DE1132558B

DE1132558B - Process for the preparation of ribotides and deoxyribotides of 5-fluorouracil

Info

Publication number: DE1132558B
Application number: DEH40403A
Authority: DE
Inventors: Robert Duschinsky; Walter G Farkas; Charles Heidelberger
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1958-05-20
Filing date: 1959-05-05
Publication date: 1962-07-05

Description

Verfahren zur Herstellung von Ribotiden und Desoxyribotiden von 5-Fluoruracil Die Erfindung betrifft- ein Verfahren zur Herstellung von neuen Ribotiden und Desoxyribotiden von 5-Fluoruracil und deren Salzen mit pharmazeutisch verwendbaren Basen, insbesondere das 5-Fluoruridinphosphat und das 2'-Desoxy-5-fluoruridinphosphat, sowie Salze dieser Verbindungen. Der Ausdruck »Phosphat« ist bei der Beschreibung der vorliegenden- :Erfindung in weitem Sinne zu verstehen. Er soll einen Ester des Phosphors bezeichnpn, worin der Säureteil des Esters von einer Säure des Phosphors abgeleitet ist, welche nur Wasserstoff, Sauerstoff und Phosphor enthält und worin der Phosphor fünfwertig und über ein Sauerstoffatom mit einem Kohlenstoffatom verbunden ist.Process for the preparation of ribotides and deoxyribotides of 5-fluorouracil The invention relates to a process for the production of new ribotides and deoxyribotides of 5-fluorouracil and its salts with pharmaceutically acceptable bases, in particular the 5-fluorouridine phosphate and the 2'-deoxy-5-fluorouridine phosphate, and salts thereof Links. The term "phosphate" is used in the description of the present : To understand invention in a broad sense. It is said to denote an ester of phosphorus, wherein the acid portion of the ester is derived from an acid of phosphorus, which contains only hydrogen, oxygen and phosphorus and in which the phosphorus is pentavalent and is connected to a carbon atom via an oxygen atom.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man ein 5-Fluoruracü-N-ribosid bzw. -N-desoxyribösid; z. B. 5-Fluoruridin =oder 2'-Desoxy-5-fluoruridin.unter Ausschluß von Wasser mit Phosphorsäuremonochlorid oder Phosphorsäuredichlorid oder.einer Mischung dieser beiden Stöffe in Gegenwart' 'einer tertiären organischen Base, -z. $. Pyridin, Chinolin, bei Zimmertemperatur oder leicht erhöhter Temperatur umsetzt und die gewünschten Nucleotide chromatographisch abtrennt. Die Reaktionsdauer hängt im allgemeinen vom Verhältnis des verwendeten °Monozum.Dichlorid der Phosphorsäure ab. Bei Verwendung von im wesentlichen reinen PhosphorsäuredichIorid ist die kürzeste Reaktionsdauer :erforderlich. Die .längste Reaktionsdauer ist notwendig, wenn man im wesentlichen reines Phosphorsäuremonochlorid verwendet. Eine mittlere Reaktionsdauer ist dann nötig, wenn -man ein Gemisch dieser beiden Stoffe. anwendet. '.The inventive method consists in that one 5-Fluoruracü-N-riboside or -N-deoxyriboside; z. B. 5-fluorouridine = or 2'-deoxy-5-fluorouridine, to the exclusion of water with phosphoric acid monochloride or phosphoric acid dichloride or a mixture of these two substances in the presence of a tertiary organic base, -z. $. Pyridine, Quinoline, at room temperature or at a slightly elevated temperature, and the desired Separating nucleotides by chromatography. The reaction time generally depends on The ratio of the ° Monozum.Dichlorid used to the phosphoric acid. Using of essentially pure phosphoric acid dichloride is the shortest reaction time :necessary. The longest reaction time is necessary if one essentially pure phosphoric acid monochloride is used. An average reaction time is then necessary if you use a mixture of these two substances. applies. '.

Als Beispiele für die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen 5-Fluoruracilmononucleotide seien, die folgenden genannt: 2'-Desoxy-5-fluoruridin-5'-monophosphat, 2'-Desoxy-5-fluoruridin-3',5'-diphosphat, 5-Fluoruridin-5'-rnonophosphat, 5-Fluoruridin-5'-diphosphat, 5-Fluoruridin-5'-triphosphat.As examples of those obtainable by the process of the invention 5-fluorouracil mononucleotides are the following: 2'-deoxy-5-fluorouridine-5'-monophosphate, 2'-deoxy-5-fluorouridine-3 ', 5'-diphosphate, 5-fluorouridine-5'-monophosphate, 5-fluorouridine-5'-diphosphate, 5-fluorouridine-5'-triphosphate.

Die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren -.er= hältlichen Nucleotide von 5-Fluoruracil können mit pharmazeutisch verwendbaren Basen, wie AlkalimetaIlhydroxyde, Egdalkalimetallhydroxyde, Ammoniak, nicht toxische organische Basen, z,- B. Diäthänolämin; Morpholin,. in ihre Salze übergeführt werden.The nucleotides obtainable according to the method according to the invention of 5-fluorouracil can be mixed with pharmaceutically acceptable bases, such as alkali metal hydroxides, Egdalkali metal hydroxides, ammonia, non-toxic organic bases, e.g. diethhenolamine; Morpholine ,. be converted into their salts.

Die neuen 5-Flüoruracilribotide und Desoxyribotide und ihre Salze sind germicid wirksam. Sie wirken z.$-: gegen grampositive Bakterien, wie Staphylococcus aureus. Sie lassen sich auch als Antimetaboliten- verwenden, z. B. zur Wachstumshemmung von Zellen, wie Lactobacillus leichmannii, wobei sie in den Nucleinsäuremetabolismus eingreifen.The new 5-fluorouracilribotide and deoxyribotide and their salts are germicidally effective. They work z. -: against gram-positive bacteria such as Staphylococcus aureus. They can also be used as antimetabolites, e.g. B. to inhibit growth of cells such as Lactobacillus leichmannii, taking them into nucleic acid metabolism intervention.

