DE1181151B

DE1181151B - Process for the purification of a 5'-phosphodiesterase-active, aqueous extract from plant materials which is suitable for the cleavage of nucleic acids to 5'-mononucleotides

Info

Publication number: DE1181151B
Application number: DEZ8815A
Authority: DE
Inventors: Dr Gerhard Pffeiderer; Dr Heinrich Kirchhoff; Dr Kurt Holle
Original assignee: Zellsloff Fabrik Waldhof AG
Current assignee: Zellsloff Fabrik Waldhof AG
Priority date: 1961-06-19
Filing date: 1961-06-19
Publication date: 1964-11-12

Description

Verfahren zur Reinigung eines zur Spaltung von Nucleinsäuren zu 5'-Mononucleotiden geeigneten, 5'-phosphordiesterase-aktiven, wäßrigen Extraktes aus pflanzlichen Materialien Es ist bekannt, daß man Nucleinsäuren zu Mononucleotiden mit Hilfe von Enzymen spalten kann. Als enzymhaltige Substanzen sind für diesen Zweck neben bestimmten Mikroorganismen vor allen Dingen Schlangengifte genannt worden. Schlangengiften haftet jedoch der Nachteil an, daß infolge ihres Gehaltes an den verschiedenartigsten Enzymen der Abbau schwer zu kontrollieren ist und häufig bis zu den Nucleosiden erfolgt. Ein so weitgehender Abbau ist in den meisten Fällen unerwünscht. Man hat daher versucht, die enzymatische Wirkung der Schlangengifte herabzusetzen, vor allen Dingen die Wirksamkeit der 5'-Phosphordiesterase weitgehend zu erhalten und gleichzeitig die Aktivität der 5'-Nucleotidase zu hemmen. Dies kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Beispielsweise hat man die Schlangengifte unter Verwendung verschiedener Fällungsmanipulationen gereinigt. Ein weiterer Weg zur Inaktivierung der Nucleotidase besteht darin, daß man die Schlangengifte einer Hitzeeinwirkung aussetzt. Ferner ist bekanntgeworden, daß bestimmte Metallionen zu inaktivieren vermögen. Auch die Kombination einzelner Inaktivierungsverfahren ist beschrieben worden.Process for the purification of a for the cleavage of nucleic acids to 5'-mononucleotides suitable, 5'-phosphorodiesterase-active, aqueous extract from plant materials It is known that nucleic acids can be cleaved to form mononucleotides with the aid of enzymes can. As enzyme-containing substances are for this purpose in addition to certain microorganisms above all, snake poisons have been called. However, the snake venom is liable Disadvantage that due to their content of the most diverse enzymes Degradation is difficult to control and often occurs down to the nucleosides. A such extensive degradation is undesirable in most cases. One has therefore tried to reduce the enzymatic effect of the snake venom, especially the Effectiveness of the 5'-phosphodiesterase largely to be preserved and at the same time the To inhibit 5'-nucleotidase activity. This can be done in a number of ways. For example, one has the snake venom using various felling manipulations cleaned. Another way to inactivate the nucleotidase is that the snake venom is exposed to heat. It has also become known that certain metal ions are able to inactivate. Even the combination of individual ones Inactivation procedures have been described.

An allen diesen Verfahren ist jedoch nachteilig, daß sie bei den meisten der zur Verfügung stehenden Schlangengifte umständlich, zeitraubend und nur unter Einhaltung von bestimmten Bedingungen durchführbar sind. Zudem ist die Beschaffung der als Ausgangsmaterial für die enzymatische Spaltung erforderlichen Schlangengifte kostspielig und gefährlich.In all of these processes, however, it is disadvantageous that most of them the available snake venom cumbersome, time consuming and only under Compliance with certain conditions are feasible. In addition, the procurement the snake venom required as the starting material for enzymatic cleavage expensive and dangerous.

Die Schwierigkeiten bei der Enzymgewinnung aus Mikroorganismen liegt vor allen Dingen in den aufwendigen Vorrichtungen zur Züchtung, in der zusätzlichen Herstellung der Nährmedien und in der ständigen Kontrolle der Züchtungsbedingungen, wie Überwachung des Wachstums, der Nährmedien, der Temperaturen u. .dgl.The difficulty in obtaining enzymes from microorganisms lies above all in the complex devices for cultivation, in the additional Production of the culture media and constant control of the cultivation conditions, such as monitoring of growth, nutrient media, temperatures and the like.

