DE1157346B

DE1157346B - Process for the preparation of concentrates of the erythropoietic factor from the blood plasma of warm blooded animals

Info

Publication number: DE1157346B
Application number: DEA32246A
Authority: DE
Inventors: Wilfrid Francis White; Gotthard Felix Weber
Original assignee: US Atomic Energy Commission (AEC)
Current assignee: US Atomic Energy Commission (AEC)
Priority date: 1958-06-12
Filing date: 1959-06-12
Publication date: 1963-11-14

Description

Verfahren zur Herstellung von Konzentraten des erythropoetischen Faktors aus dem Blutplasma von Warmblütern Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Konzentraten des erythropoetischen Faktors aus dem Blutplasma von Warmblütern durch Zusammenbringen des Plasmas mit lonenaustauschern.Process for the preparation of concentrates of the erythropoietic factor from the blood plasma of warm-blooded animals. The invention relates to manufacture of concentrates of the erythropoietic factor from the blood plasma of warm-blooded animals by bringing the plasma together with ion exchangers.

Die Existenz eines erythropoetischen Faktors im Blutplasma, der die Erythropoese bei Tieren und auch beim Menschen anregt, ist sicher bewiesen. Die Anwesenheit eines solchen Faktors, z. B. im Blut von Menschen, die unter Cooleyscher Anämie und Sichelzellenanämie leiden, wurde gezeigt, indem man Blutserum solcher Individuen Laboratoriumstieren zuführte. Es wurde gefunden, daß das Serum die Menge der peripheren roten Zellen, des Hämaglobins und der Reticulocyten bei den Versuchstieren merklich erhöhte. Ein ähnliches Resultat wurde mit Blutserum von Patienten, die an Polycythämia vera litten, erreicht.The existence of an erythropoietic factor in the blood plasma that causes the Erythropoiesis stimulates in animals and also in humans, has been safely proven. the Presence of such a factor, e.g. B. in the blood of people taking Cooleyscher Suffering from anemia and sickle cell anemia has been shown by taking blood serum such Gave laboratory animals to individuals. It was found that the serum was the amount the peripheral red cells, hemaglobin and reticulocytes in the test animals noticeably increased. A similar result was obtained with blood serum from patients who suffered from polycythemia vera.

Es ist auch bekannt, daß der erythropoetische Faktor im Plasma von Tieren mit induzierter Anämie vorhanden ist.It is also known that the erythropoietic factor in the plasma of Animals with induced anemia is present.

Die Anwesenheit dieser Substanz im Plasma von anämischen Kranken und Kranken mit Polycythämie hat die Erforschung der Möglichkeit seiner Verwendung bei der Behandlung der Blutzersetzung beim Menschen und bei Tieren angeregt. Dieses Ziel führte zu einem intensiven Suchen nach einem Darstellungsverfahren eines erythropoetischen Faktors von hohem Titer und gesteigerter Aktivität.The presence of this substance in the plasma of anemic sufferers and Sufferers with polycythemia has been researching the possibility of its use at the treatment of blood decomposition in humans and animals. This The goal led to an intensive search for a method of representing an erythropoietic High titer and increased activity factor.

Bekannte Gewinnungsverfahren benutzen die Tatsache, daß der Faktor wärmebeständig ist und von Perchlorsäure nicht ausgefällt wird. Verfahren jedoch, die entweder Wärme oder Säure verwendeten, zeigten Nachteile. In allen Fällen ergab sich ein Filtrat, das ein großes Volumen und eine geringe Aktivität hatte und für klinische Untersuchungen ungeeignet war. Von diesem Nachteil abgesehen, ist die Verwendung dieser Reagenzien auch in anderer Hinsicht nicht wünschenswert. Das nicht ungefährliche Arbeiten mit Perchlorsäure sei beispielsweise erwähnt. Auf der anderen Seite ist zwar das Kochen des Plasmas sicherer als das Perchlorsäureverfahren, führt aber zum Verlust von bis zu 70 % der Aktivität und liefert eine Substanz, die kein gleichmäßiges Ansprechen gibt. Zudem führt das Kochen, wie auch die Eiweißfällung mit Perchlorsäure, zur Unbrauchbarkeit des Plasmarestes.Known extraction methods use the fact that the factor is heat resistant and is not precipitated by perchloric acid. Procedure however, which used either heat or acid showed disadvantages. In all cases revealed a filtrate that had a large volume and a low activity and for clinical investigation was unsuitable. Aside from this disadvantage, the Use of these reagents is also undesirable in other respects. Not that one Safe work with perchloric acid should be mentioned, for example. On the other On the other hand, boiling the plasma is safer than the perchloric acid process that leads to it but the loss of up to 70% of the activity and yields a substance that is not even response. In addition, the cooking leads, as does the protein precipitation with perchloric acid, to the uselessness of the plasma residue.

