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Verfahren zur Gewinnung von Gammaglobulin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Gammaglobulin, insbesondere in der Form klinisch verwendbarer Präparate, wobei man von humanem Serum ausgeht und aus diesem Gamma- globulin entweder in lyophilisierter Form oder als gebrauchsfertige Injektionslösung herstellt.
Verfahren zur technischen Plasmafraktionierung sind bekannt. Neben der Trennung mit Hilfe ver- schieden konzentrierter wässerig-alkoholischer Lösungen kann man auch so vorgehen, dass das Serum einer Ammonsulfatfraktionierung unterworfen wird, wobei jedoch ein reines Präparat, bei dem mit Hil- fe der Elektrophorese keine Verunreinigungen durch Alpha- oder Betaglobuline nachgewiesen werden können, erst nach verhältnismässig kompliziertem Arbeitsaufwand und grossen Ausbeuteverlusten erhal- ten werden kann. Oft gelingt die Abtrennung der beiden oben genannten Globuline vom Gammaglobulin nicht immer quantitativ.
Es ist bekannt, das gewonnene Gammaglobulin in einer 2, 25 igen Aminoessigsäurelösung klinisch zu verwenden, wobei diese Lösung noch einen geringen Zusatz eines Bakteriostatikums, wie Natrium- äthylquecksilberthiosalicylat, enthält.
Das erfindungsgemässe Verfahren beruht auf der Erkenntnis, dass sich Aminoessigsäure nicht nur als
Stabilisator für das Gammaglobulin eignet, sondern dass seine wässerigen Lösungen auch eine Trennwirkung auf die Plasmafraktionen ausüben, die in solchen Lösungen derart unterschiedliche Löslichkeiten zeigen, dass sich der Trenneffekt technisch ausnutzen lässt, wobei die Trennung schärfer gelingt, als dies mit dem vorbekannten Verfahren der Fall war.
Demnach besteht das Verfahren zur Gewinnung von Gammaglobulin, bei welchem die durch Fällung mit einer elektrolytisch stark dissoziierten Substanz, vorzugsweise mit Ammonsulfat, aus mit Was- ser verdünntem nativem humanem Serum gewonnenen Rohglobuline weiter gereinigt werden, im wesentlichen darin, dass das Gammaglobulin aus der nach Abtrennung des Ammonsulfats aus den Rohglobulinen gebildeten Flüssigkeit durch einen erneuten Ammonsulfatzusatz gefällt, der Niederschlag mit wässeriger Aminoessigsäure aufgenommen und gegen diese dialysiert wird, wobei alle andern Globuline ausfallen und nur reines Gammaglobulin in Lösung bleibt, worauf dieses nach Entfernung der Aminoessigsäure auf feste oder flüssige Handelspräparate aufgearbeitet wird.
Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass es die Verwendung eines leicht flüchtigen Lösungsmittels wie Alkohol vermeidet, in kleinen Volumsmengen arbeitet und Gammaglobulin von 99 zuiger Reinheit in guten Ausbeuten liefert.
Es hat sich ferner herausgestellt, dass das humane Serum bei seiner Aufarbeitung mit Hilfe des er- findungsgernÅassen Verfahrens aus einem sogenannten Pool stammen kann, worunter ein steriler Plasmavorrat verstanden wird, in welchem das Plasma von vielen Spendern nach dem Abzentrifugieren der Formbestandteile des Blutes, der Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten, vereinigt ist. Wiewohl dieses Ausgangsmaterial ein besonders wirtschaftliches Arbeiten gestattet und deshalb bevorzugt ist, ist
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es auch möglich, das Plasma von Einzelspendern mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens aufzuarbeiten.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird aus dem Plasma zunächst in an sich bekannter Weise das Fibrinogen abgeschieden. Aus dem dabei gewonnenen Serum wird eine Fraktion abgetrennt, die im wesentlichen aus Gammaglobulin besteht, während der Rest auf PPL-Lösung aufgearbeitet wird. Zur Durchführung dieser Trennung kann das Serum in an sich bekannter Weise bei einem pH-Wert von 6, 3 mit Ammonsulfat versetzt werden, bis sein Stickstoffgehalt um 4Q % abgenommen hat.