Es ist daher bereits in einem älteren Vorschlag empfohlen worden, zur Gewinnung von 5'-Mononucleotiden aus Nucleinsäuren wäßrige, 5'-phosphordiesterase-aktive Extrakte aus pflanzlichen Materialien zu verwenden. Dabei wird gegebenenfalls so vorgegangen, daß der Extrakt Reinigungsprozesse durchläuft. Im Anschluß daran wird die störende 5'-Mononucleotidase durch Chromatographie entfernt. Neben einem erheblichen Material- und Zeitaufwand birgt dieses Verfahren die Gefahr in sich, daß bei den verschiedenen Reinigungsstufen Anteile der wertvollen 5'-Phosphordiesterase verlorengehen.It has therefore already been recommended in an older proposal, aqueous, 5'-phosphodiesterase-active for the production of 5'-mononucleotides from nucleic acids To use extracts from plant materials. This is where appropriate proceeded that the extract goes through cleaning processes. Following this will the interfering 5'-mononucleotidase removed by chromatography. In addition to a significant In terms of material and time, this process harbors the risk that the various stages of purification, portions of the valuable 5'-phosphorodiesterase are lost.

Vorliegender Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Reinigung eines zur Spaltung von Nueleinsäuren zu 5'-Mononucleotiden geeigneten 5'-phosphordiesterase-aktiven wäßrigen Extraktes aus pflanzlichen Materialien zu entwickeln.The present invention was based on the object of an improved Process for the purification of a for the cleavage of nucleic acids to 5'-mononucleotides suitable 5'-phosphorodiesterase-active aqueous extract from plant materials to develop.

Es wurde gefunden, daß die Aufgabe dadurch gelöst werden konnte, daß man die Extrakte in Gegenwart von Schwermetallsalzen kurzzeitig erwärmt und dann abkühlt.It has been found that the object could be achieved in that the extracts are briefly heated in the presence of heavy metal salts and then cools down.

Beim älteren Vorschlag wurde bereits auf eine weitgehende Erhaltung der 5'-Phosphordiesterase-Aktivität acht gegeben. Dies erfolgt auch bei dem vorliegenden Verfahren. Jedoch wird zusätzlich eine weitesgehende Inaktivierung der 5-Nucleotidase erzielt und zudem mit einem sehr geringen Aufwand an Fremdmaterialien und mit einer erheblichen Zeitersparnis gearbeitet.The older proposal was based on an extensive preservation paid attention to 5'-phosphodiesterase activity. This is also the case with the present one Procedure. However, there is also extensive inactivation of the 5-nucleotidase achieved and also with a very low cost of foreign materials and with a considerable time savings worked.