Hieraus ist ersichtlich, daß für ein praktisches Verfahren zur Herstellung von Konzentraten des erythropoetischen Faktors im Plasma Bedarf besteht. Es ist nun ein Ziel der Erfindung, ein einfaches und sehr wirksames Verfahren zur Herstellung von Konzentraten des erythropoetischen Faktors im Plasma zu schaffen. Erfindungsgemäß verfährt man zur Herstellung von Konzentraten des erythropoetischen Faktors aus dem Blutplasma von Warmblütern in der Weise, daß man das Blutplasma, insbesondere von anämischem Blut und vorzugsweise von Schafen, bei einem pH-Wert von 3,5 bis 8,5, besonders. 4 bis 6, mit einem praktisch unlöslichen offenkettigen Polysaccharidionenaustauscher, besonders mit Alkylaminoderivaten der Cellulose, behandelt und das Adsorbat mit einer mittels etwa 0,1 bis 0,5 Mol Natriumchlorid und 0,05 bis 0,2 Mol primärem Natriumphosphat abgepufferten, wäßrigen Lösung eluiert. Insbesondere geht man von einer Blutplasmalösung mit einem Gehalt an Alkalisalzen von etwa 0,01 bis 0,06 Mol, vorzugsweise 0,03 bis 0,04 Mol, Natriumchlorid aus. Das Ionenaustauschermaterial wird vor der Adsorption auf einen p.-Wert von etwa 3,5 bis 8,5, vorzugsweise 4,2 bis 4,8, und eine Natriumchloridkonzentration von etwa 0,03 bis 0,04 Mol eingestellt.From this it can be seen that there is a need for a convenient method for preparing concentrates of erythropoietic factor in plasma. It is now an object of the invention to provide a simple and very effective process for the preparation of concentrates of the erythropoietic factor in plasma. According to the invention, the procedure for preparing concentrates of the erythropoietic factor from the blood plasma of warm-blooded animals is that the blood plasma, in particular from anemic blood and preferably from sheep, is at a pH of 3.5 to 8.5, especially. 4 to 6, treated with a practically insoluble open-chain polysaccharide ion exchanger, especially with alkylamino derivatives of cellulose, and the adsorbate is eluted with an aqueous solution buffered by means of about 0.1 to 0.5 mol of sodium chloride and 0.05 to 0.2 mol of primary sodium phosphate . In particular, one starts from a blood plasma solution with an alkali metal salt content of about 0.01 to 0.06 mol, preferably 0.03 to 0.04 mol, of sodium chloride. Before the adsorption, the ion exchange material is adjusted to a p. Value of about 3.5 to 8.5, preferably 4.2 to 4.8, and a sodium chloride concentration of about 0.03 to 0.04 mol.

Das nach diesem Verfahren erhaltene Konzentrat kann sofort verwendet oder zunächst gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden.The concentrate obtained by this process can be used immediately or stored first and used at a later date.

