht von etwa 2,2 g pro Liter Kulturlösung, auf. einer sterilen 0,05°/0igen Albuminlösung (»Bovinweight of about 2.2 g per liter of culture solution. a sterile 0.05 ° / 0 albumin solution ( "Bovin
Verwendet man unter sonst gleichen Bedingungen Albumin Fraction V«, Hersteller Pentex Inc., Kanka-If, all other things being equal, Albumin Fraction V «, manufacturer Pentex Inc., Kanka-
eine Nährlösung, welche statt des Glycerins 75 g GIu- kee, Illinois) gewaschen.a nutrient solution which, instead of glycerine, washed 75 g (GIukee, Illinois).
cose enthält, so ist die optische Dichte nach 10 Tagen Zur Injektion verwendbare Suspensionen werden er-contains cose, the optical density is after 10 days. Suspensions that can be used for injection are
0,13; bei einer Nährlösung ohne Glycerin und mit nur 65 halten, wenn man das gewaschene BCG-Sediment bei-0.13; with a nutrient solution without glycerine and with only 65, if you keep the washed BCG sediment
0,5 g Polyoxyäthylensorbitanhydridmonooleat, jedoch spielsweise in physiologischer Kochsalzlösung suspen-0.5 g of polyoxyethylene sorbitan anhydride monooleate, but suspend, for example, in physiological saline
mit 100 statt 50 ml Albuminlösung pro Liter ist die diert.with 100 instead of 50 ml of albumin solution per liter, the dated one.
optische Dichte nach 10 Tagen 0,02. Zur Herstellung lyophilisierter Ampullen suspenoptical density after 10 days 0.02. Suspend for the production of lyophilized ampoules
diert man das gewaschene Sediment in einem »Trocknungsmedium« (1 g BCG-Trockengewicht pro Liter), das man herstellt, indem man 50 g Dextran, 50 g Natriumglutamat und 50 g Saccharose mit destilliertem Wasser auf 1 Liter auffüllt, auf 90° erhitzt bis zur vollständigen Lösung und nach dem Abkühlen auf etwa 30° zur Entkeimung seitzfiltriert. Dann wird die Sus- '·. pension in Ampullen abgefüllt. Mit einer Geschwindigkeit von 4C/Minute kühlt man die Ampullen auf —50° ab, bringt sie in den Gefriertrockner und lyophilisiert bei —15 bis —20° und 0,02 mm Hg.the washed sediment is dosed in a "drying medium" (1 g BCG dry weight per liter), which is prepared by making up to 50 g dextran, 50 g sodium glutamate and 50 g sucrose with distilled water to 1 liter, heated to 90 ° to completely dissolve and after cooling to about 30 ° for sterilization. Then the sus- '·. pension filled in ampoules. At a rate of 4 C / min, it is cooled to -50 ° from the ampules, they bring into the freeze dryer and lyophilized at -15 to -20 ° and 0.02 mm Hg.
Die Ampullen werden in einem mit einer Diffusionspumpe evakuierten Exsikkator mit Blaugel bei 0,02 mm Hg nachgetrocknet, mit chemisch reinem, wasserfreiem Stickstoff begast und zugeschmolzen. Der Endwassergehalt der Vaccine beträgt 1 bis 20I0. The ampoules are dried in a desiccator evacuated with a diffusion pump with blue gel at 0.02 mm Hg, gassed with chemically pure, anhydrous nitrogen and melted shut. The final water content of the vaccine is 1 to 2 0 I 0 .
