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VERWANDTE ANMELDUNGEN
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Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen
US-Anmeldung Nr. 62/624,624 , eingereicht am 31. Januar 2018. Der Inhalt der vorläufigen Anmeldung wird hiermit in seiner Gesamtheit für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen.
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HINTERGRUND
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Natürliche Killerzellen (NK) sind zytotoxische Lymphozyten, die einen Hauptbestandteil des angeborenen Immunsystems darstellen. NK-Zellen, die im Allgemeinen etwa 10 bis 15 % der zirkulierenden Lymphozyten ausmachen, binden und töten Zielzellen, einschließlich virusinfizierter Zellen und vieler maligner Zellen, unspezifisch in Bezug auf Antigene und ohne vorherige Immunsensibilisierung. Herberman et al., Science 214:24 (1981). Das Abtöten von Zielzellen erfolgt durch Induzieren der Zelllyse. Zu diesem Zweck verwendete NK-Zellen werden aus der Periphere-Blutlymphozyten(„PBL“)-Fraktion des Blutes des Subjekts isoliert, in Zellkultur expandiert, um eine ausreichende Anzahl von Zellen zu erhalten, und dann wieder in das Subjekt infundiert. Es wurde gezeigt, dass NK-Zellen sowohl in der Ex-vivo-Therapie als auch in der In-vivo-Behandlung eine gewisse Wirkung haben. Eine solche Therapie wird jedoch durch die Tatsache erschwert, dass nicht alle NK-Zellen zytolytisch sind und die Therapie spezifisch für den behandelten Patienten ist.
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NK-92
®-Zellen wurden zuvor als therapeutisches Mittel bei der Behandlung bestimmter Krebsarten bewertet. Im Gegensatz zu NK-Zellen ist NK-92
® eine zytolytische Krebszelllinie, die im Blut eines Subjekts mit einem Non-Hodgkin-Lymphom entdeckt und anschließend ex vivo immortalisiert wurde. NK-92
®-Zellen fehlen die wichtigsten inhibitorischen Rezeptoren, die von normalen NK-Zellen präsentiert werden, sie behalten jedoch die Mehrzahl der aktivierenden Rezeptoren bei. NK-92
®-Zellen greifen jedoch weder normale Zellen an, noch lösen sie beim Menschen eine inakzeptable Immunabstoßungsreaktion aus. Die Charakterisierung der NK-92
®-Zelllinie ist z. B. in der
WO 1998/49268 und im
US-Patent Nr. 8,034,332 offenbart.
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Die schlechte Effizienz der Zellernte bleibt jedoch eine bedeutende Herausforderung für die Herstellung ausreichender NK-92®-Zellen für verschiedene therapeutische Anwendungen. Herkömmliche Ernteverfahren umfassen typischerweise das Sammeln von Zellen aus Zellkulturmedium und das Waschen der Zellen in Puffern wie PBS. Die mehrfachen Waschungen in PBS verursachen Zellverlust und eine signifikante Verringerung der Lebensfähigkeit. In einigen Fällen werden Zellen in einem Medium wie etwa X-VIVO™10 gewaschen; dies ist auch nicht ideal, weil die endgültige Produktformulierung zwei zusätzliche Schritte einschließlich Zentrifugation zum Entfernen von X-VIVO™10 erfordert. Diese Schritte verlängern die Verarbeitungszeit und verursachen aufgrund der erforderlichen wiederholten Zentrifugationsschritte Zellstress und Zellverlust.
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KURZDARSTELLUNG
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Es werden hier Verfahren zum Ernten von NK-92®-Zellen bereitgestellt, umfassend das Sammeln von NK-92®-Zellen aus einer Zellkultur und das Waschen der gesammelten NK-92®-Zellen durch einen Puffer, der 1-5 % Albumin umfasst. Die NK-92®-Zellen können diejenigen sein, die modifiziert sind, um ein oder mehrere Transgene zu exprimieren, beispielsweise können die NK-92®-Zellen modifiziert werden, um ein Zytokin, einen Fc-Rezeptor, einen chimären Antigenrezeptor oder eine Kombination davon zu exprimieren.
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Gegebenenfalls umfasst das Sammeln von NK-92®-Zellen das Zentrifugieren der NK-92®-Zellen in der Zellkultur. Gegebenenfalls umfasst das Verfahren ferner das Platzieren der gewaschenen NK-92®-Zellen in einen Infusionsbeutel. Gegebenenfalls wird das Waschen durchgeführt, indem die Zellen zentrifugiert und dann die Zellen im Waschpuffer resuspendiert werden. Gegebenenfalls wird das Waschen mindestens dreimal durchgeführt, z. B. vier- bis sechsmal. Gegebenenfalls gewinnt das Verfahren mindestens 80 % der NK-92®-Zellen zurück. Gegebenenfalls beträgt die Lebensfähigkeit der geernteten Zellen mindestens 90 %.
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Gegebenenfalls weisen die geernteten NK-92®-Zellen im Wesentlichen die gleiche Zytotoxizität und/oder Lebensfähigkeit auf Kontroll-NK-92®-Zellen, die nicht geerntet wurden. Gegebenenfalls weisen die geernteten NK-92®-Zellen im Wesentlichen die gleiche Zytotoxizität und/oder Lebensfähigkeit auf wie die NK-92®-Zellen vor der Ernte. Gegebenenfalls weisen die geernteten NK-92®-Zellen eine Zytotoxizität von 80-100 % gegen K562-Zellen auf. Gegebenenfalls enthält der Puffer 2-5 % Albumin, z. B. 3-5 % Albumin oder 5 % Albumin. Gegebenenfalls fehlt dem Puffer Zucker. Gegebenenfalls fehlt dem Puffer Dextran. Gegebenenfalls erfolgt die Zentrifugation durch kontinuierliche Zentrifugation. Gegebenenfalls ist das Albumin humanes Plasmaalbumin oder humanes Serumalbumin. Gegebenenfalls exprimieren die NK-92®-Zellen ein Zytokin, einen Fc-Rezeptor, einen chimären Antigenrezeptor oder eine Kombination davon.
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Die vorstehende allgemeine Beschreibung und die folgende detaillierte Beschreibung sind beispielhaft und erklärend und sollen eine weitere Erläuterung der Offenbarung bereitstellen. Andere Objekte, Vorteile und neue Merkmale werden dem Fachmann leicht ersichtlich sein.
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Figurenliste
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Die Objekte, Merkmale und Vorteile werden unter Bezugnahme auf die folgende Offenbarung leichter erkannt, wenn sie in Verbindung mit den beigefügten Zeichnungen betrachtet werden.
- 1 ist eine schematische Darstellung eines beispielhaften Prozesses zum Ernten von NK-92®-Zellen.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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Es werden hier Verfahren zum Ernten von NK-92®-Zellen unter Verwendung eines Puffers bereitgestellt, der 1-5 % Albumin, gegebenenfalls 5 % Humanalbumin enthält. Nach dem Waschen können die Zellen direkt für therapeutische Anwendungen wie Infusionen verwendet werden, ohne dass weitere Verarbeitungsschritte oder Formulierungen erforderlich sind. Dies reduziert vorteilhafterweise die Verarbeitungszeiten und minimiert den Zellverlust und den Zellstress.
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Nach dem Lesen dieser Beschreibung wird dem Fachmann klar, wie verschiedene alternative Ausführungsformen und alternative Anwendungen zu implementieren sind. Es werden hier jedoch nicht alle Ausführungsformen beschrieben. Es versteht sich, dass die hier dargestellten Ausführungsformen nur als Beispiel und nicht als Einschränkung dargestellt werden. Daher sollte diese detaillierte Beschreibung verschiedener alternativer Ausführungsformen nicht so ausgelegt werden, dass sie den Umfang oder die Breite der hier dargelegten Offenbarung einschränkt. Es versteht sich, dass die nachstehend beschriebenen Aspekte nicht auf bestimmte Zusammensetzungen, Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen oder Verwendungen davon beschränkt sind, da diese natürlich variieren können.
