DE1298283B - Process for dissolving so-called insoluble collagen by enzyme treatment - Google Patents

Process for dissolving so-called insoluble collagen by enzyme treatment

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DE1298283B
DE1298283B DEN25773A DEN0025773A DE1298283B DE 1298283 B DE1298283 B DE 1298283B DE N25773 A DEN25773 A DE N25773A DE N0025773 A DEN0025773 A DE N0025773A DE 1298283 B DE1298283 B DE 1298283B
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Kojima Hisao
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Description

Eiweißabbauende Enzyme mit einer optimalen Wirkung im sauren Bereich, wie Pepsin und eiweißabbauende Enzyme aus Mikroorganismen, sind bekannt. -.··■-Protein-degrading enzymes with an optimal effect in the acidic range, such as pepsin and protein-degrading ones Enzymes from microorganisms are known. -. ·· ■ -

Wenn sogenanntes unlösliches Kollagen mit einem solchen eiweißabbauenden Enzym bei einer Temperatur, die kleiner ist als die, bei der die Kollagenfasern schrumpfen, behandelt wird und wenn danach eine Behandlung mit verdünnter Säure erfolgt, so ergibt sich darin eine Dispersion von Kollagen, und man erhält eine Lösung von nicht aufbereiteten Kollagen-Molekülen mit einer stabilen, stab- bzw; schraubenförmigen Struktur. Im Fall, daß ein im neutralen oder alkalischen Bereich wirksames, eiweißabbauendes Enzym in. der Dispersion des so·=· genannten unlöslichen Kollagen verwendet wird, wird das sogenannte unlösEche Kollagen zuerst mit dem Enzym und danach mit einer schwachen Säure behandelt, um eine Kollagenlösung zu erhalten.When so-called insoluble collagen with such a protein-degrading enzyme at a temperature which is smaller than that at which the collagen fibers shrink, is treated and if afterwards treatment with dilute acid results in a dispersion of collagen, and a solution of unprocessed collagen molecules with a stable, rod-like or; helical structure. In the event that an effective in the neutral or alkaline range, protein-degrading enzyme in the dispersion of the so = When the so-called insoluble collagen is used, the so-called insoluble collagen is used first Enzyme and then treated with a weak acid to obtain a collagen solution.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Lösung von sogenanntem unlöslichem Kollagen durch Enzymbehandlung in einer Lösung mit einem pH-Wert von 1,5 bis 3 und einer Temperatur von 0 bis 37° C, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein durch Kultivierung von Penicillium spinolosum T-4 (ATCC 16348), Penicillium frequentans (ATCC 16349) oder Penicillium citrioviride 36-7 (ATCC 16351) gewonnenes Enzym in einer Menge von 0,01 bis 1,0" Gewichtsprozent, bezogen auf das sogenannte unlösliche Kollagen, verwendet wird.The invention relates to a method for dissolving so-called insoluble collagen Enzyme treatment in a solution with a pH of 1.5 to 3 and a temperature of 0 to 37 ° C, which is characterized in that a by cultivation of Penicillium spinolosum T-4 (ATCC 16348), Penicillium frequentans (ATCC 16349) or Penicillium citrioviride 36-7 (ATCC 16351) Enzyme in an amount of 0.01 to 1.0% by weight, based on the so-called insoluble Collagen, is used.

Die Behandlung des sogenannten unlöslichen Kollagens mit dem Enzym und mit der Säure wird gleichzeitig ausgeführt, dander Bereich des pH-Wertes in dem das Enzym auf das unlösliche Kollagen einwirkt, dem Bereich des pH-Wertes entspricht, in dem das unlösliche Kollagen durch die Einwirkung des Enzyms aufgelöst wird. Deshalb ist die Erfindung im industriellen Bereich sehr vorteilhaft für die Lösung von sogenanntem unlöslichem Kollagen.The treatment of the so-called insoluble collagen with the enzyme and with the acid is carried out at the same time executed, the range of the pH value in which the enzyme acts on the insoluble collagen corresponds to the pH range in which the insoluble collagen is dissolved by the action of the enzyme. Therefore the invention is in industrial area very beneficial for the solution of so-called insoluble collagen.