Verfahren zur Herstellung der als Ausgangsstof% verwendeten Riboside bzw. Desoxyriboside sind Gegenstand `der deutschen Patentschriften `@ 1083825 bzw. 1072249.. Die verfahrensgemäß benötigten Phos= pliörsäurechloride werden nach -dein folgenden Verfahren, für das ein Schutz nicht begehrt wird; hergestellt (1) Zu 10 ml - (etwa. 0,11 Mo» frisch destilliertem Phosphoroxychlorid werden .langsam unter Kühlung auf 25°C und gutem Rühren 20 ml (etwa 0,11 Mol) destilliertes Wasserzugesetzt. Man läßt die Mischung hierauf etwa 15 Stunden unter sorgfältigem Ausschluß von atmosphärischer Feuchtigkeit stehen: Das erhaltene Produkt besteht im wesentlichen aus Phosphorsäuredichlorid (I) der Formel (2) Zu 20 ml (etwa 0,22 Mol) frisch destilliertem Phosphoroxychlorid werden unter gutem Rühren 8,0 ml (etwa 0;44 Mol) destilliertes Wasser zugesetzt, wobei durch Kühlung eine Temperatur von 25°C aufrechterhalten wird. Die Mischung wird hierauf während 15 Stunden unter Ausschluß-von atmosphärischer Feuchtigkeit stehengelassen: Man erhält ein Produkt, dasimwesentlichen ausPhosphorsäuremonochlorid (II) der folgenden Formel besteht. (3) Zu 36,6 ml (0,4 Mol) technischem, nicht redestilliertem Phosphoroxychlorid werden langsam unter gutem Rühren und unter Kühlung auf etwa 25'C 7,2 ml (0,4 Mol) destilliertes Wasser zugesetzt. Die Mischung wird gerührt, bis die Chlorwasserstoffentwicklung im wesentlichen beendigt erscheint, und hierauf während etwa 15 Stunden stehengelassen. Man erhält ein Produkt (1I1), das im wesentlichen aus Phosphorsäuremonochlorid mit einer geringen Menge Phosphorsäuredichlorid besteht.Processes for the production of the ribosides or deoxyribosides used as starting materials are the subject of the German patents @ 1083825 and 1072249 .. The phosphoric acid chlorides required according to the process are made according to the following process, for which protection is not sought; (1) 20 ml (about 0.11 mol) of distilled water are slowly added to 10 ml (about 0.11 mol) of freshly distilled phosphorus oxychloride while cooling to 25 ° C and stirring well Stand for hours with careful exclusion of atmospheric moisture: The product obtained consists essentially of phosphoric acid dichloride (I) of the formula (2) 8.0 ml (about 0; 44 mol) of distilled water are added to 20 ml (about 0.22 mol) of freshly distilled phosphorus oxychloride with thorough stirring, a temperature of 25 ° C. being maintained by cooling. The mixture is then left to stand for 15 hours with the exclusion of atmospheric moisture: a product is obtained which essentially consists of phosphoric acid monochloride (II) of the following formula consists. (3) 7.2 ml (0.4 mol) of distilled water are slowly added to 36.6 ml (0.4 mol) of technical, non-redistilled phosphorus oxychloride with thorough stirring and while cooling to about 25 ° C. The mixture is stirred until the evolution of hydrogen chloride appears to have essentially ceased and then left to stand for about 15 hours. A product (11) is obtained which consists essentially of phosphoric acid monochloride with a small amount of phosphoric acid dichloride.

In jedem der folgenden Beispiele wird das Phosphorsäurechlorid unmittelbar nach dem vorstehend erwähnten Zeitraum von etwa 15 Stunden verwendet.In each of the following examples, the phosphoric acid chloride becomes immediate used after the aforementioned period of about 15 hours.

Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen das erfindungsgemäße Verfahren.The following examples illustrate the invention Procedure.

