DE1184901B - Manufacture of the antibiotic 1415 - Google Patents
Manufacture of the antibiotic 1415Info
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Description
Herstellun- des Antibiotikums 1415 C Die Erfindung betrifft die Herstellung, Gewinnung und Reinigung eines neuen, mit 1415 bezeichneten Antibiotikums. Die Gewinnung dieses Antibiotikums erfolgt aus der Kultur des Streptomyces Aetnaensis nov. spee. 1415 (NRRL 2836). Die Kultivierung erfolgt auf fermentativem Weg unter aeroben Bedingungen. Das Antibiotikum wird durch Extraktion aus dem Mycel oder durch Adsorption oder Extraktion aus den Nährlösungen gewonnen. Die Speeies des Streptomyces wurde aus einer vulkanischen Erdprobe vom Ätna isoliert. Der Stamm ist unter der Nummer NRRL 2836 beim »Uiiited States Department of Agriculture« in Peoria, Illinois, USA., hinterlegt worden.Manufacture of antibiotic 1415 C The invention relates to the manufacture, extraction and purification of a new antibiotic designated 1415. This antibiotic is obtained from the culture of Streptomyces Aetnaensis nov. spee. 1415 (NRRL 2836). The cultivation takes place in a fermentative way under aerobic conditions. The antibiotic is obtained by extraction from the mycelium or by adsorption or extraction from the nutrient solutions. The species of Streptomyces was isolated from a volcanic soil sample from Mount Etna. The strain has been deposited under number NRRL 2836 with the United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, USA.
Der Streptomyces-Stamm Aetnaensis nov. spec. 1415 zeigt folgende Eigenschaften: Morphologische Eigenschaften Morphologische Analyse auf Plättchen in flüssigem Czapek-Agar und Nährbrühe auf geneigten Petrischalen. Kultur: 24'C. Färbung: Kristallviolett.The Streptomyces strain Aetnaensis nov. spec. 1415 shows the following properties: Morphological properties Morphological analysis on platelets in liquid Czapek agar and nutrient broth on inclined Petri dishes. Culture: 24'C. Color: crystal violet.
Sowohl auf Czapek-Agar wie auf Nährbrühe zeigt das vegetative Mycel gewellte oder gerade Hyphen, wobei Verbindungen an den Enden sehr selten sind, mit keinerlei Neigung zur Bündelbildung der parallelen Hyphen.The vegetative mycelium shows on both Czapek agar and nutrient broth wavy or straight hyphae, with connections at the ends being very rare no tendency to form bundles of the parallel hyphae.
Besonders auf Czapek-Medium zeigen die Hyphen des vegetativen Mycels im Jugendstadium einige Unterbrechungen; später werden diese Unterbrechungen nicht mehr beobachtet. Das Luftmycel auf beiden Medien zeigt Hyphen, die kurze Bündel bilden mit einer Anzahl von Häkchen.The hyphae of the vegetative mycelium show particularly on Czapek medium some interruptions in the youth stage; later these interruptions will not observed more. The aerial mycelium on both media shows hyphae that are short bundles form with a number of ticks.
Bei Vorliegen der genannten Bedingungen ist die Sporenbildung langsam. Die Sporenform ist rund bis oval.When the above conditions are met, spore formation is slow. The spore shape is round to oval.
Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften sind aus TabelleI
ersichtlich.
Koaguliert Milch. Peptonisiert Milch. Verflüssigt Gelatine. Abbau von Caleium-malat.Coagulates milk. Peptonized milk. Liquefies gelatin. Dismantling of caleium malate.
Hydrolyse der Stärke.Hydrolysis of starch.
Der isolierte Streptomyces-Aetnaensis-Stamm 1415 ähnelt dem Streptomyces vinaceus, Streptomyces violaceus, Streptomyces californicus und Streptomyces griseoflavus, doch weisen diese folgende Verschiedenheiten auf: Streptomyces vinaceus Rotblaues lösliches Pigment, auf Glucose-Agar dunkelrotblau.The isolated Streptomyces aetnaensis strain 1415 is similar to Streptomyces vinaceus, Streptomyces violaceus, Streptomyces californicus and Streptomyces griseoflavus, but these show the following differences: Streptomyces vinaceus red-blue soluble pigment, dark red-blue on glucose agar.
Gelatine: Schnelle Verflüssigung, kein lösliches Pigment.Gelatin: Fast liquefaction, no soluble pigment.