Obwohl bereits Enzymgewinnungsverfahren mit einer Inaktivierung störender Enzyme mittels Schwermetallionen und/oder Hitzeeinwirkung bekannt waren, lassen sich jedoch aus diesen bekannten Verfahren keine Parallelen zu dem vorliegenden Verfahren ziehen. Bei den Enzymen aus Schlangengiften hat man einen Aktivitätsbereich bei ganz bestimmten pH-Werten festgestellt. Demgegenüber weisen die aus pflanzlichen Materialien gewonnenen Enzyme einen viel breiteren Bereich auf, so daß daraus der Schluß gezogen werden muß, daß es sich um ein chemisch andersartig aufgebautes Enzym handelt, obwohl es die gleiche Wirkung wie ein Schlangengiftenzym besitzt. Daher läßt sich auch nicht voraussehen, ob Schwermetallionen und die Einwirkung von Wärme einerseits die Aktivität der Pflanzenenzyme bestehen läßt und andererseits störende Enzyme. inaktiviert. Unter wäßrigem Extrakt aus pflanzlichen Materialien werden gemäß dem vorliegenden Verfahren in erster Linie wäßrige Extrakte aus Pflanzen, oberirdischen und/oder unterirdischen Pflanzenteilen, wie Früchten, Samen, Knollen, Wurzeln und/oder Rüben, ferner aus Pflanzenkeimlingen sowie aus Gemischen verschiedener und beliebiger Pflanzen oder Pflanzenteile, gegebenenfalls mit Keimlingen, verstanden. Als besonders geeignet haben sich rohe Extrakte aus Samen, Keimen und/oder Keimbestandteilen von Di- oder Monokotyledonen, wie beispielsweise Leguminosen, Weizen, Reis, Gerste und/oder Gräser sowie die bei der Malzbereitung anfallenden sogenannten Putzkeime erwiesen. Es liegt auch im Rahmen der Erfindung, daß man an Stelle der rohen Extrakte solche verwenden kann, die teilweise vorgereinigt sind. Beispielsweise können die Extrakte durch fraktionierte Calciumphosphatgelfraktionierungen oder Ausfällungen durch Aceton oder Alkohol vorgereinigt sein.Although enzyme recovery processes with inactivation are already more disruptive Enzymes by means of heavy metal ions and / or exposure to heat were known However, these known processes do not show any parallels to the present one Procedure draw. The enzymes from snake venom have a range of activity found at very specific pH values. In contrast, those from vegetable Materials obtained enzymes cover a much broader range, so that from it the It must be concluded that it is an enzyme with a different chemical structure acts even though it has the same effect as a snake venom enzyme. Therefore Nor can it be foreseen whether heavy metal ions and the action of heat on the one hand the activity of the plant enzymes persists and on the other hand disruptive Enzymes. inactivated. Taking aqueous extract of vegetable materials According to the present process, primarily aqueous extracts from plants, above-ground and / or underground parts of plants, such as fruits, seeds, tubers, Roots and / or beets, also from plant seedlings and from mixtures of different and any plants or parts of plants, optionally with seedlings, understood. Raw extracts from seeds, germs and / or germ components have proven to be particularly suitable of di- or monocotyledons, such as legumes, wheat, rice, barley and / or grasses as well as the so-called cleaning germs that occur during malt preparation proven. It is also within the scope of the invention that instead of the raw extracts can use those that are partially pre-cleaned. For example, the Extracts by fractionated calcium phosphate gel fractionation or precipitation be pre-cleaned with acetone or alcohol.

Erfindungsgemäß werden die heterogen zusammengesetzten Extrakte aus pflanzlichem Material, die gegebenenfalls zwecks Verhinderung von unerwünschten Infektionen mit in Wasser schwer oder unlöslichen organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise Toluol und/oder Chloroform, versetzt sein können, vor ihrer Anwendung zur Spaltung der Nucleinsäuren kurze Zeit, etwa 5 bis 40 Minuten, zweckmäßigerweise 15 bis 25 Minuten, in Gegenwart von Schwermetallsalzen auf Temperaturen zwischen 45 und 70° C, vorzugsweise 55 und 65° C, erwärmt. Von besonderem Vorteil ist die Verwendung von anorganischen Salzen, wie Chloride, Sulfate, Nitrate der Metalle Zink, Nickel und Kupfer. Die Konzentration an Schwermetallsalzen in den Extrakten soll zweckmäßigerweise 10-2- bis 10'5molar betragen.According to the invention, the heterogeneously composed extracts are made from vegetable material that may be used for the purpose of preventing unwanted Infections with organic solvents that are sparingly or insoluble in water, such as for example toluene and / or chloroform, can be added before their use to cleave the nucleic acids for a short time, about 5 to 40 minutes, expediently 15 to 25 minutes, in the presence of heavy metal salts to temperatures between 45 and 70 ° C, preferably 55 and 65 ° C, heated. The is of particular advantage Use of inorganic salts such as chlorides, sulfates, nitrates of metals Zinc, nickel and copper. The concentration of heavy metal salts in the extracts should expediently be 10-2 to 10'5 molar.