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TERMINOLOGIE
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Sofern nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie allgemein von einem Durchschnittsfachmann verstanden werden.
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In dieser Beschreibung und in den folgenden Ansprüchen wird auf eine Reihe von Begriffen Bezug genommen, die so definiert werden sollen, dass sie die folgenden Bedeutungen haben:
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Die hier verwendete Terminologie dient nur zum Zweck der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen und soll nicht einschränkend sein. Wie hier verwendet, sollen die Singularformen „ein“, „einer“, „eine“, „eines“ und „der“, „die“, „das“ auch die Pluralformen einschließen, sofern der Kontext nicht eindeutig etwas anderes anzeigt. So umfasst beispielsweise die Bezugnahme auf „eine natürliche Killerzelle“ eine Vielzahl von natürlichen Killerzellen.
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Alle numerischen Bezeichnungen, z. B. pH, Temperatur, Zeit, Konzentration, Mengen und Molekulargewicht, einschließlich Bereiche, sind Näherungswerte, die erforderlichenfalls in Schritten von 0,1 oder 1,0 variiert (+) oder (-) werden. Es versteht sich, dass, obwohl nicht immer ausdrücklich angegeben, allen numerischen Bezeichnungen der Begriff „ungefähr“ vorangestellt werden kann.
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Wie der Fachmann für alle Zwecke, insbesondere im Hinblick auf die Bereitstellung einer schriftlichen Beschreibung, versteht, decken alle hierin offenbarten Bereiche auch alle möglichen Unterbereiche und Kombinationen von Unterbereichen davon ab. Jeder aufgelistete Bereich kann leicht als ausreichend beschreibend und befähigend erkannt werden, damit derselbe Bereich in mindestens gleiche Hälften, Drittel, Viertel, Fünftel, Zehntel usw. aufgegliedert wird. Als nicht einschränkendes Beispiel kann jeder hier dargestellte Bereich leicht in ein unteres Drittel, ein mittleres Drittel und ein oberes Drittel usw. aufgegliedert werden. Wie ein Fachmann ebenfalls verstehen wird, schließen alle Ausdrücke wie „bis“, „mindestens“, „größer als“, „kleiner als“ und dergleichen die angegebene Zahl ein und beziehen sich auf Bereiche, die anschließend wie oben beschrieben in Unterbereiche aufgegliedert werden können. Schließlich beinhaltet, wie der Fachmann verstehen wird, ein Bereich jedes einzelne Element. So bezieht sich beispielsweise eine Gruppe mit 1-3 Zellen auf Gruppen mit 1, 2 oder 3 Zellen. Genauso bezieht sich eine Gruppe mit 1-5 Zellen auf Gruppen mit 1, 2, 3, 4 oder 5 Zellen und so weiter.
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Es versteht sich auch, dass, obwohl nicht immer ausdrücklich angegeben, die hier beschriebenen Reagenzien nur beispielhaft sind und dass Äquivalente davon im Stand der Technik bekannt sind.
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„Gegebenenfalls“ bedeutet, dass das nachfolgend beschriebene Ereignis oder der nachfolgend beschriebene Umstand auftreten kann oder nicht auftreten kann und dass die Beschreibung Fälle enthält, in denen das Ereignis oder der Umstand eintritt, und Fälle, in denen dies nicht der Fall ist.
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Der Begriff „umfassend“ soll bedeuten, dass die Zusammensetzungen und Verfahren die angegebenen Elemente enthalten, andere jedoch nicht ausschließen. „Im Wesentlichen bestehend aus“ bedeutet bei Verwendung zur Definition von Zusammensetzungen und Verfahren, dass andere Elemente ausgeschlossen sind, die für die Kombination von wesentlicher Bedeutung sind. Zum Beispiel würde eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen aus den hier definierten Elementen besteht, andere Elemente nicht ausschließen, die die grundlegende(n) und neuartige(n) Eigenschaft(en) der Ansprüche nicht wesentlich beeinflussen. „Bestehend aus“ bedeutet, dass andere Inhaltsstoffe in mehr als Spurenmengen und wesentliche Verfahrensschritte ausgeschlossen sind. Ausführungsformen, die durch jeden dieser Übergangsbegriffe definiert sind, liegen im Umfang der Offenbarung.
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Wie hier verwendet, sind „natürliche Killerzellen (NK)“ Zellen des Immunsystems, die Zielzellen in Abwesenheit eines spezifischen antigenen Stimulus und ohne Einschränkung gemäß der Klasse des Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex - MHC) abtöten. Zielzellen können Krebs- oder Tumorzellen sein. NK-Zellen sind durch das Vorhandensein von CD56 und die Abwesenheit von CD3-Oberflächenmarkern gekennzeichnet.
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Für die Zwecke dieser Erfindung und sofern nicht anders angegeben, soll sich der Begriff „NK-92
®“ oder „NK-92
®“ sowohl auf die ursprünglichen NK-92
®-Zelllinien als auch auf NK-92
®-Zelllinien, Klone von NK-92
®-Zellen und NK-92
®-Zellen, die modifiziert wurden (z. B. durch Einführung exogener Gene), beziehen. NK-92
®-Zellen und beispielhafte und nicht einschränkende Modifikationen davon sind in den
US-Patenten Nr. 7,618,817 ;
8,034,332 ;
8,313,943 ;
9,181,322 ;
9,150,636 ; und in der veröffentlichten
US-Anmeldung Nr. 10/008,955 beschrieben, die hier alle in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen sind und Wildtyp-NK-92
®, NK-92
®-CD16, NK-92
®-CD16-γ, NK-92
®-CD16-ζ, NK-92
®-CD16(F176V), NK-92
®MI und NK-92
®CI beinhalten. NK-92
®-Zellen sind dem Durchschnittsfachmann bekannt, für den solche Zellen von NantKwest, Inc., leicht erhältlich sind.
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Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „aNK-Zellen“ auf die parentalen NK-92®-Zellen.
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Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „haNK-Zellen“ auf NK-92®-Zellen, die zur Expression des Fc-Rezeptors erzeugt wurden.
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Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „taNK-Zellen“ auf NK-92®-Zellen, die so erzeugt wurden, dass sie einen chimären Antigenrezeptor (CAR) mit Affinität für ein krebsspezifisches Antigen, ein krebsassoziiertes Antigen oder ein tumorspezifisches Antigen exprimieren. In einigen Ausführungsformen ist das tumorspezifische Antigen HER-2, z. B. humanes HER-2, und diese NK-92®-Zellen werden als HER-2-taNK-Zellen bezeichnet.
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Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „t-haNK-Zellen“ auf NK-92®-Zellen, die so erzeugt wurden, dass sie einen chimären Antigenrezeptor (CAR) mit Affinität für ein krebsspezifisches Antigen, ein krebsassoziiertes Antigen oder ein tumorspezifisches Antigen exprimieren und einen Fc-Rezeptor exprimieren. In einigen Ausführungsformen ist das tumorspezifische Antigen CD19, z. B. humanes CD19, und diese NK-92®-Zellen werden als CD19-t-haNK-Zellen bezeichnet. In einigen Ausführungsformen ist das tumorspezifische Antigen PD-L1. In einigen Ausführungsformen exprimieren die t-haNK-Zellen einen chimären Antigenrezeptor PD-L1-CAR, der eine Sequenz von SEQ ID NO:5 aufweist. In einigen Ausführungsformen exprimieren die t-haNK-Zellen einen chimären Antigenrezeptor CD19-CAR, der eine Sequenz von SEQ ID NO:6 aufweist. In einigen Ausführungsformen exprimieren die t-haNK-Zellen einen chimären Antigenrezeptor HER2-CAR, der eine Sequenz von SEQ ID NO:7 aufweist.