Der dabei gebildete Niederschlag enthält die Globuline des Serums. Die Rohglobuline können aber auch auf jede andere bekannte Art gewonnen sein.
Aus dem erwähnten Niederschlag wird nun zunächst auf irgendeine bekannte Weise das Ammonsulfat entfernt. Dabei kann mit Vorteil so gearbeitet werden, dass die Rohglobuline in einer NaCl-Lösung dialysiert werden. Dabei ist es möglich, das NaCl in allen jenen Konzentrationen anzuwenden, bei denen einerseits der Elektrolytgehalt der Lösung noch so gross ist, dass kein Gammaglobulin ausfällt und anderseits so hohe Salzkonzentrationen vermieden werden, bei denen der Aussalzeffekt bereits wirksam werden kann. Es wurde gefunden, dass sich besonders günstige Verhältnisse für die Austauschzeit und für das anzuwendende Flüssigkeitsvolumen ergeben, wenn die NaCl-Lösung etwa 3 Gew.-% enthält.
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ein Grossteil der andern Proteine in Lösung bleibt.
Es hat sich gezeigt, dass dabei die Fällung am besten gelingt, wenn der erwähnten NaCl-haltigen Flüssigkeit so viel Ammonsulfat, vorteilhaft in wässeriger Lösung, zugesetzt wird, dass seine Endkonzentration etwa 33 % von der Sättigungskonzentration beträgt und in der Lösung ein pH-Wert von 7, zweckmässig durch Zusatz von Ammoniak, eingestellt wird.
Sollte die Gammaglobulinlösung, von der bei diesem Verfahrensschritt ausgegangen wird, aus einer andern Quelle stammen, so können andere Ammonsulfatkonzentrationen und gegebenenfalls auch andere pH-Werte zweckmässiger sein. Der Fachmann ist aber in jedem Falle imstande, durch einfache Handversuche die jeweils günstigste Konzentration zu ermitteln und anzuwenden.
Der erhaltene ammonsulfathaltige Niederschlag kann nun auf irgendeine bekannte Weise, z. B. durch Zentrifugieren von der Lösung, welche die Verunreinigungen enthält und aus dem Verfahren ausgeschieden wird, getrennt werden.
Erfindungsgemäss wird der Niederschlag mit wässeriger Aminoessigsäure aufgenommen und gegen diese bis zur Ammonsulfatfreiheit dialysiert, wobei nur reines Gammaglobulin in Lösung bleibt. An Stelle der Dialyse kann auch irgendein äquivalentes Verfahren zur Abtrennung des Ammonsulfats angewendet werden.
Die Aminoessigsäure, die dabei als Trennmittel zur Anwendung kommt, ist auch unter andern Bezeichnungen wie Glycin, Glykokoll, Aminoäthansäure, Leimzucker oder Leimsüss bekannt. Sie schmilzt bei 232 bis 2360C und löst sich in 4, 3 Teilen kalten Wassers zu einer farblosen Lösung.
Die Konzentration, in welcher die Aminoessigsäure beim erfindungsgemässen Verfahren angewendet wird, hängt von verschiedenen Faktoren ab, u. zw. vor allem von der Konzentration des Ammonsulfates bzw. allgemein von der Salzkonzentration des zu verarbeitenden Niederschlages. Sie hängt ferner auch von der Proteinkonzentration der Lösung ab, die bei der Trennung hergestellt werden soll. Sie kann deshalb in weiten Grenzen schwanken und zwischen 0,2 und 15 Gew. -010 oder mehr liegen. Es empfiehlt sich nicht, den Niederschlag in einer Lösung aufzuschlämmen, deren Aminoessigsäuregehalt weniger als OSGew.-beträgt, weil dann die Trennung unscharf wird.