Stärke: Vegetatives Mycel: runzelig, trocken, weiß, Hydrolyse beschränkt.Strength: Vegetative mycelium: wrinkled, dry, white, limited hydrolysis.
Streptomyces violaceus Nitrate: Keine Reduktion. Stärke: Schwache Hydrolyse.Streptomyces violaceus nitrates: No reduction. Strength: weak Hydrolysis.
Schwache Luftmycelbildung auf allen Substraten. Offene Spiralen.Weak aerial mycelia on all substrates. Open spirals.
Hyphen des Luftmycels gestreckt.Hyphae of the air mycelium elongated.
Auf Cellulose-Agar kein Wachstum oder nur geringes.No or little growth on cellulose agar.
Streptomyces californicus Auf Agar nach C z a p e k kein lösliches Pigment. Auf Glucose-Agar: Vegetatives Mycel gehemmt, cremeschwefelgelb.Streptomyces californicus No soluble pigment on agar according to C za p e k. On glucose agar: vegetative mycelium inhibited, creamy sulfur yellow.
Bildung von Vancomycin. Offene Spiralen. Streptomyces griseoflavus Auf Czapek-Agar bildet sich ein lösliches gelbes Pigment.Formation of vancomycin. Open spirals. Streptomyces griseoflavus A soluble yellow pigment forms on Czapek agar.
Auf Kartoffel-Agar bildet sich kein lösliches Pigment, auf Gelatine hingegen ein gelbliches Pigment.Soluble pigment does not form on potato agar, but on gelatin on the other hand a yellowish pigment.
Milch wird nicht koaguliert. Streptomyces Aetnaensis nov. spec. 1415 verhindert auf festem Medium (Nähr-Agar) die Entwicklung einiger grampositiver Keime. In flüssigen Substraten, die eine organische oder anorganische Stickstoffquelle, eine Kohlenstoffquelle, Mineralsalze und gegebenenfalls Wachstumsfaktoren und Spurenelemente enthalten, bildet Streptomyces Aetnaensis nov. spee. 1415 (bei ruhender oder Rühr- bzw. Schüttelkultur) einen Komplex antibiotischer Substanzen, die gegen verschiedene grampositive Keime wirksam sind.Milk is not coagulated. Streptomyces aetnaensis nov. spec. 1415 prevents the development of some gram-positive germs on a solid medium (nutrient agar). In liquid substrates that contain an organic or inorganic nitrogen source, a source of carbon, mineral salts and possibly growth factors and trace elements contain, forms Streptomyces aetnaensis nov. spee. 1415 (with stationary or stirring or shaking culture) a complex of antibiotic substances that are resistant to various gram-positive germs are effective.
Das Antibiotikum 1415 unterscheidet sich hinsichtlich seiner chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften von anderen bereits bekannten Biotika.Antibiotic 1415 differs in terms of its chemical, physical and biological properties of other already known biotics.
Zur Herstellung des Antibiotikums 1415 geht man in folgender Weise vor: Das Impfen kann sowohl mittels seiner Sporensuspension, die aus einer Kultur auf festem Medium gewonnen wurde, als auch durch Abschöpfen des Stammes oder auf dem Wege einer Vorimpfung mit einer flüssigen, verschieden lange Zeit unter Fermentation stehenden Kultur durchgeführt werden. Die Fermentation erfolgt bei einer Temperatur zwischen 20 und 35'C, wobei das Optimum bei etwa 27'C liegt.The procedure for preparing antibiotic 1415 is as follows before: The inoculation can both by means of its spore suspension, which comes from a culture was obtained on solid medium, as well as by skimming the trunk or on the way of a pre-inoculation with a liquid, different length of time under fermentation standing culture. The fermentation takes place at one temperature between 20 and 35'C, the optimum being around 27'C.
Der Verlauf der Fermentation selbst ist weitgehend abhängig von der Belüftung, dem Rühren bzw. Schütteln, der Zusammensetzung der Nährsubstrate und dem Fassungsvermögen sowie der Form der Fermentationsgefäße. Das Extrahieren muß in dem Augenblick erfolgen, in dem die Brühe die höchste Aktivität erreicht hat. Dieser Zeitpunkt ergibt sich genau genommen aus den angewandten Fermentationsmethoden.The course of the fermentation itself is largely dependent on the Aeration, stirring or shaking, the composition of the nutrient substrates and the capacity and the shape of the fermentation vessels. Extracting must take place at the moment when the broth has reached the highest activity. Strictly speaking, this point in time results from the fermentation methods used.