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Der Begriff „Fc-Rezeptor“ bezieht sich auf ein Protein, das auf der Oberfläche bestimmter Zellen (z. B. natürlicher Killerzellen) gefunden wird und zu den Schutzfunktionen der Immunzellen beiträgt, indem es an einen Teil eines Antikörpers bindet, der als Fc-Region bekannt ist. Die Bindung der Fc-Region eines Antikörpers an den Fc-Rezeptor (FcR) einer Zelle stimuliert die phagozytische oder zytotoxische Aktivität einer Zelle durch antikörpervermittelte Phagozytose oder antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (antibodydependent cell-mediated cytotoxicity - ADCC). FcR werden basierend auf der Art des Antikörpers klassifiziert, den sie erkennen. Beispielsweise binden Fc-Gamma-Rezeptoren (FcγR) an die IgG-Klasse von Antikörpern. FcyRIII-A (auch als CD16 bezeichnet) ist ein Fc-Rezeptor, der mit niedriger Affinität an IgG-Antikörper bindet und ADCC aktiviert. FcyRIII-A werden typischerweise auf NK-Zellen gefunden. NK-92®-Zellen exprimieren kein FcγRIII-A.
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Der Begriff „chimärer Antigenrezeptor“ (CAR), wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine extrazelluläre Antigenbindungsdomäne, die an eine intrazelluläre Signaldomäne fusioniert ist. CAR können in T-Zellen oder NK-Zellen exprimiert werden, um die Zytotoxizität zu erhöhen. Im Allgemeinen ist die extrazelluläre Antigenbindungsdomäne ein scFv, das spezifisch für ein Antigen ist, das auf einer Zelle von Interesse gefunden wird. Eine CAR-exprimierende NK-92®-Zelle zielt auf Zellen ab, die bestimmte Antigene auf der Zelloberfläche exprimieren, basierend auf der Spezifität der scFv-Domäne. Die scFv-Domäne kann so erzeugt werden, dass sie jedes Antigen erkennt, einschließlich tumorspezifischer Antigene.
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Die Begriffe „Polynukleotid“, „Nukleinsäure“ und „Oligonukleotid“ werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf eine polymere Form von Nukleotiden beliebiger Länge, entweder Desoxyribonukleotide oder Ribonukleotide oder Analoga davon. Polynukleotide können jede beliebige dreidimensionale Struktur haben und jede bekannte oder unbekannte Funktion erfüllen. Die Folgenden sind nicht einschränkende Beispiele für Polynukleotide: ein Gen oder Genfragment (zum Beispiel eine Sonde, ein Primer, ein EST- oder ein SAGE-Tag), Exons, Introns, Messenger-RNA (mRNA), Transfer-RNA, ribosomale RNA, Ribozyme, cDNA, rekombinante Polynukleotide, verzweigte Polynukleotide, Plasmide, Vektoren, isolierte DNA beliebiger Sequenz, isolierte RNA beliebiger Sequenz, Nukleinsäuresonden und Primer. Ein Polynukleotid kann modifizierte Nukleotide wie methylierte Nukleotide und Nukleotidanaloga umfassen. Falls vorhanden, können Modifikationen der Nukleotidstruktur vor oder nach dem Zusammenbau des Polynukleotids vorgenommen werden. Die Sequenz von Nukleotiden kann durch Nicht-Nukleotidkomponenten unterbrochen werden. Ein Polynukleotid kann nach der Polymerisation weiter modifiziert werden, wie etwa durch Konjugation mit einer Markierungskomponente. Der Begriff bezieht sich auch sowohl auf doppelsträngige als auch auf einzelsträngige Moleküle. Sofern nicht anders angegeben oder erforderlich, deckt ein Polynukleotid sowohl die doppelsträngige Form als auch jede von zwei komplementären einzelsträngigen Formen ab, von denen bekannt ist oder vorhergesagt wird, dass sie die doppelsträngige Form bilden.
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Der Begriff „Expression“ bezieht sich auf die Produktion eines Genprodukts. Der Ausdruck „transient“ bedeutet, wenn er auf Expression bezogen wird, dass ein Polynukleotid nicht in das Genom der Zelle eingebaut ist.
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Der Begriff „Zytokin“ oder „Zytokine“ bezieht sich auf die allgemeine Klasse von biologischen Molekülen, die Zellen des Immunsystems beeinflussen. Beispielhafte Zytokine beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Interferone und Interleukine (IL), insbesondere IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 und IL-21. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Zytokin IL-2.
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Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Vektor“ auf eine nichtchromosomale Nukleinsäure, die ein intaktes Replikon umfasst, so dass der Vektor repliziert werden kann, wenn er in eine permissive Zelle eingebracht wird, beispielsweise durch einen Transformationsprozess. Ein Vektor kann sich in einem Zelltyp wie etwa Bakterien replizieren, hat jedoch eine begrenzte Fähigkeit, sich in einer anderen Zelle wie Säugetierzellen zu replizieren. Vektoren können viral oder nichtviral sein. Beispielhafte nichtvirale Vektoren zur Abgabe von Nukleinsäure beinhalten nackte DNA; mit kationischen Lipiden komplexierte DNA allein oder in Kombination mit kationischen Polymeren; anionische und kationische Liposomen; DNA-Protein-Komplexe und -Partikel umfassend DNA, kondensiert mit kationischen Polymeren wie etwa heterogenem Polylysin, Oligopeptiden definierter Länge und Polyethylenimin, in einigen Fällen in Liposomen enthalten; und die Verwendung von ternären Komplexen, die ein Virus und Polylysin-DNA umfassen.
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Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „im Wesentlichen derselbe/dieselbe/dasselbe“, der austauschbar mit dem Begriff „vergleichbar“ oder „ähnlich“ verwendet wird, wenn er sich auf Zytotoxizität, Lebensfähigkeit oder Zellrückgewinnung bezieht, darauf, dass zwei Messungen von Zytotoxizität, Lebensfähigkeit oder Zellrückgewinnung sich um nicht mehr als 15 %, um nicht mehr als 10 %, um nicht mehr als 8 % oder um nicht mehr als 5 % voneinander unterscheiden.
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Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „zytotoxisch“, wenn er zur Beschreibung der Aktivität von Effektorzellen wie NK-Zellen verwendet wird, auf das Abtöten von Zielzellen durch einen beliebigen aus verschiedenen biologischen, biochemischen oder biophysikalischen Mechanismen.
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Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Ernten“ auf das Separieren und Sammeln von Zellen aus ihrem Kulturmedium und das Vorbereiten der Zellen für therapeutische Anwendungen. Das Ernten umfasst das Waschen von Zellen mit einem geeigneten Puffer, z. B. 5 % Albumin, und gegebenenfalls das Resuspendieren von Zellen in einem Puffer, der für beabsichtigte Anwendungen geeignet ist, z. B. zur Infusion.
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Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Rückgewinnung“ auf die relative Menge an Zellen, die nach Abschluss des Ernteprozesses erhalten wurden, verglichen mit der Anzahl der Zellen, die in den Ernteprozess eintreten. In einigen Fällen wird die Rückgewinnung als Prozentsatz ausgedrückt, wenn beispielsweise eine kontinuierliche Zentrifugation als Mittel zum Ernten von Zellen verwendet wird, kann die Rückgewinnung als folgende Gleichung ausgedrückt werden:
- Rückgewinnung = die Menge an Zellen, die aus kontinuierlicher Zentrifugation rückgewonnen wurden/Menge an Zellen, die in die kontinuierliche Zentrifugation eingetreten sind.
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Zur Vereinfachung für den Leser können in der Beschreibung Titel oder Untertitel verwendet werden, die den Umfang der vorliegenden Offenbarung nicht beeinflussen sollen. Darüber hinaus werden einige in dieser Spezifikation verwendete Begriffe im Folgenden genauer definiert.
