DE1130113B

DE1130113B - Process for separating therapeutically usable preparations containing at least 80% ª † -globulin from other blood proteins

Info

Publication number: DE1130113B
Application number: DEF28057A
Authority: DE
Inventors: Dr Hermann Friedrich; Dr Werner Scholtan
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1959-03-28
Filing date: 1959-03-28
Publication date: 1962-05-24

Description

Verfahren zur Abtrennung von therapeutisch verwendbaren, mindestens 80% y-Globulin enthaltenden Präparaten von anderen Blutproteinen Die Globuline teilte man früher auf Grund ihres verschiedenen Verhaltens bei der Aussalzung in Euglobuline und Pseudoglobuline ein. Heute unterscheidet man sie nach ihrer verschiedenen elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit als a-, B-und y-Globuline, wobei y-Globuline als die am langsamsten wandernden Globuline charakterisiert sind. Für die präparative Herstellung der y-Globuline ist die von Cohn und Mitarbeiter ausgearbeitete Methode wichtig. Ihre Grundlage ist die Fraktionierung von Blutserum oder Plasma mit Alkohol bei bestimmtem pH und bestimmtem Salzgehalt und bei niedrigen Temperaturen. Das Verfahren ist aber umständlich und kostspielig und hat deshalb verschiedene Modifikationen notwendig werden lassen.Process for the separation of therapeutically useful, at least 80% γ-globulin containing preparations of other blood proteins The globulins divided one earlier because of their different behavior in the salting out in euglobulins and pseudoglobulins. Today one differentiates them according to their different electrophoretic ones Migration speed as a-, B- and y-globulins, with y-globulins as the am slowest migrating globulins are characterized. For preparative production The method worked out by Cohn and co-workers is important for the y-globulins. Their basis is the fractionation of blood serum or plasma with alcohol certain pH and certain salinity and at low temperatures. The procedure but is cumbersome and expensive and therefore has various modifications make it necessary.

Auch andere Herstellungsmethoden sind bekannt, z. B. die Ausfällung mit Metallsalzen oder Säuren, die Behandlung mit Adsorptionsmitteln und Ionenaustauschern.Other manufacturing methods are also known, e.g. B. the precipitation with metal salts or acids, treatment with adsorbents and ion exchangers.

Die Vielzahl der bisher bekanntgewordenen Methoden ist schon ein Hinweis darauf, daß diese mit Mängeln behaftet sind und daß ein Bedarf nach einem einfachen und zuverlässigen Verfahren besteht.The multitude of methods that have become known so far is an indication that these are flawed and that there is a need for a simple one and reliable procedures exist.

Es wurde nun gefunden, daß man mindestens 80% aus y-Globulin bestehende Präparate aus Blut oder aus Blut hergestelltem Plasma, Serum oder einzelnen Fraktionen derselben in einfacher Weise gewinnen kann, wenn man diese Ausgangsmaterialien mit quaternären Ammoniumverbindungen, die am Ammoniumstickstoffatom einen aliphatischen Rest von mindestens 8 Kohlenstoffatomen tragen und die zur Gruppe der kationaktiven Kolloidelektrolyte gehören, behandelt, den dabei entstehenden Niederschlag, der vorwiegend Albumin, a- und ß-Globuline enthält, entfernt und gegebenenfalls das in Lösung gebliebene Protein, das weitgehend einheitliches ,y-Globulin ist, nach an sich bekannten Methoden gewinnt.It has now been found that at least 80% consist of γ-globulin Preparations made from blood or plasma, serum or individual fractions the same can be obtained in a simple manner if you use these starting materials quaternary ammonium compounds that have an aliphatic on the ammonium nitrogen atom Carry a remainder of at least 8 carbon atoms and belong to the group of the cation-active Colloidal electrolytes belong, treated, the resulting precipitate, the predominantly contains albumin, a- and ß-globulins, removed and possibly the protein remaining in solution, which is largely uniform, γ-globulin known methods wins.