Beispiel 1 50 mg 5-Fluoruridin werden in 15 ml wasserfreiem Pyridin gelöst. Die Lösung wird mit 0,3 ml Phosphorsäurechlorid (III) (nach vorstehendem Verfahren 3 erhalten) vermischt, wobei eine leichte Temperaturerhöhung eintritt. Die Mischung, wird während 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Während dieser Zeit fällt etwas Pyridinsalz als gummiartiger weißer Feststoff aus. Man setzt zur Reaktionsmischung 10 ml Wasser und erhitzt die erhaltene Lösung in einem warmen Wasserbad während 20 Minuten auf 60°C. Die Lösung wird hierauf auf etwa 25°C abgekühlt und durch Zusatz von verdünnter Natronlauge auf p$ 7,2 gebracht, worauf das Pyridin durch Abdampfen im Vakuum bis auf ein geringes Volumen entfernt wird. Der pyridinfreie Rückstand wird mit 100 ml Wasser verdünnt, der pH-Wert mit verdünnter Natronlauge auf 9,0 gebracht und die Reaktionsprodukte an einer unter dem Handelsnamen »Dowex 1-X4« bekannten Anionenaustauschersäule(bestehendausquerverbundenen Copolymerenvon Styrolmit 4 % pWinylbenzol; welches als funktionelle Gruppen quaternäre Ammoniumgruppen enthält, 1 cm - 20 cm, Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm), welche vorgängig in die Formiatform übergeführt wurde, adsorbiert. Die Säule wird hierauf entsprechend den Angaben in Tabelle 1 behandelt. Die Durchflußgeschwindigkeit der Eluiermittel beträgt 1 ml je Minute, wobei einzelne Fraktionen von etwa 15 ml mit einer automatischen Auffangvorrichtung gesammelt werden. Tabelle 1 Gesamt- Fraktionen Eluiermittel absorption (PH 1) bei 270 m[, 1 bis 4 Wasser 0 5 bis 36 0,05 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf pu 6,5 eingestellt 0 Kolonne mit Wasser ge- waschen zur Entfernung der Ammoniumionen - Fortsetzung Tabelle 1 Gasamt- Fraktionen Eluiermittel absorption (PH 1) bei 270 m[. 37 bis 45 0,02 n-Ameisensäure 0 46 bis 73 0,5 n-Ameisensäure 0 74 bis 86 1,0 n-Ameisensäure 0 87 bis 104 2,0 n-Ameisensäure 0 105 bis 122 3,0 n-Ameisensäure 0 123 bis 142 4,0 n-Ameisensäure 0 143 bis 164 5,0 n-Ameisensäure 0 165 bis 184 7,0 n-Ameisensäure 0 185 bis 207 10,0 n-Ameisensäure 0 208 bis 248 15,0 n-Ameisensäure 0 249 bis 294 Kolonne mit Wasser ge- waschen zur Entfernung der überschüssigen Amei- sensäure 0 295 1,0 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf p$ 6,5 eingestellt 2,3 296 desgl. 146,0 297 desgl: 81,0 298 desgl. 440,0 299 desgl. 104,0 300 desgl. 50,3 301 desgl. 46,0 302 desgl. 54,5 303 desgl. 52,0 304 desgl:- 23,4 305 desgl. 19,0 306 desgl. 17,7 307 desgl. 17,5 308 desgl. 16,5 309 desgl. 14,9 310 desgl. 13,7 311 desgl. 13,5 312 desgl. 11,2 313 desgl. 10,4 314 bis 323 desgl. 70,0 324 desgl. 0 Die Gesamtadsorption der Fraktionen 295 bis 323 beläuft sich auf 1203,9, was eine Ausbeute von 45,5 mg (910/, Rohausbeute) unter der Annahme von 5-Fluoruridin anzeigt.Example 1 50 mg of 5-fluorouridine are dissolved in 15 ml of anhydrous pyridine. The solution is mixed with 0.3 ml of phosphoric acid chloride (III) (obtained by method 3 above), a slight increase in temperature occurring. The mixture is left to stand for 18 hours at room temperature. During this time some of the pyridine salt precipitates out as a gummy white solid. 10 ml of water are added to the reaction mixture and the resulting solution is heated to 60 ° C. in a warm water bath for 20 minutes. The solution is then cooled to about 25 ° C. and brought to p $ 7.2 by adding dilute sodium hydroxide solution, whereupon the pyridine is removed to a small volume by evaporation in vacuo. The pyridine-free residue is diluted with 100 ml of water, the pH is brought to 9.0 with dilute sodium hydroxide solution and the reaction products are transferred to an anion exchange column known under the trade name »Dowex 1-X4« (consisting of cross-linked copolymers of styrene with 4% vinylbenzene; which serve as functional groups contains quaternary ammonium groups, 1 cm - 20 cm, mesh spacing 0.075 to 0.15 mm), which was previously converted into the formate form, adsorbed. The column is then treated as shown in Table 1. The flow rate of the eluent is 1 ml per minute, with individual fractions of about 15 ml being collected with an automatic collecting device. Table 1 Total- Fractions eluent absorption (PH 1) at 270 m [, 1 to 4 water 0 5 to 36 0.05 n-formic acid, with Ammonia to pu 6.5 set 0 Column with water wash to remove of ammonium ions - Table 1 continued Gas office Fractions eluent absorption (PH 1) at 270 m [. 37 to 45 0.02 n-formic acid 0 46 to 73 0.5 n-formic acid 0 74 to 86 1.0 n-formic acid 0 87 to 104 2.0 n-formic acid 0 105 to 122 3.0 n-formic acid 0 123 to 142 4.0 n-formic acid 0 143 to 164 5.0 n-formic acid 0 165 to 184 7.0 n-formic acid 0 185 to 207 10.0 n-formic acid 0 208 to 248 15.0 n-formic acid 0 249 to 294 column with water wash to remove of the excess amei sensic acid 0 295 1.0 n-formic acid, with Ammonia to p $ 6.5 set 2.3 296 also 146.0 297 the same: 81.0 298 and 440.0 299 also 104.0 300 and 50.3 301 the same as 46.0 302 also 54.5 303 also 52.0 304 the same: - 23.4 305 also 19.0 306 and 17.7 307 and 17.5 308 the same 16.5 309 and 14.9 310 also 13.7 311 also 13.5 312 also 11.2 313 also 10.4 314 to 323 the same 70.0 324 same as 0 The total adsorption of fractions 295 to 323 amounts to 1203.9, which indicates a yield of 45.5 mg (910 /, crude yield) assuming 5-fluorouridine.

Die Fraktionen 296, 298 und 302, welche die Hauptfraktion von drei verschiedenen 5-Fluoruridinphosphaten darstellen, werden vereinigt, mit Wasser auf ein Volumen von 1000 ml verdünnt und neuerlich an einer i>Dowex 1-X4«-Anionenaustauschersäule (1 cm - 20 cm, Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm), welche vorgängig in die Formiatform übergeführt wird, adsorbiert. Nach Adsorption des Materials wird die Säule mit 100 ml Wasser gewaschen und hierauf entsprechend den Angaben in Tabelle 2 behandelt. Die Durchflußgeschwindigkeit der Eluiermittel beträgt 1 ml je Minute, wobei einzelne Fraktionen von etwa 15 ml mittels einer automatischen Auffangvorrichtung gesammelt werden. Tabelle 2 Gesamt- Fraktionen Eluiermittel absorption (pii 1) bei 270 m[. 1 bis 46 0,2 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf p$ 6,5 eingestellt 0 47 bis 69 0,3 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf p$ 6,5 eingestellt 0 70 bis 79 0,5 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf p$ 6,5 eingestellt 0 80 desgl. 4,05 81 desgl. 14,50 82 desgl. 19,50 83 desgl. 22,00 84 desgl. 20,50 85 desgl. 11,70 86 desgl. 4,20 87 bis 117 desgl. 0 118 0,7 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf pn 6,5 eingestellt 0 119 desgl. 7,0 120 desgl. 62,2 121 desgl. 39,2 122 desgl. 9,9 123 bis 128 desgl. 0 129 desgl. 0,3 130 desgl. 18,3 131 desgl. 11,0 132 desgl. 11,2 133 desgl. 14,8 134 desgl. 11,5 135 bis 150 desgl. 0 Wie der Tabelle 2 zu entnehmen ist, werden die drei verschiedenen 5-Fluoruridinphosphate durch die Eluierbehandlung vollständig voneinander getrennt.The fractions 296, 298 and 302, which represent the main fraction of three different 5-fluorouridine phosphates, are combined, diluted with water to a volume of 1000 ml and again on an i> Dowex 1-X4 "anion exchange column (1 cm - 20 cm , Mesh spacing 0.075 to 0.15 mm), which is converted into the formate form beforehand, is adsorbed. After adsorption of the material, the column is washed with 100 ml of water and then treated according to the information in Table 2. The flow rate of the eluent is 1 ml per minute, individual fractions of about 15 ml being collected by means of an automatic collecting device. Table 2 Total- Fractions eluent absorption (pii 1) at 270 m [. 1 to 46 0.2 n-formic acid, with Ammonia to p $ 6.5 set 0 47 to 69 0.3 n-formic acid, with Ammonia to p $ 6.5 set 0 70 to 79 0.5 n-formic acid, with Ammonia to p $ 6.5 set 0 80 and 4.05 81 and 14.50 82 the same 19.50 83 the same 22.00 84 also 20.50 85 and 11.70 86 also 4.20 87 to 117 same as 0 118 0.7 n-formic acid, with Ammonia to pn 6.5 set 0 119 like 7.0 120 and 62.2 121 and 39.2 122 like 9.9 123 to 128 same as 0 129 also 0.3 130 and 18.3 131 the same as 11.0 1 32 same as 11.2 133 also 14.8 134 and 11.5 135 to 150 same as 0 As can be seen from Table 2, the three different 5-fluorouridine phosphates are completely separated from one another by the elution treatment.