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ALBUMIN
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Albumin ist eine Proteinergänzung in Zellkulturen, die verwendet wird, um nicht veresterte Fettsäuren in und von Zellen abzugeben; Albumin kann aus humanen oder nichthumanen Quellen stammen, beispielsweise aus Menschen oder Rindern. Humanalbumin kann aus humanem Serum („humanes Serumalbumin“) oder humanem Plasma („humanes Plasmaalbumin“) stammen oder in vitro synthetisiert werden, z. B. durch Expression eines Gens (z. B. Sequenz von NM_000477), das das humane Albumin codiert. Bisher wurde Albumin, insbesondere vom Menschen stammendes Albumin, nicht zum Waschen von Zellen während der Ernte verwendet, da es im Vergleich zu anderen Waschpuffern wie PBS oder Wachstumsmedien wie X VIVO™10 relativ kostspielig ist. Humanalbumin ist beispielsweise von CSL Behring im Handel erhältlich.
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VERFAHREN ZUR ERNTE VON NK-92®-ZELLEN
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Das Züchten von NK-92®-Zellen beginnt typischerweise damit, dass gefrorene NK-92®-Zellen aufgetaut und in einem Behälter mit einem geeigneten Medium angesetzt werden. Die Zellen können sich erholen, bis die Lebensfähigkeit der Zellen einen bestimmten Wert erreicht, beispielsweise mehr als 85 %. Die Zellen werden dann in einem Gefäß, z. B. einer G-Rex-Flasche, auf eine gewünschte Zelldichte expandiert, beispielsweise eine Dichte, die gleich oder kleiner als 1,2×106 Zellen/ml ist. Die Zellkultur aus dem Gefäß wird dann gesammelt und zum Inokulieren eines oder mehrerer größerer Kulturgefäße verwendet. Zu den üblicherweise verwendeten größeren Kulturgefäßen gehören Xuri-Beutel, die ein Volumen von mindestens 2 Litern, mindestens 10 Litern oder mindestens 50 Litern haben können. Die Übertragung von Zellen zwischen den verschiedenen Gefäßen kann unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Mitteln durchgeführt werden, z. B. unter Verwendung einer Pumpe oder einer Schwerkraftzufuhr, die unter sterilen Bedingungen durchgeführt wird.
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Die so hergestellten NK-92®-Zellen können durch Zentrifugation geerntet werden. Gegebenenfalls wird die Zentrifugation in einer kontinuierlichen Zentrifuge durchgeführt, die aseptisch an dem Kulturgefäß angebracht ist, z. B. dem Xuri-Beutel, das sich am Ende des Expansionsprozesses befindet. Kontinuierliche Zentrifugation bezieht sich auf eine Zentrifugation von einer Dauer von 45-60 Minuten, abhängig vom Zellkulturvolumen, um die Zellen zu konzentrieren, gefolgt von einer Zellwäsche von mindestens 1 Minute, mindestens 3 Minuten oder mindestens 5 Minuten. Der Kulturüberstand wird dann entfernt, und die Zellen werden in einem Waschpuffer resuspendiert, der 1-5 % Albumin umfasst, z. B. 2-5 %, 3-5 % oder 4-5 %, vorzugsweise 5 % Albumin. Gegebenenfalls kann das Waschen mindestens zweimal, mindestens dreimal, z. B. 4- bis 6-mal, wiederholt werden. Nach dem letzten Waschen kann das Gemisch, das die Zellen und den Waschpuffer enthält, erneut zentrifugiert werden, und die Zellen werden gesammelt und für therapeutische Anwendungen verarbeitet.
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Zusätzlich zu Albumin kann der Waschpuffer auch 1-10 mg/ml Natrium, z. B. 3-5 mg/ml Natrium oder 3,2 mg/ml Natrium, umfassen. Gegebenenfalls fehlt dem Waschpuffer Zucker, z. B. Dextran. Gegebenenfalls fehlt dem Waschpuffer Dextran-40.
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Das Ernteverfahren kann 80 bis 100 % der NK-92®-Zellen, z. B. 85-99 % oder 89-99 % der NK-92®-Zellen, zurückgewinnen. Die Ernteausbeute kann unter Verwendung eines Standard-Zellzählverfahrens bewertet werden, z. B. eines Trypanblau-Farbstoffausschlussverfahrens oder eines Nucleocounter-NC-200-Verfahrens. Gegebenenfalls kann das Ernteverfahren unter Verwendung der hier offenbarten Verfahren im Wesentlichen die gleiche Menge an NK-92®-Zellen zurückgewinnen wie das Ernteverfahren unter Verwendung von X-VIVO™10-Medium.
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NK-92®-Zellen, die unter Verwendung von 1-5 % Albumin, wie hier offenbart, geerntet wurden, können im Wesentlichen die gleiche Zytotoxizität wie Kontroll-NK-92®-Zellen aufweisen, die unter den gleichen Bedingungen gezüchtet, aber nicht geerntet wurden. Die Kontrollzellen können beispielsweise die NK-92®-Zellen aus der G-Rex-Flasche sein. Die NK-92®-Zellen, die unter Verwendung des hier offenbarten Verfahrens geerntet wurden, können auch im Wesentlichen die gleiche Zytotoxizität aufweisen wie NK-92®-Zellen, die in X-VIVO™10-Medium geerntet wurden. Die NK-92®-Zellen, die unter Verwendung der hier offenbarten Verfahren geerntet wurden, können im Wesentlichen die gleiche Zytotoxizität wie die NK-92®-Zellen vor der Ernte aufweisen. Siehe Tabelle 2.
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Die Zytotoxizität von NK-92
®-Zellen kann sich in ihrer direkten Zytotoxizität oder ADCC widerspiegeln. Die direkte Zytotoxizität der hergestellten NK-92
®-Zellen, die Fähigkeit, aberrante Zellen wie viral infizierte und tumorigene Zellen anzuvisieren und abzutöten, kann durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren bewertet werden, beispielsweise einen
51Cr-Freisetzungstest (Gong et al. (1994) unter Verwendung der von Klingemann et al. (Cancer Immunol. Immunother. 33:395-397 (1991)) beschriebenen Vorgehensweise. Kurz gesagt werden
51Crmarkierte Zielzellen mit NK-92
®-Zellen gemischt und lysiert. Der Prozentsatz der spezifischen Zytotoxizität kann basierend auf der Menge an freigesetztem
51Cr berechnet werden. Siehe Patentveröffentlichung Nr.
US20020068044 .
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Alternativ kann die direkte Zytotoxizität der hergestellten NK-92®-Zellen auch unter Verwendung eines Calcein-Freisetzungsassays bewertet werden. Beispielsweise können die NK-92®-Zellen (im Assay als Effektor bezeichnet) in bestimmten Verhältnissen mit den mit Calcein beladenen Zielzellen (im Assay als Ziel bezeichnet) gemischt werden. Nach einer Inkubationszeit über einen bestimmten Zeitraum kann das aus den Zielzellen freigesetzte Calcein beispielsweise mit einem Fluoreszenzplattenleser bewertet werden. Das Verhältnis des im Assay verwendeten Effektors und Ziels kann variieren, gegebenenfalls kann das Effektor:Ziel-Verhältnis 20:1, 15:1, 10:1, 8:1 oder 5:1 betragen; vorzugsweise beträgt das Effektor:Ziel-Verhältnis 10:1. Die Zielzellen können beliebige Zellen sein, die MHC-Moleküle exprimieren, die von den NK-92®-Zellen erkannt werden können, beispielsweise K562-Zellen oder BT-474-Zellen. Die Werte der Zytotoxizität von NK-92®-Zellen können in Abhängigkeit von der Art der verwendeten Zielzellen sowie dem Effektor:Ziel-Verhältnis variieren. Im Allgemeinen können die NK-92®-Zellen, die unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, eine Zytotoxizität von 60-100 % aufweisen, z. B. 70-100 % oder 80-100 %. In einigen Fällen können aNK-Zellen eine Zytotoxizität von 80-100 % aufweisen, wenn in einem Calcein-Freisetzungsassay K562-Zellen als Zielzellen verwendet werden, z. B. 82-100 %, 85-100 %, 87-100 %, 88-100 % oder 89-100 %.