Dieses Ergebnis ist überraschend, weil das Verhalten von Proteinen und Mucopolysacchariden gegenüber quaternären Ammoniumverbindungen schon öfter untersucht wurde, wobei sich wegen der zunehmenden Verwendung der letzteren als Desinfektionsmittel am lebenden Organismus die Frage nach dem Wirkungsorganismus dieser Verbindungen und nach ihrem Verhalten gegenüber den Einzelbestandteilen des Organismus ergab. Man fand dabei eine fällende Wirkung dieser Desinfektionsmittel gegenüber Proteinen und Mucopolysacchariden, ohne aber die erfindungsgemäße selektive Fraktionierungswirkung zu finden. Kuhn und B i e 1 i g, Ber., 73, S. 1080 (1940), untersuchten das Verhalten von Invertseifen, wie die quaternären Ammoniumverbindungen auch genannt werden, gegenüber Symplexen und Proteinen und geben an, daß sie mit Lauryldimethylbenzylammoniumbromid und Pseudoglobulin in stark oder schwach saurer Lösung keine, in alkalischer Lösung dagegen eine vollständige Ausfällung erhielten. P o 1 o n o v s k i und Macheboeuf, Ann. Inst. Past., 74, S.203 (1948), haben das Fällungsverhalten von Serum, Albumin und -y-Globulin gegenüber Zephirol speziell hinsichtlich der erforderlichen Mengen- und pH-Verhältnisse untersucht. Bei keinem der Autoren findet sich ein Hinweis darauf, daß das Filtrat der jeweiligen Fällungslösung Globuline mit einem Gehalt von mindestens 800% y-Globulin enthält, daß damit eine Herstellungsmethode für das y-Globulin gegeben ist. Einige Autoren glaubten, daß alle Serumeiweißkörper durch die Behandlung mit Invertseifen denaturiert werden. Tatsächlich werden aber nur die durch die Invertseifen ausgefällten Serumeiweißkörper denaturiert. So berichtet Schmidt, Ztschr. physiol. Chem., 277, S.117 (1943), »daß durch Invertseifen gefälltes Eiweiß in höchstem Maße denaturiert und daher für viele anschließende Versuche wertlos sei«. Zu einem analogen Ergebnis kommen Jerchel und Scheurer, Ztschr. Naturf., 86, S. 541 (1953). Sie fanden auf Grund von Elektrophorese-Dialyse- und Löslichkeitsversuchen, »daß bei der Einwirkung von Invertseife auf Albumin tiefgreifende Veränderungen im Eiweißgefüge auftreten, welche nach Entfernung der Invertseife zu denaturiertem Albumin führen«. Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß durch Zugabe der obengenannten quaternären Ammoniumverbindungen zum Serum nur die ausgefällten Eiweißkörper, nicht aber die in der Lösung verbleibenden Serumeiweißkörper denaturiert werden. Das in Lösung verbleibende Eiweiß verhält sich nach der Dialyse elektrophoretisch und in der Ultrazentrifuge wie natives -y-Globulin, Denaturierungserscheinungen sind nicht nachweisbar, so daß also im Gegensatz zu der Ansicht der erwähnten Autoren durchaus die Voraussetzungen für die Gewinnung intakter y-Globulinpräparate aus den Fällungsfiltraten gegeben sind.This result is surprising because of the behavior of proteins and mucopolysaccharides compared to quaternary ammonium compounds have been investigated several times has been, being due to the increasing use of the latter as disinfectants in the living organism the question of the organism of action of these compounds and according to their behavior towards the individual components of the organism. It was found that these disinfectants had a precipitating effect on proteins and mucopolysaccharides, but without the selective fractionation effect according to the invention to find. Kuhn and B i e 1 i g, Ber., 73, p. 1080 (1940), examined the behavior of invert soaps, as the quaternary ammonium compounds are also called, towards symplexes and proteins and state that they are with lauryldimethylbenzylammonium bromide and pseudoglobulin in strongly or weakly acidic solution none, in alkaline solution on the other hand received complete precipitation. P o 1 o n o v s k i and Macheboeuf, Ann. Inst. Past., 74, p.203 (1948), have the precipitation behavior of serum, albumin and -y-globulin compared to Zephirol especially with regard to the required quantities and pH conditions investigated. There is no indication of any of the authors that the filtrate of the respective precipitation solution globulins with a content of at least 800% γ-globulin contains that thus a production method for the γ-globulin is given is. Some authors believed that all serum proteins from treatment with Invert soaps are denatured. Actual only those made by the invert soaps precipitated serum protein denatured. So reports Schmidt, Ztschr. Physiol. Chem., 277, p.117 (1943), “that protein precipitated by invert soaps is extremely high denatured and therefore worthless for many subsequent attempts «. To an analog The result comes from Jerchel and Scheurer, Ztschr. Naturf., 86, p. 541 (1953). they found on the basis of electrophoresis, dialysis and solubility tests, »that on exposure from invert soap to albumin profound changes in the protein structure occur, which after removal of the invert soap lead to denatured albumin «. Surprisingly it has now been found that by adding the abovementioned quaternary ammonium compounds to the serum only the precipitated protein bodies, but not those remaining in the solution Serum proteins are denatured. The protein remaining in the solution behaves electrophoretically and in the ultracentrifuge after dialysis like native -y-globulin, Denaturation phenomena are not detectable, so that in contrast to in the opinion of the authors mentioned, the prerequisites for the extraction intact γ-globulin preparations from the precipitation filtrates are given.

