DE112022002442T5

DE112022002442T5 - Röntgen-kontrastmittel und röntgen-bilderfassungsverfahren

Info

Publication number: DE112022002442T5
Application number: DE112022002442.9T
Authority: DE
Inventors: Koichiro Ito; Naoki Kunishima; Raita HIROSE
Original assignee: Rigaku Denki Co Ltd; Rigaku Corp
Current assignee: Rigaku Denki Co Ltd; Rigaku Corp
Priority date: 2021-05-06
Filing date: 2022-05-02
Publication date: 2024-03-07
Also published as: CN117280200A; JPWO2022234844A1; WO2022234844A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft beispielsweise ein Verfahren zum Erhalten eines Röntgen-CT-Bilds einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: einen Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, wobei das Kontrastmittel Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist, einen Schritt von Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels, und einen Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds durch Bestrahlen der wiederverfestigten biologischen Probe mit einer Röntgenstrahlung mit einer Energie von 4 bis 12 keV, wobei die Gestalt der biologischen Probe eine Gestalt ist, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten eines Röntgen-CT-Bilds einer biologischen Probe, ein Analyseverfahren für eine biologische Probe, ein Kontrastmittel und dergleichen.
Stand der Technik
Röntgen-CT (Computertomographie) ist eine Technologie zum Bestrahlen eines Testgegenstands mit Röntgenstrahlen aus verschiedensten Richtungen, Detektieren der Intensität der transmittierten Röntgenstrahlen und Kombinieren von Bildern, die eine räumliche Verteilung eines Röntgen-Absorptionskoeffizienten im Innern des Testgegenstands angeben, mit einer arithmetischen Rekonstruktionsoperation, um ein Schnittbild und ein dreidimensionales Bild des Testgegenstands zu erhalten. Mit der Röntgen-CT ist, anders als bei einem optischen Mikroskop und einem Elektronenmikroskop, eine dreidimensionale Beobachtung ohne Zerbrechen des Testgegenstands möglich. Daher wird die Röntgen-CT in industriellen Anwendungen und verschiedensten Gebieten, wie etwa dem medizinischen Gebiet, verwendet.
Zurzeit weit verbreitete Mikro-Röntgen-CT verwendet einen harten Röntgenbereich mit einer Röhrenspannung von ungefähr 50 bis 160 kV. Feine und klare hohe Bildqualität mit starkem Kontrast kann in einem Testgegenstand, wie etwa einer mechanischen Komponente oder einer elektronischen Komponente, die mit einem Element, das eine große Ordnungszahl aufweist, ausgestaltet ist, erfasst werden. Andererseits kann kein hinreichender Kontrast für eine aus einem leichten Element aufgebaute Probe, die eine schwache Röntgenabsorption aufweist, beispielsweise eine biologische Probe, erhalten werden. Daher wird die Röntgen-CT für die biologische Probe durchgeführt, indem mit einem Kontrastmittel, wie etwa einem Schwermetall, Kontrast eingeführt wird. Die Nichtpatentliteratur 1 beschreibt beispielsweise, dass ein Röntgen-CT-Bild von einer biologischen Probe unter Verwendung von Osmiumtetroxid als ein Kontrastmittel erhalten wird.
Referenzliste
Nichtpatentliteratur
Nichtpatentliteratur 1: MICHAEL D. BENTLEY et al., THE ANATOMICAL RECORD 290:277-283 (2007)
Kurzdarstellung der Erfindung
Die Röntgen-CT, die heutzutage weit verbreitet ist, erhält Kontrast in Abhängigkeit von dem Grad der Röntgenabsorption durch einen Testgegenstand und erzeugt ein Bild. Alle Elemente mit niedriger Ordnungszahl, beispielsweise Wasserstoff, Kohlenstoff, Sauerstoff und Stickstoff, die hauptsächlich ein biologisches Weichgewebe ausmachen, weisen eine geringe Röntgenabsorption auf und somit kann ein ausreichender Kontrast nicht erhalten werden und somit kann in der Struktur von Weichgewebe keine hohe Visualisierungsfähigkeit erwartet werden. Daher wird ein Kontrastmittel, das ein schweres Element enthält, wie etwa Osmiumtetroxid, zum Kompensieren des geringen Kontrasts verwendet. Allerdings ist in vielen Fällen, in denen eine Beobachtung nötig ist, ein angemessenes Kontrastmittel nicht immer vorhanden. In manchen Fällen dringt das Kontrastmittel beispielsweise nicht ausreichend tief in eine biologische Probe ein oder der Einfluss des Kontrastmittels ist zu stark, was für ein Röntgenmikroskop bei der Beobachtung der biologischen Probe ein Problem darstellte.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht beispielsweise darin, ein Verfahren zum Erhalten eines klaren (beispielsweise mit einer Voxelgröße von 5 µm oder weniger) hochqualitativen Röntgen-CT-Bilds für eine biologische Probe und ein für das Verfahren verwendetes Kontrastmittel bereitzustellen.
Die vorliegenden Erfinder haben ein Prinzip zum Erhalten von Kontrast in einer biologischen Probe bei CT-Bildgebung erdacht und fanden, dass, indem ein Kontrastmittel, das Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe aufweist und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist, verwendet wird, hinreichender Kontrast erreicht werden kann, selbst dann, wenn ein Kontrastmittel, das aus einem schweren Element besteht, nicht verwendet wird. Im Allgemeinen wird Wachs, wie etwa Paraffin, nur als ein Einbettungsmaterial, das in einem Prozess des Herstellens eines Paraffinblocks als Vorbehandlung für optische und Elektronenmikroskopie verwendet wird, angesehen. Bisher war nicht bekannt, dass das Wachs als ein Kontrastmittel verwendet werden kann.
Die vorliegenden Erfinder haben die vorliegende Erfindung durch Finden abgeschlossen, dass ein feines und klares hochqualitatives Röntgen-CT-Bild durch ein Verfahren des Erhaltens eines Röntgen-CT-Bilds einer biologischen Probe erhalten werden kann, wobei das Verfahren einen Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, umfasst, wobei das Kontrastmittel Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist, einen Schritt von Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels, und einen Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT durch Bestrahlen der wiederverfestigten biologischen Probe mit einer Röntgenstrahlung mit einer Energie von 4 bis 12 keV, wobei die Gestalt der biologischen Probe eine Gestalt ist, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt.
Die vorliegende Erfindung umfasst die folgenden Ausführungsformen.

(1) Ein Verfahren zum Erhalten eines Röntgen-CT-Bilds einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst:
- einen Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, wobei das Kontrastmittel Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist;
- einen Schritt von Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels; und
- einen Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds durch Bestrahlen der wiederverfestigten biologischen Probe mit einer Röntgenstrahlung mit einer Energie von 4 bis 12 keV, wobei die Gestalt der biologischen Probe eine Gestalt ist, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt.
(2) Das in (1) beschriebene Verfahren, wobei der Schritt des Aufschmelzens und Wiederverfestigens des Kontrastmittels in einem Zustand, in dem die biologische Probe auf einem Probentisch platziert ist, durchgeführt wird.
(3) Das in (1) oder (2) beschriebene Verfahren, ferner umfassend, vor dem Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, einen Schritt des Schneidens der biologischen Probe in eine Gestalt, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt.
(4) Das in (1) oder (2) beschriebene Verfahren, ferner umfassend, nach dem Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, einen Schritt des Schneidens der verfestigten biologischen Probe in eine Gestalt, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt.
(5) Das in (4) beschriebene Verfahren, wobei der Schritt des Schneidens der biologischen Probe mit einem zylindrischen Rohr durchgeführt wird, das auf eine höhere Temperatur als den Schmelzpunkt des Kontrastmittels erwärmt ist.
(6) Das in einem von (1) bis (5) beschriebene Verfahren, ferner umfassend einen Schritt des Hinzufügens eines Markers zu der biologischen Probe, wobei in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds, das Röntgen-CT-Bild durch Bewegen von Schnitten des Röntgen-CT-Bilds gemäß einer Bewegung eines projizierten Bilds, das aus einem Röntgen-Projektionsbild des Markers erhalten wird, korrigiert wird.
(7) Das in einem von (1) bis (6) beschriebene Verfahren, wobei das Kontrastmittel eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger bei 25°C aufweist.
(8) Das in einem von (1) bis (7) beschriebene Verfahren, wobei das Wachs festes Paraffin ist.
(9) Das in einem von (1) bis (8) beschriebene Verfahren, wobei das Röntgen-CT-Bild klar mit einer Voxelgröße von 5 µm oder weniger erhalten wird.
(10) Ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe, umfassend:
- einen Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in eine biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, wobei das Kontrastmittel Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist;
- einen Schritt von Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels;
- einen Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds durch Bestrahlen der wiederverfestigten biologischen Probe mit einer Röntgenstrahlung mit einer Energie von 4 bis 12 keV, wobei die Gestalt der biologischen Probe eine Gestalt ist, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt;
- einen Schritt des Spezifizierens einer Stelle, die weiter durch ein optisches Mikroskop und/oder ein Elektronenmikroskop beobachtet werden soll, auf der Grundlage des erfassten Röntgen-CT-Bilds und Aufschneiden und Freilegen der Stelle;
- einen Schritt des Beobachtens der Stelle mit dem optischen Mikroskop und/oder dem Elektronenmikroskop; und
- einen Schritt des Kombinierens des Röntgen-CT-Bilds und von Ergebnissen der Beobachtung durch das optische Mikroskop und/oder das Elektronenmikroskop zum Analysieren der biologischen Probe.
(11) Kontrastmittel für Röntgen-CT einer biologischen Probe, wobei das Kontrastmittel Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist.

Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, ein feines und klares hochqualitatives Röntgen-CT-Bild für eine biologische Probe zu erhalten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen

[1] 1 zeigt ein Präparationsbeispiel für einen Paraffinblock mit biologischer Probe, versehen mit Kontrastbildgebung durch Paraffin. A: Ein Paraffinblock (eine Originalprobe), der eine Mäusenierenprobe umfasst. Ein rundes Objekt im Zentrum des Blocks ist eine biologische Probe. B: Sammeln einer Beobachtungsprobe durch eine Biopsiestanze. Eine zylindrische biologische Probe mit einem Durchmesser von 0,5 Millimeter, angedeutet durch „a“, wurde von einer Stelle „b“ des Paraffinblocks unter Verwendung der Biopsiestanze, gezeigt auf der rechten Seite der biologischen Probe, gesammelt. C: Aufschmelzen und Wiederverfestigen des in der biologischen Probe enthaltenen Paraffins. Ein Zustand, in dem die zylindrische biologische Probe „b“ mit einem Durchmesser von 0,5 Millimeter auf der oberen Fläche einer Metallstange „a“ mit einem Durchmesser von 3 Millimetern errichtet ist, ist gezeigt. Ein unterer Teil der Metallstange über eine Aluminiumfolie hinweg wird erwärmt und danach gekühlt. D: Ein Block mit biologischer Probe, versehen mit Paraffin-Kontrastbildgebung nach Präparation, ist gezeigt. In jedem von einer Komplettansicht (links) und einer Vergrößerung eines Probenteils (rechts) ist a: die Metallstange, b: die biologische Probe.
[2] 2 zeigt ein Röntgenprojektionsbild einer biologischen Probe, versehen mit Kontrastbildgebung durch Paraffin. Ein einzelner Partikel (als schwarzer Punkt sichtbar) mit einem Durchmesser von 2 bis 3 Mikron, der tatsächlich als ein Positionsmarker verwendet wird, ist mit einem „a“ gezeigt. Eine Region „b“, umgeben von einem Rahmen, ist ein Markerpräsenzbereich während Bildgebung. Da dieser Markerpartikel nahe einer Probenrotationsachse „c“ präsent ist, weicht der Markerpartikel nicht von einem Sichtfeld gemäß einer Probenrotation während der Bildgebung ab.
[3] 3 zeigt ein Beispiel für Driftkorrektur. A: Ein projiziertes Bild einer Spur eines gesamten Markers zu der Zeit, als eine Serie von Röntgenprojektionsbildern ausgelesen wird. B: Ein projiziertes Bild einer Spur eines einzigen Markerpartikels. Eine Linie (ein Pfeil in 3A) verbunden von einem Ende zu einem Ende in einem gesamten projizierten Bild ist extrahiert. Eine besonders große Verlagerung ist an zwei durch * angedeuteten Stellen zu sehen. C: Vergleich von CT-Bildern vor (links) und nach (rechts) der Driftkorrektur.
[4] 4 zeigt eine Vorrichtung, in der eine Probenanbringung an einer handelsüblichen Diamantdrahtsäge angebracht ist. A: Ein schematisches Diagramm der Vorrichtung. B: Ein CT-Bild mit Kontrastbildgebung mit in Epon-Harz eingebettetem Osmium (Os). Bilder von vor Trimmen von überschüssigem Harz (oben) und nach Trimmen von überschüssigem Harz (unten) durch die Diamantdrahtsäge werden verglichen. Der Kontrast wurde durch das Entfernen etwas verbessert. C: Schneiden einer biologischen Probe in einem Paraffinblock. Eine lange zylindrische biologische Probe wurde mit der Diamantdrahtsäge in zwei Hälften zerschnitten. Ein durch einen Pfeil angedeutetes Objekt ist eines der Halbstücke der biologischen Probe.
[5] 5 zeigt einen Vergleich von Röntgen-CT-Bildern. A: Ein Ergebnis von Kontrastbildgebung mit in Epon-Harz eingebettetem Osmium (Os). Eine in der Mitte der Fotografie zu sehende kreisförmige Struktur ist ein Querschnitt eines sphärischen Nierenkörperchens (das einen Durchmesser von ungefähr 80 Mikron aufweist). B: Ein Ergebnis von Paraffin-Kontrastbildgebung. Eine in der Mitte der Fotografie zu sehende kreisförmige Struktur ist ein Querschnitt eines sphärischen Nierenkörperchens (das einen Durchmesser von ungefähr 80 Mikron aufweist).
[6] 6 zeigt ein Oberflächenbeobachtungsergebnis von Paraffin, gewonnen von einem Paraffinblock unter Verwendung einer wärmebehandelten Biopsiestanze und einer nicht-wärmebehandelten Biopsiestanze (6A: eine optische Fotographie in dem Fall, in dem das Paraffin unter Verwendung der wärmebehandelten Biopsiestanze gewonnen wurde. 6B: eine Optisches-Mikroskop-Fotographie in dem Fall, in dem das Paraffin unter Verwendung der wärmebehandelten Biopsiestanze gewonnen wurde. 6C: eine optische Fotographie in dem Fall, in dem das Paraffin unter Verwendung der nicht-wärmebehandelten Biopsiestanze gewonnen wurde. 6D: eine Optisches-Mikroskop-Fotographie in dem Fall, in dem das Paraffin unter Verwendung der nicht-wärmebehandelten Biopsiestanze gewonnen wurde).
[7] 7 zeigt ein Auswertungsbeispiel für einen Kontrastbildgebungseffekt durch Wachs. A: Eine Messprobe. „a“ ist ein mit Wachs (Paraffin) gefülltes Polyimidröhrchen. B: Orthogonale CT-Schnitte aus drei Richtungen, „a“ ist eine Wachsregion und „b“ ist eine Polyimidregion. Der Kontrastbildgebungseffekt des Wachses wurde durch Messen eines SN-Verhältnisses zwischen den beiden Regionen ausgewertet. Ein als schwarz zu sehender Anteil nahe einem Röhrchenzentrum ist eine bei Wachsverfestigung gebildete Aushöhlung.
[8] 8 zeigt eine Ausführungsform eines Verfahrens zum Erhalten eines Röntgen-CT-Bilds einer biologischen Probe der vorliegenden Erfindung.