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Gegebenenfalls ist die Zytotoxizität von NK-92®-Zellen, z. B. von haNK-Zellen, die bewertet wird, die antikörperabhängige Zytotoxizität (ADCC). Die Verfahren zum Messen der ADCC von NK-92®-Zellen ähneln den oben beschriebenen Verfahren zum Messen der direkten Zytotoxizität, außer dass ein Antikörper hinzugefügt wird, der die Zielzelle erkennen kann. Der Fc-Rezeptor der NK-Zellen erkennt die zellgebundenen Antikörper und löst eine zytolytische Reaktion und das Abtöten der Zielzellen aus. In einem veranschaulichenden Beispiel können die haNK-Zellen mit Rituxan (einem Antikörper) und Ramos (Zielzellen) inkubiert werden, und das Abtöten der Ramos-Zellen kann durch die Freisetzung interner Komponenten der Zielzellen gemessen werden, z. B. 51Cr oder Calcein, wie oben beschrieben.
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NK-92®-ZELLEN
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Die NK-92®-Zellen, die unter Verwendung der hier offenbarten Verfahren kultiviert werden können, umfassen aNK-Zellen, haNK-Zellen, taNK- und t-haNK-Zellen, die nachstehend näher beschrieben werden.
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Die NK-92
®-Zelllinie ist eine einzigartige Zelllinie, von der entdeckt wurde, dass sie sich in Gegenwart von Interleukin 2 (IL-2) vermehrt. Gong et al., Leukemia 8:652-658 (1994). Diese Zellen weisen gegen verschiedene Krebsarten eine hohe zytolytische Aktivität auf. Die NK-92
®-Zelllinie ist eine homogene kanzeröse NK-Zell-Population mit einer breiten Antitumor-Zytotoxizität mit vorhersagbarer Ausbeute nach Expansion. Klinische Studien der Phase I haben ihr Sicherheitsprofil bestätigt. NK-92
® wurde im Blut eines Subjekts mit einem Non-Hodgkin-Lymphom entdeckt und anschließend ex vivo immortalisiert. NK-92
®-Zellen werden von NK-Zellen abgeleitet, ihnen fehlen aber die wichtigsten inhibitorischen Rezeptoren, die von normalen NK-Zellen präsentiert werden, während sie jedoch die Mehrzahl der aktivierenden Rezeptoren beibehalten. NK-92
®-Zellen greifen jedoch weder normale Zellen an, noch lösen sie beim Menschen eine inakzeptable Immunabstoßungsreaktion aus. Die Charakterisierung der NK-92
®-Zelllinie ist beispielsweise in der
WO 1998/49268 und in der
US-Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 2002-0068044 offenbart.
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Es wurde gefunden, dass die NK-92®-Zelllinie die Oberflächenmarker CD56hell, CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45 und CD54 aufweist. Des Weiteren zeigt sie die Marker CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23 und CD34 nicht an. Das Wachstum von NK-92®-Zellen in Kultur hängt von der Gegenwart von rekombinantem Interleukin 2 (rIL-2) ab, wobei eine Dosis von nur 1 IE/ml ausreicht, um die Proliferation aufrechtzuerhalten. IL-7 und IL-12 unterstützen das Langzeitwachstum nicht, ebenso wenig wie andere getestete Zytokine, einschließlich IL-1α, IL-6, Tumornekrosefaktor α, Interferon α und Interferon γ. NK-92® weist selbst bei einem niedrigen Effektor:Ziel(E:T)-Verhältnis von 1:1 eine hohe Zytotoxizität auf. Gong et al., siehe oben. NK-92®-Zellen sind bei der American Type Culture Collection (ATCC) unter der Bezeichnung CRL-2407 hinterlegt.
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Bisher haben Studien an endogenen NK-Zellen gezeigt, dass IL-2 (1000 IE/ml) für die Aktivierung von NK-Zellen während des Versands kritisch ist, die Zellen jedoch nicht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid gehalten werden müssen. Koepsell et al., Transfusion 53:398-403 (2013).
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Modifizierte NK-92
®-Zellen sind bekannt und beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, diejenigen, die beispielsweise in den
US-Patenten Nr. 7,618,817, 8,034,332 und 8,313,943 ,
US-Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 2013/0040386 beschrieben sind, die alle hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen sind, wie Wildtyp NK-92
®, NK-92
®-CD16, NK-92
®-CD16-γ, NK-92
®-CD16-ζ, NK-92
®-CD16(F157V), NK-92
®mi und NK-92
®ci.
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Obwohl NK-92®-Zellen fast alle aktivierenden Rezeptoren und zytolytischen Wege, die mit NK-Zellen assoziiert sind, behalten, exprimieren sie auf ihren Zelloberflächen kein CD16. CD16 ist ein Fc-Rezeptor, der den Fc-Anteil eines Antikörpers erkennt und daran bindet, um NK-Zellen für die antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) zu aktivieren. Aufgrund des Fehlens von CD16-Rezeptoren können NK-92®-Zellen Zielzellen nicht über den ADCC-Mechanismus lysieren und als solche die Antitumorwirkung endogener oder exogener Antikörper (d. h. Rituximab und Herceptin) nicht potenzieren.
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Studien zu endogenen NK-Zellen haben gezeigt, dass IL-2 (1000 IE/ml) für die Aktivierung von NK-Zellen während des Versands kritisch ist, die Zellen jedoch nicht bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid gehalten werden müssen. Koepsell et al., Transfusion 53:398-403 (2013). Endogene NK-Zellen unterscheiden sich jedoch erheblich von NK-92®-Zellen, was zum großen Teil auf ihre unterschiedliche Herkunft zurückzuführen ist: NK-92® ist eine Krebs-abgeleitete Zelllinie, während endogene NK-Zellen von einem Spender (oder dem Patienten) geerntet und zur Infusion in einen Patienten verarbeitet werden. Endogene NK-Zellpräparate sind heterogene Zellpopulationen, während NK-92®-Zellen eine homogene, klonale Zelllinie sind. NK-92®-Zellen vermehren sich leicht in Kultur, während die Zytotoxizität erhalten bleibt, wohingegen endogene NK-Zellen dies nicht tun. Außerdem aggregiert eine endogene heterogene Population von NK-Zellen nicht mit hoher Dichte. Darüber hinaus exprimieren endogene NK-Zellen Fc-Rezeptoren, einschließlich CD-16-Rezeptoren, die nicht von NK-92®-Zellen exprimiert werden.
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Fc-Rezeptoren
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Fc-Rezeptoren binden an den Fc-Anteil von Antikörpern. Es sind mehrere Fc-Rezeptoren bekannt, die sich nach ihrem bevorzugten Liganden, ihrer Affinität, Expression und Wirkung nach ihrer Bindung an den Antikörper unterscheiden.