Der wirksame, antibiotische Substanz 1415 genannte Komplex wird dadurch gewonnen, daß man die Brühe mittels mit Wasser nicht mischbarer Lösungsmittel extrahiert.The effective complex called antibiotic substance 1415 is thereby obtained by extracting the broth using water-immiscible solvents.
Der Komplex kann aber auch direkt durch Absorbieren auf Aktivkohle aus der Brühe gewonnen werden mit anschließendem Eluieren mit organischen Lösungsmitteln. Hierzu können alle bekannten organischen Lösungsmittel mit Ausnahme von Petroläther, Gasolin, Ligroin verwendet werden. Nach Verdampfen des Lösungsmittels kann der Rohrückstand gereinigt werden mit Hilfe der Chromatographie auf verschiedenen Lösungsmitteln (Kohle oder Aluminiumoxyd, aktivierte Kieselerde [Celid], die mit einer geeigneten stationären Phase gesättigt ist, usw.), ebenso aber auch durch Umkristallisieren aus geeigneten Lösungsmitteln, wie Diäthyläther, Tetrachlorkohlenstoff usw. Gemischen verschiedener Lösungsmittel. Der wirksame Anteil kann aber auch gefällt werden, indem man in einem Lösungsmittel, in dem der Komplex löslich ist, auflöst und durch Zusatz eines Lösungsmittels, in dem er unlöslich ist, wie Petroläther, Gasolin, Ligroin, Wasser, ausfällt. Durch Papierchromatographie mit aufsteigender Mischung nach Z a f f a r o n i und B u r t o n (R. B. B u r t o n, A. Zaffaroni und E. H. Keutmann, Paper ehromatography of steroids, II, Corticosteroids and related Compounds, J. Biol. Chem., 188 [1951], S. 763) in einem 24stündigen Prozeß auf 25 - 4,5 mit Formamid vorimprägnierten Streifen in luftdichten Kolonnen (Durchmesser 5cm, Höhe 40cm) und durch Impfen mit ly (Wathman paper Nr.1); der Komplex läßt sich in acht biologisch wirksame und durch Autobiographie auf mit Bacillus subtilis (s. F i g. 1) beimpftem Agar erkennbare Konstituenten aufspalten.The complex can, however, also be obtained directly from the broth by absorbing it onto activated carbon with subsequent elution with organic solvents. All known organic solvents with the exception of petroleum ether, gasoline and ligroin can be used for this purpose. After evaporation of the solvent, the crude residue can be purified using chromatography on various solvents (carbon or aluminum oxide, activated silica [Celid], which is saturated with a suitable stationary phase, etc.), but also by recrystallization from suitable solvents, such as Diethyl ether, carbon tetrachloride, etc. Mixtures of different solvents. The effective fraction can also be precipitated by dissolving it in a solvent in which the complex is soluble and precipitating it by adding a solvent in which it is insoluble, such as petroleum ether, gasoline, ligroin, water. By paper chromatography with ascending mixture according to Z a ff aroni and B urton (RB B urton, A. Zaffaroni and E. H. Keutmann, Paper Ehromatography of steroids, II, Corticosteroids and related Compounds, J. Biol. Chem., 188 [1951 ], p 763) in a 24-hour process to 25 - (4,5 pre-impregnated with formamide strips in airtight column diameter 5 cm, height 40 cm), and by seeding with poly (Wathman paper No.1); the complex can be broken down into eight biologically active constituents recognizable by autobiography on agar inoculated with Bacillus subtilis (see FIG. 1).
Die antibiotische Wirksamkeit des Komplexes wird in der nachfolgenden
Tabelle III erläutert.
Beispiel 1
Die Züchtung des Streptomyces Aetnaensis nov. spee.1415
(NRRL2836) erfolgt in Roux-Flaschen, die Glycerin-Asparagin-Agar bei einer Temperatur
von 27'C enthalten; nach mehrtägiger Inkubation wird eine gute Sporenbildung erreicht.