Beschreibung von Ausführungsformen
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalten eines Röntgen-CT-Bilds einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: einen Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, wobei das Kontrastmittel Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist, einen Schritt von Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels, und einen Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds durch Bestrahlen der wiederverfestigten biologischen Probe mit einer Röntgenstrahlung mit einer Energie von 4 bis 12 keV, wobei die Gestalt der biologischen Probe eine Gestalt ist, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann ein klares (beispielsweise ist eine Voxelgröße 5 µm oder weniger, 4 µm oder weniger, 3 µm oder weniger, 2 µm oder weniger oder 1 µm oder weniger) hochqualitatives Röntgen-CT-Bild erhalten. Die Voxelgröße des Röntgen-CT-Bilds gibt die Größe eines Kubikpixels an (ein Würfel, der die Voxelgröße als eine Seite aufweist). Die Voxelgröße kann durch Teilen der Größe eines Sichtfelds eines CT-Bilds durch die Anzahl der in dem Sichtfeld enthaltenen Pixel berechnet werden.
Wie hier beschrieben wurde, bedeutet Wachs eine lipophile Verbindung, die bei Normaltemperatur (20°C bis 30°C) fest ist und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist. Das Wachs kann entweder natürliches oder synthetisches Wachs sein. Beispiele für Wachs beinhalten Petroleumwachs (natürliches Wachs), beispielsweise Paraffinwachs, mikrokristallines Wachs und Vaseline. Hauptkomponenten dieser Art von Petroleumwachs sind gesättigte Kohlenwasserstoffe, lineares n-Paraffin, verzweigtes Isoparaffin und zyklisches Zykloparaffin. In einer Ausführungsform ist das Petroleumwachs festes Paraffin. Das feste Paraffin bedeutet eine Mischung von Alkanen mit Kohlenstoffatomanzahlen größer oder gleich 20. Das Petroleumwachs kann beliebige der obigen Wachse allein oder eine Kombination der obigen Wachse enthalten.
Das wie hier beschriebene Kontrastmittel, das das Wachs umfasst, weist in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger auf. In einer Ausführungsform ist die Dichte ein Wert bei Normaltemperatur, beispielsweise 20°C bis 30°C oder 25°C. Die Dichte des Kontrastmittels kann durch ein pyknometrisches Verfahren, ein gravimetrisches Verfahren unter Verwendung des Archimedischen Prinzips oder dergleichen gemessen werden.
Der Schmelzpunkt des wie hier beschriebenen Kontrastmittels kann 40°C bis 80°C, beispielsweise 45°C oder höher, 50°C oder höher, oder 55°C oder höher und/oder kann 80°C oder niedriger, 70°C oder niedriger, oder 60°C oder niedriger sein. Der Schmelzpunkt des Kontrastmittels kann durch ein Kalorimeter für dynamische Differenz-Thermoanalyse (Differential Scanning Calorimeter - DSC) oder dergleichen gemessen werden.
Das wie hier beschriebene Kontrastmittel enthält Wachs, wie etwa Paraffin als eine Hauptkomponente (das Kontrastmittel enthält beispielsweise 50 % oder mehr, 60 % oder mehr, 70 % oder mehr, 80 % oder mehr, 90 % oder mehr, 95 % oder mehr, 98 % oder mehr, 99 % oder mehr, oder 100 % Wachs, wie etwa Paraffin im Hinblick auf das Gewicht des Kontrastmittels).
Wie hier beschrieben, bedeutet ein „Kontrastmittel“ ein Mittel zum Liefern von Kontrast für ein Bild bei Beobachtung einer biologischen Probe durch Röntgen-CT (so wie hier beschrieben, wird das Kontrastmittel auch als ein „niederdichtes verfestigtes Kontrastmittel“ beschrieben). Wenn das wie hier beschriebene Kontrastmittel in eine biologische Probe penetriert wird, beträgt die Dichte des verfestigten Kontrastmittels 0,95 g/cm³ oder weniger, was niedriger als die Dichte von Wasser ist. Daher kann durch Penetrieren des Kontrastmittels in eine biologische Probe (beispielsweise ein Weichgewebe, in dem das meiste den gleichen Dichtegrad wie die Dichte von Wasser aufweist) eine Dichtedifferenz zwischen dem Kontrastmittel und der biologischen Probe Kontrast zu einem Bild bei der Beobachtung durch die Röntgen-CT ergeben. Durch Penetrieren des Kontrastmittels, wie hier beschrieben, in eine Zelle und/oder einen Gewebezwischenraum der biologischen Probe und Verfestigen des Kontrastmittels ist es möglich, eine Änderung eines Zustands der biologischen Probe (beispielsweise Bewegung einer weichen und fragilen biologischen Probe während der Messung) bei der Beobachtung durch die Röntgen-CT zu unterdrücken. Da darüber hinaus Röntgenabsorption des Wachses in der Mitte zwischen der Röntgenabsorption von Luft und der Röntgenabsorption von Wasser liegt, verursacht das Wachs kein Metallartefakt (Bildrauschen, das mitunter auftritt, wenn Substanzen mit signifikant anderen Röntgentransmittivitäten in einem Bildgebungsziel enthalten sind), das auftritt, wenn Schwermetall als das Kontrastmittel verwendet wird. Da Wachs allerdings mit Wasser inkompatibel ist, behindert die Anwesenheit von Feuchtigkeit in einem Gewebe Wachspenetration. Daher ist es bevorzugt, hinreichende Dehydrierung mit Alkohol oder Aceton durchzuführen, bevor das Kontrastmittel, das das Wachs enthält, penetriert und verfestigt wird.
Wie hier beschrieben, wird in „dem Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern“, das wie hier beschriebene Kontrastmittel in die biologische Probe penetriert und verfestigt, wobei Kontrast zu einem Bild bei der nachfolgenden Beobachtung der biologischen Probe durch Röntgen-CT geliefert wird. Ohne Einschränkung kann der „Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern“, beispielsweise durchgeführt werden durch Penetrieren des Kontrastmittels in eine biologische Probe, die von einem Testgegenstand gesammelt wurde, wobei das Kontrastmittel durch Erwärmen auf eine Temperatur höher oder gleich der eines Schmelzpunkts des Kontrastmittels verflüssigt wird, und Verfestigen des Kontrastmittels durch Abkühlen des Kontrastmittels auf den Schmelzpunkt oder darunter. Durch Verwendung einer Form kann das Kontrastmittel in einer beliebigen Gestalt verfestigt werden. Wenn die Form verwendet wird, muss das verfestigte Kontrastmittel nicht aufgeschmolzen und wiederverfestigt werden, da Kontrastbildgebung in einem Zustand, in dem eine Probenoberfläche glatt ist, durchgeführt werden kann. Allerdings kann das verfestigte Kontrastmittel aufgeschmolzen und wiederverfestigt werden, um die biologische Probe an dem Probentisch zu fixieren und um überschüssiges Paraffin zu entfernen. Das Kontrastmittel kann leichter penetriert werden, indem ein Kontrastmittel mit einer niedrigen Viskosität in einem flüssigen Zustand verwendet wird. Bevor das Kontrastmittel in die biologische Probe penetriert wird, können einer oder mehrere der folgenden Schritte durchgeführt werden: ein Schritt des chemischen Fixierens der biologischen Probe durch Eintauchen der biologischen Probe in eine Fixierlösung, wie etwa Formalin oder Bouin-Lösung, ein Schritt des Dehydrierens der fixierten biologischen Probe mit Alkohol, wie etwa Ethanol oder Aceton, und einen Schritt des Substituierens der dehydrierten Probe mit einem Zwischenmittel, wie etwa Xylol, Propylenoxid oder Chloroform, um die dehydrierte Probe mit dem Wachs zu überblenden. Als Fixierungsverfahren können Formalinfixierung (unter Verwendung von Formaldehyd, Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder dergleichen), Alkoholfixierung (unter Verwendung von Ethanol, Methanol, Aceton, Chloroform oder dergleichen), Pikrinsäurefixierung (unter Verwendung von Bouin-Lösung, alkoholischer Bouin-Lösung oder dergleichen), und andere Fixierungsverfahren (HOPE, PAXgene) verwendet werden. Durch Durchführen dieser Schritte ist es möglich, Gewebeschrumpfung, Rissbildung, eine Änderung der Zellstruktur und dergleichen, involviert bei Verdampfung von Feuchtigkeit zu der Zeit, zu der das Kontrastmittel in die biologische Probe penetriert und verfestigt wird, zu reduzieren. Zusätzlich zu den oben beschriebenen Schritten kann der Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern , ferner wenn nötig einen Schritt des Entfettens der biologischen Probe mit Aceton oder dergleichen und einen Schritt des Entkalkens der biologischen Probe mit einer sauren Lösung umfassen.