Tabelle 1. Beispielhafte Fc-Rezeptoren
| Rezeptorname | Wichtigste Antikörpe rliganden | Affinität zum Liganden | Zellverteilung | Wirkung nach Bindung an den Antikörper |
| FcyRI (CD64) | IgG1 und IgG3 | Hoch (Kd ~10-9 M) | | Phagozytose |
| | Zellaktivierung |
| Makrophagen | |
| Neutrophile | Aktivierung des respiratorische n Bursts |
| Eosinophile |
| Dendritische |
| Zellen | Induktion der Abtötung von Mikroben |
| FCγRIIA (CD32) | IgG | Niedrig (Kd > 10-7 M) | Makrophagen Neutrophile Eosinophile Thrombozyten Langerhans-Zellen | Phagozytose Degranulation (Eosinophile) |
| FcγRIIB1 (CD32) | IgG | Niedrig (Kd > 10-7 M) | B-Zellen Mastzellen | Keine Phagozytose Hemmung der Zell aktivität |
| FcγRIIB2 (CD32) | IgG | Niedrig (Kd > 10-7 M) | Makrophagen Neutrophile Eosinophile | Phagozytose Hemmung der Zellaktivität |
| FcγRIIIA (CD16a) | IgG | Niedrig (Kd > 10-6 M) | NK-Zellen Makrophagen (bestimmte Gewebe) | Induktion einer antikörperabhän gigen zellvermittelte n Zytotoxizität (ADCC) Induktion der Zytokin-Freisetzung durch Makrophagen |
| FcyRIIIB (CD16b) | IgG | Niedrig (Kd > 10-6 M) | Eosinophile Makrophagen Neutrophile Mastzellen Follikuläre dendritische Zellen | Induktion der Abtötung von Mikroben |
| FceRI | IgE | Hoch (Kd ~10-10 M) | Mastzellen Eosinophile Basophile Langerhans-Zellen Monozyten | Degranulation Phagozytose |
| FceRII (CD23) | IgE | Niedrig (Kd > 10-7 M) | B-Zellen Eosinophile Langerhans-Zellen | Mögliches Adhäsionsmolekü 1 IgE-Transport durch das humane Darmepithel Positiver Rückkopplungsme chanismus zur Verbesserung der allergischen Sensibilisierun g (B-Zellen) |
| FcaRI (CD89) | IgA | Niedrig (Kd > 10-6 M) | Monozyten Makrophagen Neutrophile Eosinophile | Phagozytose Induktion der Abtötung von Mikroben |
| Fcα/µR | IgA und IgM | Hoch für IgM, mittel für IgA | B-Zellen Mesangiumzel len Makrophagen | Endozytose Induktion der Abtötung von Mikroben |
| FcRn | IgG | Monozyten | Monozyten Makrophagen Dendritische Zellen Epithelzelle n Endothelzell en Hepatozyten | Überträgt IgG von einer Mutter über die Plazenta auf den Fetus Überträgt über Milch IgG von einer Mutter auf das Kind Schützt IgG vor Abbau |
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In einigen Ausführungsformen werden NK-92®-Zellen modifiziert, um ein Fc-Rezeptorprotein auf der Zelloberfläche zu exprimieren.
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In einigen Ausführungsformen ist der Fc-Rezeptor CD16. Eine repräsentative Aminosäuresequenz, die CD16 codiert, ist in SEQ ID NO:2 gezeigt. Eine repräsentative Polynukleotidsequenz, die CD16 codiert, ist in SEQ ID NO:1 gezeigt. In einigen Ausführungsformen werden NK-92®-Zellen durch Einführen eines Polynukleotids modifiziert, das ein CD16-Polypeptid codiert, das mindestens ungefähr 70 % Polynukleotidsequenzidentität mit einer Polynukleotidsequenz aufweist, die ein natürlich vorkommendes CD16 voller Länge beinhaltend ein Signalpeptid codiert, das ein Phenylalanin an Position 176 des CD16 voller Länge aufweist. In einigen Ausführungsformen weist ein Polynukleotid, das ein CD16-Polypeptid codiert, mindestens ungefähr 70 % Polynukleotidsequenzidentität mit einer Polynukleotidsequenz auf, die ein natürlich vorkommendes CD16 voller Länge beinhaltend das Signalpeptid codiert, das ein Valin an Position 176 aufweist.
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Homologe Polynukleotidsequenzen schließen diejenigen ein, die Polypeptidsequenzen codieren, die für Varianten von CD16 codieren. In einigen Ausführungsformen können homologe CD16-Polynukleotide eine Länge von etwa 150 bis etwa 700, etwa 750 oder etwa 800 Polynukleotiden aufweisen, obwohl CD16-Varianten mit mehr als 700 bis 800 Polynukleotiden im Umfang der Offenbarung liegen.
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In anderen Beispielen werden cDNA-Sequenzen mit Polymorphismen, die die CD16-Aminosäuresequenzen verändern, verwendet, um die NK-92®-Zellen zu modifizieren, wie zum Beispiel die allelischen Variationen zwischen Individuen, die genetische Polymorphismen in CD16-Genen aufweisen. In anderen Beispielen werden CD16-Gene von anderen Spezies, die eine Polynukleotidsequenz aufweisen, die sich von der Sequenz von humanem CD16 unterscheidet, verwendet, um NK-92®-Zellen zu modifizieren.
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In Beispielen werden variante Polypeptide unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren wie etwa Oligonukleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scannen und PCR-Mutagenese hergestellt. Ortsgerichtete Mutagenese (Carter, 1986; Zoller und Smith, 1987), Kassettenmutagenese, Restriktionsselektionsmutagenese (Wells et al., 1985) oder andere bekannte Techniken können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um CD16-Varianten herzustellen (Ausubel, 2002; Sambrook und Russell, 2001).
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Konservative Substitutionen in der Aminosäuresequenz des humanen CD16-Polypeptids, bei denen eine Aminosäure einer Klasse durch eine andere Aminosäure derselben Klasse ersetzt wird, fallen in den Umfang der offenbarten CD16-Varianten, solange die Substitution die Aktivität des Polypeptids nicht wesentlich verändert. Konservative Substitutionen sind dem Fachmann bekannt. Nichtkonservative Substitutionen, die (1) die Struktur der Polypeptid-Hauptkette wie etwa ein β-Faltblatt- oder eine α-helikale Konformation, (2) die Ladung, (3) die Hydrophobizität oder (4) die Masse der Seitenkette der Zielstelle beeinflussen, können die Funktion oder die immunologische Identität des CD16-Polypeptids modifizieren. Nichtkonservative Substitutionen beinhalten den Austausch eines Mitglieds einer dieser Klassen gegen eine andere Klasse. Substitutionen können in konservative Substitutionsstellen oder bevorzugter in nichtkonservierte Stellen eingeführt werden.
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In einigen Ausführungsformen sind CD16-Polypeptidvarianten mindestens 200 Aminosäuren lang und weisen mindestens 70 % Aminosäuresequenzidentität oder mindestens 80 % oder mindestens 90 % Identität zu SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 auf. In einigen Ausführungsformen sind CD16-Polypeptidvarianten mindestens 225 Aminosäuren lang und weisen mindestens 70 % Aminosäuresequenzidentität oder mindestens 80 % oder mindestens 90 % Identität zu SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 auf.
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In einigen Ausführungsformen kann eine Nukleinsäure, die ein CD16-Polypeptid codiert, ein CD16-Fusionsprotein codieren. Ein CD16-Fusionspolypeptid beinhaltet einen beliebigen Anteil von CD16 oder einen gesamten CD16, der mit einem Nicht-CD16-Polypeptid fusioniert ist. In einigen Ausführungsformen kann ein Fusionspolypeptid erzeugt werden, in dem eine heterologe Polypeptidsequenz an den C-Terminus von CD16 fusioniert ist oder intern im CD16 positioniert ist. Typischerweise können bis zu etwa 30 % der zytoplasmatischen Domäne von CD16 ersetzt werden. Eine solche Modifikation kann die Expression verbessern oder die Zytotoxizität erhöhen (z. B. ADCC-Reaktionsfähigkeit). In anderen Beispielen ersetzen chimäre Proteine, wie etwa Domänen von anderen lymphozytenaktivierenden Rezeptoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Ig-a, Ig-B, CD3-e, CD3-d, DAP-12 und DAP-10, einen Anteil der zytoplasmatischen Domäne von CD16.
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Fusionsgene können durch herkömmliche Techniken synthetisiert werden, einschließlich automatisierter DNA-Synthesizer und PCR-Amplifikation unter Verwendung von Ankerprimern, die zu komplementären Überhängen zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten führen, die anschließend angelagert und erneut amplifiziert werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (Ausubel, 2002). Im Handel sind viele Vektoren erhältlich, die das Subklonieren von CD16 in den Rahmen einer Fusionseinheit erleichtern.