Einige 300 ml fassende Erlenmayer-Kolben werden mit einer Sporensuspension,
die in bereits vorerwähntem Medium gezüchtet wurde, beimpft. Jeder Kolben enthält
60 ml Brühe folgender Zusammensetzung:
Beispiel 2 Man verwendet eine Brühe, die, wie unter Beispiel 1 beschrieben, 24 Stunden fermentierte und wie oben beimpft war, zur Inoculierung einiger 20 1 der gleichen Brühe enthaltender Fermentationsgefäße. Nach Belüftung mit 20 1 Luft je Minute und Rühren (320 Drehungen je Minute) und einer auf 27'C gehaltenen Temperatur steigt nach 11/, Tagen Fermentieren die Aktivität der Brühe auf 1600 Verdünnungseinheiten bei Bacillus subtilis.Example 2 used a mixture which, as described in Example 1, fermented 24 hours, and was inoculated as above for inoculation of some 20 1 of the same broth containing fermentation vessels. After aeration with 20 1 of air per minute and stirring (320 rotations per minute) and at a temperature maintained at 27'C, the activity of the broth dilution to 1600 units in Bacillus subtilis rises to 11 /, days fermentation.
Beispiel 3 Die gemäß der Arbeitsweise wie unter Beispiel 2 beschrieben erhaltene Fermentationsbrühe wird zentrifugiert, das Mycel durch zweimaliges Behandeln mit siedendem Aceton extrahiert und das Extrahierte einer klaren Brühe zugesetzt, die ihrerseits extrahiert war mit einer dem Ausgangsvolumen Brühe gleichen Menge an Äthylacetat. Das Zusetzen erfolgt langsam in kleinen Mengen unter längerem Rühren.EXAMPLE 3 The fermentation broth obtained according to the procedure as described in Example 2 is centrifuged, the mycelium is extracted by treating twice with boiling acetone and the extract is added to a clear broth, which in turn was extracted with an amount of ethyl acetate equal to the initial volume of broth. The addition takes place slowly in small amounts with prolonged stirring.
Nach durchgeführter Extraktion wird das Lösungsmittel getrocknet und eingeengt. Sobald ein Volumen von etwa 11 erreicht ist, läßt man das mit Äthylacetat Extrahierte durch eine Säule, die 10 g Kohle und 10 g Kieselerde (Celite) innig vermischt enthält, durchtropfen.After the extraction has been carried out, the solvent is dried and concentrated. As soon as a volume of about 11 is reached, what has been extracted with ethyl acetate is allowed to drip through a column which contains 10 g of charcoal and 10 g of silica (Celite) intimately mixed.
Die Säule wird zuerst so lange mit Äthylacetat gewaschen, bis das Lösungsmittel aktiv auf Bacillus subtilis wird, dann mit Aceton, das einen verbleibenden Rest an Aktivität wegnimmt. Die Eluate werden im Vakuum verdampft, und man erhält ein festes Rohprodukt, das in Benzol gelöst und mit 10 Volumen Petroleumäther ausgefällt werden kann.The column is first washed with ethyl acetate until the solvent becomes active on Bacillus subtilis, then with acetone, which takes away any remaining activity. The eluates are evaporated in vacuo, and a solid crude product is obtained which can be dissolved in benzene and precipitated with 10 volumes of petroleum ether.
Beispiel 4 Man setzt 11 der Brühe, wie man sie nach der unter Beispiel 1 und 2 gegebenen Vorschrift erhält, unter starkem Rühren während 1/2 Stunde 5 g Aktivkohle zu. Darauf wird diese Brühe durch Absaugen gefiltert und die Kohle mit Wasser so lange gewaschen, bis dieses klar und farblos abfließt. Der Rückstand wird getrocknet und mit Aceton eluiert, bis das Lösungsmittel sich aktiv zeigt gegenüber Baeillus subtilis. Das Lösungsmittel wird im Vakuum zur Trockne verdampft, worauf es möglich ist, den Rückstand wie unter Beispiel 3 beschrieben züi behandeln. Beispiel 5 Eine Probe der antibiotischen Substanz, die nach der Arbeitsweise wie unter Beispiel 3 und 4 beschrieben gewonnen ist, wird mit Benzol aufgenommen, von der unlöslichen Fraktion im Lösungsmittel abgetrennt und mit 10 Volumen Petroläther wieder ausgefällt, dann warm in Tetrachlorkohlenstoff gelöst und filtriert, dann läßt man Kristallisieren.EXAMPLE 4 To 11 of the broth as obtained according to the instructions given in Examples 1 and 2, 5 g of activated charcoal are added with vigorous stirring over the course of 1/2 hour. This broth is then filtered by suction and the charcoal is washed with water until it flows off clear and colorless. The residue is dried and eluted with acetone until the solvent is active against Baeillus subtilis. The solvent is evaporated to dryness in vacuo, whereupon it is possible to treat the residue as described in Example 3. Example 5 A sample of the antibiotic substance, which is obtained by the procedure described under Examples 3 and 4, is taken up with benzene, separated from the insoluble fraction in the solvent and precipitated again with 10 volumes of petroleum ether, then dissolved in carbon tetrachloride while warm and filtered, then allowed to crystallize.
