DE1128596B - Process for obtaining insulin free from proteolytic enzymes - Google Patents

Process for obtaining insulin free from proteolytic enzymes

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DE1128596B
DE1128596B DEI15100A DEI0015100A DE1128596B DE 1128596 B DE1128596 B DE 1128596B DE I15100 A DEI15100 A DE I15100A DE I0015100 A DEI0015100 A DE I0015100A DE 1128596 B DE1128596 B DE 1128596B
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Johan Erik Jorpes
Johan Gunnar Boris Linden
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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Description

DEUTSCHESGERMAN

PATENTAMTPATENT OFFICE

115100 IVa/30h115100 IVa / 30h

ANMELDETAG: 11. JULI 1958REGISTRATION DATE: JULY 11, 1958

BEKANNTMACHUNG DER ANMELDUNG UNDAUSGABEDER AUSLEGESCHRIFT: 26. A P R I L 1962NOTICE THE REGISTRATION ANDOUTPUTE EDITORIAL: 26. A P R I L 1962

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Insulin, das frei von proteolytischen Enzymen ist.The invention relates to a method for obtaining insulin which is free from proteolytic enzymes.

Es ist bekannt, Insulin dadurch zu gewinnen, daß man Pankreasdrüsen mit angesäuertem Alkohol extrahiert, den alkoholischen Extrakt bei niedriger Temperatur unter vermindertem Druck einengt und nach Entfernung der Fettstoffe das Insulin aus dem wäßrigen Rückstand durch Neutralsalze fällt oder das Insulin aus dem alkoholischen Extrakt an einem Ionenaustauscher adsorbiert und aus dem Eluat isoliert.It is known that insulin can be obtained by extracting pancreatic glands with acidified alcohol, the alcoholic extract is concentrated at low temperature under reduced pressure and after Removal of the fatty substances, the insulin falls from the aqueous residue by neutral salts or the insulin from the alcoholic extract adsorbed on an ion exchanger and isolated from the eluate.

Der alkoholische Pankreasextrakt enthält aber stets proteolytische Enzyme, die das Insulin zerstören und damit die Insulinwirkung des nach bekannten Verfahren gewonnenen Präparats reduzieren.The alcoholic pancreatic extract always contains proteolytic enzymes that destroy the insulin and thus reducing the insulin effect of the preparation obtained by known methods.

Man hat zwar schon Pankreasdrüsen mit alkoholischer Salzsäure bei 95 0C behandelt, bei dieser Extraktion gehen aber unerwünschte Begleitstoffe mit dem Insulin in Lösung, so daß die Reinigung der Lösung schwierig wird.It is true that pancreatic glands have already been treated with alcoholic hydrochloric acid at 95 ° C., but with this extraction undesired accompanying substances go into solution with the insulin, so that the purification of the solution becomes difficult.

Es wurde nun gefunden, daß man ein von proteolytischen Enzymen freies Insulin durch Extraktion von Pankreasdrüsen mit angesäuertem Alkohol gewinnen kann, wenn man den alkoholischen Extrakt vor der Abtrennung des Insulins so lange und auf eine solche Temperatur erhitzt, bis die darin enthaltenen proteolytischen Enzyme inaktiviert sind, und den alkoholischen Extrakt dann aufarbeitet.It has now been found that an insulin free from proteolytic enzymes can be obtained by extraction of pancreatic glands with acidified alcohol can be obtained if one uses the alcoholic extract before separating the insulin and heated to such a temperature that the contained therein proteolytic enzymes are inactivated, and the alcoholic extract is then processed.

Dadurch, daß bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die proteolytischen Enzyme vor Aufarbeitung des alkoholischen Extrakts inaktiviert werden, erhält man eine höhere Ausbeute an Insulin als nach den bekannten Verfahren, da das Insulin bei der Aufarbeitung nicht der enzymatischen Zersetzung ausgesetzt ist.In that, in the process according to the invention, the proteolytic enzymes before working up of the alcoholic extract are inactivated, a higher yield of insulin is obtained than after the known processes, since the insulin is not exposed to enzymatic decomposition during processing is.