Zur Herstellung von Lebendkulturen, die sich insbesondere eignen zur Herstellung von stabilen lyophilisierten Vaccinen mit hoher Anzahl von lebenden Keimen und guter Resuspendierbarkeit, verwendet man ein Ausgangsmaterial, das wie folgt erhalten wird:For the production of live cultures, which are particularly suitable for the production of stable lyophilized Vaccines with high numbers of living germs and good resuspendability are used a starting material obtained as follows:
Mit einer sterilen 0,05°/0igen Albuminlösung Fraktion V gewaschenes BCG-Sediment wird, wie im Beispiel 4 beschrieben, in einem »Trocknungsmedium« suspendiert (optische Dichte 0,4 bis 0,6 bei 655 πιμ) und unter den angegebenen Bedingungen lyophilisiert. Das Lyophilisat wird 6 Monate bei 37° gelagert und dann in einer 0,25%igeri Albuminlösung Fraktion V resuspendiert. Man gießt die Suspension auf Löwenstein-Jensen-Platten in Petrischalen aus, so daß pro Petrischale nicht mehr als 100 Kolonien wachsen. Die Platten werden bei 37° inkubiert. Einzelne der entstandenen Einzell-Kolonien impft man ab in je 100 ml Nährlösung, z. B. die glycerinhaltige Lösung von Beispiel 2, die sich in 500-ml-Erlenmeyerkolben befindet, und inkubiert auf einer rotierenden Schüttelmaschine bei 120 Umdrehungen pro Minute bei 37°, bis die optische Dichte bei 655 ηιμ 0,5 bis 0,8 beträgt. Dann überträgt man je 5 °/0 der Kulturen in neue Schüttelkolben mit der gleichen Nährlösung (zwecks Gewin" nung einer homogenen Kultur), läßt bis zum Erreichen einer optischen Dichte von 1,0 bis 1,5 wachsen, zentrifugiert ab, wäscht das Sediment mit 0,05%iger Albuminlösung Fraktion V, suspendiert im obigen Trocknungsmedium und sät einen Teil auf Löwenstein-.Jensen-Platten aus, während man einen anderen Teil unter den im Beispiel 4 angegebenen Bedingungen lyophilisiert und dann auf Löwenstein-Jensen-Platten aussät. Beim Inkubieren der Platten zeigt sich, daß die Überlebensrate, d. h. das Verhältnis der Anzahl der lebenden Keime nach der Lyophilisierung zur Anzahl der lebenden Keime vor der Lyophilisierung, der verschiedenen Einzell-Kulturen sehr verschieden ist (vgl. Tabelle). Bei den Einzell-Kulturen mit großer Uberlebensrate handelt es sich um Kulturen, die aus einer genotypisch thermostabilen Mutante des BCG-Stammes hervorgegangen sind. Solche Kulturen ergeben bei der Züchtung nach dem in den Beispielen 1 bis 3 beschriebenen Verfahren in hohem Maße lyophilisierungs- und lagerungsbeständige Lebendkulturen, die zur Herstellung von lyophilisierten Vaccinen besonders geeignet sind. Die selektionierten Kulturen mit 100%iger Überlebensrate zeigen im Tierversuch die volle immunisierende Wirkung im Vergleich zu einer nicht lyophilisierten, frischen Lebendkultur.Using a sterile 0.05 ° / 0 aqueous solution of albumin fraction V washed BCG sediment is suspended in a "drying medium" as described in Example 4 (optical density 0.4 at 655 πιμ to 0.6) and under the conditions indicated lyophilized. The lyophilizate is stored at 37 ° for 6 months and then resuspended in fraction V in a 0.25% albumin solution. The suspension is poured onto Löwenstein-Jensen plates in Petri dishes so that no more than 100 colonies grow per Petri dish. The plates are incubated at 37 °. Individuals of the single-cell colonies formed are inoculated in 100 ml of nutrient solution each, e.g. B. the glycerol-containing solution from Example 2, which is in 500 ml Erlenmeyer flasks, and incubated on a rotating shaker at 120 revolutions per minute at 37 ° until the optical density at 655 ηιμ is 0.5 to 0.8. Then transmits every 5 ° / 0 of cultures in shake flasks using the same new nutrient solution (for the purpose threaded "voltage of a homogeneous culture), can grow until reaching an optical density of 1.0 to 1.5, centrifuged, wash the sediment with 0.05% albumin solution fraction V, suspended in the above drying medium and sown a part on Löwenstein-Jensen plates, while another part is lyophilized under the conditions given in Example 4 and then sown on Löwenstein-Jensen plates. Incubation of the plates shows that the survival rate, ie the ratio of the number of living germs after lyophilization to the number of living germs before lyophilization, of the various single-cell cultures is very different (see table) Cultures with a high survival rate are those which have emerged from a genotypically thermostable mutant of the BCG strain In the methods described in Examples 1 to 3, live cultures which are highly resistant to lyophilization and storage and which are particularly suitable for the production of lyophilized vaccines. The selected cultures with a 100% survival rate show the full immunizing effect in animal experiments compared to a non-lyophilized, fresh live culture.
frt+A if, O/ Survival
frt + A if, O /
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