Auf diese Weise erhält man eine Substanz mit einer halbfesten Oberfläche, die nach Abtrennung von dem darunterliegenden Flüssigen und Trocknen im Vakuum-Trockenschrank eine schwachgelbliche feste Substanz bildet mit einem antibiotischen Spektrum, wie es in Tabelle III, mit UV- und IR-Spektren, wie sie in F i g. 3 bzw. 4 aufgezeigt sind. In F i g. 4 sind in den Ordinaten die Prozentdurchgänge, in den Abszissen unten die Wellenlänge in (-t und oben die Frequenz (cm-) gezeigt.In this way, a substance is obtained with a semi-solid surface which, after separation from the liquid below and drying in a vacuum drying cabinet, forms a pale yellowish solid substance with an antibiotic spectrum as shown in Table III, with UV and IR spectra, such as they in Fig. 3 and 4 are shown. In Fig. 4 the percent crossings are shown in the ordinates, the wavelength in (-t) in the lower abscissae and the frequency (cm-) above.
Die Substanz hat eine spezifische Drehung [X] -21 D 31' (C = 111/, in Methanol), sie entfärbt eine Permanganatlösung, absorbiert Brom in Chloroform und hat die folgende Zusammensetzung: C = 52,39, 52,270/,; H = 6,570/0; N = 1,55 - 0,20/0.The substance has a specific rotation [X] -21 D 31 ' (C = 111 /, in methanol), it decolorizes a permanganate solution, absorbs bromine in chloroform and has the following composition: C = 52.39, 52.270 /,; H = 6.570 / 0; N = 1.55 to 0.20 / 0th
Eine noch größere Reinheit des antibiotischen Komplexes kann man erzielen, wenn man ihn, wie nachfolgend unter Beispiel 6 beschrieben, behandelt. Beispiel 6 1 g der festen Substanz, die man nach der unter Beispiel 5 gegebenen Vorschrift erhält, löst man warm in Tetrachlorkohlenstoff (200 ccm) und läßt abkühlen; die feste Oberflächenphase wird durch Zentrifugieren abgetrennt und das darunterliegende Flüssige in eine Säule von 65 cm Höhe und mit einem Durchmesser von M cm eingebracht, die 60 g Aktivkohle (Dareo G 60) und 60 g Hyflo-Hypercel innig vermischt und gepreßt enthielt.An even greater purity of the antibiotic complex can be achieved if it is treated as described in Example 6 below. EXAMPLE 6 1 g of the solid substance obtained according to the procedure given in Example 5 is dissolved warm in carbon tetrachloride (200 ccm) and allowed to cool; the solid surface phase is separated off by centrifugation and the liquid below is introduced into a column 65 cm high and M cm in diameter containing 60 g of activated charcoal (Dareo G 60) and 60 g of Hyflo-Hypercel, intimately mixed and pressed.
Nach Eluieren mit Benzol, bis die antibiotische Aktivität verschwindet, Einengen auf ein kleines, etwa 100 ccm betragendes Volumen durch Zentrifugieren und Ausfällen mit Petroläther, bildet sich eine weiße feste Substanz, die bei etwa 90 bis 95'C weich wird und eine spezifische Drehung von [ix]-'D' = -34' (C = 10/0 in Methanol) aufweist.After eluting with benzene until the antibiotic activity disappears, concentration to a small volume of about 100 ccm by centrifugation and precipitation with petroleum ether, a white solid substance forms which softens at about 90 to 95 ° C and has a specific rotation of [ix] - 'D' = -34 '(C = 10/0 in methanol).
Zusammensetzung: C = 59,44 bis 59,570/" H = 7,98 bis 8,040/0, N = 2,040/,.Composition: C = 59.44 to 59.570 / "H = 7.98 to 8.040 / 0, N = 2.040 /,.
Die entsprechenden UV- und IR.#Spektren sind in Fig. 5 und 6 aufgeführt; in letzterer sind die Prozentdurchgänge an der Ordinate abzulesen, an den Abszissen sind unten die Wellenlänge und oben die Frequenz (cm-) angezeigt.The corresponding UV and IR. # Spectra are shown in FIGS. 5 and 6 ; In the latter, the percentage crossings can be read off the ordinate, the wavelength (cm-) is indicated on the abscissa at the bottom and the frequency (cm-) at the top.