Bei der Ausführung der Erfindung wird vorzugsweise ein anämisches Plasma vom Rind, Schaf, Schwein oder von anderen Säugetieren verwendet. Anämie kann bei den Tieren auf verschiedenen Wegen induziert werden, z. B. durch sublethale Bestrahlung, Blutungen, Einbringen in eine hypoxische Atmosphäre oder Einspritzung eines hämolytischen oder polycythämischen Präparats. Für die Zwecke der Erfindung ist diese letztgenannte Methode, die Bildung des erythropoetischen Anregefaktors hervorzurufen, besonders geeignet. Ein hämolytischer Stoff, wie Phenylhydrazin-Hydrochlorid, oder ein polycythämischer Stoff, wie Kobaltchlhorid, ist besonders wünschenswert, weil so eine schnelle Bildung des erythropoetischen Faktors im Plasma des Tieres bewirkt wird und die Wiedergewinnung des Plasmas. möglich ist, so daß es noch für andere klinische Arbeiten verwendet werden kann. Es wurde gefunden, daß mit Phenylhydrazin behandelte Tiere produktiver sind und deutlich größere Volumina Plasma geben als Tiere, die mit Kobaltchlorid behandelt wurden. Das Kobaltchlorid erhöht die Bildung von Erythrocyten, was die Ausbeute an Plasma erniedrigt.In practicing the invention, it is preferred to become anemic Plasma from beef, sheep, pork or other mammals used. Anemia can in animals in different ways be induced, e.g. B. by sublethal radiation, bleeding, placement in a hypoxic atmosphere or Injection of a hemolytic or polycythemic preparation. For the purposes of the invention is this latter method, the formation of the erythropoietic To cause the excitation factor is particularly suitable. A hemolytic agent, such as phenylhydrazine hydrochloride, or a polycythemic substance such as cobalt chloride is particularly desirable because such a rapid formation of the erythropoietic factor in the plasma of the animal is effected and the recovery of the plasma. is possible, so it's still for other clinical work can be used. It has been found that with phenylhydrazine treated animals are more productive and give significantly larger volumes of plasma than Animals treated with cobalt chloride. The cobalt chloride increases the formation of erythrocytes, which lowers the yield of plasma.

Bei einer besonders günstigen Ausführungsform der Erfindung werden Tiere, denen Phenylhydrazin-Hydrochlorid eingespritzt worden war, gewöhnlich dann ausgeblutet. wenn der Hämatocrit ungefähr bei 25 und vorzugsweise zwischen 16,0 und 8,0 liegt. Der Hämatocrit ist ein Maß des relativen, von den Erythrocyten im Blut eingenommenen Volumens und ein ausgezeichneter Hinweis auf die optimale Menge des erythropoetischen Faktors im Plasma. Das Blut des Tieres kann nach herkömmlichen aseptischen Verfahren entnommen werden und direkt in eine die Koagulation verhindernde Lösung mit entweder Heparin, Citrat oder unter dem Namen Versen bekannten synthetischen Polyaminopolycarbonsäuren gegeben werden. Danach wird die Trennung der Erythrocyten vom Plasma gewöhnlich durch Zentrifugieren erreicht.In a particularly favorable embodiment of the invention Animals that had been injected with phenylhydrazine hydrochloride usually then bled out. when the hematocrit is around 25 and preferably between 16.0 and 8.0. The hematocrit is a measure of the relative size of the erythrocytes in the Blood ingested volume and an excellent indication of the optimal amount of the erythropoietic factor in plasma. The blood of the animal can according to conventional aseptic procedures and directly into a coagulation preventing Solution with either heparin, citrate or synthetic known under the name Versen Polyaminopolycarboxylic acids are given. After that, the separation of the erythrocytes from plasma usually obtained by centrifugation.

Das Plasma wird mit einer Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Ameisensäure, Milchsäure, Zitronensäure, Benzoesäure usw. versetzt. Die Aktivitätsmenge, die an dem Austauschermaterial adsorbiert wird, steht in einem direkten Verhältnis zum pH-Wert des Plamas. Bei einem sehr niedrigen pH-Wert z. B. wird die Fähigkeit des Austauschers, die Aktivität festzuhalten, erniedrigt. Am anderen Ende der Skala werden unerwünschte Mengen von Feststoffen zusammen mit dem Wirkstoff auf dem Austauscher zurückbehalten, wodurch ein weiterer Arbeitsgang zur Reinigung notwendig wird. In der Praxis können zufriedenstellende Resultate bei einem PH-Wert von ungefähr 3,5 bis ungefähr 8,5 erreicht werden. Ein pA-Wert-Bereich von ungefähr 4,0 bis ungefähr 6,0 ist vorzuziehen, und eine optimale und selektive Retention des Wirkstoffes wird bei einem pH-Wert von ungefähr 4,2 bis ungefähr 4,8 erzielt.The plasma is treated with an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, Formic acid, lactic acid, citric acid, benzoic acid, etc. added. The amount of activity, which is adsorbed on the exchange material is in a direct relationship the pH of the plasma. At a very low pH z. B. becomes the ability of the exchanger to hold on to the activity is lowered. At the other end of the scale there will be undesirable amounts of solids along with the active ingredient on the exchanger retained, which means that another cleaning operation is necessary. In in practice, satisfactory results can be obtained at a pH of approximately 3.5 until about 8.5 is reached. A range of pA from about 4.0 to about 6.0 is preferable, and optimal and selective retention of the active ingredient will be at a pH of about 4.2 to about 4.8.