Die Fraktionen 80 bis 86, welche das erste 5-Fluoruridinphosphat enthalten, werden vereinigt, und durch eine Säule eines mit »Dowex 50-X8« bezeichneten Kationenaustauscherharzes (bestehend aus querverbundenen Copolymeren von Styrol mit 8 % Divinylbenzol, enthaltend nucleare Sulfonsäuregruppen als funktionelle Gruppen, 2,5 cm - 35 cm, Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm), welches vorgängig in die Säureform umgewandelt wurde, fließen gelassen. Die von Kationen freien Nucleotide werden quantitativ im wäßrigen Ausflußgut erhalten, aus welchem man die Ameisensäure durch Verdampfung entfernt. Der Rückstand wird mit Wasser verdünnt und die erhaltene wäßrige Lösung mit verdünnter Natronlauge auf p$ 6,0 eingestellt. Die Lösung wird hierauf im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Äthanol aufgenommen und die Lösung abermals zur Trockne eingedampft. Die Verdampfung mit Äthanol wird einige Male wiederholt, um das Wasser zu entfernen. Der Rückstand wird schließlich in Äther aufgenommen, das unlösliche Produkt durch Zentrifugieren und Dekantieren gewaschen und getrocknet. Man erhält das Natriumsalz eines 5-Fluoruridinpolyphosphats mit den folgenden spektrophotometrischen Daten: pH = 1: Amax = 270 m#t; E270/mg = 5,45; -'280/E280 = e816.The fractions 80 to 86, which contain the first 5-fluorouridine phosphate, are combined and passed through a column of a cation exchange resin called "Dowex 50-X8" (consisting of cross-linked copolymers of styrene with 8% divinylbenzene, containing nuclear sulfonic acid groups as functional groups, 2.5 cm - 35 cm, mesh spacing 0.075 to 0.15 mm), which was previously converted into the acid form, allowed to flow. The cation-free nucleotides are obtained quantitatively in the aqueous effluent from which the formic acid is removed by evaporation. The residue is diluted with water and the aqueous solution obtained is adjusted to pH 6.0 with dilute sodium hydroxide solution. The solution is then evaporated to dryness in vacuo, the residue is taken up in ethanol and the solution is again evaporated to dryness. Evaporation with ethanol is repeated a few times to remove the water. The residue is finally taken up in ether, the insoluble product washed by centrifugation and decanting and dried. The sodium salt of a 5-fluorouridine polyphosphate is obtained with the following spectrophotometric data: pH = 1: Amax = 270 m # t; E270 / mg = 5.45; -'280 / E280 = e816.

pg = 4,5: @max = 268 m#t; E2.8/mg = 5,87; -'280/E280 - 0,740.pg = 4.5: @max = 268 m # t; E2.8 / mg = 5.87; -'280 / E280 - 0.740.

p$ = 8,5: im.., = 268 m#t; E26$/mg = 4,78; 8280/E280 = e829. Dieses Salz enthält 1,5 [,Mol organisch gebundenen Phosphor je Milligramm Substanz.p $ = 8.5: im .., = 268 m # t; E26 $ / mg = 4.78; 8280 / E280 = e829. This salt contains 1.5 mol of organically bound phosphorus per milligram of substance.

In derselben Art, wie vorstehend für die Fraktionen 80 bis 86 angegeben, werden die Fraktionen 119 bis 122, welche das zweite 5-Fluoruridinphosphat enthalten, in die freie Säureform umgewandelt, indem man diese Fraktionen durch einen »Dowex 50-X8«-Kationenaustauscher fließen läßt; sodann wird die Säureform in die Natriumsalzform umgewandelt. Das zweite 5-Fluoruridinpolyphosphat-natriumsalz weist die folgenden spektrophotometrischen Daten auf p$ = 1: imax = 270 mtL; E2.o/mg = 6,68; - -'280/-'280 = 0,834.In the same manner as given above for fractions 80 to 86, fractions 119 to 122, which contain the second 5-fluorouridine phosphate, are converted to the free acid form by flowing these fractions through a "Dowex 50-X8" cation exchanger leaves; then the acid form is converted to the sodium salt form. The second 5-fluorouridine polyphosphate sodium salt has the following spectrophotometric data p $ = 1: imax = 270 ml; E2.o / mg = 6.68; - -'280 / - '280 = 0.834.

p$ = 4,5: @max = 268 m#t; E218/mg = 6,90; -'280/-'280 = e837.p $ = 4.5: @max = 268 m # t; E218 / mg = 6.90; -'280 / - '280 = e837.

PH = 8,5: Amax = 268 m£; E261/mg = 5,97; -'280/E280 - 0,872. Dieses Salz enthält 1,7 #LMol organisch gebundenen Phosphor je Milligramm Substanz.PH = 8.5: Amax = 268m £; E261 / mg = 5.97; -'280 / E280 - 0.872. This salt contains 1.7 mol of organically bound phosphorus per milligram of substance.