Es hat sich als überraschend herausgestellt, daß bei vorliegendem Verfahren der pH-Wert in weiten Grenzen schwanken kann, wobei verständlicherweise extrem saure oder alkalische Bereiche zu vermeiden sind. Zur Erzielung einer weitgehenden Inaktivierung der 5-Nucleotidase hat sich die Einstellung des Extraktes auf pH-Werte zwischen 4 und 7 als besonders zweckmäßig herausgestellt. Diese kann gegebenenfalls durch Pufferlösungen, wie beispielsweise Phosphat-, Phthalat-, Acetat oder Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Puffer erfolgen.It has been found to be surprising that with the present Process the pH value can fluctuate within wide limits, and understandably extremely acidic or alkaline areas are to be avoided. To achieve an extensive Inactivation of the 5-nucleotidase has resulted in the adjustment of the extract to pH values between 4 and 7 proved to be particularly useful. This can if necessary by buffer solutions such as phosphate, phthalate, acetate or tris (oxymethyl) aminomethane buffers take place.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Extrakte werden als solche direkt zur Spaltung von Nucleinsäuren eingesetzt.The extracts obtained by the process according to the invention are used as such directly for the cleavage of nucleic acids.

Nachstehend soll das Verfahren näher erläutert werden: Beispiel 1 a) Herstellung des Keimextraktes 100 g Gerstenputzkeime und 1000 ccm Wasser, zu Beginn des Extrahierens mit Natronlauge auf pH 8,0 eingestellt, werden 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und dann zentrifugiert. Der Extrakt wird mit Natronlauge oder mit Essigsäure auf den gewünschten pH-Wert eingestellt. Dann wird so viel einer Schwermetallösung hinzugefügt, daß die gewünschte Molarität erreicht wird. Die anschließende Erhitzung erfolgt bei den zu untersuchenden Temperaturen und Zeitintervallen in einem Wasserbad. Nach der Hitzebehandlung wird abgekühlt und der pH-Wert des so vorbehandelten Extraktes wieder auf 8,0 eingestellt (vgl. Spalten 1 bis 6 der nachstehenden Tabelle).The method is explained in more detail below: Example 1 a) Production of the germ extract 100 g of barley cleaning germs and 1000 ccm of water, adjusted to pH 8.0 with sodium hydroxide at the beginning of the extraction, are stirred for 2 hours at room temperature and then centrifuged. The extract is adjusted to the desired pH value with sodium hydroxide solution or with acetic acid. Then enough of a heavy metal solution is added to achieve the desired molarity. The subsequent heating takes place in a water bath at the temperatures and time intervals to be examined. After the heat treatment, the mixture is cooled and the pH value of the extract pretreated in this way is adjusted to 8.0 again (cf. columns 1 to 6 of the table below).

b) Spaltungsansatz 3 ccm des nach a) erhaltenen Gerstenputzkeimextraktes oder eines Extraktes anderer Pflanzen, z. B. aus Weizenölkeimen, werden mit 2 ccm Natriumnucleinatlösung (1,687o/oig in bezug auf Nucleinsäure) und 3 ccm 0,1 m Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Puffer von pH 8,0 unter Zusatz von Toluol versetzt. In den zugehörigen Blindversuchen ersetzt man die Nucleinsäurelösung durch 2 ccm Wasser. Die Dauer der enzymatischen Spaltung beträgt bei 37° C etwa 20 Stunden. Die Ergebnisse sind in den Spalten 7 und 8 der nachstehenden Tabelle aufgeführt.b) Cleavage approach 3 ccm of the barley cleaning germ extract obtained according to a) or an extract of other plants, e.g. B. from wheat oil germs, are with 2 ccm Sodium nucleate solution (1.687% with respect to nucleic acid) and 3 cc of 0.1 M tris (oxymethyl) aminomethane buffer of pH 8.0 with the addition of toluene. Replaced in the associated blind tests the nucleic acid solution with 2 cc of water. The duration of the enzymatic cleavage is about 20 hours at 37 ° C. The results are in columns 7 and 8 of the the table below.