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Chimärer Antigenrezeptor
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Wie hier beschrieben, werden NK-92
®-Zellen überdies erzeugt, um einen chimären Antigenrezeptor (CAR) auf der Zelloberfläche zu exprimieren. Gegebenenfalls ist der CAR für ein tumorspezifisches Antigen spezifisch. Tumorspezifische Antigene sind als nicht einschränkendes Beispiel in
US 2013/0189268 ;
WO 1999024566 A1 ;
US 7098008 ; und
WO 2000020460 A1 beschrieben, von denen jedes in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme hier aufgenommen ist. Tumorspezifische Antigene beinhalten ohne Einschränkung NKG2D, CS1, GD2, CD138, EpCAM, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, ETA, MAGE, CAGE, BAGE, HAGE, LAGE, PAGE, NY-SEO-1, GAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAB, WT-1, PSMA, NY-ESO1, AFP, CEA, CTAG1B, CD19 und CD33. Zusätzliche nicht einschränkende tumorassoziierte Antigene und die damit verbundenen Malignitäten sind in Tabelle 2 zu finden.
Tabelle 2: Tumorspezifische Antigene und assoziierte Malignitäten
| Zielantigen | Assoziierte Malignität |
| Folatrezeptor α | Eierstockkrebs |
| CAIX | Nierenzell-Karzinom |
| CD19 | B-Zell-Malignitäten |
| Chronische lymphatische Leukämie (CLL) |
| B-Zell-CLL (B-CLL) |
| Akute lymphoblastische Leukämie (ALL), hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) nach ALL |
| Lymphom; refraktär follikulär Lymphom; B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphom (B-NHL) |
| Leukämie |
| B-Zell-Malignitäten nach HSCT |
| Lymphoide Malignitäten der B-Linie nach Transplantation von Nabelschnurblut (UCBT) |
| CD19/CD20 | Lymphoblastische Leukämie |
| CD20 | Lymphome |
| | B-Zell-Malignitäten |
| | B-Zell-Lymphome |
| | Mantel zell lymphom |
| | Indolentes B-NHL |
| | Leukämie |
| CD22 | B-Zell-Malignitäten |
| CD30 | Lymphome; Hodgkin-Lymphom |
| CD33 | AML |
| CD44v7/8 | Zervixkarzinom |
| CD138 | Multiples Myelom |
| CD244 | Neuroblastom |
| CEA | Brustkrebs |
| | Kolorektaler Krebs |
| CS1 | Multiples Myelom |
| EBNA3C | EBV-positive T-Zellen |
| EGP-2 | Multiple Malignitäten |
| EGP-40 | Kolorektaler Krebs |
| EpCAM | Brustkarzinom |
| Erb-B2 | Kolorektaler Krebs |
| Brustkrebs und andere |
| Prostatakrebs |
| Erb-B 2,3,4 | Brustkrebs und andere |
| FBP | Eierstockkrebs |
| Fetaler Acetylcholinrezeptor | Rhabdomyosarkom |
| GD2 | Neuroblastom |
| GD3 | Melanom |
| GPA7 | Melanom |
| Her2 | Brustkarzinom |
| Eierstockkrebs |
| Tumoren epithelialen Ursprungs |
| Her2/neu | Medulloblastom |
| Malignität der Lunge |
| Fortgeschrittenes Osteosarkom |
| Glioblastom |
| IL-13R-a2 | Gliom |
| Glioblastom |
| Medulloblastom |
| KDR | Tumor-Neovaskulatur |
| k-Leichtkette | B-Zell-Malignitäten |
| B-NHL, CLL |
| LeY | Karzinome |
| Tumoren epithelialen Ursprungs |
| Zelladhäsionsmolekül L1 | Neuroblastom |
| MAGE-A1 | Melanom |
| Mesothelin | Verschiedene Tumoren |
| MUC1 | Brustkrebs; Eierstockkrebs |
| NKG2D-Liganden | Verschiedene Tumoren |
| Onkofetales Antigen (h5T4) | Verschiedene Tumoren |
| PSCA | Prostatakarzinom |
| PSMA | Prostata-/Tumor-Vaskulatur |
| TAA, Ziel von mAb-IgE | Verschiedene Tumoren |
| TAG-72 | Adenokarzinome |
| VEGF-R2 | Tumor-Neovaskulatur |
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In einigen Ausführungsformen zielt der CAR auf CD19, CD33 oder CSPG-4 ab.
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In Beispielen werden variante Polypeptide unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren wie etwa Oligonukleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alanin-Scannen und PCR-Mutagenese hergestellt. Ortsgerichtete Mutagenese (Carter, 1986; Zoller und Smith, 1987), Kassettenmutagenese, Restriktionsselektionsmutagenese (Wells et al., 1985) oder andere bekannte Techniken können an der klonierten DNA durchgeführt werden, um CD16-Varianten herzustellen (Ausubel, 2002; Sambrook und Russell, 2001).
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Gegebenenfalls zielt der CAR auf ein Antigen ab, das mit einem bestimmten Krebstyp assoziiert ist. Gegebenenfalls ist der Krebs aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus Leukämie (einschließlich akuter Leukämien (z. B. akute lymphatische Leukämie, akute myelozytische Leukämie (einschließlich myeloblastischer, promyelozytischer, myelomonozytischer, monozytischer und Erythroleukämie)) und chronischer Leukämien (z. B. chronische myelozytische (granulozytische) Leukämie und chronische lymphatische Leukämie), Polyzythaemia vera, Lymphome (z. B. Hodgkin-Krankheit und Non-Hodgkin-Krankheit), Multiples Myelom, Waldenström-Makroglobulinämie, Schwerkettenkrankheit, solide Tumoren einschließlich, aber nicht beschränkt auf Sarkome und Karzinome wie Fibrosarkom, Myxosarkom, Liposarkom, Chondrosarkom, osteogenes Sarkom, Chordom, Angiosarkom, Endotheliosarkom, Lymphangiosarkom, Lymphangioendotheliosarkom, Synoviom, Mesotheliom, Ewing-Tumor, Leiomyosarkom, Rhabdomyosarkom, Darmkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, Brustkrebs, Eierstockkrebs, Prostatakrebs, Plattenepithelkarzinom, Basalzellkarzinom, Adenokarzinom, Schweißdrüsenkarzinom, Talgdrüsenkarzinom, papilläres Karzinom, papilläre Adenokarzinome, Zystadenokarzinom, medulläres Karzinom, bronchogenes Karzinom, Nierenzellkarzinom, Hepatom, Gallengangskarzinom, Choriokarzinom, Seminom, embryonales Karzinom, Wilm-Tumor, Gebärmutterhalskrebs, Hodentumor, Lungenkarzinom, kleinzelliges Lungenkarzinom, Blasenkarzinom, Epithelkarzinom, Gliom, Astrozytom, Medulloblastom, Kraniopharyngeom, Ependymom, Pinealom, Hämangioblastom, Akustikusneurinom, Oligodendrogliom, Menangiom, Melanom, Neuroblastom und Retinoblastom.
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In einigen Ausführungsformen wird ein Polynukleotid, das einen CAR codiert, mutiert, um die für CAR codierende Aminosäuresequenz zu ändern, ohne die Funktion des CAR zu ändern. Zum Beispiel können Polynukleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen an „nicht essentiellen“ Aminosäureresten führen, in den oben offenbarten CAR hergestellt werden. CAR können wie beispielsweise in den Patentveröffentlichungen Nr.
WO 2014039523 ;
US 20140242701 ;
US 20140274909 ;
US 20130280285 und
WO 2014099671 beschrieben erzeugt werden, von denen jede in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hier aufgenommen ist. Gegebenenfalls ist der CAR ein CD19-CAR, ein CD33-CAR oder ein CSPG-4-CAR.