In derselben Art, wie vorstehend für die Fraktionen 80 bis 86 angegeben, werden die Fraktionen 129 bis 134, welche das dritte 5-Fluoruridinphosphat enthalten, in die freie Säureform übergeführt, indem man es durch einen »Dowex 50-X8«-Kationenaustauscher fließen läßt, und sodann in die Natriumsalzform überführt. Das dritte 5-Fluoruridinpolyphosphatnatriumsalz weist die folgenden spektrophotometrischen Daten auf PH = 1: Amax = 270 m#t; E2,o/mg = 5,05; 8280/8210 = e813.In the same way as indicated above for fractions 80 to 86, the fractions 129 to 134, which contain the third 5-fluorouridine phosphate, converted into the free acid form by passing it through a "Dowex 50-X8" cation exchanger allowed to flow, and then converted into the sodium salt form. The third 5-fluorouridine polyphosphate sodium salt exhibits the following spectrophotometric data: PH = 1: Amax = 270 m # t; E2, o / mg = 5.05; 8280/8210 = e813.

pg = 4,5: Am"." = 268 ml,t; E2"/mg= 5,17; 8280I8280 - 0,813. pg = 8,5: Amax = 268 m#t; E2"8/mg = 4,62; -'280/82B0 = e810. Dieses Salz enthält 1,7 #tMol organisch gebundenen Phosphor je Milligramm Substanz.pg = 4.5: On "." = 268 ml, t; E2 "/ mg = 5.17; 8280I8280-0.813 . Pg = 8.5: Amax = 268 m # t; E2" 8 / mg = 4.62; -'280 / 82B0 = e810. This salt contains 1.7 tmoles of organically bound phosphorus per milligram of substance.

Jedes der drei vorstehend beschriebenen 5-Fluoruridinpolyphosphate zeigt im Testversuch eine hohe Hemmaktivität auf das Wachstum von Lactobacillus leichmannii.Any of the three 5-fluorouridine polyphosphates described above shows a high inhibitory activity on the growth of Lactobacillus in the test leichmannii.

Beispiel 2 1,0 g 2'-Desoxy-5-fluoruridin wird in 300 ml trockenem Pyridin gelöst. Zu der klaren Lösung werden unter Rühren 6,0 ml Phosphorsäurechlorid (III) zugesetzt, wobei eine leichte Temperaturerhöhung eintritt. Die Mischung wird während einiger Stunden bei 25 bis 30°C gerührt, wobei etwas Pyridinsalz als gummiartiger weißer Feststoff aus der Lösung ausfällt. Die Reaktionsmischung wird hierauf mit 500 ml Wasser verdünnt, der pH-Wert mit verdünnter Natronlauge auf 9,0 gebracht und die Lösung hierauf durch eine Säule von »Dowex 1-X4«-Anionenaustauscherharz (3 cm - 60 cm, Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm) fließen gelassen, welches vorgängig in die Formiatform übergeführt wurde. Die Säule wird mit Wasser gewaschen, bis sie pyridinfrei ist, und hierauf, in der in Tabelle 3 angegebenen Weise behandelt. Die Durchflußgeschwindigkeit der Eluiermittel beträgt 3 ml je Minnte, wobei einzelne Fraktionen von etwa 15 ml mit Hilfe einer automatischen Auffangvorrichtung gesammelt werden. - Tabelle 3 Gesamt- ; -Fraktionen Eluiermittel absorption bei 270 mg. 10,05- n-Ameisensäure, ; mit Ammoniak auf p-u -6,5. _ .. eingestellt. - . -24 2 desgl. - 140;0 .. ." 3 .. desgl. , ' 240,0 ._ -. :.. 4-' -" desgl: 321,0;.--: 5 desgl." 536,0 ,, . 6 - desgl. 55 0 ,0 -7 - desgl. 693,0 8 . desgl. - 850,0 9 ' desgl: 1875,0 10 desgl. 5950,0 11 desgl. -8560,0 12 desgl: -- . , . . 796;0 :. 13: desgl. $Ö7,4- .: -14.-:-- desgl. ._ " 480,0N - . ..-15` .:: desgl. ' - - . 262;Ö" .:- . . desgL " 52,0 _ "' 17 -- desgi::., . - 0 Kolonne gewaschen mit ' Wasser zur Entfernung der überschüssigen Am- mäniumiönen, hierauf _ mit 500m1 0,1 n-Amei- " - sensäure, uni die Kolonne - zur sauren Eluierung vor- zubereiten 18 bis 31 3,5 n-Ameisensäure ' 0 32- desgl. 31,5 - 33 _ desgl. 51;0 34 desgl. 17,5 35 desgl. 100,0 36 desgl. 146;0 37 desgl. 197,0 Fortsetzung Tabelle 3 Gesamt- Fraktionen Eluiermittel absorption (PH 1) bei 270 m#t 38 3,5 n-Ameisensäure 234,0 - 39 desgl. 223,0 40 desgl. 163,0 41 desgl. 115,0 42 desgl, 70,0 43 desgl. 38,2 44 desgl. 0 Die Fraktionen 1 bis 16 enthalten wiedergewonnenes, nicht umgesetztes -Ausgangsmaterial. Die Fraktionen 32 bis 43, welche Nucleotide enthalten, werden vereinigt und die Ameisensäure durch Verdampfung im Vakuum auf ein kleines. Volumen entfernt. Die erhaltene Lösung wird durch Gefriertrocknung zur Trockne gebracht, der feste Rückstand. in 20 ml Wasser aufgenommen und etwas unlösliches Material abfiltriert. Das Filtrat wird mit verdünnter Natronlauge auf p$ 6,5 ge>racht, wobei sich ein Natriumsalz der Nucleotide bildet. Nach Gefriertrocknung der Lösung erhält man 84,8 -mg eines festen Rückständer.Example 2 1.0 g of 2'-deoxy-5-fluorouridine is dissolved in 300 ml of dry pyridine. 6.0 ml of phosphoric acid chloride (III) are added to the clear solution with stirring, a slight increase in temperature occurring. The mixture is stirred for a few hours at 25 to 30 ° C., some pyridine salt precipitating out of the solution as a gummy white solid. The reaction mixture is then diluted with 500 ml of water, the pH value is brought to 9.0 with dilute sodium hydroxide solution and the solution is then passed through a column of "Dowex 1-X4" anion exchange resin (3 cm - 60 cm, mesh spacing 0.075 to 0, 15 mm), which was converted into the formate form beforehand. The column is washed with water until it is free of pyridine, and then treated in the manner indicated in Table 3. The flow rate of the eluent is 3 ml per minute, individual fractions of about 15 ml being collected with the aid of an automatic collecting device. - Table 3 Total- ; -Fractions eluent absorption at 270 mg. 10.05-n-formic acid,; with Ammonia to pu -6.5. _ .. set. -. -24 2 the same - 140; 0 ... "3 .. the same, '240.0 ._ -. : .. 4- '- "the same: 321.0; .--: 5 the same. "536.0 ,,. 6 - the same 55 0 , 0 -7 - the same 693.0 8th . the same - 850.0 9 'also: 1875.0 10 also 5950.0 11 also -8560.0 12 the same: -. ,. . 796; 0:. 13: the same $ Ö7.4- .: -14 .-: - the same ._ "480.0N - . ..- 15`. :: the same. '- -. 262; Ö ".: -. . desgL "52.0 _ "'17 - desgi ::.,. - 0 Column washed with 'Water for removal the excess am- on this _ with 500m1 0.1 n-Amei- " - sensic acid, uni the column - for acidic elution prepare 18 to 31 3.5 n-formic acid '0 32- like 31.5 - 33 _ also 51; 0 34 the same 17.5 35 the same 100.0 36 also 146; 0 37 also 197.0 Continuation of table 3 Total- Fractions eluent absorption (PH 1) at 270 m # t 38 3.5 n-formic acid 234.0 - 39 as well. 223.0 40 and 163.0 41 the same 115.0 42 the same, 70.0 43 also 38.2 44 same as 0 Fractions 1 to 16 contain recovered, unreacted starting material. Fractions 32 to 43, which contain nucleotides, are pooled and the formic acid is reduced to a small size by evaporation in vacuo. Volume removed. The solution obtained is brought to dryness by freeze-drying, the solid residue. taken up in 20 ml of water and some insoluble material filtered off. The filtrate is brought to 6.5 with dilute sodium hydroxide solution, a sodium salt of the nucleotides being formed. After freeze-drying the solution, 84.8 mg of a solid residue are obtained.