Zur Bestimmung des Spaltungsverlaufs werden nach beendeter Bebrütung die Ansätze nach vorhergehender Abkühlung mit Trichloressigsäure-Uranylacetatlösung versetzt und filtriert. Dann wird die UV-Adsorption im Spektrophotometer gegen den Blindansatz gemessen. Die P20$-Bestimmung erfolgt mit Hilfe des Spektrophotometers nach den Angaben von M. R o c k s t e i n und P. N. H e r ro n, Analyt. Chemistry, 23 (l951), S. 1500. Spalte 1 2 j 3 4 5 6 7 ; 8 Lfd. Vorbehandlung des Extraktes Nucleinsäure Nr. Extraktionsmaterial Metallsalz Erwärmung Konzen- Tempe- Dauer pH-Wert Nucleinsäure- P205- Art tration ratur spaltung Abspaltung Mol ° C Minuten °/o °/e Versuche mit verschiedenen Salzen, Salzkonzentrationen und pH-Werten bei gleicher Temperatur und Erwärmungsdauer 1 Gerstenputzkeime CuC12 I 0,002 65 20 I 5 87 I 11 2 Gerstenputzkeime cuC12 0,0002 65 20 1 5 91 j 4 3 Gerstenputzkeime NiC12 0,001 65 20 i 5 100 15 4 Gerstenputzkeime NiC12 0,00025 65 20 5 100 18 5 Gerstenputzkeime NiCl2 ; 0,001 65 20 6 100 15 6 Gerstenputzkeime NiC12 0,00025 65 20 6 100 16 7 Gerstenputzkeime NiC12 0,001 65 20 7 96 15 8 Gerstenputzkeime NiC12 0,00025 65 20 7 87 8 9 Gerstenputzkeime ZnC12 0,01 65 20 4 96 10 10 Gerstenputzkeime zncl2 0,001 65 20 4 92 3,6 11 Gerstenputzkeime ZnC12 0,01 65 20 6 85 2,6 12 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 65 1 20 6 79 2,7 (Fortsetzung) Spalte 1 2 3 4 5 6 7 8 Lfd. Vorbehandlung des Extraktes Nucleinsäure Nr. Metallsalz Erwärmung Extraktionsmaterial Konzen- Tempe- Nueleinsäure- P206- Axt tration ratur Dauer pH-Wert spalte . Abspaltung Mol ° C Minuten o/' 0/0 Versuche in Abhängigkeit der Temperatur und der Zeit mit gleichem Schwermetallsalz und gleicher Salzkonzentration 13 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 55 5 4 92 32 14 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 55 10 4 97 23 15 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 55 20 4 87 16 16 Gerstenputzkeime znC12 0,001 55 40 4 69 2 17 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 65 5 4 85 0,5 18 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 65 10 4 80 0,4 19 Gerstenputzkeime znC12 0,001 65 20 4 75 0,3 20 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 65 , 40 4 59 0,1 Vergleichsversuche verschiedener Keimextrakte ohne Erwärmung und Schwermetallsalzzusatz und mit Erwärmung und Schwermetallsalzzusatz 21 Gerstenputzkeime - 0 - - - 100 12 22 Weizenölkeime - 0 - - - 75 27 23 Gerstenputzkeime ZnC12 0,001 65 20 4 72 0 24 Weizenölkeime ZnC12 , 0,001 65 20 4 43 0,5 Beispiel 2 a) Herstellung des Keimextraktes 150 g Weizenölkeime werden in 1000 ccm Wasser eingetragen und bei Raumtemperatur und bei einem pH-Wert von 7,5 (durch Zugabe von Kalilauge eingestellt) 2 Stunden gerührt. Danach wird die Mischung zentrifugiert. Nach Einstellung des Extraktes auf einen pH-Wert von 5 durch Zugabe von Salzsäure wird eine Zinkchloridlösung zugefügt, so daß die Molarität des Extraktes 0,005 Mol an ZnC12 beträgt. Anschließend wird 20 Minuten bei 65° C gehalten, abgekühlt und der pH-Wert des erhaltenen Keimextraktes wieder