Aus Schmidt, »Fortschritte der Serologie«, 1955, S. 1029, ist zwar bereits ein Verfahren zur Gewinnung von y-Globulin bekannt, dieses Verfahren ist jedoch recht umständlich, wie aus folgendem hervorgeht: Zunächst werden mit Hilfe von Ammoniumsulfat a-, ß- und y-Globuline ausgefällt. Aus der Lösung der Globuline wird dann bei einer Ionenstärke von 0,07 und bei pH von 5,3 das ß-Globulin ausgefällt. Anschließend müssen bei einer geringen Ionenstärke und bei pH 5,0 die a-Globuline ausgefällt werden. Die dann verbleibende Lösung muß zur Entfernung restlicher a- und ß-Globuline anschließend mit Aluminiumhydroxyd behandelt werden, wobei man ein Filtrat erhält, in welchem die y-Globuline vorhanden sind. Gegenüber diesen umständlichen Manipulationen werden im erfindungsgemäßen Verfahren in einem Arbeitsgang die unerwünschten Proteinen ausgefällt, und man erhält sofort ein Filtrat, welches lediglich -y-Globulin enthält.From Schmidt, "Advances in Serology", 1955, p. 1029, a process for obtaining γ-globulin is already known, but this process is quite cumbersome, as can be seen from the following: First, with the help of ammonium sulfate, α, β - and y-globulins precipitated. The ß-globulin is then precipitated from the solution of the globulins at an ionic strength of 0.07 and a pH of 5.3. Then the α-globulins have to be precipitated at a low ionic strength and at pH 5.0. The solution then remaining then has to be treated with aluminum hydroxide to remove residual α- and β-globulins, a filtrate in which the γ-globulins are present is obtained. In contrast to these cumbersome manipulations, the undesired proteins are precipitated in one operation in the process according to the invention, and a filtrate is obtained immediately which only contains -y-globulin.

Die praktische Durchführung des Verfahrens erfolgt so, daß man das Ausgangsmaterial, z. B. frisches Rinderserum, bei Zimmertemperatur mit einer wäßrigen Lösung der Invertseife so lange versetzt, wie noch ein Niederschlag entsteht. Diesen entfernt man durch Filtration oder Zentrifugieren; das Filtrat enthält das y-Globulin in weitgehend einheitlicher Form. Man kann die erhaltene Lösung gegebenenfalls nach einer schonenden Eindampfung direkt verwenden, man kann sie aber auch durch Lyophilisierung oder Sprühtrocknung in ein Trockenpulver überführen. Das y-globulinhaltige Filtrat kann man nach den bei der Herstellung von Reinproteinen üblichen Methoden noch weiterfraktionieren, z. B. durch Behandlung mit Alkohol nach C o h n , durch Aussalzung, chromatographische Reinigung u. a. m.The practical implementation of the process is carried out in such a way that one can Starting material, e.g. B. fresh bovine serum, at room temperature with an aqueous Solution of the invert soap added as long as a precipitate still forms. This one removed by filtration or centrifugation; the filtrate contains the γ-globulin in a largely uniform form. You can optionally after the solution obtained a gentle evaporation, but it can also be used by lyophilization or spray drying to convert it into a dry powder. The y-globulin-containing filtrate can be further fractionated using the methods customary in the production of pure proteins, z. B. by treatment with alcohol according to C o h n, by salting out, chromatographic Cleaning, etc. m.

Als 7#-globulinhaltige Ausgangsmaterialien eignen sich Blut von Menschen und Tieren und alle daraus herstellbaren y-globulinhaltigen Zubereitungen, wie Serum, Plasma oder einzelne Fraktionen derselben.Human blood is suitable as starting materials containing 7 # -globulin and animals and all preparations containing y-globulin that can be prepared from them, such as serum, Plasma or individual fractions thereof.

Als quaternäre Ammoniumverbindungen finden die zu der Gruppe der kationaktiven Kolloid-Elektrolyte oder Invertseifen gehörigen oberflächenaktiven Präparate, die am Ammoniumstickstoffatom einen aliphatischen Rest von mindestens 8 Kohlenstoffatomen tragen, Verwendung, z. B. das am Anmeldetag unter dem geschützten Namen »Zephirol« oder »Riseptin®« bekannte Präparat. Vorzugsweise werden 1%ige wäßrige Lösungen verwendet, jedoch sind auch andere Konzentrationen oder Lösungsformen brauchbar. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen y-Globuline sollen therapeutische Verwendung finden, vor allem in der Veterinärmedizin. Sie eignen sich zur Unterstützung der Therapie mit Antibiotiea.The quaternary ammonium compounds belong to the group of the cation-active Colloid electrolytes or invert soaps are part of the surface-active preparations that an aliphatic radical of at least 8 carbon atoms on the ammonium nitrogen atom wear, use, e.g. B. on the filing date under the protected name »Zephirol« or »Riseptin®« well-known preparation. 1% aqueous solutions are preferably used, however, other concentrations or forms of solution are also useful. The after γ-globulins obtained by the method according to the invention are intended for therapeutic use find, especially in veterinary medicine. They are useful in supporting the Therapy with antibiotics a.