Die Enzyme, die von den in der Tabelle genannten Arten des Penicilliums erzeugt werden, werden in einem Bereich von 0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent, bezogen auf das sogenannte unlösliche Kollagen, bei einer Temperatur von 0 bis 37° C, vorzugsweise aber bei 25° C, und in einem Bereich des pH-Wertes von 1,5 bis etwa 3,0 benutzt.The enzymes that are produced by the types of Penicillium mentioned in the table are in in a range from 0.01 to 1.0 percent by weight, based on the so-called insoluble collagen a temperature from 0 to 37 ° C, but preferably at 25 ° C, and in a range of the pH value of 1.5 to about 3.0 are used.

Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die Lösung des sogenannten unlöslichen Kollagens durchgeführt werden, indem die Enzyme benutzt werden, die von den in der folgenden Tabelle aufgeführten Penicillium-Ärten. erzeugt werden, wobei noch anorganische Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder organische Säuren, wie Zitronensäure oder Essigsäure, in einer solchen Menge hinzugegeben werden, daß die Lösung einen pH-Wert zwischen 1,5 und 3 aufweist. Vom industriellen Standpunkt aus betrachtet ist jedoch die Anwendung von Salzsäure vorteilhaft. N According to the method of the invention, the so-called insoluble collagen dissolution can be carried out using the enzymes produced by the Penicillium species listed in the table below. are generated, with inorganic acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid or phosphoric acid, or organic acids such as citric acid or acetic acid, are added in such an amount that the solution has a pH between 1.5 and 3. However, from the industrial point of view, the use of hydrochloric acid is advantageous. N

Artenspecies EnzymeEnzymes PaecilomycesPaecilomyces Filtrat aus der FermenFiltrate from fermen KollagenCollagen varioti 9-2varioti 9-2 tationsflüssigkeit tation fluid lösungssolution 1515th PenicilliumPenicillium Filtrat aus der FermenFiltrate from fermen Pepsin**)Pepsin**) vermögen
des Enzymscapital
of the enzyme spinulosum T-4spinulosum T-4 tationsflüssigkeittation fluid in
Prozent*) in
Percent*) PenicilliumPenicillium erste Fraktion desfirst fraction of 9393 2020th spinulosum TS,l/ spinulosum TS, l / '. obigen Filtrat's '. the above filtrate PenicilliumPenicillium Filtrat aus der FermenFiltrate from fermen 9696 frequentans 47-5frequentans 47-5 tationsflüssigkeittation fluid PenicilliumPenicillium jFilträt aus der FermenjFilträt aus der Fermen 9696 2525th citrio-viride 36-7citrio-viride 36-7 tationsflüssigkeittation fluid Vergleichsversuche:Comparative tests: 9595 3030th ,15, 15 1515th

"' Hierzu ist noch zu bemerken: "' It should also be noted here:

*) Die Aktivität des Enzyms wird gemessen durch die prozentual gelöste Menge Kollagen, nachdem das Kollagen 24 Stunden lang unter ständigem Rühren in einer wäßrigen Lösung von 0,2 Mol Salzsäure bei 25° C eingeweicht wurde.. Die benutzte Enzymmenge genügte, um Casein aufzuschließen, in einem Maß, wie es der*) The activity of the enzyme is measured by the percentage of dissolved collagen after the collagen In an aqueous solution of 0.2 mol of hydrochloric acid at 25 ° C. for 24 hours with constant stirring was soaked .. The amount of enzyme used was enough to break down casein, as much as the

Wirksamkeit von l«/o. Pepsin auf Casein entspricht.Effectiveness of l «/ o. Pepsin is equivalent to casein.

**) Gereinigtes Pepsin wurde benutzt.**) Purified pepsin was used.

Die mykologischen Eigenschaften der Arten nach der Tabelle sind in dem japanischen Patent 47 091/ 1964 beschrieben.The mycological properties of the species according to the table are in Japanese patent 47 091 / Described in 1964.