Der Schritt des Aufschmelzens und Wiederverfestigens des verfestigten Kontrastmittels kann beispielsweise durchgeführt werden durch Erwärmen der biologischen Probe oder eines Raumes um die biologische Probe herum und danach Abkühlen der biologischen Probe oder des Raumes. Das Aufschmelzen des verfestigten Kontrastmittels kann durch Erwärmen eines wärmeleitenden Anteils in dem Falle einer Ausführungsform, in der sich der wärmeleitende Anteil (beispielsweise ein metallischer Probentisch) in Kontakt mit der biologischen Probe befindet, durchgeführt werden. Das Erwärmen des wärmeleitenden Anteils (beispielsweise des metallischen Probentischs), falls vorhanden, kann beispielsweise durchgeführt werden durch Eintauchen in ein Warmwasserbad von 40°C oder höher, 50°C oder höher, 60°C oder höher, 70°C oder höher oder 80°C oder höher für einige Minuten, beispielsweise 1 bis 30 Minuten, 1 bis 20 Minuten, 1 bis 5 Minuten. Das Abkühlen kann beispielsweise durchgeführt werden durch Entfernen des wärmeleitenden Anteils aus dem Warmwasserbad und Rückführen des wärmeleitenden Anteils auf Raumtemperatur. Durch Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels kann ein überschüssiges Kontrastmittel um die biologische Probe herum entfernt werden und die Oberfläche der biologischen Probe kann geglättet werden. Dies kann Mischen von Artefakten zu einem Bild aufgrund von scharfer Ungleichmäßigkeit der Oberfläche der biologischen Probe, verfestigt durch das Kontrastmittel, verhindern oder reduzieren und/oder eine Kontrastverminderung in einem Röntgenabsorptionsbild, die auftreten kann, wenn eine große Menge von Kontrastmittel auf der biologischen Probe steckengeblieben ist, verhindern. Eine Aufwärmzeit kann angemessen eingestellt werden, unter Berücksichtigung, dass es ein Risiko gibt, dass selbst ein notwendiges Kontrastmittel leckt oder dass die biologische Probe selbst verändert wird, wenn die Aufwärmzeit zu lang ist. Beispielsweise kann die Aufwärmzeit in dem Maße eingestellt werden, dass die Oberfläche der biologischen Probe nicht austrocknet und/oder das zur Fixierung nötige Paraffin zurückbleibt, wenn die biologische Probe direkt auf den Probentisch fixiert wird. Die Aufwärmzeit kann beispielsweise 30 Sekunden bis 30 Minuten, 1 Minute bis 10 Minuten, 3 Minuten bis 8 Minuten oder 5 Minuten betragen.
In einer Ausführungsform wird der Schritt des Aufschmelzens und Wiederverfestigens des Kontrastmittels in einem Zustand, in dem die biologische Probe auf einem Probentisch platziert ist, durchgeführt. Folglich wird ein überschüssiges Kontrastmittel um die biologische Probe herum durch Aufschmelzen entfernt und die Oberfläche der biologischen Probe kann geglättet werden. Ferner kann, da die biologische Probe durch das Kontrastmittel durch das Wiederverfestigen direkt auf dem Probentisch befestigt ist, Rauschen, das in dem Bild aufgrund der Verwendung einer anderen Befestigung (ein Röhrchen, ein Film oder dergleichen) auftreten könnte, reduziert werden.
Der Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds durch Bestrahlen der wiederverfestigten biologischen Probe mit Röntgenstrahlen mit einer Energie von 4 bis 12 keV kann beispielsweise durch ein übliches Verfahren unter Verwendung eines Röntgenmikroskops durchgeführt werden. Eine Art des Röntgenmikroskops ist nicht eingeschränkt. Allerdings kann beispielsweise nano3DX (Rigaku Corporation) verwendet werden.
Eine Röntgenröhre und Synchrotronstrahlung sind als eine Röntgenquelle bekannt. Die Röntgenröhre ist ein Gerät, das Röntgenstrahlung durch Beschleunigen und Fokussieren thermischer Elektronen, die von einer Kathode (einem Filament) emittiert werden, mit einer Potentialdifferenz zwischen der Kathode und einer Anode, und Bewirken, dass die thermischen Elektronen mit der Anode (engl. target) kollidieren, erzeugt. Die durch die Röntgenröhre erzeugte Röntgenstrahlung beinhaltet kontinuierliche Röntgenstrahlung aufgrund von Bremsstrahlung und charakteristische Röntgenstrahlung (ein brillantes Linienspektrum zeigend), die bei Anregung und Übergang von extranuklearen Elektronen von Atomen, die die Anode ausmachen, involviert ist.
In einer Ausführungsform beinhaltet die hier beschriebene Röntgenstrahlung charakteristische Röntgenstrahlung, die sich von Anoden, wie etwa Ti, Cr, Cu und Ga, ableitet. Verwendung von Ti, Cr, Cu, Ga und dergleichen als Anodenmaterialien ermöglicht Verwendung einer empfindlichen niederenergetischen charakteristischen Röntgenstrahlung. In einer Ausführungsform beträgt die Energie der Röntgenstrahlung 5 bis 9 keV oder 5,41 bis 8,04 keV.
Die Synchrotronstrahlung ist eine Röntgenstrahlung, die in einem Synchrotron (einer Art von Kreisbeschleuniger) erzeugt wird, wenn der Orbit eines auf nahezu Lichtgeschwindigkeit beschleunigten Elektronenstrahls durch einen Magneten oder dergleichen geändert wird. Da der Durchmesser beispielsweise einige zehn Meter oder mehr erreichen kann, wird üblicherweise eine große Einrichtung zur Verwendung der Synchrotronstrahlung benötigt. In einer Ausführungsform ist die hier beschriebene Röntgenstrahlung keine Synchrotronstrahlung. In dieser Ausführungsform erfordert das hier beschriebene Verfahren keine große Einrichtung.
In einer Ausführungsform verwendet das wie hier beschriebene Verfahren keine anderen Kontrastmittel (beispielsweise Osmium, lod und Barium) als die oben erläuterten Kontrastmittel. In dieser Ausführungsform ist ein Kontrastbildgebungsschritt durch die anderen Kontrastmittel nicht nötig. Metallartefakte und Bildabänderungen, verursacht durch die Verwendung von anderen Kontrastmitteln, können reduziert werden (beispielsweise, weil Osmiumtetroxid, als ein Kontrastmittel verwendet, chemisch mit einer biologischen Komponente, die eine Doppelbindung aufweist, reagiert und bindet, werden ungesättigte Fettsäuren oder dergleichen, die viele Doppelbindungen enthalten, mitunter in einem Röntgen-CT-Bild betont).
In dieser Schrift ist eine Art der biologischen Probe nicht eingeschränkt, kann aber eine Zelle, ein Gewebe, ein Organ oder ein Organsystem eines Säugetiers einschließlich eines Menschen, eines Vogels, eines Reptils, eines Amphibiums, eines Insekts, eines Fischs, eines Benthostiers, einer Pflanze oder dergleichen sein. Beispiele für das Organ oder das Organsystem beinhalten eine Niere, eine Leber, ein Herz, eine Bauchspeicheldrüse, einen Verdauungstrakt, einen Magen, eine Lunge, ein Gehirn und einen Nerv, einen Knochen und einen Muskel, ein Blutgefäß, ein Sinnesorgan, ein Reproduktionsorgan und ein Organoid sowie ein bioabsorbierbares Polymergerüstmaterial, das für Gewebe- und Organregeneration verwendet werden kann.
Um ein Röntgen-CT-Bild mit einer räumlichen Auflösung von ungefähr einigen zehn Mikrometern oder weniger zu erhalten, müssen 10 % oder mehr einer Bestrahlungs-Röntgenstrahlung durch eine Probe transmittiert werden. Eine Röntgenabschwächungslänge von Wasser, das einen Röntgen-Absorptionskoeffizienten gleich dem einer biologischen Substanz aufweist, beträgt ungefähr 1 mm, wenn die Röntgenenergie 8 keV ist, was bedeutet, dass Röntgenstrahlung um nahezu eine Größenordnung abgeschwächt wird, wenn sie durch eine biologische Probe von 2 mm Dicke hindurchgeht. Daher kann die biologische Probe mit einer Röntgen-Transmissivität von 10 % oder höher beobachtet werden, wenn die Röntgenenergie 8 keV ist, falls die biologische Probe mit einer maximalen optischen Weglänge der Röntgenstrahlung von 2 mm oder weniger verarbeitet wird (beispielsweise eine Gestalt, deren maximale Breite in der Röntgentransmissionsrichtung 2 mm oder weniger beträgt, wie etwa eine Säule mit einem Durchmesser von ungefähr 2 mm oder weniger). Beispiele für eine biologische Probe mit einer maximalen optischen Weglänge für Röntgenstrahlung von 2 mm oder weniger beinhalten eine Gestalt mit einem Durchmesser von 2 mm oder weniger oder 1 mm oder weniger oder einer maximalen Breite von 2 mm oder 1 mm oder weniger (beispielsweise eine prismatische Gestalt). Wie hier beschrieben, kann eine Gestalt mit einer maximalen Breite von 2 mm eine prismatische Gestalt sein, beispielsweise ein dreieckiges Prisma, ein quadratisches Prisma (beispielsweise ein rechteckiges Parallelepiped), ein pentagonales Prisma oder ein hexagonales Prisma. Wie hier beschrieben, beinhaltet eine säulenförmige oder prismatische Gestalt eine im Wesentlichen säulenförmige oder im Wesentlichen prismatische Gestalt. Die durch das wie hier beschriebene Kontrastmittel verfestigte biologische Probe ist wegen Kompatibilität mit CT-Rekonstruktion bevorzugt eine Säule.
So wie hier beschrieben, bedeutet die „optische Weglänge“ der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds, unter der Annahme, dass ein Röntgenstrahlungsbrechungsindex der biologischen Probe 1 ist, die Länge eines Wegs, auf dem die Röntgenstrahlung durch die Probe hindurchgeht. In dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds wird eine große Anzahl von Röntgenprojektionsbildern aus verschiedenen Richtungen durch Rotieren der Probe erhalten. Eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in jenen Projektionsbildern ist als „die maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds“ definiert. Die maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung wird durch Messen einer maximalen Länge der biologischen Probe in einer Richtung senkrecht zu einer Probenrotationsachse zur Röntgen-CT-Datenbildgebungszeit erhalten. Beispielsweise kann ein Röntgenprojektionsbild in einer Richtung aufgenommen werden, in der eine Seite, die die maximale Länge aufweist, senkrecht zu einer Röntgenstrahlung-Bestrahlungsrichtung ist, und die maximale Länge der biologischen Probe in der Richtung senkrecht zu der Probenrotationsachse kann unter Verwendung von Bildanalysesoftware, wie etwa ImageJ, gemessen werden. Genauer gesagt, kann die maximale Länge der biologischen Probe in der Richtung senkrecht zu der Probenrotationsachse aus einem projizierten Bild (Sinogramm) in der Probenrotationsachsenrichtung, erstellt durch ImageJ oder dergleichen aus den Röntgen-CT-Projektionsbilddaten, gemessen werden.