Zweckmäßig erhitzt man den alkoholischen Extrakt höchstens 30 Minuten, vorzugsweise 10 bis 15 Sekunden, bei einem ps-Wert von 2,0 bis 4,5 auf 70 bis 75 0C, hält diese Temperatur entweder 5 bis 10 Minuten oder kühlt direkt innerhalb von 30 Minuten auf Zimmertemperatur ab.The alcoholic extract is expediently heated for a maximum of 30 minutes, preferably 10 to 15 seconds, at a ps value of 2.0 to 4.5 to 70 to 75 ° C., this temperature is either maintained for 5 to 10 minutes or cooled directly within 30 Minutes to room temperature.

Die Aufarbeitung des alkoholischen Extrakts erfolgt zweckmäßig so, daß man durch Zusatz von Ammoniak die Lösung auf einen pn-Wert von etwa 8,5 bringt, den gebildeten Niederschlag entfernt, das Ph auf einen Wert von 2,8 bis 3,4 einstellt, die alkoholische Lösung dann entweder bei niedriger Temperatur und vermindertem Druck destilliert und das Insulin nach Entfernung des Fettmaterials aus dem erhaltenen wäßrigen Rückstand fällt oder an einem carboxylhaltigen Kationenaustauscher adsorbiert, das Adsorbat mit einer Mineralsäure eluiert und das Insulin aus dem Eluat isoliert.The work-up of the alcoholic extract is expediently carried out by adding ammonia the solution brings to a pn value of about 8.5, the precipitate formed is removed, the Ph on adjusts a value of 2.8 to 3.4, the alcoholic solution then either at low temperature and distilled under reduced pressure and the insulin obtained after removal of the fatty material from the aqueous residue falls or adsorbed on a carboxyl-containing cation exchanger, the adsorbate eluted with a mineral acid and the insulin isolated from the eluate.

Verfahren zur GewinnungMethod of extraction

eines von proteolytischen Enzymenone of proteolytic enzymes

freien Insulinsfree insulin

Anmelder:Applicant:

Johan Erik Jorpes, Stockhohn,Johan Erik Jorpes, mockery of the stick,

und Johan Gunnar Boris Linden,and Johan Gunnar Boris Linden,

Hässelby-Villastad (Schweden)Hässelby-Villastad (Sweden)

Vertreter: Dipl.-Chem. Dr. W. Koch,Representative: Dipl.-Chem. Dr. W. Koch,

Hamburg 4, Simon-von-Utrecht-Str. 43,Hamburg 4, Simon-von-Utrecht-Str. 43,

und Dr.-Ing. R. Glawe, München 27,and Dr.-Ing. R. Glawe, Munich 27,

PatentanwältePatent attorneys

Beanspruchte Priorität:
Schweden vom 13. September 1957 (Nr. 8346)Claimed priority:
Sweden of September 13, 1957 (No. 8346)

Johan Erik Jorpes, Stockholm,
und Johan Gunnar Boris Linden,Johan Erik Jorpes, Stockholm,
and Johan Gunnar Boris Linden,

Hässelby-Villastad (Schweden),
sind als Erfinder genannt wordenHässelby-Villastad (Sweden),
have been named as inventors

Als Kationenaustauscher kommen hierfür beispielsweise Oxycellulose, Pektinsäure, Alginsäure oder »Amberlite IRC 50« in Betracht.For example, oxycellulose, pectic acid, alginic acid or "Amberlite IRC 50" into consideration.