Diese Erfindung wird näher beschrieben durch die folgenden Beispiele:This invention is further described by the following examples:

Beispiel 1example 1

3 kg einer frischen Haut eines erwachsenen Tieres, die 1,3 kg sogenanntes unlösliches Kollagen enthielt, wurde sofort nach dem Schlachten mit Wasser gewaschen und danach mit einer 5prozentigen Salzlösung behandelt, um die wasserlöslichen Proteine, wie Albumin, Grobulin usw., zu entfernen. Danach wurde die Haut durch Behandlung mit Enzymen enthaart und nochmals mit Wasser gewaschen. Die so behandelte Haut wurde in Stücke von etwa 10cm2 Fläche geschnitten. Dann wurden 201 Salzsäure mit einem pH-Wert von 2 hinzugegeben, wonach die resultierende Mischung unter gelegentlichem Umrühren sich selbst überlassen wurde. Während dieser Zeit wurde ab und zu etwas Salzsäure hinzugefügt, um einen pH-Wert von 2,4 aufrechtzuerhalten. Wenn der pH-Wert im Gleichgewicht war, wurde die Haut durch eine dazu geeignete Vorrichtung zerstückelt, wobei darauf geachtet wurde, daß die Temperatur der so zerstückelten Haut 30° C nicht überschritt. Die3 kg of a fresh skin of an adult animal containing 1.3 kg of so-called insoluble collagen was washed with water immediately after slaughter and then treated with a 5% saline solution to remove the water-soluble proteins such as albumin, grossulin, etc. The skin was then depilated by treatment with enzymes and washed again with water. The skin treated in this way was cut into pieces with an area of about 10 cm 2 . Then 201 hydrochloric acid having a pH of 2 was added, after which the resulting mixture was left to stand with occasional stirring. During this time, a little hydrochloric acid was occasionally added to maintain a pH of 2.4. When the pH was in equilibrium, the skin was chopped up by a suitable device, taking care that the temperature of the skin so chopped up did not exceed 30 ° C. the

- zerstückelte Haut wurde dann gesammelt und in ein sehr leistungsfähiges Rührwerk gegeben. Weiterhin wurde Salzsäure mit einem pH-Wert von 2 bis 2,5 hinzugefügt, so daß ein Gesamtgewicht von 20 kg erreicht wurde. Danach wurden während des Rührens 2,5 g eines eiweißabbauenden Enzyms, das von Penicillium spinulosum T-4 (ATCC 16348) erzeugt wird, in das Rührwerk gegeben. Diese 2,5 g waren in einer kleinen Menge von verdünnter Salzsäure gelöst. Während die so erhaltene Mischung auf einer Temperatur von etwa 25° C gehalten wurde, wurde sie ständig 24 Stunden lang umgerührt, um 96% des unlöslichen Kollagens der Haut zu lösen. Danach wurde sie nochmals während 12 Stunden ständig umgerührt, um eine sehr viskose Lösung zu erhalten. In einer- Chopped up skin was then collected and placed in a very powerful mixer. Farther hydrochloric acid with a pH of 2 to 2.5 was added so that a total weight of 20 kg was achieved. Thereafter, while stirring, 2.5 g of a protein-degrading enzyme from Penicillium spinulosum T-4 (ATCC 16348) is added to the agitator. These 2.5 g were in a small amount of dilute hydrochloric acid dissolved. While the mixture thus obtained is at one temperature was kept at about 25 ° C, it was stirred continuously for 24 hours to remove 96% of the insoluble Dissolve the skin's collagen. Then it was stirred again continuously for 12 hours, to get a very viscous solution. In a

Filterpresse wurde diese viskose Lösung gefiltert. Dieses Filtrat — gemessen nach der Kjeldahl-Methode — enthielt Kollagen mit einer Konzentration von etwa 6,5% und — gemessen entsprechend einem physikalisch-chemischen Verfahren — wies Kollagen Moleküle mit einer Länge von etwa 3000 Ä auf, mit einem Molekulargewicht von etwa 260 000 und zeigte eine stabile stab- bzw. schraubenförmige Struktur.Filter press this viscous solution was filtered. This filtrate - measured by the Kjeldahl method - contained collagen at a concentration of about 6.5% and - measured accordingly a physicochemical process - collagen exhibited molecules with a length of about 3000 Å on, with a molecular weight of about 260,000 and showed a stable rod or helical shape Structure.