So wie hier beschrieben, bedeutet die maximale Breite der Gestalt eine maximale Länge der Gestalt in der Richtung senkrecht zu der Probenrotationsachse zur Röntgen-CT-Datenbildgebungszeit. Die Untergrenze des Durchmessers oder die maximale Breite der biologischen Probe ist nicht beschränkt, beträgt aber bevorzugt 0,1 mm oder mehr, 0,3 mm oder mehr oder 0,5 mm oder mehr, aufgrund eines Verarbeitungstechnologieproblems.
Die Höhe der Säule oder der Gestalt, so wie hier beschrieben (die Länge in der Probenrotationsachsenrichtung zur Röntgen-CT-Datenbildgebungszeit), ist nicht beschränkt.
In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Erhalten eines Röntgen-CT-Bilds, wie hier beschrieben, ferner, vor dem Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, einen Schritt des Schneidens der biologischen Probe in eine Gestalt, in der die maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt. Das Kontrastmittel wird in die biologische Probe, erhalten durch den Schritt, penetriert und verfestigt, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern (in diesem Fall kann eine Form verwendet werden, um Verfestigung durchzuführen, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, so dass die biologische Probe nach der Verfestigung diese Gestalt aufweist). In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Erhalten eines Röntgen-CT-Bilds, wie hier beschrieben, vor dem Schritt von Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels, nach dem Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, einen Schritt des Schneidens der verfestigten biologischen Probe in eine Gestalt, in der die maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Röntgen-CT-Bilderfassungsschritt 2 mm oder weniger beträgt. Der Schritt des Schneidens der biologischen Probe kann unter Verwendung eines zylindrischen Rohrs, beispielsweise eines nahtlosen zylindrischen Rohrs, das einen Durchmesser von 2 mm oder weniger aufweist und eine scharfe Schneidkante aufweist, beispielsweise einer Biopsiestanze, durchgeführt werden. Der Schritt des Schneidens der biologischen Probe kann mit dem zylindrischen Rohr durchgeführt werden, das auf eine höhere Temperatur als den Schmelzpunkt des Kontrastmittels erwärmt ist. Folglich kann, da es möglich ist, die biologische Probe während Schmelzens des Kontrastmittels zu sammeln, die biologische Probe in einem Zustand gesammelt werden, in dem Risse weniger leicht auftreten und die Oberfläche der biologischen Probe glatt ist.
In einer Ausführungsform umfasst das hier beschriebene Verfahren ferner einen Schritt des Hinzufügens eines Markers zu der biologischen Probe und, in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds wird das Röntgen-CT-Bild durch Bewegen von Schnitten des Röntgen-CT-Bilds gemäß einer Bewegung eines projizierten Markerbilds, das aus dem Röntgen-Projektionsbild des Markers erhalten wird, korrigiert. Eine Beobachtung durch die Röntgen-CT dauert mitunter mehrere Stunden bis zu 48 Stunden oder mehrere Stunden bis zu 24 Stunden. Die Bildqualität ist mitunter durch Drift verschlechtert (Bewegung einer Beobachtungsprobe in Mikrometereinheiten während Bildgebung). In diesem Fall kann ein klareres Bild durch Durchführen der oben erläuterten Korrektur erhalten werden.
Wie hier beschrieben, bedeutet der Marker eine Markierung, die für die oben erläuterte Driftkorrektur verwendet wird. Als Marker kann ein Material, das eine hinreichend höhere Dichte als die biologische Probe aufweist, verwendet werden, beispielsweise Diamant, Graphit, Silicium, Titan und Aluminium.
Der Schritt des Hinzufügens eines Markers zu der biologischen Probe kann beispielsweise durchgeführt werden durch Dispergieren des Markers in dem Kontrastmittel durch Wiederverfestigen des Wachses, das wie hier beschrieben den Marker umfasst, (wenn beispielsweise Diamant als der Marker verwendet wird, kann der Marker durch Schneiden eines verfestigten Wachses mit einer Diamantdrahtsäge erhalten werden) nach Wärmeaufschmelzen des Wachses, das den Marker umfasst, zusammen mit der durch das Kontrastmittel verfestigten biologischen Probe, wie hier beschrieben. Die Markerkonzentration in dem Kontrastmittel ist wünschenswerterweise ein Grad zum Ergeben einer Situation, in der Driftkorrektur möglich ist (das heißt, eine Situation, in der ein oder mehrere Einzelpartikelmarker in wünschenswerten Positionen in einem durch Röntgenstrahlung erhaltenen Bild vorhanden und von anderen Markern unterscheidbar sind). Es wird ebenfalls bevorzugt, den Marker in einer Position nahe an der Probenrotationsachse auf der Oberfläche der biologischen Probe hinzuzufügen. Wenn der Marker in einer von der Achse fernen Position hinzugefügt wird, weicht der Marker mitunter von einem Sichtfeld gemäß Probenrotation während Röntgenbildgebung ab. In diesem Fall ist die Driftkorrektur schwierig.
Die Driftkorrektur kann durchgeführt werden durch Korrigieren des Röntgen-CT-Bilds durch Bewegen von Schnitten des Röntgenprojektionsbilds gemäß der Bewegung des Bilds des projizierten Markers, erhalten aus dem Röntgenprojektionsbild der biologischen Probe, zu der der Marker hinzugefügt wurde. Die Korrektur kann beispielsweise folgendermaßen gemäß der Beschreibung der Beispiele in dieser Anmeldungsschrift durchgeführt werden. Das heißt, dass das Röntgenprojektionsbild der biologischen Probe, zu der der Marker hinzugefügt wurde (eine große Anzahl von kontinuierlichen Bilddaten, erhalten durch sequentielles systematisches Ändern einer Probenrichtung während die Probe rotiert wird), durch Software, wie etwa das Programm ImageJ, ausgelesen wird und ein projiziertes Bild (Linogramm) in einer Richtung einer Spur des Markers senkrecht zu der Probenrotationsachse erstellt wird. Danach wird das projizierte Bild weiter verarbeitet, um eine einzige Spur zu extrahieren. Die Position dieser Linie, umgewandelt in einen numerischen Wert, ist der Driftbetrag in der Probenrotationsachsenrichtung. Danach kann das Röntgen-CT-Bild durch paralleles Hoch- und Runterbewegen der Schnitte des Röntgenprojektionsbilds der biologischen Probe korrigiert werden, um den Driftbetrag aufzuheben.
Eine Ausführungsform des Schritts des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, in dem Verfahren zum Erhalten eines Röntgen-CT-Bilds einer biologischen Probe der vorliegenden Erfindung ist in 8 gezeigt. Zuerst wird eine Probe aus einem Organismus herausgeschnitten. Danach wird chemische Fixierung durchgeführt, um die biologische Probe vor Abbau durch Autolyse oder Zerfall zu schützen. Die chemische Fixierung kann irgendeine aus Formalinfixierung (unter Verwendung von Formaldehyd, Paraformaldehyd, Glutaraldehyd oder dergleichen), Alkoholfixierung (unter Verwendung von Ethanol, Methanol, Aceton, Chloroform oder dergleichen), Pikrinsäurefixierung (unter Verwendung von Bouin-Lösung, alkoholischer Bouin-Lösung oder dergleichen), anderen Fixierungsverfahren (HOPE, PAXgene)und dergleichen sein. Danach wird ein Dehydrierungsprozess zum Entfernen von Feuchtigkeit (bevorzugt vollständig) aus einem biologischen Gewebe durch Ersetzen von Feuchtigkeit in dem Gewebe mit Alkohol oder dergleichen durchgeführt. Der Dehydrierungsprozess kann unter Verwendung von ethanolischen, acetonischen oder anderen Lösungen durchgeführt werden. Nach dem Dehydrierungsprozess wird ein Zwischenmittelbehandlungsprozess durchgeführt, der eine Behandlung zum Ersetzen von Alkohol oder dergleichen in dem biologischen Gewebe mit einem Zwischenmittel ist. Der Zwischenmittelbehandlungsprozess kann unter Verwendung von Xylol, Propylenoxid, Chloroform und dergleichen durchgeführt werden. Danach wird ein Kontrastmittelpenetrationsprozess durchgeführt. In dem Kontrastmittelpenetrationsprozess wird ein Kontrastmittel, das Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist, in die Probe penetriert. Danach kann ein Kontrastmittelüberschuss um die biologische Probe herum unter Verwendung einer Diamantdrahtsäge, einer Rasierklinge oder dergleichen entfernt werden. Ein Teil einer größeren biologischen Probe kann gesammelt werden durch ein nahtloses zylindrisches Rohr, das eine scharfe Schneidkante von 2 mm oder weniger in Durchmesser aufweist, wie etwa eine Biopsiestanze (das zylindrische Rohr kann in dem Sammelprozess auf eine höhere Temperatur als den Schmelzpunkt des Kontrastmittels erwärmt werden). Zum Zwecke der Driftkorrektur kann der biologischen Probe ein Zeigemarker zugegeben werden, beispielsweise Diamant, Graphit, Silicium, Titan und Aluminium. In dem Schritt des Hinzufügens des Markers zu der biologischen Probe kann, wenn beispielsweise Diamant verwendet wird, der Marker durch Schneiden eines verfestigten Kontrastmittels mit einer Diamantdrahtsäge erhalten werden. Danach kann Aufschmelz- und Wiederverfestigungsbehandlung durchgeführt werden. Durch dieses Entfernen des Kontrastmittelüberschusses um die biologische Probe herum, ist es möglich, letztlich die maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung auf 2 mm oder weniger zu reduzieren, die Probenoberfläche zu glätten und einen Probenhalter an einem Röntgenmikroskop zu befestigen.
In einer Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe, umfassend:

einen Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in eine biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, wobei das Kontrastmittel Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist;
einen Schritt von Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels;
einen Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds durch Bestrahlen der wiederverfestigten biologischen Probe mit einer Röntgenstrahlung mit einer Energie von 4 bis 12 keV, wobei die Gestalt der biologischen Probe eine Gestalt ist, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt;
einen Schritt des Spezifizierens einer Stelle, die weiter durch ein optisches Mikroskop und/oder ein Elektronenmikroskop beobachtet werden soll, auf der Grundlage des erfassten Röntgen-CT-Bilds und Aufschneiden und Freilegen der Stelle;
einen Schritt des Beobachtens der Stelle mit dem optischen Mikroskop und/oder dem Elektronenmikroskop; und
einen Schritt des Kombinierens des Röntgen-CT-Bilds und von Ergebnissen der Beobachtung durch das optische Mikroskop und/oder das Elektronenmikroskop zum Analysieren der biologischen Probe.

In diesem Analyseverfahren sind der Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, der Schritt von Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels, und der Schritt von Erfassen eines Röntgen-CT-Bilds jeweils so wie sie hier für die Schritte des Verfahrens des Erhaltens eines Röntgen-CT-Bilds erläutert wurden.
Der Schritt des Spezifizierens einer Stelle, die weiter durch ein optisches Mikroskop und/oder ein Elektronenmikroskop beobachtet werden soll, auf der Grundlage des erfassten Röntgen-CT-Bilds, und Aufschneiden und Freilegen der Stelle kann beispielsweise wie nachstehend erläutert durchgeführt werden. Zuerst wird, wie in 1D gezeigt ist, der Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds durchgeführt, in einem Zustand, in dem das Kontrastmittel aufgeschmolzen und wiederverfestigt ist und die Probe durch das Kontrastmittel an dem Probentisch befestigt ist. Danach wird in einer handelsüblichen Schneidvorrichtung (beispielsweise eine Diamantdrahtsäge von Musashino Denshi, Inc. oder WELL Diamond Wire Saws, Inc.) eine handelsübliche Einheit entfernt, wenn nötig, wird neuerlich ein Winkelmesser installiert, wie in 4 gezeigt ist, und der an dem Winkelmesser angebrachte Probentisch, an dem die biologische Probe befestigt ist, wird an eine Probentischeinheit eines Röntgenmikroskops übertragen. Die Probentischeinheit ist fähig zum Rotieren und Bewegen auf einer X-Y-Achse und ist wünschenswerterweise mit einem Kippmechanismus (ein Mechanismus zum Anpassen einer in 4A gezeigten Richtung) versehen, und der Winkelmesser ist fähig zur Bewegung in einem Bereich von 90° oder mehr, um es möglich zu machen, die biologische Probe zweckdienlich zu schneiden. Hier kann eine Markierung (Passermarke) zum Bestimmen eines Winkels in dem Probentisch vorgesehen sein, und der Probentisch kann gemäß der Passermarke in der Probentischeinheit installiert werden. Das Schneiden kann durchgeführt werden auf der Grundlage von Informationen (einem numerischen Wert), die durch Bildgebung mit Röntgen-CT erhalten wurden, während Prüfung durch ein mit einer Schneidmaschine ausgestatteten Mikroskop.
Wenn Beobachtung durch optische Mikroskopie nach dem Schneiden durch die Diamantdrahtsäge durchgeführt wird, wird die biologische Probe von dem Probentisch entfernt, mit einem Paraffinblock, der einen mit einem Mikrotom kompatiblen Standard aufweist, penetriert und verfestigt und durch das Mikrotom unter Verwendung einer Schneidfläche durch die Diamantdrahtsäge als eine Markierung zerschnitten, und eine Beobachtungsprobe für ein optisches Mikroskop wird gemäß einem üblichen Verfahren präpariert. Wenn andererseits Beobachtung durch Elektronenmikroskopie nach dem Schneiden durch die Diamantdrahtsäge durchgeführt wird, wird die biologische Probe von dem Probentisch entfernt, entparaffinisiert, in einem Epon-Harz-Block eingebettet, der einen mit dem Mikrotom kompatiblen Standard aufweist, und Ultradünnschnitt durch das Mikrotom wird unter Verwendung einer Schneidfläche durch die Diamantdrahtsäge als eine Markierung durchgeführt, und eine Beobachtungsprobe für ein Elektronenmikroskop wird gemäß dem üblichen Verfahren präpariert. Die Oberfläche der Probe kann, wenn nötig, durch lonenfräsen, einen Querschnittspolierer (Cross-section Polisher (TM)) oder dergleichen geglättet werden. Wenn sich als ein Ergebnis der Röntgen-CT-Beobachtung findet, dass das Schneiden durch die Diamantdrahtsäge unnötig ist, kann das Verfahren das Schneiden weglassen und mit einer Beobachtung durch ein optisches Mikroskop oder ein Elektronenmikroskop weitermachen.
In einer Ausführungsform kann der „Schritt des Penetrierens, in die biologische Probe, eines Kontrastmittels, Verfestigens des Kontrastmittels und Kontrastbildgebung der biologischen Probe“ durch dieselbe Prozedur wie der Schritt der Paraffineinbettung durchgeführt werden.
Da das Analyseverfahren die biologische Probe durch Kombinieren des Röntgen-CT-Bilds und des optischen Mikroskops und/oder des Elektronenmikroskops beobachten kann, können detailliertere Informationen erhalten werden, als wenn eine Beobachtung durch Röntgen-CT-Bild, optische Mikroskopie oder Elektronenmikroskopie allein durchgeführt wird. Zunächst kann, anders als das optische Mikroskop und das Elektronenmikroskop, in der Röntgen-CT die biologische Probe in einer Form näher an deren Originalzustand beobachtet werden, da eine Beobachtung in drei Dimensionen möglich ist und ein Testgegenstand zerstörungsfrei untersucht werden kann. Da andererseits die Röntgen-CT im Vergleich mit dem optischen Mikroskop und dem Elektronenmikroskop im Allgemeinen eine schlechtere räumliche Auflösung aufweist, kann, durch Spezifizieren einer zu beobachtenden Stelle auf der Grundlage eines Röntgen-CT-Bilds und Durchführen einer Beobachtung durch das optische Mikroskop oder das Elektronenmikroskop für die Stelle, die Stelle mehr im Detail beobachtet werden.
Das Verfahren zum Erhalten eines Röntgen-CT-Bilds einer biologischen Probe und das Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe, so wie hier beschrieben, können für eine Diagnose einer Krankheit oder einer Störung oder zur Unterstützung davon und für Zell- und/oder Gewebeforschungszwecke verwendet werden.
In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Kontrastmittel für Röntgen-CT einer biologischen Probe, wobei das Kontrastmittel, wie hier beschrieben, Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist. Details des Kontrastmittels sind wie hier im Hinblick auf das Verfahren des Erhaltens eines Röntgen-CT-Bilds einer biologischen Probe beschrieben.
Beispiele
<Beispiel 1: Präparation einer Probe>
Die Temperatur einer biologischen Probe, in einem Paraffinblock (ungefähr 35 × 25 × 5 mm) verfestigt, um ein Kontrastbild der biologischen Probe (ein Mäusenierenschnitt, chemisch fixiert durch 4%-iges Paraformaldehyd für 16 Stunden bei Raumtemperatur, dehydriert mit Ethanol und danach mit Paraffin penetriert, (ein Paraffinstift CT-PARA-ST hergestellt von Genostaff Co., Ltd.) mit einem Schmelzpunkt von 56 bis 58°C und einer Dichte von ungefähr 0,90 g/cm³ und verfestigt; 1A) zu liefern, wurde höher als der Schmelzpunkt des Paraffins zum Schmelzen des Paraffins eingestellt. Insbesondere wurde zuerst ein Teil einer Mäuseniere in dem Paraffinblock in eine zylindrische Gestalt mit einem Durchschnitt von 0,5 mm geschnitten, unter Verwendung einer dermatologischen Biopsiestanze (KAI Industries Co., Ltd., Wegwerf-Biopsiestanze 0,5 mm, BP-A05F) (1A und 1B). Diese zylindrische Probe wurde auf der oberen Fläche einer zylindrischen Metallstange mit einem Durchmesser von 3 mm platziert, die eine Standardprobenanbringungslehre eines Röntgenmikroskops ist (Rigaku Corporation, nano3DX) (1C). In diesem Zustand wurde überschüssiges Paraffin um die Probe herum aufgeschmolzen und durch Erwärmen eines unteren Teils der Metallstange mit einem Warmwasserbad (für eine Erwärmungsdauer von ungefähr 5 Minuten bei einer Wassertemperatur von ungefähr 90°C) abgeleitet. Gleichzeitig wurde eine Wegwerf-Pipettenspitze (Molecular Bioproducts, 0,1-10 µl, cat 4103) und Haar zum Anpassen der Orientierung der Probe verwendet, so dass eine Längsachse der Probe und eine Längsachse der Metallstange ungefähr parallel verliefen. Danach, wenn das Warmwasserbad entfernt war, wurde das Paraffin in der Probe zum Verfestigen auf Raumtemperatur abgekühlt, während Glätte der Oberfläche aufrechterhalten wurde, und die Probe wurde auf der Metallstange stehend in einem nahezu nackten Zustand befestigt (1D). Die biologische Probe, versehen mit Kontrastbildgebung durch das Paraffin, wurde mit dem oben erläuterten Verfahren präpariert.
<Beispiel 2: Hinzufügen eines Markers zu der biologischen Probe>
Der folgende Schritt wurde zu dem Präparationsverfahren für die biologische Probe, versehen mit der Kontrastbildgebung durch das Paraffin, beschrieben in Beispiel 1, hinzugefügt. Diamantdrahtsägespäne (mutmaßlich Diamantpartikel) wurden als ein Marker verwendet. Wenn insbesondere ein Teil des Probenblocks auf der Metallstange mit 3 mm Durchmesser platziert wurde und das Warmwasserbad in Beispiel 1 durchgeführt wurde, wurde ungefähr 1 mg eines Paraffinstücks, umfassend den Marker (ein schwarzer Anteil einer Schneidfläche des Paraffinblocks, geschnitten durch eine Diamantdrahtsäge (Musashino Denshi, Inc.) und durch ein Messer abrasiert), zusätzlich auf der Metallstange platziert und der Marker wurde durch thermisches Schmelzen in dem Paraffin dispergiert. Folglich wurde der Marker erfolgreich zu einer Position nahe der Probenrotationsachse hinzugefügt (2). Wenn der Marker an einer von der Probenrotationsachse fernen Position hinzugefügt wird, weicht der Marker mitunter von einem Sichtfeld gemäß Probenrotation während Bildgebung ab. In diesem Fall ist die Driftkorrektur schwierig.
<Beispiel 3: Driftkorrektur>
Driftkorrektur wurde durch Verarbeiten von Röntgenprojektionsbildern der biologischen Probe, versehen mit Kontrastbildgebung durch das Paraffin, (ungefähr einige hundert oder einige tausend kontinuierliche Bilddaten wurden bildgebend durch sequentielles systematisches Ändern einer Probenrichtung mit Rotation um die Probenrotationsachse herum verarbeitet) gemäß der folgenden Prozedur durchgeführt. Ein in 2 in Beispiel 2 gezeigtes Bild ist eines der oben erläuterten Röntgenprojektionsbilder.