Bei Verwendung gewisser organischer Säuren zum Ansäuern des Alkohols wird eine beträchtliche Menge der Säure als in 70%igem Äthanol unlösliches Ammoniumsalz entfernt. Um die übrigen Ammoniumionen zu entfernen und um die Bildung von Salzen zu vermeiden, wenn die Lösung auf den für die Adsorption oder Anreicherung des rohen Insulins an dem carboxylhaltigen Kationenaustauscher erforderlichen sauren Ph eingestellt wird, wird der alkoholische Extrakt vorzugsweise stufenweise mit einem sulfonierten, hochvernetzten Kationenaustauscher des Typs »Dowex 50«, einem sulfonierten Polystyrol der FormelWhen using certain organic acids for acidifying the alcohol is removed a considerable amount of the acid in 70% strength ethanol em insoluble ammonium salt. In order to remove the remaining ammonium ions and to avoid the formation of salts when the solution is adjusted to the acidic pH required for the adsorption or enrichment of the crude insulin on the carboxyl-containing cation exchanger, the alcoholic extract is preferably gradually mixed with a sulfonated, highly crosslinked cation exchanger of the type "Dowex 50", a sulfonated polystyrene of the formula

CH CH2—CH CH2 CH CH 2 -CH CH 2

CHCH

'SO3H L J-SO3H I J-SO3H'SO 3 HL J-SO 3 HI J-SO 3 H

-CH-CH2 -CH-CH 2

209 577/381209 577/381

Claims (2)