Durch die Anwendung von Aminoessigsäurekonzentrationen von mehr als 15 Gew.-% in der Lösung wird die Trennung gleichfalls unscharf.
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Konzentrationsbereich entsteht beim Aufschlämmen des Niederschlages eine trübe Lösung, die sich beim Dialysieren gegen Glycinlösung bis zur Ammonsulfatfreiheit vollständig klärt, wobei nur noch reines Gammaglobulin in Lösung gegangen ist, während sich alle andern Proteine als fester Bodenkörper abgesetzt haben.
Die Trennung erfolgt am besten bei Temperaturen unterhalb 300C, vorzugsweise bei 2 bis 10 C, wobei die Dialyse gegen eine Aminoessigsäurelösung von vorzugsweise der gleichen Konzentration durchgeführt wird, wie sie in dem zu dialysierenden Niederschlag eingestellt wurde.
Nach Entfernung des Ammonsulfats liegt eine reine Gammaglobulinlösung vor, die neben dem Pro-
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tein lediglich noch Aminoessigsäure enthält und an sich bereits klinisch verwendbar wäre. Wenn diese
Lösung nach ihrer Trennung von dem Niederschlag noch weiterverarbeitet wird, so liegt der Grund einzig darin, dass ihre Proteinkonzentration mit derjenigen nicht übereinstimmt, die für klinische Präparate dieser Art üblich ist.
Die Weiterverarbeitung, die in einer Anreicherung des Gammaglobulins besteht, kann auf jede an sich bekannte Weise vorgenommen werden.
Ein vorteilhafter Weg besteht darin, das Gammaglobulin aus der genannten Lösung durch Zusatz von
Ammonsulfat quantitativ auszufällen, über Nacht stehen zu lassen und den durch Zentrifugieren erhal- tenen Niederschlag gegen 0, 2 %ige NaCl-Lösung bis zur Ammonsulfatfreiheit bei einer Temperatur zwi- schen 2 bis 100 zu dialysieren. Nach Filtration wird die Lösung der Gefriertrocknung unterworfen. Das erhaltene Trockenpräparat ist unbegrenzt lagerfähig und kann jederzeit zu einer Lösung verarbeitet wer- den, die einen bestimmten Prozentsatz an Antikörpern enthält.
Beispiel : 50 1 natives humanes Serum werden mit 10 l sterilem, pyrogenfreie, bidestilliertem
Wasser verdünnt. Hierauf wird mit Ammonsulfat bei einem pH-Wert von 6,3 so viel von dem im Serum vorhandenen Protein gefällt, dass der Stickstoffgehalt um 40 % gesenkt wird, und zentrifugiert.
Der Niederschlag wird mit wenig 30/0iger NaCl-Lösung vermischt und zunächst in reinem Wasser und hernach in 3 % iger NaCl-Lösung dialysiert, bis er kein Ammonsulfat mehr enthält.
Nach Abtrennung etwa vorhandener fester Bestandteile durch Zentrifugieren wird zu der Flüssig- keit, deren pH-Wert auf 7 gestellt wurde, unter Rühren so viel gesättigte Ammonsulfatlösung (pH-
Wert = 7,0) zugefügt, bis die Ammonsulfatkonzentration 33 % der Sättigungskonzentration erreicht hat.
Hierauf wird die Lösung durch Zugabe von Ammoniak auf einen PH- Wert von 7 eingestellt, falls dies erforderlich ist. Die dabei eingehaltene Temperatur ist nicht kritisch. Sie soll aber im allgemeinen 300C nicht übersteigen. Eine Temperatur zwischen 12 und 200C ist bevorzugt. Der Mischvorgang er- folgt innerhalb einer Zeitspanne von einer bis zu einigen Stunden, wiewohl auch längere Mischzeiten nicht schaden.