Nach Einstellung des pH-Wertes bildet sich gewöhnlich ein Niederschlag, der von der klaren Plasmalösung durch Zentrifugieren oder Filtrieren getrennt werden kann. Die Lösung wird dann vorzugsweise verdünnt oder dialysiert, um ein Volumenverhältnis von 1 Teil Plasma zu 3 Teilen Wasser herbeizuführen. Dadurch wird die gewünschte Einstellung der Salzkonzentration im Plasma bewirkt, die im Bereich von 0,01 bis 0,06 Mol, besonders 0,03 bis ungefähr 0,04 Mol, liegen kann. Optimale Resultate werden bei einer Salzkonzentration von ungefähr 0,0375 Mol erzielt. Ein etwa nach dieser Behandlung auftretender Niederschlag kann n-it herkömmlichen Mitteln entfernt werden. Die Plasmalösung ist nun für das Zusammenbringen mit dem Ionenaustauschermaterial fertig.After adjusting the pH, a precipitate usually forms, which can be separated from the clear plasma solution by centrifugation or filtration can. The solution is then preferably diluted or dialyzed to a volume ratio from 1 part plasma to 3 parts water. This will make the one you want Adjustment of the salt concentration in the plasma causes that in the range of 0.01 to 0.06 moles, particularly 0.03 to about 0.04 moles. Optimal results are obtained at a salt concentration of approximately 0.0375 moles. A about after Precipitation occurring in this treatment can be removed n-it conventional means will. The plasma solution is now ready to be brought into contact with the ion exchange material done.

Die Vorteile der Erfindung können mit beliebigen unlöslichen offenkettigen hochmolekularen Polysacchariden mit Austauschergruppen erreicht werden. Dieser unlösliche Polysaccharidionenaustauscher kann von einem Polysaccharid pflanzlicher, tierischer oder kakterieller Herkunft stammen, wobei das Polysaccharid vom Strukturtyp oder vom Nährstofftyp sein kann. Daher kann dieser Polysaccharidionenaustauscher ein geeignetes Derivat von pflanzlichen Nährstoffpolysacchariden sein, z. B. Stärke, Amylose und Amylopectin und Inulin; von pflanzlichen Strukturpolysacchariden, wie Cellulose, z. B. Alfacellulose und Oxycellulose, Xylanen, Pectinen und Alginen; von tierischen Polysacchariden, wie Glykogen, Chitinen und Mucopolysacchariden, z. B. Chondroitinschwefelsäure und Hyaluronsäure; von bakteriellen Polysacchariden, wie Lävanen und Dextranen. Ein besonders erwünschter Polys.accharidionenaustauscher kann von Alfacellulose, z. B. Papier, Baumwolle, Holzschliff, Baumwolltuch, stammen.The benefits of the invention can be applied to any insoluble open chain high molecular weight polysaccharides can be achieved with exchanger groups. This insoluble Polysaccharide ion exchanger can be derived from a polysaccharide of vegetable or animal origin or of bacterial origin, the polysaccharide of the structure type or can be of the nutrient type. Therefore, this polysaccharide ion exchanger can be a be a suitable derivative of plant nutrient polysaccharides, e.g. B. Strength, Amylose and amylopectin and inulin; of plant structural polysaccharides, such as Cellulose, e.g. B. alfacellulose and oxycellulose, xylans, pectins and algins; of animal polysaccharides such as glycogen, chitins and mucopolysaccharides, z. B. chondroitin sulfuric acid and hyaluronic acid; of bacterial polysaccharides, like levans and dextrans. A particularly desirable polysaccharide ion exchanger can of alfacellulose, e.g. B. paper, cotton, wood pulp, cotton cloth come from.