3 43 4 in einer solchen Menge versetzt, daß man einen pH-Wert unter Rühren in 4 Stunden durchgeführt. Der festeadded in such an amount that a pH is carried out with stirring in 4 hours. The firm one von etwa 3 erhält. Rückstand der Drüsen wird abzentrifugiert.of about 3 receives. The residue from the glands is centrifuged off. . Eine zweite Extraktion des festen Rückstandes der Beispiel 1 Drüsen wird dann in 1,51 70%igem Äthanol unter Extraktion: lkg Ochsenpankreas wird in 1,81 5 Rühren in einer Stunde durchgeführt, worauf das 95 °/oigem Äthanol, dem 200 ml Wasser und 100 ml Gemisch zentrifugiert wird. Die Extrakte werden verEisessig zugesetzt worden waren, verrieben. Die einigt. Das Gesamtvolumen beträgt 3300 ml, und der Extraktion wird bei Zimmertemperatur in 4 Stunden pn-Wert ist etwa 2,0.. A second extraction of the solid residue of Example 1 glands is then in 1.51 70% ethanol under extraction: lkg ox pancreas is carried out in 1.81 5 stirring in one hour, after which the 95 ° / oig em ethanol, the 200 ml of water and 100 ml of mixture is centrifuged. The extracts are added to glacial acetic acid, triturated. That unites. The total volume is 3300 ml, and the extraction will take place at room temperature in 4 hours pn value is about 2.0. unter Rühren durchgeführt. Der Drüsenrückstand Reinigung des Extraktes: Zu den vereinigten wird abzentrifugiert oder abfiltriert und erneut io Extraktionen wird Ammoniak bis zu einem pn-Wert 1 Stunde mit 1,51 70 %igem Äthanol, das 5 ml Eis- von 8,5 zugesetzt Der dabei gebildete Niederschlag essig enthält, extrahiert. Die jeweiligen Filtrate werden wird abfiltriert, und das Filtrat wird mit Chlorwasservereinigt; der pH-Wert liegt bei etwa 4,0. Das Gesamt- stoffsäure bis zum pn 3,0 angesäuert,
volumen beträgt etwa 3300 ml. Wärmebehandlung: Die Wärmebehandlung wirdcarried out with stirring. The gland residue Purification of the extract: To the combined is centrifuged or filtered and again io extractions ammonia is added up to a pn value 1 hour with 1.51 70% ethanol, the 5 ml ice of 8.5 The precipitate formed thereby contains vinegar, extracted. The respective filtrates are filtered off, and the filtrate is combined with chlorine water; the pH is around 4.0. The total chemical acid acidified up to pn 3.0,
volume is about 3300 ml. Heat treatment: The heat treatment is Wärmebehandlung: Um die proteolytisehen Enzyme 15 wie im Beispiel 2 durchgeführt.Heat treatment: Carried out around the proteolytic enzymes 15 as in Example 2. zu inaktivieren, wird der alkoholische Extrakt schnell Anreicherung: Der alkoholische Extrakt wird durchTo inactivate, the alcoholic extract is rapidly enriching: the alcoholic extract is through im Verlaufe von 10 bis 15 Sekunden auf 70 bis 75° C Destillation unter verringertem Druck auf ein ZehntelDistillation under reduced pressure to one tenth in the course of 10 to 15 seconds to 70 to 75 ° C erhitzt und 5 bis 10 Minuten bei dieser Temperatur seines Volumens eingeengt. Fette werden aus demheated and concentrated 5 to 10 minutes at this temperature of its volume. Fats are made from the gehalten. Der Extrakt wird dann schnell auf Zimmer- Konzentrat entfernt und Proteine mit Neutralsalzenheld. The extract is then quickly removed to Zimmer concentrate and proteins with neutral salts temperatur abgekühlt. 20 zwecks Wiedergewinnung und weiterer Reinigung destemperature cooled. 20 for recovery and further purification of the Reinigung der Extrakte: Den vereinigten Extrakten Insulins gefällt,Purification of the extracts: The combined extracts precipitate insulin, wird Ammoniak zugesetzt, bis sich ein pn-Wert von Beispiel 4
8,5 ergibt. Der dadurch erzeugte Niederschlag wirdammonia is added until a pn value of Example 4