Sobald die Ammonsulfatlösung zugesetzt ist, wird die Lösung einige Stunden ruhig stehen gelassen.
Der Zeitraum kann zwischen 2 h und 8 Tagen liegen. Eine Dauer von 24 bis 48 h ist bevorzugt, wobei die Temperatur im allgemeinen 300C nicht übersteigt und vorzugsweise nicht höher als 200C liegt. Dabei bildet sich ein Niederschlag, der auf der Zentrifuge von der Lösung getrennt wird.
Der Niederschlag wird mit einer überschüssigen Menge Aminoessigsäure behandelt und zu diesem Zweck mit etwa 121 einer wässerigen Lösung dieser Säure bei Raumtemperatur vermischt, die 2,25 Gew.-% derselben enthält.
Das erhaltene Gemisch wird gegen eine 2, 25 loge wässerige Aminoessigsäurelösung dialysiert, bis das Ammonsulfat entfernt ist und zentrifugiert.
Die erhaltene Lösung enthält etwa 1 bis 2 % reinstes Gammaglobulin. Es wird darin so viel festes Ammonsulfat aufgelöst, bis das Gammaglobulin vollständig ausgefällt ist. Hierauf wird der pH- Wert der Lösung mit Ammoniak auf 7,2 gebracht und die Lösung etwa 24 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Nach Abtrennung des Niederschlages auf der Zentrifuge wird dieser bei einer Temperatur von 2 bis 100C gegen 0,2 tige NaCl-Lösung dialysiert, bis er vom Ammonsulfat befreit ist. Ein etwa gebildeter Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und die Lösung der Gefriertrocknung unterworfen.
Weil der nach der Dialyse mit Aminoessigsäure abgetrennte Niederschlag meist noch Gammaglobulin okkludiert enthält, wird derselbe mit 4 l 2, 25 %iger Aminoessigsäurelösung aufgeschlämmt, einige Zeit stehen gelassen und abermals zentrifugiert. Die anfallende Lösung wird mit der Hauptmenge vereinigt oder für sich mit Ammonsulfat in der oben für die Hauptmenge angegebenen Weise bei einem pH-Wert von 7,2 gefällt und mit 0,2 gew.-iger NaCl-Lösung dialysiert.
Der erwähnte Niederschlag kann auf diese Weise mehrfach ausgewaschen werden.
Von dem im Serum vorhandenen Protein werden auf diese Weise wenigstens 9, 5 bis 10 % als Gammaglobulin von über 99 figer Reinheit (elektrophoretisch) gewonnen.
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Process for obtaining gamma globulin
The invention relates to a method for obtaining gamma globulin, in particular in the form of clinically usable preparations, starting from human serum and producing gamma globulin from this either in lyophilized form or as a ready-to-use injection solution.
Processes for technical plasma fractionation are known. In addition to the separation with the help of various concentrated aqueous-alcoholic solutions, one can also proceed in such a way that the serum is subjected to an ammonium sulfate fractionation, but a pure preparation in which no contamination by alpha or beta globulins can be detected with the help of electrophoresis can only be obtained after a relatively complex workload and large losses in yield. The separation of the two globulins mentioned above from the gamma globulin is often not always quantitative.
It is known that the gamma globulin obtained can be used clinically in a 2.55 strength aminoacetic acid solution, this solution also containing a small amount of a bacteriostat such as sodium ethylmercury thiosalicylate.
The inventive method is based on the knowledge that aminoacetic acid is not only
Stabilizer for the gamma globulin, but that its aqueous solutions also exert a separating effect on the plasma fractions, which show such different solubilities in such solutions that the separating effect can be technically exploited, whereby the separation succeeds more sharply than is the case with the previously known method was.