Lediglich um die Reversibilität zu zeigen, wurden die Kollagenfasern mit einer Ausbeute von nahezu 100% aus dem Filtrat wiederhergestellt, indem es mit einer wäßrigen Lösung von zweibasischem Natriumphosphat neutralisiert oder dialisiert wurde. Bei Beobachtung unter einem Elektronenmikroskop ergab sich, daß die wiederhergestellten Kollagenfasern die periodischen Streifen von 700 Ä aufwiesen, die für Kollagenfasern eigentümlich sind.Merely to show the reversibility, the collagen fibers were produced with a yield of almost Recovered 100% from the filtrate by treating it with an aqueous solution of dibasic sodium phosphate neutralized or dialized. When observed under an electron microscope, revealed found that the restored collagen fibers had the 700 Å periodic streaks that are peculiar to collagen fibers.

Beispiel 2Example 2

Bei dem Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde an Stelle des dort benutzten Enzyms ein eiweißabbauendes Enzym benutzt, das von Penicillium frequentans (ATCC 16349) erzeugt wird. Bei diesem Verfahren wurde das sogenannte unlösliche Kollagen vollstän- as dig bei einer Temperatur von etwa 25° C während 36 Stunden nach Zugabe des Enzyms gelöst. Das erhaltene Kollagen hatte dieselben Eigenschaften wie jenes, das gemäß dem Verfahren im Beispiel 1 erhalten wurde.In the method according to Example 1, a protein-degrading enzyme was used instead of the enzyme used there Enzyme used that is produced by Penicillium frequentans (ATCC 16349). In this procedure the so-called insoluble collagen became completely dig dissolved at a temperature of about 25 ° C for 36 hours after adding the enzyme. The received Collagen had the same properties as that obtained according to the method in Example 1 became.

Beispiel 3Example 3

Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wurde mit einem eiweißabbauenden Enzym, erzeugt aus Penicillium Penicillium citrio-viride 36-7 (ATCC 16351) an Stelle des im Beispiel 1 benutzten Enzyms durchgeführt. Dabei wurden 95% des unlöslichen Kollagens bei einer Temperatur von etwa 25° C während 24 Stunden nach Zugabe des Enzyms gelöst. Nachdem während weiterer 12 Stunden die Mischung gerührt wurde, war das Kollagen vollständig gelöst. Das erhaltene Kollagen wies dieselben Eigenschaften auf wie jenes, erhalten gemäß dem im Beispiel 1 geschilderten Verfahren.The method according to Example 1 was carried out with a protein-degrading enzyme produced from Penicillium Penicillium citrio-viride 36-7 (ATCC 16351) instead of the enzyme used in Example 1 carried out. Thereby 95% of the insoluble collagen became at a temperature of about 25 ° C for 24 hours dissolved after adding the enzyme. The mixture was then stirred for a further 12 hours the collagen was completely dissolved. The collagen obtained had the same properties like that obtained according to the procedure outlined in Example 1.

Claims (1)

Patentanspruch:Claim: 30 Verfahren zur Lösung von sogenanntem unlöslichem Kollagen durch Enzymbehandlung in einer Lösung mit einem pH-Wert von 1,5 bis 3 und einer Temperatur von 0 bis 37°C, dadurchgekennzeichnet, daß ein durch die Kultivierung von Penicillium spinolosum T-4 (ATCC 16348), Penicillium frequentans (ATCC 16349) oder Penicillium citrio-viride 36-7 (ATCC 16351) gewonnenes Enzym in einer Menge von 0,01 bis 1,0 Gewichtsprozent, bezogen auf das sogenannte unlösliche Kollagen, verwendet wird. 30 Process for dissolving so-called insoluble collagen by enzyme treatment in a solution with a pH value of 1.5 to 3 and a temperature of 0 to 37 ° C, characterized in that a product obtained from the cultivation of Penicillium spinolosum T-4 (ATCC 16348 ), Penicillium frequentans (ATCC 16349) or Penicillium citrio-viride 36-7 (ATCC 16351) is used in an amount of 0.01 to 1.0 percent by weight, based on the so-called insoluble collagen.
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