8.5 gives. The resulting precipitate is abfiltriert. Der Überschuß an Ammoniumionen wird Extraktion: 5 kg Pankreas vom Kalb, Hornviehfiltered off. The excess of ammonium ions is extracted: 5 kg pancreas from calves, horned cattle durch Zusatz eines hochvernetzten sulfonierten Katio- 25 oder Schwein werden in 81 95%igem Äthanol, demby adding a highly crosslinked sulfonated Katio 25 or pig are in 81 95% ethanol, the nenaustauschers, beispielsweise »Dowex 50«, unter 11 Wasser und 175 g Oxalsäure (H2C2O4 · 2 H2O)exchange exchanger, for example »Dowex 50«, under 11 water and 175 g oxalic acid (H 2 C 2 O 4 · 2 H 2 O) Rühren entfernt, wobei die verwendete Menge derart zugesetzt worden waren, verrieben. Das Gemisch wirdStir removed with the amount used so added, triturated. The mixture will ist, daß ein Endwert des ph von etwa 2,8 bis 3,4 er- 5 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und dasis that a final value of the pH of about 2.8 to 3.4 he stirred for 5 hours at room temperature and that halten wird. Der Ionenaustauscher wird entfernt. Drüsenmaterial abzentrifugiert. Das Drüsenmaterialwill hold. The ion exchanger is removed. Centrifuged gland material. The glandular material Adsorption und Elution: 60 g Alginsäure, die mit 30 wird dann mit 7500 ml 70%igem Äthanol wiederAdsorption and elution: 60 g of alginic acid, which with 30 is then reapplied with 7500 ml of 70% ethanol 0,2 n-Chlorwasserstoffsäure und dann wiederholt mit extrahiert und der Drüsenrückstand abgetrennt. Die0.2 N hydrochloric acid and then extracted repeatedly with, and the gland residue was separated off. the destilliertem Wasser gewaschen worden ist, werden beiden Extrakte werden vereinigt,distilled water has been washed, the two extracts are combined, noch feucht dem Extrakt zugesetzt und 2 Stunden bei Reinigung der Extrakte: Den vereinigten Extraktenadded to the extract while still moist and for 2 hours when cleaning the extracts: the combined extracts Zimmertemperatur gerührt. Die Alginsäure wird auf wird Ammoniak bis zu einem pH-Wert von 8,5 zu-Stirred at room temperature. The alginic acid is added to ammonia up to a pH of 8.5. einem Saugfilter gesammelt, mit etwa 600 ml 35 gesetzt. Der dabei gebildete Niederschlag wird ab-collected on a suction filter, set with about 600 ml 35. The precipitate formed in the process is 0,3 n-Chlorwasserstoffsäure 20 Minuten unter Rühren filtriert. Die überschüssigen Ammoniumionen werden0.3 N-hydrochloric acid filtered with stirring for 20 minutes. The excess ammonium ions will be eluiert und das Insulin aus dem Eluat durch Sättigen entfernt, indem unter Rühren ein hochvernetztereluted and the insulin removed from the eluate by saturation by adding a highly cross-linked mit Natriumchlorid gefällt. sulfonierter Kationenaustauscher, beispielsweiseprecipitated with sodium chloride. sulfonated cation exchanger, for example »Dowex 50«, zugesetzt wird, wobei eine solche Menge"Dowex 50", being added, being such an amount Beispiel 2 40 verwendet wird, daß das pn einen Endwert von etwaExample 2 40 is used that the pn has a final value of about Extraktion: 1 kg Schweinepankreas wird in 1,8 1 2,8 bis 3,4 erreicht. Der Ionenaustauscher wird ent-Extraction: 1 kg of porcine pancreas is achieved in 1.8 1 2.8 to 3.4. The ion exchanger is 95%igem Äthanol, dem 0,21 Wasser und 75 g fernt.95% ethanol, which removes 0.21 water and 75 g. Citronensäure (C6H8O7-H2O) zugesetzt worden Wärmebehandlung: Die Wärmebehandlung wird waren, verrieben. Das Gemisch wird 5 Stunden bei wie im Beispiel 1 durchgeführt.
Zimmertemperatur gerührt und die Drüsenrückstände 45 Adsorption und Elution: Zu dem alkoholischen durch Zentrifugieren entfernt. Das feste Drüsen- Extrakt wird Alginsäure zugesetzt, die mit 0,2 n-Chlormaterial wird dann wieder mit 1,5170 %igem Äthanol wasserstoffsäure und anschließend mit Wasser geextrahiert und durch Zentrifugieren entfernt. Die waschen worden ist. Die Alginsäure-muß, bevor sie beiden Extrakte werden vereinigt. dem Extrakt zugesetzt wird, mit Wasser angefeuchtetCitric acid (C 6 H 8 O 7 -H 2 O) has been added. Heat treatment: The heat treatment is triturated. The mixture is carried out as in Example 1 for 5 hours.
Stirred at room temperature and the glandular residues 45 Adsorption and elution: To the alcoholic removed by centrifugation. The solid glandular extract is added to alginic acid, that with 0.2 n-chlorine material is then again extracted with 1.5170% ethanol and then with water and removed by centrifugation. Which has been washed. The alginic acid must be combined before the two extracts. added to the extract, moistened with water Wärmebehandlung: Der alkoholische Extrakt wird 5° werden. Die Menge an zugesetzter Alginsäure ent-Heat treatment: the alcoholic extract will be 5 °. The amount of added alginic acid dann zur Inaktivierung der proteolytisehen Enzyme im spricht 150 g trockener Alginsäure oder 30 g prothen for the inactivation of the proteolytic enzymes speak 150 g of dry alginic acid or 30 g per Verlaufe von 30 Minuten auf 750C erhitzt, 5 Minuten Kilogramm Pankreas. Die Adsorption erfolgt unterHeated to 75 ° C. for 30 minutes, kilograms of pancreas for 5 minutes. Adsorption takes place under bei dieser Temperatur gehalten und der Extrakt im Rühren bei Zimmertemperatur über Nacht. Man läßtkept at this temperature and the extract while stirring at room temperature overnight. One lets Verlaufe von 30 Minuten auf Zimmertemperatur die Alginsäure absetzen und trennt sie auf_ einemAfter 30 minutes at room temperature, settle the alginic acid and separate it on one abgekühlt. 