Accordingly, the method for obtaining gamma globulin, in which the crude globulins obtained by precipitation with an electrolytically strongly dissociated substance, preferably with ammonium sulfate, are further purified from native human serum diluted with water, essentially consists in removing the gamma globulin from the after Separation of the ammonium sulfate formed from the crude globulins by another addition of ammonium sulfate, the precipitate is absorbed with aqueous aminoacetic acid and dialyzed against it, whereby all other globulins precipitate and only pure gamma globulin remains in solution, whereupon this after removal of the aminoacetic acid on solid or liquid commercial preparations is worked up.
This process has the advantage that it avoids the use of a volatile solvent such as alcohol, works in small volumes and provides gamma globulin of 99 too pure in good yields.
It has also been found that the human serum can come from a so-called pool during its processing with the aid of the method according to the invention, which is understood to mean a sterile plasma supply in which the plasma from many donors after centrifuging off the mold components of the blood Erythrocytes, leukocytes and platelets, is combined. Although this starting material permits particularly economical working and is therefore preferred
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It is also possible to work up the plasma from individual donors with the aid of the method according to the invention.
When carrying out the method according to the invention, the fibrinogen is first deposited from the plasma in a manner known per se. A fraction is separated from the serum obtained, which consists essentially of gamma globulin, while the rest is processed into PPL solution. To carry out this separation, ammonium sulfate can be added to the serum in a manner known per se at a pH of 6.3 until its nitrogen content has decreased by 40%.
The precipitate formed contains the globulins of the serum. However, the raw globulins can also be obtained in any other known manner.
The ammonium sulfate is now first removed from the precipitate mentioned in a known manner. It is advantageous to work in such a way that the raw globulins are dialyzed in an NaCl solution. It is possible to use the NaCl in all those concentrations at which, on the one hand, the electrolyte content of the solution is still so high that no gamma globulin precipitates and, on the other hand, such high salt concentrations are avoided at which the salting out effect can already be effective. It has been found that particularly favorable ratios for the exchange time and for the liquid volume to be used result when the NaCl solution contains about 3% by weight.
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a large part of the other proteins remain in solution.
It has been shown that the precipitation works best if the NaCl-containing liquid mentioned is added so much ammonium sulfate, advantageously in an aqueous solution, that its final concentration is about 33% of the saturation concentration and the solution has a pH value of 7, conveniently by adding ammonia, is adjusted.
If the gamma globulin solution, which is assumed in this process step, comes from a different source, other ammonium sulfate concentrations and possibly also other pH values may be more expedient. The person skilled in the art is in any case able to determine and apply the most favorable concentration in each case by means of simple manual experiments.
The resulting ammonium sulfate-containing precipitate can now in any known manner, e.g. B. by centrifugation from the solution containing the impurities and eliminated from the process, separated.
According to the invention, the precipitate is taken up with aqueous aminoacetic acid and dialyzed against it until it is free of ammonium sulfate, with only pure gamma globulin remaining in solution. Instead of dialysis, any equivalent process for separating off the ammonium sulfate can also be used.
The aminoacetic acid, which is used as a separating agent, is also known under other names such as glycine, glycocolla, aminoethanoic acid, glue sugar or glue sweet. It melts at 232 to 2360C and dissolves in 4.3 parts of cold water to form a colorless solution.
The concentration in which the aminoacetic acid is used in the process according to the invention depends on various factors, including: between the concentration of ammonium sulphate and the salt concentration of the precipitate to be processed in general. It also depends on the protein concentration of the solution which is to be produced in the separation. It can therefore vary within wide limits and be between 0.2 and 15% by weight or more. It is not advisable to suspend the precipitate in a solution whose aminoacetic acid content is less than OS by weight, because then the separation becomes blurred.
The use of aminoacetic acid concentrations of more than 15% by weight in the solution also makes the separation fuzzy.
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Concentration range, when the precipitate is slurried, a cloudy solution is created which, when dialyzed against glycine solution, clears completely until it is free of ammonium sulfate, whereby only pure gamma globulin has gone into solution, while all other proteins have settled as solid bodies.