'73;5 mg dieses Rückstandes:werden in 50 ml.Wasser gelöst und in die freie Säureform umgewandelt, indem man' die Lösung durch eine »13öwex 50-X8«-Kationenaüstauschersäule (2,5 cm - 35 cm) in der im "Vorhergehenden Beispiel angegebenen Weise fließen -läßt. Die freien Nucleotide werden quantitativ im wäßrigen Ausflußgut wiedergeWörinen-Dieses wird 'gefriergetrocknet, der feste 'kiickstärld in: 15 ml Methanol gelöst, eine geringe Menge umlösliches Material abfiltriert und das methanolische.Filtrat zur Trockne eingedampft. Der 48,1 mg schwere feste Rückstand wird in 5-ml Methanol gelöst, rvdräuf man 25 ml -Äther zusetzt. Der erhaltene weiße -Niederschlag wird mit Äther durch Zentrifugieren und Dekantieren gewaschen und hierauf getrocknet. Man erhält 33,2 mg eines weißen Pulvers, welches-Im wesentlichen 2'-Deso XY'5 -fluoruridin-5'-monophosphat enthält. Die: spektrophotometrischen Daten flir diese Verbindung sind die foleenden: - P. = 1: A@reax = 271 mg,; E271/Mg = 17,9; - E280/2260 - 0,87, Absorption/Grammatom- Phosphor = 8700. pg = 13: Amax = 269 m#t; . E269/mg = 14,75; - - E280/2280 = 0,184, Absorption/Grammatom- Phosphor = _7200. Bei der Prüfung auf die Wachstumshemmung von Lactobacillus leichmannü zeigt diese Verbindung eine selig starke Wirkeng.'73; 5 mg of this residue: are dissolved in 50 ml of water and converted into the free acid form by passing the solution through a »13öwex 50-X8« cation exchange column (2.5 cm - 35 cm) in the The free nucleotides are quantitatively recovered in the aqueous effluent Solid residue weighing 48.1 mg is dissolved in 5 ml of methanol, 25 ml of ether are then added. The white precipitate obtained is washed with ether by centrifugation and decanting and then dried. 33.2 mg of a white powder are obtained. which-essentially contains 2'-Deso XY'5 -fluoruridine-5'-monophosphate. The: spectrophotometric data for this compound are the following ends: - P. = 1: A @ reax = 271 mg ,; E271 / Mg = 17.9; - E280 / 2260 - 0.87, Absorbance / gram atom phosphorus = 8700. pg = 13: Amax = 269 m # t; . E269 / mg = 14.75; - - E280 / 2280 = 0.184, Absorbance / gram atom phosphorus = _7200. When tested for the growth inhibition of Lactobacillus leichmannü, this compound shows a blissfully strong effect.