55 Saugtrichter ab. Sie wird dann mit 95 %igem Äthanolcooled down. 55 Suction funnel off. She is then with 95% ig em ethanol Reinigung der Extrakte: Der Extrakt wird mit und absolutem Äthanol gewaschen und belüftet, umPurification of the extracts: The extract is washed with and absolute ethanol and aerated to Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt, der das Äthanol zu entfernen. Eine weitere AdsorptionAmmonia adjusted to a pH value of 8.5, which remove the ethanol to. Another adsorption gebildete Niederschlag abfiltriert, die Lösung mit mit derselben Menge Alginsäure wird vorgenommen,The precipitate formed is filtered off, the solution is made with the same amount of alginic acid, Schwefelsäure bis zum pn von 2,8 bis 3,4 angesäuert um das in dem Filtrat verbleibende Insulin zu ent-Sulfuric acid acidified up to pn from 2.8 to 3.4 in order to remove the insulin remaining in the filtrate. und durch Destillation unter vermindertem Druck 60 fernen. Die Adsorbate werden jedes mit 11 0,3 n-Chlor-and removed by distillation under reduced pressure 60. The adsorbates are each with 11 0.3 n-chlorine auf ein Zehntel seines Volumens zwecks weiterer wasserstoffsäure getrennt eluiert. Die Eluate werdeneluted separately to one tenth of its volume for further hydroic acid. The eluates are Behandlung wie im Beispiel 1 eingeengt. vereinigt und das Insulin gefällt, indem das Eluat mitTreatment as in Example 1 concentrated. combined and the insulin precipitated by the eluate with Natriumchlorid gesättigt wird. Das Insulin wird dannSodium chloride becomes saturated. The insulin will then Beispiel 3 nach üblichen Verfahren gereinigt.Example 3 purified by conventional methods. Extraktion: lkg Ochsenpankreas wird in 1,81 65Extraction: 1kg ox pancreas becomes 1.81 65 95%igem Äthanol, dem 200ml Wasser und 30ml PATENTANSPRÜCHE:95% ethanol, 200ml water and 30ml PATENT CLAIMS: 10 n-Chlorwasserstoffsäure zugesetzt worden waren, 1. Verfahren zur Gewinnung eines von proteoly-10 n-hydrochloric acid had been added, 1. Process for obtaining one of proteoly- verrieben. Die Extraktion wird bei Zimmertemperatur tischen Enzymen freien Insulins durch Extraktionrubbed in. The extraction is done at room temperature by enzymatic free insulin extraction der Pankreasdrüsen mit angesäuertem Alkohol, dadurch gekennzeichnet, daß man den alkoholischen Extrakt vor der Isolierung des Insulins so lange und auf eine solche Temperatur erhitzt, bis die darin enthaltenen proteolytischen Enzyme inaktiviert sind.of the pancreatic glands with acidified alcohol, characterized in that the alcoholic extract is heated to such a temperature before isolating the insulin until the proteolytic enzymes contained therein are inactivated. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den alkoholischen Extrakt bei einem pH-Wert von 2,0 bis 4,5 innerhalb von 30 Minuten, vorzugsweise 10 bis 15 Sekunden, auf 70 bis 75 0C erhitzt und dann entweder 5 bis 10 Minuten diese Temperatur hält oder direkt innerhalb von 30 Minuten auf etwa Zimmertemperatur abkühlt.2. The method according to claim 1, characterized in that the alcoholic extract is heated at a pH of 2.0 to 4.5 within 30 minutes, preferably 10 to 15 seconds, to 70 to 75 0 C and then either 5 Maintains this temperature for up to 10 minutes or cools directly to about room temperature within 30 minutes. In Betracht gezogene Druckschriften: Französische Patentschrift Nr. 1 091 732; dänische Patentschrift Nr. 74 709; USA.-Patentschriften Nr. 2 695 861, 2 648 622; belgische Patentschrift Nr. 448 597.Documents considered: French Patent No. 1 091 732; Danish patent specification No. 74 709; U.S. Patent Nos. 2,695,861, 2,648,622; Belgian patent specification No. 448 597. © 209 577/381 4.62© 209 577/381 4.62
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