The separation is best carried out at temperatures below 30 ° C., preferably at 2 to 10 ° C., the dialysis being carried out against an aminoacetic acid solution of preferably the same concentration as was set in the precipitate to be dialyzed.
After removal of the ammonium sulfate, a pure gamma globulin solution is present, which in addition to the product
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tein only contains aminoacetic acid and would be clinically usable in and of itself. If those
Solution is further processed after it has been separated from the precipitate, the sole reason for this is that its protein concentration does not match that which is customary for clinical preparations of this type.
The further processing, which consists in an enrichment of the gamma globulin, can be carried out in any known manner.
An advantageous way is to remove the gamma globulin from the solution mentioned by adding
Quantitatively precipitate ammonium sulfate, leave to stand overnight and dialyze the precipitate obtained by centrifugation against 0.2% NaCl solution until ammonium sulfate is free at a temperature between 2 and 100%. After filtration, the solution is subjected to freeze-drying. The dry preparation obtained can be stored indefinitely and can be processed into a solution at any time that contains a certain percentage of antibodies.
Example: 50 liters of native human serum are mixed with 10 liters of sterile, pyrogen-free, double-distilled
Water diluted. So much of the protein present in the serum is then precipitated with ammonium sulphate at a pH value of 6.3 that the nitrogen content is reduced by 40%, and centrifugation.
The precipitate is mixed with a little 30/0 NaCl solution and dialyzed first in pure water and then in 3% NaCl solution until it no longer contains any ammonium sulfate.
After any solid constituents have been separated off by centrifugation, the liquid, the pH of which has been set to 7, is mixed with as much saturated ammonium sulphate solution (pH
Value = 7.0) added until the ammonium sulfate concentration has reached 33% of the saturation concentration.
The solution is then adjusted to a pH value of 7 by adding ammonia, if necessary. The temperature maintained is not critical. In general, however, it should not exceed 300C. A temperature between 12 and 200 ° C. is preferred. The mixing process takes place within a period of one to a few hours, although longer mixing times do not hurt either.
As soon as the ammonium sulfate solution is added, the solution is left to stand for a few hours.
The period can be between 2 hours and 8 days. A duration of 24 to 48 hours is preferred, the temperature generally not exceeding 30 ° C. and preferably not higher than 200 ° C. A precipitate forms, which is separated from the solution on the centrifuge.
The precipitate is treated with an excess amount of aminoacetic acid and, for this purpose, mixed with about 121% of an aqueous solution of this acid at room temperature which contains 2.25% by weight thereof.
The resulting mixture is dialyzed against a 2.25 log aqueous aminoacetic acid solution until the ammonium sulfate is removed and centrifuged.
The solution obtained contains about 1 to 2% of the purest gamma globulin. So much solid ammonium sulfate is dissolved in it until the gamma globulin has completely precipitated. The pH of the solution is then brought to 7.2 with ammonia and the solution is left to stand at room temperature for about 24 hours.
After the precipitate has been separated off on the centrifuge, it is dialyzed against 0.2-term NaCl solution at a temperature of 2 to 100 ° C. until it has been freed from ammonium sulfate. Any precipitate that has formed is removed by centrifugation and the solution is subjected to freeze-drying.
Because the precipitate separated off after dialysis with aminoacetic acid usually still contains gamma globulin occluded, it is slurried with 4 l of 2.5% strength aminoacetic acid solution, left to stand for a while and centrifuged again. The resulting solution is combined with the main amount or precipitated individually with ammonium sulfate in the manner indicated above for the main amount at a pH of 7.2 and dialyzed with 0.2% strength by weight NaCl solution.
The mentioned precipitate can be washed out several times in this way.
In this way, at least 9.5 to 10% of the protein present in the serum is obtained as gamma globulin of over 99% purity (electrophoretically).
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