Mittels Papierchromatographie, nach bereits erwähnten Verfahren, war es möglich, in der gewonnenen Verbindung die acht antibiotisch wirksamen Konstituenten festzustellen.Using paper chromatography, according to the procedure already mentioned, was it is possible to use the eight antibiotic constituents in the compound obtained ascertain.
Der Komplex ist in wäßriger Lösung, die man durch Auflösen in einer sehr kleinen Menge Aceton und Verdünnung mit Wasser erhält, mindestens 5 Tage lang stabil, in wäßriger 511/,iger Salzsäure bei Zimmertemperatur gelöst, ist er mindestens 6 Stunden stabil und bei Puffern auf pH = 2 bei 100'C mindestens 3 Minuten. The complex is stable for at least 5 days in aqueous solution, which is obtained by dissolving it in a very small amount of acetone and diluting it with water; when dissolved in aqueous 511 /, hydrochloric acid at room temperature, it is stable for at least 6 hours and with buffers pH = 2 at 100'C for at least 3 minutes.
Puffert man auf pH = 9, so bleibt die Aktivität in der Kälte mindestens 6 Stunden und bei einer Temperatur von 100'C 3 Minuten lang erhalten; in 511/,iger Natriumhydroxydlösung tritt schon kalt eine rapide Inaktivierung ein, wobei sich die Lösung intensiv gelb färbt.If you buffer to pH = 9, the activity remains in the cold for at least 6 hours and at a temperature of 100 ° C for 3 minutes; In sodium hydroxide solution of 5% strength, rapid inactivation occurs even when cold, with the solution turning an intense yellow.
Die Nihydrinreaktion, an sich negativ, wird positiv nach einer 48stündigen sauren Hydrolyse bei 100'C. Mit Diäthyläther und Diäthylacetat ist es möglich, einige gelbe oder rötliche Substanzen, die nicht identifiziert wurden, zu extrahieren. Die wäßrige Phase enthält sechs Aminosäuren, die mittels zweidimensionaler Papierchromatographie feststellbar sind.The nihydrin reaction, negative in itself, becomes positive after 48 hours acid hydrolysis at 100'C. With diethyl ether and diethyl acetate it is possible to do some extract yellow or reddish substances that have not been identified. The aqueous phase contains six amino acids, which are determined by means of two-dimensional paper chromatography are detectable.
Erste Richtung. Normales Butanol - Essigsäure -Wasser 4 : 1 : 5 Vol./Vol.; zweite Richtung: Phenol mit Wasser gesättigt + »versene« Watman Papier Nr. 1 V (s. F i g. 2) durch Entwickeln mit Nihydrin.First direction. Normal butanol - acetic acid - water 4: 1 : 5 v / v; second direction. phenol saturated with water + "Versene" Watman paper # 1 V (. s F i g. 2) by developing with Nihydrin.
Die Flecken, die in Erscheinung treten (s. Figur) sind: A Glycin, B Alanin, D Prolin, F Valin, E Phenylatanin (dieses wurde fixiert auf Kohlenstoff nach einer von M. J u t i e s stammenden Technik, die bei J. L o i s e 1 e u r, zitiert »Techniques de laboratoire«, 2. Auflage, S. 652, Masson & Cie., Paris, 1954, und ausgewaschen mit Wasser, das mit Schwefelwasserstoff und Äthylacetat gesättigt war), G Leucin, C gehört höchstwahrscheinlich zur Aminobuttersäuregruppe und wurde in gleicher Weise wie y-Aminobuttersäure eluiert.(S. Figure), the spots which appear are: A glycine, alanine B, D proline, valine F, E Phenylatanin (this was fixed on carbon by one uties of M. J stemming technique in J. L oise 1 eur, cited "Techniques de laboratoire", 2nd edition, p. 652, Masson & Cie., Paris, 1954, and washed out with water saturated with hydrogen sulfide and ethyl acetate), G Leucine, C most likely belongs to the aminobutyric acid group and was eluted in the same way as γ-aminobutyric acid.
Die Identität verschiedener Aminosäuren wurde bestätigt durch wiederholte Chromatographie in Anwesenheit von Lösungen bekannter Proben.The identity of various amino acids was confirmed by repeating Chromatography in the presence of solutions of known samples.
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