Die Ionenaustauschgruppen in diesen offenkettigen hochmolekularen Polymeren können entweder basisch (anionische Austauscher) oder sauer (kationische Austauscher) sein. Beispiele für Celluloseanionenaustauscher sind der Dimethylaminoäthyläther von Cellulose und der Diäthylaminoäthyläther von Cellulose. Diese Celluloseanionenaustauscher können durch Kondensation von Natriumcellulose mit 2-Chlor-N,N-dimethyläthylamin bzw. 2-Chlortriäthylamin hergestellt werden. Beispiele für Cellulosekationaustauscher sind Carboxymethyleellulose, Cellulosecitrat und Cellulosephosphat. Cellulosecitrat kann durch Veresterung von Alfacellulose mit Zitronensäure hergestellt werden.The ion exchange groups in these open chain high molecular weight Polymers can be either basic (anionic exchangers) or acidic (cationic Exchanger). Examples of cellulose anion exchangers are dimethylaminoethyl ether of cellulose and the diethylaminoethyl ether of cellulose. These cellulose anion exchangers can by condensation of sodium cellulose with 2-chloro-N, N-dimethylethylamine or 2-chlorotriäthylamine are produced. Examples of cellulose cation exchangers are carboxymethyl cellulose, cellulose citrate and cellulose phosphate. Cellulose citrate can be made by esterifying alfacellulose with citric acid.

Das Zusammenbringen des Ionenaustauschermaterials und der anämischen Plasmalösung kann chargenweise oder in der Säule geschehen. Ein gutes Ergebnis wird dann erzielt, wenn das Ionenaustauschermaterial in die Plasmalösung eingebracht und dann das Gemisch gerührt wird. Diese bevorzugte Arbeitsweise bringt nicht nur den Wirkstoff wirksam auf den Austauscher, sondern ist auch zeitsparend. Die Austauschermenge je Einheit des Plasmavolumens kann in einem weiten Bereich variiert werden; praktisch brauchbar ist besonders eine Menge von ungefähr 10 g Ionenaustauscher je Liter Plasmalösung.Bringing together the ion exchange material and the anemic Plasma solution can be done in batches or in the column. A good result will be then achieved when the ion exchange material is introduced into the plasma solution and then the mixture is stirred. This preferred way of working doesn't just bring the active ingredient is effective on the exchanger but is also time-saving. The amount of exchanger per unit of the plasma volume can be varied within a wide range; practically An amount of approximately 10 g of ion exchanger per liter of plasma solution is particularly useful.

Bevor der Ionenaustauscher in die Plasmalösung eingebracht wird, soll vorzugsweise die Salzkonzentration und der pH-Wert des Austauschers praktisch denen der Plasmalösung gleichgemacht werden, z. B. mit beliebigen geeignet gepufferten Säure-Salz-Lösungen. Eine solche Pufferlösung enthält beispielsweise etwa 0,02 bis 0,03 Mol primäres Natriumphosphat und etwa 0,03 bis 0,04 Mol Natriumchlorid.Before the ion exchanger is introduced into the plasma solution, should preferably the salt concentration and the pH of the exchanger practically those be made equal to the plasma solution, e.g. B. with any suitably buffered Acid-salt solutions. Such a buffer solution contains, for example, about 0.02 to 0.03 moles of primary sodium phosphate and about 0.03 to 0.04 moles of sodium chloride.

Die Adsorption kann in 15 Minuten bis 11/2 Stunden durchgeführt werden, wonach das Austauschermaterial von der Lösung getrennt, gewaschen und abgesaugt wird und in einer Säure-Salz-Pufferlösung aufs neue suspendiert wird. Die Elution des erythropoetischen Plasmafaktors aus dem lonenaustauschermaterial kann, ebenso wie die Adsorption, chargenweise oder in Säulen durchgeführt werden. Die Arbeitsweise in Säulen besteht im Einfüllen oder Packen des Ionenaustauschermaterials in einen zylindrischen Körper und im Hindurchgleiten eines vorher hergestellten Desorptionsmittels durch die Säule. Bei der chargenweisen Eluierung erniedrigt es die Zahl der für die Desorption nötigen Waschungen.Adsorption can be carried out in 15 minutes to 11/2 hours, after which the exchanger material is separated from the solution, washed and suctioned off and is resuspended in an acid-salt buffer solution. The elution of the erythropoietic plasma factor from the ion exchange material can, as well such as adsorption, can be carried out in batches or in columns. The way of working in columns consists in filling or packing the ion exchange material in one cylindrical body and in the sliding of a previously made Desorbent through the pillar. When eluting in batches, it lowers the number of for the desorption necessary washes.