" - Beispiel 3 50 mg 2'-Desoxy-5-fluoruridin werden in 15 ml trockenem Pyridin gelöst. Zu der klaren Lösung setzt man 0,3 ml Phosphorsäürechlorid (III). Es tritt -eine leichte Temperaturerhöhung ein. Die Mischung wird während 18 Stunden bei 25 bis 30°C gerührt, wobei etwas Pyridinsalz als gummiartiger weißer Feststoff aus der Lösung ausfällt. Die Reaktionsmischung wird hierauf mit 10 ml Wasser verdünnt, -im Wasserbad während 20 Minuten auf 80°C erhitzt, hierauf gekühlt und mit 50 ml Wasser verdünnt. Man stellt den pg-Wert der Lösung mit verdünnter Natronlauge auf 7,2 ein und entfernt das Pyridin durch Vakuumdestillation. Die pyridinfreie Lösung wird hierauf durch Zusatz von verdünnter Natronlauge auf pg 9,0 gebracht und an einer »Dowex 1-X4«-Formiatkolonne (1 cm - 20 cm, Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm) adsorbiert. Die Kolonne wird mit 200 ml Wasser gewaschen und hierauf entsprechend den Angaben in Tabelle 4 eluiert. Die Durchflußgeschwindigkeit der Eluiermittel beträgt 1 ml je Minute, wobei einzelne Fraktionen von etwa 30 ml mit Hilfe einer automatischen Auffangvorrichtung gesammelt werden. Tabelle 4 Gesamt- Fraktionen Eluiermittel absorption (PH 1) bei 270 m#t 1 bis 12 0,05 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf pg 6,5 eingestellt 0 13 desgl. 9,5 14 desgl. 23,2 15 desgl. 41,5 16 desgl. 63,5 17 desgl. 111,0 18 desgl. 268,0 19 desgl. 720,0 20 desgl. 25,0 21 bis 33 desgl. 0 34 0,5 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf pH 6,5 eingestellt 0 35 desgl. 0 36 desgl. 23,2 37 desgl. 11,0 38 desgl. 4,6 39 desgl. 9,1 40 desgl. 8,3 41 desgl. 4,6 42 desgl. 5,6 43 desgl. 9,0 44 desgl. 13,3 45 desgl. 24,8 46 desgl. 26,7 47 desgl. 36,2 48 desgl. 30,4 49 desgl. 17,0 50 desgl. 10,4 51 desgl. 8,0 52 desgl. 7,1 53 desgl. 8,4 54 desgl. 9,0 55 bis 60 desgl. 0 Die Fraktionen 13 bis 20 enthalten wiedergewonnenes, nicht umgesetztes Ausgangsmaterial."- Example 3 50 mg of 2'-deoxy-5-fluorouridine are dissolved in 15 ml of dry pyridine. 0.3 ml of phosphoric acid chloride (III) is added to the clear solution The reaction mixture is then diluted with 10 ml of water, heated to 80 ° C. in a water bath for 20 minutes, then cooled and washed with 50 ml of water The pg value of the solution is adjusted to 7.2 with dilute sodium hydroxide solution, and the pyridine is removed by vacuum distillation. The pyridine-free solution is then brought to pg 9.0 by adding dilute sodium hydroxide solution and put on a "Dowex 1-X4" Formate column (1 cm-20 cm, mesh spacing 0.075 to 0.15 mm) adsorbed. The column is washed with 200 ml of water and then eluted according to the information in Table 4. The flow rate of the eluent is 1 ml per minute , with individual fractions of about 30 ml being collected using an automatic collecting device. Table 4 Total- Fractions eluent absorption (PH 1) at 270 m # t 1 to 12 0.05 n-formic acid, with Ammonia to pg 6.5 set 0 13 and 9.5 14 and 23.2 15 and 41.5 16 also 63.5 17 also 111.0 18 also 268.0 19 also 720.0 20 and 25.0 21 to 33 same as 0 34 0.5 n-formic acid, with Ammonia to pH 6.5 set 0 35 same 0 36 as well. 23.2 37 same as 11.0 38 same 4.6 39 and 9.1 40 and 8.3 41 also 4.6 42 and 5.6 43 like 9.0 44 also 13.3 45 and 24.8 46 the same 26.7 47 as well. 36.2 48 same as 30.4 49 the same 17.0 50 and 10.4 51 like 8.0 52 and 7.1 53 and 8.4 54 like 9.0 55 to 60 same as 0 Fractions 13-20 contain recovered, unreacted starting material.

Die Fraktionen 36 bis 54, welche Nucleotide enthalten, werden vereinigt und mit 570 ml Wasser verdünnt an einer »Dowex 1-X4«-Formiatsäule (1 cm 20 cm, Maschenabstand 0,075 bis 0,15 mm) neuerlich adsorbiert und hierauf in der Tabelle 5 angegebenen Weise behandelt. Die Durchflußgeschwindigkeit beträgt 1 ml je Minute, wobei Fraktionen von etwa 15 ml mit Hilfe einer automatischen Auffangvorrichtung gesammelt werden. Tabelle 5 (200 ml 0,05 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf pg 6,5 eingestellt, werden durch die Kolonne laufengelassen, ohne einzelne Fraktionen zu sammeln. Das Ausflußgut enthält kein organisches Material. Die Eluierung wird hierauf fortgesetzt, wobei einzelne Fraktionen gesammelt werden.) Gesamt- Fraktionen Eluiermittel absorption SPA 1) bei 270 ml, 1 1,0 n-Ameisensäure, mit Ammoniak auf pg 6,5 eingestellt 0 2 desgl. 0 3 desgl. 5,0 4 desgl. 8,3 5 desgl. 23,4 6 desgl. 29,4 7 desgl. 19,4 8 desgl. 8,3 9 desgl. 7,2 10 desgl. 6,0 11 desgl. 4,5 12 desgl. 4,5 13 desgl. 4,5 14 desgl. 3,6 15 desgl. 3,6 16 desgl. 3,3 17 desgl. 3,3 18 desgl. 3,4 19 desgl. 3,4 20 desgl. 1,8 21 desgl. 1,8 22 desgl. 3,1 23 desgl. 3,1 24 desgl. 3,0 25 desgl. 3,0 26 bis 71 desgl. 0 Die Fraktionen 3 bis 9, welche den größten Teil der Nucleotide enthalten, werden vereinigt und das Produkt in die freie Säureform übergeführt, indem man es durch eine »Dowex 50-X8«-Kationenaustauschersäule (1,0 cm - 20 cm) in der im vorhergehenden Beispiel angegebenen Weise fließen läßt. Die freien Nucleotide werden im Ausflußgut quantitativ wiedergewonnen.The fractions 36 to 54, which contain nucleotides, are combined and diluted with 570 ml of water on a "Dowex 1-X4" formate column (1 cm 20 cm, mesh spacing 0.075 to 0.15 mm) and then reabsorbed in Table 5 treated way. The flow rate is 1 ml per minute, with fractions of approximately 15 ml being collected using an automatic collecting device. Table 5 (200 ml of 0.05 n-formic acid, adjusted to pg 6.5 with ammonia, are run through the column without collecting individual fractions. The effluent contains no organic material. The elution is then continued, with individual fractions being collected will.) Total- Fractions eluent absorption SPA 1) at 270 ml, 1 1.0 n-formic acid, with Ammonia to pg 6.5 set 0 2 same as 0 3 as well as 5.0 4 same as 8.3 5 as well. 23.4 6 same as 29.4 7 and 19.4 8 and 8.3 9 and 7.2 10 as well as 6.0 11 also 4.5 12 and 4.5 13 and 4.5 14 also 3.6 15 like 3.6 16 same 3.3 17 also 3.3 18 same 3.4 19 same 3.4 20 the same 1.8 21 same 1.8 22 as well as 3.1 23 also 3.1 24 like 3.0 25 also 3.0 26 to 71 same as 0 Fractions 3 to 9, which contain the majority of the nucleotides, are combined and the product is converted into the free acid form by passing it through a "Dowex 50-X8" cation exchange column (1.0 cm - 20 cm) in the im previous example lets flow. The free nucleotides are recovered quantitatively in the effluent.