1) Eine Serie von Röntgenprojektionsbildern wurde durch das Programm ImageJ (Freeware) ausgelesen, um ein projiziertes Bild (Linogramm) einer Spur eines Markers in einer Richtung senkrecht zu der Probenrotationsachse zu erstellen (3A).
2) Das projizierte Bild wurde weiterverarbeitet, um eine Spur zu extrahieren ( 3B). Hier wurde eine Linie, verbunden von einem Ende zu einem Ende, vorhanden in Positionen von ungefähr 1/4 vom oberen Rand des in 3A gezeigten Bilds, verwendet (ein Pfeil in 3A). Die Position dieser Linie, umgewandelt in einen numerischen Wert, ist ein Betrag der Hoch-Runter-Drift. Besonders große Verlagerung wurde an zwei Stellen gesehen, die in 3B durch Sterne angedeutet sind.
3) Schnitte des Projektionsbilds wurden parallel hoch- und runterbewegt, um den Driftbetrag auszulöschen.

Wenn CT-Bilder vor und nach der Driftkorrektur verglichen werden, sind radiales Rauschen und dergleichen, die um ein Objekt herum erscheinen, deutlich reduziert ( 3C).
<Beispiel 4: Ausschneiden durch eine Schneidmaschine eines Teils von Interesse, das durch eine Röntgenmikroskopiebeobachtung beobachtet wurde>
Die Standardlehre der handelsüblichen Diamantdrahtsäge (Musashino Denshi, Inc.) wurde entfernt und ein Winkelmesser wurde neu installiert, wie in 4 gezeigt ist. Eine Probentischeinheit eines Röntgenmikroskops wurde an dem Winkelmesser angebracht.

1) Für eine in Epon-Harz eingebettete Probe einer mit Os kontrastgebildeten Mäuseniere (eine in 5A in Beispiel 5 gezeigte Probe) wurde Harz unter Verwendung einer Diamantdrahtsäge getrimmt. Als Ergebnis wurde der Kontrast eines CT-Bilds leicht verbessert (4B).
2) Für eine Probe (Mäuseniere), versehen mit Kontrastbildgebung durch Paraffin, wurde eine Diamantdrahtsäge zum Schneiden einer übermäßig langen zylindrischen Probe in einem Paraffinblock in angemessene Längen geschnitten (4C). Es besteht ein hohes Risiko einer Beschädigung der Probe, wenn die Probe mit einem Rasiermesser in Stücke geschnitten wird.

<Beispiel 5: Vergleich mit dem Stand der Technik>
Ein Nierenkörperchen einer Mäuseniere wurde als eine Probe zum Vergleichen eines Beobachtungsbeispiels im Stand der Technik, eingefärbt mit Osmiumtetroxid, und einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, in der Paraffin als ein niederdichtes verfestigtes Kontrastmittel verwendet wurde, verwendet. Die Beobachtung wurde unter Verwendung eines Röntgenmikroskops nano3DX (Rigaku Corporation) (CCD-Detektor) und einer charakteristischen Röntgenstrahlung von 8,0 keV von einer Cu-Anode durchgeführt. Unter Verwendung einer Drehanode ist in nano3DX eingesetzte hochbrillante Röntgenstrahlung effektiv beim Reduzieren einer Gesamtbelichtungszeit, die zur Datenaufzeichnung benötigt wird (beispielsweise zum Reduzieren der Zeit auf ungefähr 24 Stunden oder weniger). Reduzieren des Einflusses von Lichtquellendrift mit einem in nano3DX eingesetzten Nahbildgebungsverfahren ist effektiv beim Erhöhen der räumlichen Auflösung (beispielsweise zum Durchführen der Beobachtung mit räumlicher Submikronauflösung).
In einem Beobachtungsbeispiel im Stand der Technik wurden Mäusenierenschnitte chemisch mit 2,4% Glutaraldehyd bei 4°C für 2 Stunden fixiert, mit 1% Osmiumtetroxid bei 4°C über Nacht eingefärbt, mit Aceton dehydriert und danach in Epon-Harz eingebettet, um einen Harzblock zu bilden. Ein Spitzenanteil des Harzblocks, der die Nierenschnitte umfasst, wurde im Wesentlichen isotrop um 0,7-0,8 mm beschnitten, und der beschnittene Anteil wurde mit einem Röntgenmikroskop beobachtet (4B, oben). Eine Probe wurde an einem Röntgenmikroskop nano3DX (Rigaku Corporation) (CCD-Detektor) angebracht und Röntgenprojektionsbilddaten wurden unter Bedingungen einer Cu-Anode (40kV/30mA), L0270-bin2-XD5 (0,53 µm/Voxel) und Schrittscan (1600 Belichtungen von jeweils 30 s) erhalten (benötigte Zeit: 13,8 Stunden). Die Projektionsbilddaten wurden mittels eines gemeinen Rauschreduktionsfilters (Median 1 und Gauß 1) verarbeitet und danach wurde CT-Rekonstruktion durch Software auf der Grundlage eines gemeinen FBP-Algorithmus durchgeführt.
Probenpräparation im Falle, in dem Paraffin als ein niederdichtes verfestigtes Kontrastmittel verwendet wurde, wurde gemäß Beispiel 1 durchgeführt. Eine Probe wurde an einem Röntgenmikroskop nano3DX (Rigaku Corporation) (CCD-Detektor) angebracht und Röntgenprojektionsbilddaten wurden unter Bedingungen einer Cu-Anode (40kV/30mA), L0270-bin2-XD2 (0,54 µm/Voxel), Schrittscan (1700 Belichtungen von jeweils 40 s) erhalten (benötigte Zeit: 19,4 Stunden). Nachdem die Projektionsbilddaten mittels eines gemeinen Rauschreduktionsfilters (Median 1 und Gauß 1) verarbeitet wurden, wurde CT-Rekonstruktion durch nano3DX-Standardsoftware auf der Grundlage eines gemeinen FBP-Algorithmus durchgeführt.
Ergebnisse sind in 5 gezeigt. 5A zeigt ein Ergebnis von Kontrastbildgebung mit Epon-Harz-eingebettetem Os. Da Röntgenabsorption durch die Probe groß ist, wurde kein hinreichender Kontrast durch Belichtung für 13,8 Stunden erhalten und die räumliche Auflösung war im Wesentlichen ungefähr 10 µm. 5B zeigt ein Ergebnis von Kontrastbildgebung durch Paraffin. Hinreichender Kontrast wurde erfolgreich nach Belichtung für 19,4 Stunden erhalten und die räumliche Auflösung war im Wesentlichen 0,9 µm. Eine Mikrostruktur im Innern des Nierenkörperchens wurde ebenfalls erfolgreich herausgearbeitet. 5B zeigt ein Ergebnis in dem Fall, in dem Driftkorrektur durch einen Marker durchgeführt wurde. Die räumliche Auflösung wurde anhand einer Luminanzwertlinie einer Substanzgrenze in einem CT-Schnittbild beispielsweise gemäß einem in der folgenden Literatur beschriebenen Verfahren gemessen: Kunishima et al. Plant Methods (2020) 16:7.
<Beispiel 6: Sammeln einer Probe unter Verwendung eines wärmebehandelten Instruments>
Eine dermatologische Biopsiestanze (KAI Industries Co., Ltd. eine Wegwerf-Biopsiestanze 1,0 mm, BPP-10F), eingetaucht in heißes Wasser von 90°C für 20 Sekunden und wärmebehandelt, und die Biopsiestanze nicht-wärmebehandelt, wurden zum Sammeln von Paraffin aus einem Paraffinblock verwendet (McCormick Scientific Institute, PARA-PLASTPLUS 502004, Schmelzpunkt 56°C). Danach wurde die gesammelte Probe einer Nahaufnahme unterzogen, um eine optische Fotographie zu erhalten und mit einem optischen Mikroskop beobachtet (ein Zoom-Stereomikroskop (mit LED-Beleuchtung) CP745, As One Corporation).
Ergebnisse sind in 6 gezeigt (6A: eine optische Fotographie in dem Fall, in dem Paraffin unter Verwendung der wärmebehandelten Biopsiestanze gewonnen wurde. 6B: eine Optisches-Mikroskop-Fotographie in dem Fall, in dem Paraffin unter Verwendung der wärmebehandelten Biopsiestanze gewonnen wurde. 6C: eine optische Fotographie in dem Fall, in dem Paraffin unter Verwendung der nicht-wärmebehandelten Biopsiestanze gewonnen wurde. 6D: eine Optisches-Mikroskop-Fotographie in dem Fall, in dem Paraffin unter Verwendung der nicht-wärmebehandelten Biopsiestanze gewonnen wurde). Wie in 6 gezeigt ist, verglichen damit, als die Wärmebehandlung durchgeführt wurde, trat ein Riss im Zentrum des Paraffins auf und eine Kontur des Paraffins war unklar, wenn die Wärmebehandlung nicht durchgeführt wurde. Dies zeigt an, dass die biologische Probe in einem Zustand, in dem ein Riss weniger leicht auftritt und die Oberfläche glatt ist, gesammelt werden kann, da die biologische Probe gesammelt werden kann, während das Kontrastmittel unter Verwendung der wärmebehandelten Biopsiestanze aufgelöst wird.
< Beispiel 7: Test unter Verwendung eines Polyimidröhrchens>
Da eine Röntgenstrahlung-Abschwächungslänge von Polyimid bei 8 keV 1,2 mm beträgt und ein Wert nahe 1,0 ist, was eine Röntgenstrahlung-Abschwächungslänge von Wasser (im Wesentlichen als einem Organismus äquivalent angesehen) unter denselben Bedingungen ist, wurde angenommen, dass ein Kontrastbildgebungseffekt von Wachs unter Verwendung von Polyimid anstelle einer biologischen Probe ausgewertet werden kann. Daher wurde der Kontrastbildgebungseffekt des Wachses durch das folgende Verfahren evaluiert.