Es wurde gefunden, daß die optische Dichte der ablaufenden Flüssigkeit ein geeignetes Verfahren zur Bestimmung des Punktes bietet, bei dem praktisch der ganze Wirkstoff vom lonenaustauschermaterial desorbiert wurde.It was found that the optical density of the draining liquid provides a suitable method for determining the point at which practically the whole active ingredient was desorbed from the ion exchange material.

Man beendet gewöhnlich das Eluieren dann, wenn die optische Dichte des Eluats unter 0,1 bis 280 mu fällt (Beckmann-Spektrophotometer).Elution is usually stopped when the optical density of the eluate falls below 0.1 to 280 mu (Beckmann spectrophotometer).

Das Eluat mit dem erythropoetischen Plasmafaktorkonzentrat kann sofort verwendet werden. Wenn man jedoch das Konzentrat für späteren Gebrauch aufbewahren will, kann das Eluat dialysiert und dann lyophilisiert werden, ohne daß die Aktivität des Faktors herabgesetzt wird.The eluate with the erythropoietic plasma factor concentrate can be used immediately be used. However, if you can keep the concentrate for later use want, the eluate can be dialyzed and then lyophilized without affecting the activity of the factor is reduced.

Das Verfahren nach der Erfindung ermöglicht die Reduktion des Volumens vom Ausgangsmaterial von 201 auf ungefähr 11, ein Vorteil, der bisher mit herkömmlichen Verfahren nicht erreichbar war.The method according to the invention enables the volume to be reduced from the starting material from 201 to about 11, an advantage that has so far been achieved with conventional Procedure was unavailable.