Für die therapeutische Anwendung ist es erforderlich, daß die nach dem vorliegenden Verfahren hergestellten Zubereitungen des y-Globulins keine Beimengungen von Invertseife enthalten. Dies ist im allgemeinen auch nicht der Fall, da man nicht mehr Invertseife zugibt, als zur Ausfällung der Begleitproteine erforderlich ist, und da das Fällungsmittel an den Eiweißniederschlag gebunden wird. Gegebenenfalls kann man aber überschüssige Invertseife durch Dialyse entfernen, wobei die erstere in die Außenflüssigkeit abwandert, oder durch Aussahen oder Ausfällung mit Alkohol, wobei sich die Invertseife im Filtrat befindet, oder mit Ionenaustauschern. Beispiel 1 Zu 150 ccm Rinderserum gibt man insgesamt 540 ccm wäßrige 0,4%ige Cetylpyridiniumchloridlösung und zentrifugiert nach 2stündigem Rühren bei Zimmertemperatur vom entstandenen Niederschlag ab. Die klare überstehende Lösung wird gefriergetrocknet. Man erhält 9,8 g Trockenprodukt, die in 500 ccm dest. Wasser aufgenommen und 44 Stunden bei Zimmertemperatur gegen öfter erneuertes dest. Wasser im Cellophanschlauch dialysiert werden. Durch Gefriertrocknung der Innenflüssigkeit erhält man ein Trockenpulver, dessen Eiweißgehalt 59,7% beträgt. Es ist frei von Albumin und a-Globulin und enthält 17,6% ß-Globulin und 82,4% y-Globulin. Beispiel 2 Das durch Ausfällen von 100 ccm Rinderserum mit 300 ccm einer l%igen wäßrigen »Riseptin@«-Lösung erhaltene Filtrat wird 24 Stunden gegen fließendes und 24 Stunden gegen stehendes dest. Wasser dialysiert und dann lyophilisiert. Das erhaltene Endprodukt enthält 920% Eiweiß, 2% davon sind ß-Globulin, 98% y-Globulin.For therapeutic use it is necessary that the preparations of γ-globulin produced by the present process do not contain any additions of invert soap. This is generally not the case either, since no more invert soap is added than is necessary to precipitate the accompanying proteins, and since the precipitating agent is bound to the protein precipitate. If necessary, however, excess invert soap can be removed by dialysis, with the former migrating into the external liquid, or by soaking or precipitation with alcohol, the invert soap being in the filtrate, or with ion exchangers. EXAMPLE 1 A total of 540 cc of aqueous 0.4% cetylpyridinium chloride solution is added to 150 cc of bovine serum and, after stirring for 2 hours at room temperature, the precipitate formed is centrifuged off. The clear supernatant solution is freeze-dried. 9.8 g of dry product are obtained, which are distilled in 500 ccm. Water taken up and 44 hours at room temperature against frequently renewed distilled water. Water in the cellophane tube can be dialyzed. Freeze-drying the inner liquid gives a dry powder with a protein content of 59.7% . It is free from albumin and α-globulin and contains 17.6% ß-globulin and 82.4% γ-globulin. EXAMPLE 2 The filtrate obtained by precipitating 100 cc of bovine serum with 300 cc of a 1% aqueous "Riseptin®" solution is treated with distilled distilled water for 24 hours and standing for 24 hours. Dialyzed water and then lyophilized. The end product obtained contains 920% protein, 2% of which is ß-globulin, 98% γ-globulin.

Claims

PATENT CLAIM: Process for the separation of therapeutically usable, Preparations of other blood proteins containing at least 80% γ-globulin, thereby characterized in that one is blood or plasma obtained from blood, serum or individual Fractions of the same with quaternary ammonium compounds attached to the ammonium nitrogen atom carry an aliphatic radical of at least 8 carbon atoms and belong to the group of the cation-active colloidal electrolytes, treated, the resulting Precipitation removed and optionally the protein that remained in solution after an known methods wins. Considered publications H. Schmidt, "Advances in Serology", 1955, p. 1029.