auf pH 5 eingestellt.To determine the course of cleavage, after the end of the incubation, trichloroacetic acid-uranyl acetate solution is added to the batches after previous cooling and the mixture is filtered. The UV adsorption is then measured in the spectrophotometer against the blank batch. The P20 $ determination is carried out with the aid of the spectrophotometer according to the information from M. R ockstein and PN H er ro n, Analyt. Chemistry, 23 (1951), p. 1500. split 1 2 j 3 4 5 6 7; 8th Serial Pre-treatment of the extract Nucleic acid No extraction material metal salt warming Concentration Tempe Duration pH Nucleic Acid P205 Art tration ratur splitting splitting off Mole ° C minutes ° / o ° / e Try different salts, salt concentrations, and pH levels at the same temperature and heating time 1 Barley cleaning germs CuC12 I 0.002 65 20 I 5 87 I 11 2 barley cleaning germs cuC12 0.0002 65 20 1 5 91 j 4 3 barley cleaning germs NiC12 0.001 65 20 i 5 100 15 4 barley cleaning germs NiC12 0.00025 65 20 5 1 00 18 5 barley cleaning germs NiCl2; 0.001 65 20 6 100 15 6 Barley cleaning germs NiC12 0.00025 65 20 6 100 16 7 Barley cleaning germs NiC12 0.001 65 20 7 96 15 8 Barley cleaning germs NiC12 0.00025 65 20 7 87 8 9 Barley cleaning germs ZnC12 0.01 65 20 4 96 10 10 barley cleaning germs zncl2 0.001 65 20 4 92 3.6 11 Barley cleaning germs ZnC12 0.01 65 20 6 85 2.6 12 Barley cleaning germs ZnC12 0.001 65 1 20 6 79 2.7 (Continuation) split 1 2 3 4 5 6 7 8 Serial Pretreatment of the nucleic acid extract No metal salt heating Extraction material Concentric- Tempe- nucleic acid- P206- Ax tration ratur duration pH value column. Spin-off Mole ° C Minutes o / ' 0/0 Tests as a function of temperature and time with the same heavy metal salt and the same salt concentration 13 Barley cleaning germs ZnC12 0.001 55 5 4 92 32 14 Barley cleaning germs ZnC12 0.001 55 10 4 97 23 15 Barley cleaning germs ZnC12 0.001 55 20 4 87 16 16 barley cleaning germs znC12 0.001 55 40 4 69 2 17 Barley cleaning germs ZnC12 0.001 65 5 4 85 0.5 18 Barley cleaning germs ZnC12 0.001 65 10 4 80 0.4 19 Barley cleaning germs znC12 0.001 65 20 4 75 0.3 20 Barley cleaning germs ZnC12 0.001 65, 40 4 59 0.1 Comparative tests of different germ extracts without heating and heavy metal salt addition and with heating and heavy metal salt addition 21 Barley cleaning germs - 0 - - - 100 12 22 Wheat Oil Sprouts - 0 - - - 75 27 23 Barley cleaning germs ZnC12 0.001 65 20 4 72 0 24 wheat oil germs ZnC12, 0.001 65 20 4 43 0.5 Example 2 a) Production of the germ extract 150 g of wheat oil germ are introduced into 1000 cc of water and stirred for 2 hours at room temperature and at a pH of 7.5 (adjusted by adding potassium hydroxide). The mixture is then centrifuged. After the extract has been adjusted to a pH value of 5 by adding hydrochloric acid, a zinc chloride solution is added so that the molarity of the extract is 0.005 mol of ZnC12. The mixture is then kept at 65 ° C. for 20 minutes, cooled and the pH value of the germ extract obtained is adjusted to pH 5 again.