Das Verfahren hat weiter den Vorteil, daß das Ionenaustauschermaterial nach jedem vollständigen Arbeitsgang regeneriert werden kann. Es ist daher möglich, denselben Austauscher immer wieder zu benutzen. Beispiel Der pH-Wert von 211 Plasma von mit Phenylhydrazin behandelten Schafen wurde mit 5 n-HC1 unter Rühren von 9,5 auf 4,5 eingestellt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Das klare Plasma wurde über Nacht gegen 75 1 kalten destillierten Wassers bei 4'C dialysiert, wobei sich ein Volumenverhältnis von ungefähr 1 Teil Plasma zu 3 Teilen Wasser einstellte. Nach Abkühlen auf Zimmertemperatur wurden 300 g feuchtes Ionenaustauschermaterial zugegeben, das hauptsächlich aus dem Kondensationsprodukt von Natriumcellulose und 2-Chlortriäthylamin bestand, und vorher mittels einer Pufferlösung aus 0,025 Mol Natriumphosphat und 0,0375 Mol Natriumchlorid auf einen pH-Wert von 4,5 gebracht worden war. Die Mischung wurde 11/2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und durch einen etwa 40 cm breiten Büchnertrichter filtriert. Das Ionenaustauschermaterial wurde mit derselben Pufferlösung so lange gewaschen, bis das Filtrat eine optische Dichte von unter 0,05 bei 280 mu (Beckmann-Spektrophotometer) erreicht hatte. Das feuchte Ionenaustauschermaterial wurde dann mit der Pufferlösung in eine etwa 10 cm breite Säule eingeschlämmt und absitzen gelassen. Die Eluierung wurde mit einer Lösung mit 0,1 Mol primärem Natriumphosphat und 0,5 Mol Natriumchlorid begonnen. Das Eluat wurde gesammelt, bis die optische Dichte unter 0,1 bei 280 mt, fiel. Das Eluat, insgesamt 2500 ccm, wurde mit 5 n-NaOH auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht. Die Analyse auf dem Spektrophotometer bei 280 mIt zeigte, daß 12 000 Wirkeinheiten eluiert worden waren. Das Eluat wurde 24 Stunden gegen 1001 kaltes destilliertes Wasser dialysiert bei nachfolgender Lyophilisierung. Die Ausbeute betrug l3,2 g Faktorkonzentrat.The method also has the advantage that the ion exchange material can be regenerated after each complete operation. It is therefore possible to use the same exchanger over and over again. EXAMPLE The pH of 21 1 plasma from sheep treated with phenylhydrazine was adjusted from 9.5 to 4.5 with 5N HCl with stirring. The precipitate formed was separated by centrifugation. The clear plasma was dialyzed overnight against 75 l of cold distilled water at 4 ° C., a volume ratio of approximately 1 part of plasma to 3 parts of water being established. After cooling to room temperature, 300 g of moist ion exchange material were added, which mainly consisted of the condensation product of sodium cellulose and 2-chlorotriäthylamine, and had previously been brought to a pH of 4.5 by means of a buffer solution of 0.025 mol of sodium phosphate and 0.0375 mol of sodium chloride was. The mixture was stirred for 11/2 hours at room temperature and filtered through a Buchner funnel about 40 cm wide. The ion exchange material was washed with the same buffer solution until the filtrate had reached an optical density of less than 0.05 at 280 μm (Beckmann spectrophotometer). The moist ion exchange material was then slurried with the buffer solution in an approximately 10 cm wide column and allowed to settle. Elution was started with a solution containing 0.1 mole primary sodium phosphate and 0.5 mole sodium chloride. The eluate was collected until the optical density fell below 0.1 at 280 mt. The eluate, a total of 2500 ccm, was brought to a pH of 7.0 with 5N NaOH. Analysis on the spectrophotometer at 280 mIt showed that 12,000 active units had been eluted. The eluate was dialyzed against 100 liters of cold distilled water for 24 hours with subsequent lyophilization. The yield was 13.2 g of factor concentrate.

Durch Versuche an männlichen Sprague-Dawley-Ratten zeigte sich, daß man durch das vorbeschriebene Anreicherungsverfahren eine Wirkstoffausbeute von etwa 72% erreicht.Experiments on male Sprague-Dawley rats showed that one by the above-described enrichment process an active ingredient yield of reached about 72%.

Die Erzielung einer Ausbeute an Wirkstoff im Eluat von ungefähr 72 % beruht auf folgenden Werten: Ausgangsmaterial 4 ccm- Plasmaäquivalent je Tier ........ 5,1% Filtrat 4 ccm Plasmaäquivalent je Tier ........ 2,011/o Eluat 4 ccm Plasmaäquivalent je Tier ........ 3,711/o Kobaltstandard 4 ccm Plasmaäquivalent je Tier ........ 4,0% Achieving a yield of active ingredient in the eluate of approximately 72% is based on the following values: Source material 4 ccm plasma equivalent per animal ........ 5.1% Filtrate 4 ccm plasma equivalent per animal ........ 2.011 / o Eluate 4 ccm plasma equivalent per animal ........ 3.711 / o Cobalt standard 4 ccm plasma equivalent per animal ........ 4.0%

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the production of concentrates of the erythropoietic factor from the blood plasma of warm-blooded animals, characterized in that that the blood plasma, especially from anemic blood and preferably from sheep, at a pH of 3.5 to 8.5, especially 4 to 6, with a practically insoluble, open-chain polysaccharide ion exchanger, especially with alkylamino derivatives of Cellulose, treated and the adsorbate with a means of about 0.1 to 0.5 moles of sodium chloride and 0.05 to 0.2 moles of primary sodium phosphate buffered aqueous solution is eluted.

2. The method according to claim 1, characterized in that one starts from a blood plasma solution with an alkali metal salt content of about 0.01 to 0.06 mol, preferably 0.03 to 0.04 mol, of sodium chloride.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized characterized in that the ion exchange material is adjusted to a pH value prior to adsorption from about 3.5 to 8.5, preferably 4.2 to 4.8, and a concentration of sodium chloride is adjusted from about 0.03 to 0.04 mol.