Das Ausflußgut wird auf etwa l0ml-im Vakuum eingedampft, um die größte Menge der Ameisensäure zu entfernen. Hierauf setzt man 25 ml Äthanol zu und dampft die Lösung im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird in 25 ml Äthanol aufgenommen und abermals zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wird hierauf in 40 ml gelöst und der pH-Wert durch Zusatz von verdünnter Natronlauge auf 6,5 gebracht, wobei sich das Natriumsalz der Nucleotide bildet. Die Lösung wird abermals im Vakuum zur Trockne eingedampft, wobei ein fester Rückstand von 16,0 mg erhalten wird. 8 mg der Substanz werden abermals in 4,5 ml Wasser gelöst und zur Erhaltung eines gleichmäßigen Produktes gefriergetrocknet. Man erhält 7,2 mg des Natriumsalzes von 2'-Desoxy-5-fluoruridin-3',5'-diphosphat mit den folgenden spektrophotometrischen Daten: p$ = 1,0: Amax = 268 m,,, E2"/mg = 10,0; E280/E260 = @@g8. Es enthält 2,22 #tMol organisch gebundenen Phosphor je Milligramm. Dieses Nucleotid zeigt ebenfalls sehr ausgeprägte Aktivität in bezug auf die Wachstumshemmung von Lactobacillus leichmannii. Beispiel 4 Zu 0,5 ml trockenem Pyridin werden 10 mg 2'-Desoxy-5-fluoruridin unter völligem Ausschluß von atmosphärischer Feuchtigkeit zugesetzt. Man versetzt die klare Lösung unter Rühren mit 0,03 ml Phosphorsäuredichlorid (I). Es tritt eine- leichte Temperaturerhöhung ein, wobei man die Reaktionsmischung .durch Kühlung bei einer Temperatur von 25'C hält. Man läßt während 10 Minuten unter sorgfältigem Ausschluß atmosphärischer Feuchtigkeit reagieren, wobei eine geringe Menge Pyridinsalz als weißer gummiartiger Feststoff' ausfällt. Hierauf setzt man der Reaktionsmischung unter Kühlen 0,5 ml Wasser zu und erhält eine wasserklare Lösung. 0,01 ml dieser Reaktionslösung, welche 0,1 mg 2'-Desoxy-5-fluoruridin entspricht, wird durch Papierchromatographie (Whatman Nr. 1-Papier, System n-Butanol-Essigsäure-Wasser, Verhältnis 5:2:3) analysiert. Durch Vergleich mit einer authentischen Probe im selben Chromatographiesystem wird festgestellt, daß etwa 40 °/o der Gesamtmenge aus 2'-Desoxy-5-fluoruridin-5'-monophosphat bestehen. Es wird auch etwa 2'-Desoxy-5-fluoruridin-3',5'-diphosphat gebildet.The effluent is evaporated to about 10 ml in vacuo in order to remove most of the formic acid. 25 ml of ethanol are then added and the solution is evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 25 ml of ethanol and again evaporated to dryness. The solid residue is then dissolved in 40 ml and the pH is brought to 6.5 by adding dilute sodium hydroxide solution, the sodium salt of the nucleotides being formed. The solution is again evaporated to dryness in vacuo, a solid residue of 16.0 mg being obtained. 8 mg of the substance are again dissolved in 4.5 ml of water and freeze-dried to obtain a uniform product. 7.2 mg of the sodium salt of 2'-deoxy-5-fluorouridine-3 ', 5'-diphosphate are obtained with the following spectrophotometric data: p $ = 1.0: Amax = 268 m ,,, E2 "/ mg = 10.0; E280 / E260 = @@ g8. It contains 2.22 tmoles of organically bound phosphorus per milligram. This nucleotide also shows very pronounced activity in relation to the growth inhibition of Lactobacillus leichmannii. Example 4 To 0.5 ml of dry pyridine 10 mg of 2'-deoxy-5-fluorouridine are added with complete exclusion of atmospheric moisture. 0.03 ml of phosphoric acid dichloride (I) are added to the clear solution while stirring Cooling is maintained at a temperature of 25 ° C. The reaction mixture is allowed to react for 10 minutes with careful exclusion of atmospheric moisture, a small amount of pyridine salt precipitating as a white, gummy solid ne water-clear solution. 0.01 ml of this reaction solution, which corresponds to 0.1 mg of 2'-deoxy-5-fluorouridine, is analyzed by paper chromatography (Whatman No. 1 paper, n-butanol-acetic acid-water system, ratio 5: 2: 3) . By comparison with an authentic sample in the same chromatography system, it is found that about 40% of the total amount consists of 2'-deoxy-5-fluorouridine-5'-monophosphate. About 2'-deoxy-5-fluorouridine-3 ', 5'-diphosphate is also formed.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. A process for the preparation of ribotides and deoxyribotides of 5-Fluoruraeil and their salts with pharmaceutically acceptable bases, characterized in that 5-Fluorouracil-N-riboside or -N-deoxyriboside with the exclusion of water with phosphoric acid mono- or - dichloride or mixtures thereof in the presence of a tertiary organic base at room temperature or slightly elevated temperature and that the nucleotide obtained in each case after chromatographic separation, if desired, is converted into a salt with a pharmaceutically acceptable base.

2. The method according to claim 1, characterized in that that 5-fluorouridine or 2'-deoxy-5-fluorouridine with phosphoric acid mono- or dichloride implements. Considered publications: "Journal of the Chemical Society", 1940, pp. 746 to 752.