b) 25 ccm des nach a) erhaltenen Weizenkeimextraktes werden mit 25 ccm einer 2%igen Nucleinsäurelösung, die aus Fischspermen hergestellt ist und hauptsächlich Desoxyribonucleinsäure enthält, versetzt und der pH-Wert dieses Gemisches auf pH 7,5 eingestellt. Dieser pH-Wert wird durch laufende Zugabe von verdünnter Kalilauge auf diesem Wert gehalten. Das Ende des Spaltungsverlaufs zeigt sich durch Bestehenbleiben des pH-Wertes an. Die durchschnittliche Dauer des Verlaufs beträgt bei 37° C etwa 27 Stunden. Nucleinsäurespaltung 85 %, P205 Abspaltung 6 %.b) 25 ccm of the wheat germ extract obtained according to a) are mixed with 25 cc of a 2% nucleic acid solution prepared from fish sperm and mainly Contains deoxyribonucleic acid, added and the pH of this mixture to pH 7.5 set. This pH value is adjusted by continuously adding dilute potassium hydroxide solution held at this value. The end of the course of division is indicated by persistence the pH value. The average duration of the course is around 37 ° C 27 hours. Nucleic acid cleavage 85%, P205 cleavage 6%.

Beispiel 3 Es wird ein Keimextrakt verwendet, der entsprechend den Angaben unter 1, a) hergestellt worden ist. Als Metallsatz wird ZnC4 in. einer Konzentration von 0,001 Mol genommen, das auf den Gerstenputzkeimextrakt bei einer Temperatur von 65° C und einem pH-Wert von 5 während 20 Minuten zur Einwirkung gelangte. 40 ccm des vorstehend genannten Gerstenputzkeimextraktes werden mit 10 ccm einer 2,5%igen neutralisierten Desoxyribonueleinsäurelösung versetzt. Der Ansatz wird durch Zugabe von Natronlauge auf einen pH-Wert von 8 eingestellt. Nach einer Dauer von 24 Stunden, während der pH-Wert auf 8 durch laufende Zugabe von verdünnter Natronlauge sowie die Inkubationstemperatur auf 37° C gehalten werden, beträgt die Nueleinsäurespaltung 75% bei einer Phosphatabspaltung von 9,6%.Example 3 A germ extract is used which corresponds to the Information under 1, a) has been made. As a metal compound, ZnC4 is used in one concentration of 0.001 moles taken on the barley germ extract at a temperature of 65 ° C and a pH of 5 for 20 minutes came to the effect. 40 ccm of the above-mentioned barley cleaning germ extract are mixed with 10 ccm of a 2.5% strength neutralized deoxyribonueleic acid solution. The approach is by adding adjusted to a pH of 8 by sodium hydroxide solution. After a period of 24 hours, while the pH value to 8 by continuous addition of dilute sodium hydroxide solution as well the incubation temperature is kept at 37 ° C, the nucleic acid cleavage is 75% with a phosphate elimination of 9.6%.

Beispiel 4 50g vakuumgetrocknete Keimwurzeln der Saubohne (vicia faba) werden fein zermahlen und mit 50 ccm Wasser bei pH 8 (NaOH) 5 Stunden extrahiert. Dieser Extrakt wird durch Zugabe von Salzsäure auf pH 5 eingestellt und mit einer CuCl2 Lösung versetzt, so daß die Schwermetallkonzentration in der Mischung 0,0002 Mol beträgt. Es wird 20 Minuten auf 60° C erwärmt. Nach Abkühlung wird der Extrakt durch Zugabe von Natronlauge wieder auf einen pH-Wert von 8 eingestellt.Example 4 50g vacuum-dried broad bean roots (vicia faba) are finely ground and extracted with 50 ccm of water at pH 8 (NaOH) for 5 hours. This extract is adjusted to pH 5 by adding hydrochloric acid and with a CuCl2 solution added so that the heavy metal concentration in the mixture is 0.0002 Moles. It is heated to 60 ° C. for 20 minutes. After cooling, the extract becomes adjusted to a pH value of 8 again by adding sodium hydroxide solution.

Zu 50 ccm dieses Extraktes werden 40 ccm 0,1m Tris-(oxymethyl)-aminomethan-Puffer von pH 8 unter Zusatz von Chloroform und 10 ccm einer 2,5%igen Natriumnucleinatlösung gegeben und die Mischung auf 37° C erwärmt. Nach 18 Stunden beträgt die enzymatische Spaltung 92 % der Nueleinsäure bei einer Phosphatabspaltung von 5,5 %.40 cc of 0.1m tris (oxymethyl) aminomethane buffer are added to 50 cc of this extract of pH 8 with the addition of chloroform and 10 ccm of a 2.5% sodium nucleate solution given and the mixture heated to 37 ° C. After 18 hours the enzymatic Cleavage of 92% of the nucleic acid with a phosphate cleavage of 5.5%.

Claims

Claims: 1. A method for purifying a cleavage of Nucleic acids suitable for 5'-mononucleotides 5'-phosphordiesterase-akdven aqueous Extract from plant materials, d u r c h marked, that the extract is briefly heated in the presence of heavy metal salts and then cools down.

2. The method according to claim 1, characterized in that the heating of the extract 5 to 40 minutes, preferably 15 to 25 minutes, at temperatures between 45 and 70 ° C, preferably 55 and 65 ° C, is carried out.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the chlorides of zinc, nickel or copper are used as heavy rivet salts .

4. The method according to claim 1 and 3, characterized in that the concentration of heavy metal salts in the extract is 10 s to 10 s molar. References considered: R. Ammon and W. Dirscherl, "Formente-Hormone-Vitamine", 1959, pp. 178 to 184, and p. 171; H. Vogel, "The brewer's yeast and its utilization", 1949, p. 195.