In Tabelle 1 beschriebene Wachse, die durch ein Warmwasserbad bei ungefähr 90°C thermisch aufgeschmolzen wurden, wurden in ein Polyimidröhrchen mit einem Innendurchmesser von 0,5 mm (ein Polyimidröhrchen PIT-S, hergestellt von Furukawa Electric Co., Ltd. (ein Innendurchmesser von 0,50 mm, Dicke 0,06 mm)) durch Kapillarwirkung auf eine Länge von ungefähr 5 bis 10 mm eingesaugt und zum Verfestigen auf Raumtemperatur abgekühlt. Das mit den Wachsen gefüllte Polyimidröhrchen wurde an den Spitzenanteil eines Probentischs für ein Röntgenmikroskop gebondet, mittels eines Klebstoffs (Aron Alpha by TOAGOSEI CO., LTD.) (7A). Diesmal waren eine Probenrotationsachse und eine Längsachse des Polyimidröhrchens im Wesentlichen ausgerichtet (angepasst, nicht aus einem Sichtfeld des Röntgenmikroskops in einer Richtung senkrecht zur Probenrotationsachse hervorzustehen). Der Probentisch wurde an einem Röntgenmikroskop nano3DX (Rigaku Corporation) (CCD-Detektor) angebracht und Röntgenprojektionsbilddaten wurden unter Bedingungen einer Cu-Anode (40kV/30mA), L0270-bin4-XD2 (1,07 µm/Voxel) und Schrittscan (700 Belichtungen von jeweils 10 s) erhalten (benötigte Zeit: 2,2 Stunden). Nachdem die Projektionsbilddaten mittels eines gemeinen Rauschreduktionsfilters (Median 1 und Gauß 1) verarbeitet wurden, wurde CT-Rekonstruktion durch nano3DX-Standardsoftware auf der Grundlage eines gemeinen FBP-Algorithmus durchgeführt. Da orthogonale CT-Schnitte aus drei Richtungen als eine Berichtsdatei im TIFF-Format ausgegeben wurden, wurde dieser Bericht in die freie Software ImageJ eingegeben und eine Bildanalyse wurde durchgeführt (7B). Ein quadratischer 15 × 15-Pixelanteil wurde optional in jeder von einer Wachsregion und einer Polyimidregion entnommen und ein durchschnittlicher Luminanzwert und eine Standardabweichung in dem Anteil wurden gemessen. Ein Wert, erhalten durch Dividieren der Differenz zwischen durchschnittlichen Luminanzwerten der zwei Regionen durch eine Standardabweichung davon (die Quadratwurzel von (einer Summe von Varianzen der zwei Regionen)), wurde als ein SN-Verhältnis definiert (Referenzliteratur: KUNISHIMA N. et al., PLANT METHODS 16:7 (2020)). Diese Messung wurde an fünf Stellen durchgeführt und ein Durchschnittswert und ein Vertrauenswert von 95 % davon wurden berechnet (Tabelle 1). Die Messstellen wurden aus den drei Richtungen in dem Bericht ausgewählt, die nicht vorverurteilt werden sollen. Ergebnisse von Durchführung ähnlicher Messungen für Polyethylenglycol (Erhalten durch Trocknen einer wässrigen Lösung von 50% PEG3350, hergestellt von Hampton Research Corp.) als ein Negativbeispiel und für die in Beispiel 5B beschriebene Mäusenierenprobe als ein Beispiel für eine tatsächliche biologische Probe, sind zusätzlich gezeigt. In der Mäusenierenprobe wurde ein SN-Verhältnis zwischen Wachs (Paraffin) und einem biologischen Gewebe (Tubuli) gemessen. Das SN-Verhältnis betrug ungefähr 18 für alle fünf Arten von handelsüblichem Paraffin, ungefähr 2,5 für Polyethylenglycol und ungefähr 8 für die biologische Probe. Auf der Grundlage der Ergebnisse sind Wachse, die SN-Verhältnisse von 8 oder höher zeigen, im Vergleich mit Polyimid durch das oben erläuterte Verfahren als Wachse, die einen Kontrastbildgebungseffekt aufweisen, qualifiziert. Diese Ergebnisse zeigen an, dass es möglich ist auszuwerten, unter Verwendung des Polyimidröhrchens anstelle der biologischen Probe, ob eine Kandidatensubstanz eine Auswirkung auf ein Kontrastmittel hat. [Tabelle 1]

Probe	Schmelzpunkt	SN-Verhältnis
Wachs 1^a)-Polyimid	56-58°C	18,1±1,1
Wachs 2^b)-Polyimid	56°C	18,8±0,9
Wachs 3^c)-Polyimid	56-58°C	18,3±1,2
Wachs 4^d)-Polyimid	58-60°C	17,6±1,6
Wachs 5^e)-Polyimid	62-64°C	18,8±1,3
Polyethylenglycol-Polyimid	50-60°C	2,5±0,4
Wachs 1-Mäuseniere	56-58°C	8,0±1,1
Anmerkung: a) Paraffin, abgeleitet von einem Paraffinstift CT-PARA-ST, hergestellt von Genostaff Co., Ltd. b) Paraffin, abgeleitet von Paraplast Plus 502004, hergestellt von McCormick Scientific Institute. c) Paraffin, abgeleitet von 24198-1, hergestellt von Polysciences, Inc. d) Paraffin, abgeleitet von Parabet 60, hergestellt von Muto Pure Chemicals Co. Ltd. e) Paraffin, abgeleitet von 24202-1, hergestellt von Polysciences, Inc.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

MICHAEL D. BENTLEY et al., THE ANATOMICAL RECORD 290:277-283 [0004]

Claims

Verfahren zum Erhalten eines Röntgen-CT-Bilds einer biologischen Probe, wobei das Verfahren umfasst: einen Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, wobei das Kontrastmittel Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist; einen Schritt von Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels; und einen Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds durch Bestrahlen der wiederverfestigten biologischen Probe mit einer Röntgenstrahlung mit einer Energie von 4 bis 12 keV, wobei die Gestalt der biologischen Probe eine Gestalt ist, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Aufschmelzens und Wiederverfestigens des Kontrastmittels in einem Zustand, in dem die biologische Probe auf einem Probentisch platziert ist, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend, vor dem Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, einen Schritt des Schneidens der biologischen Probe in eine Gestalt, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, ferner umfassend, nach dem Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in die biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, einen Schritt des Schneidens der verfestigten biologischen Probe in eine Gestalt, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Schritt des Schneidens der biologischen Probe mit einem zylindrischen Rohr durchgeführt wird, das auf eine höhere Temperatur als den Schmelzpunkt des Kontrastmittels erwärmt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ferner umfassend einen Schritt des Hinzufügens eines Markers zu der biologischen Probe, wobei in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds, das Röntgen-CT-Bild durch Bewegen von Schnitten des Röntgen-CT-Bilds gemäß einer Bewegung eines projizierten Markerbilds, das aus einem Röntgen-Projektionsbild des Markers erhalten wird, korrigiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Kontrastmittel eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger bei 25°C aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Wachs festes Paraffin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Röntgen-CT-Bild klar mit einer Voxelgröße von 5 µm oder weniger erhalten wird.
Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe, umfassend: einen Schritt des Penetrierens eines Kontrastmittels in eine biologische Probe und Verfestigens des Kontrastmittels, um ein Kontrastbild der biologischen Probe zu liefern, wobei das Kontrastmittel Wachs umfasst, das eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist; einen Schritt von Aufschmelzen und Wiederverfestigen des verfestigten Kontrastmittels; einen Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds durch Bestrahlen der wiederverfestigten biologischen Probe mit einer Röntgenstrahlung mit einer Energie von 4 bis 12 keV, um ein Röntgen-CT-Bild zu erfassen, wobei die Gestalt der biologischen Probe eine Gestalt ist, bei der eine maximale optische Weglänge der Röntgenstrahlung in der biologischen Probe in dem Schritt des Erfassens eines Röntgen-CT-Bilds 2 mm oder weniger beträgt; einen Schritt des Spezifizierens einer Stelle, die weiter durch ein optisches Mikroskop und/oder ein Elektronenmikroskop beobachtet werden soll, auf der Grundlage des erfassten Röntgen-CT-Bilds und Aufschneiden und Freilegen der Stelle; einen Schritt des Beobachtens der Stelle mit dem optischen Mikroskop und/oder dem Elektronenmikroskop; und einen Schritt des Kombinierens des Röntgen-CT-Bilds und von Ergebnissen der Beobachtung durch das optische Mikroskop und/oder das Elektronenmikroskop zum Analysieren der biologischen Probe.
Kontrastmittel für Röntgen-CT einer biologischen Probe, wobei das Kontrastmittel Wachs umfasst und eine Dichte von 0,95 g/cm³ oder weniger aufweist, in dessen verfestigtem Zustand nach Penetration in die biologische Probe, und einen Schmelzpunkt von 40°C bis 80°C aufweist.