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Zusätzliche Modifikationen - Zytokine
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Die Zytotoxizität von NK-92®-Zellen hängt von der Gegenwart von Zytokinen (z. B. Interleukin-2 (IL-2)) ab. Die Kosten für die Verwendung von exogen zugesetztem IL-2, das zur Aufrechterhaltung und Expansion von NK-92®-Zellen in einer Kultur im kommerziellen Maßstab erforderlich ist, sind erheblich. Die Verabreichung von IL-2 an humane Probanden in ausreichender Menge, um die Aktivierung von NK-92®-Zellen fortzusetzen, würde unerwünschte Nebenwirkungen verursachen.
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In einigen Ausführungsformen werden FcR-exprimierende NK-92®-Zellen weiter modifiziert, um mindestens ein Zytokin und ein Suizidgen zu exprimieren. In spezifischen Ausführungsformen ist das mindestens eine Zytokin IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 oder eine Variante davon. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Zytokin IL-2. Eine repräsentative Nukleinsäure, die IL-2 codiert, ist in SEQ ID NO:3 gezeigt, und ein repräsentatives Polypeptid von IL-2 ist in SEQ ID NO:4 gezeigt. In bestimmten Ausführungsformen ist IL-2 eine Variante, die auf das endoplasmatische Retikulum abzielt.
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In einer Ausführungsform wird das IL-2 mit einer Signalsequenz exprimiert, die das IL-2 zum endoplasmatischen Retikulum lenkt. Nicht an die Theorie gebunden zu sein, sondern das IL-2 auf das endoplasmatische Retikulum zu lenken, ermöglicht die Expression von IL-2 in Mengen, die für die autokrine Aktivierung ausreichen, jedoch ohne IL-2 extrazellulär freizusetzen. Siehe Konstantinidis et al. „Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92® cells“ Exp Hematol. 2005 Feb; 33(2):159-64. Eine kontinuierliche Aktivierung der FcRexprimierenden NK-92®-Zellen kann z. B. durch die Gegenwart des Suizidgens verhindert werden.
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Zusätzliche Modifikationen - Suizidgen
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Der Begriff „Suizidgen“ ermöglicht die negative Selektion der Zellen. Ein Suizidgen wird als Sicherheitssystem verwendet, das es erlaubt, dass die Zellen, die das Gen exprimieren, durch die Einführung eines selektiven Wirkstoffs abgetötet werden. Dies ist wünschenswert, wenn das rekombinante Gen eine Mutation verursacht, die zu einem unkontrollierten Zellwachstum führt. Es wurde eine Reihe von Suizidgensystemen identifiziert, darunter das Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase(TK)-Gen, das Cytosin-Deaminase-Gen, das Varicella-Zoster-Virus-Thymidinkinase-Gen, das Nitroreduktase-Gen, das Escherichia-coli-gpt-Gen und das E.-coli-Deo-Gen (siehe auch zum Beispiel Yazawa K, Fisher W E, Brunicardi F C: Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J. Surg. 2002 Juli; 26(7):783-9). Wie hier verwendet, ist das Suizidgen in NK-92® Zellen aktiv. Typischerweise kodiert das Suizidgen für ein Protein, das keine negativen Auswirkungen auf die Zelle hat, aber in Gegenwart einer bestimmten Verbindung die Zelle tötet. Somit ist das Suizidgen typischerweise Teil eines Systems.
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In einer Ausführungsform ist das Suizidgen das Thymidinkinase(TK)-Gen. Das TK-Gen kann ein Wildtyp- oder ein mutiertes TK-Gen sein (z. B. tk30, tk75, sr39tk). Zellen, die das TK-Protein exprimieren, können mit Ganciclovir abgetötet werden.
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In einer anderen Ausführungsform ist das Suizidgen Cytosin-Deaminase, die in Gegenwart von 5-Fluorocytosin toxisch für Zellen ist. Garcia-Sanchez et al. „Cytosine deaminase adenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1 million-fold when they contaminate hematopoietic cells: a potential purging method for autologous transplantation.“ Blood 1998 Jul 15;92(2):672-82.
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In einer anderen Ausführungsform ist das Suizidgen Cytochrom P450, das in Gegenwart von Ifosfamid oder Cyclophosphamid toxisch ist. Siehe z. B. Touati et al. „A suicide gene therapy combining the improvement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of an anti-tumor immune response.“ Curr Gene Ther. 2014;14(3):236-46.
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In einer anderen Ausführungsform ist das Suizidgen iCas9. Di Stasi, (2011) „Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy.“ N. Engl. J. Med. 1673-1683. Siehe auch Morgan, „Live and Let Die: A New Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic“ Molecular Therapy (2012); 20:11-13. Das iCas9-Protein induziert Apoptose in Gegenwart eines kleinmolekularen AP1903. AP1903 ist ein biologisch inertes kleines Molekül, von dem in klinischen Studien gezeigt wurde, dass es gut verträglich ist, und das im Rahmen der adoptiven Zelltherapie eingesetzt wurde.
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In einer Ausführungsform werden die modifizierten NK-92
®-Zellen vor der Verabreichung an den Patienten bestrahlt. Die Bestrahlung von NK-92
®-Zellen ist beispielsweise im
US-Patent Nr. 8,034,332 beschrieben, auf das hiermit in vollem Umfang Bezug genommen wird. In einer Ausführungsform werden modifizierte NK-92
®-Zellen bestrahlt, die nicht zur Expression eines Suizidgens erzeugt wurden.
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Transgenexpression
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Transgene (z. B. CD19-CAR und CD16) können durch jeden dem Fachmann bekannten Mechanismus in einen Expressionsvektor eingebaut werden. Transgene können in den gleichen Expressionsvektor oder einen anderen Expressionsvektor eingebaut werden. In bevorzugten Ausführungsformen werden die Transgene in den gleichen Vektor eingebaut.
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In einigen Ausführungsformen ermöglicht der Vektor die Einbindung des Transgens (der Transgene) in das Genom der Zelle. In einigen Ausführungsformen weisen die Vektoren einen positiven Selektionsmarker auf. Positive Selektionsmarker beinhalten alle Gene, die es der Zelle ermöglichen, unter Bedingungen zu wachsen, die eine Zelle abtöten würden, die das Gen nicht exprimiert. Nicht einschränkende Beispiele beinhalten Antibiotikaresistenz, z. B. Geneticin (Neo-Gen aus Tn5) .
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Eine beliebige Anzahl von Vektoren kann verwendet werden, um den Fc-Rezeptor und/oder den CAR zu exprimieren. In einigen Ausführungsformen ist der Vektor ein Plasmid. In einer Ausführungsform ist der Vektor ein viraler Vektor. Virale Vektoren beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, retrovirale Vektoren, adenovirale Vektoren, adenoassoziierte virale Vektoren, Herpes-simplex-Virusvektoren, Pocken-Virusvektoren und andere.
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Transgene können unter Verwendung eines beliebigen auf dem Fachgebiet bekannten Transfektionsverfahrens in die NK-92®-Zellen eingeführt werden, einschließlich, als nicht einschränkendes Beispiel, Infektion, Elektroporation, Lipofektion, Nukleofektion oder „Genkanone“.
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Offenbart sind Materialien, Zusammensetzungen und Komponenten, die für die offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen verwendet werden können, die in Verbindung mit diesen verwendet werden können, die zur Vorbereitung auf diese verwendet werden können oder Produkte dieser sind. Diese und andere Materialien werden hier offenbart, und es versteht sich, dass, wenn Kombinationen, Teilmengen, Wechselwirkungen, Gruppen usw. dieser Materialien offenbart werden, hier alle speziell in Betracht gezogen und beschrieben werden, auch wenn eine spezifische Referenz jeder einzelnen und kollektiven Kombinationen und Permutationen dieser Verbindungen möglicherweise nicht explizit offenbart wird. Wenn zum Beispiel ein Verfahren offenbart und dargestellt wird und eine Anzahl von Modifikationen, die mit dem Verfahren an einer Anzahl von Molekülen vorgenommen werden können, dargestellt werden, werden jede Kombination und Permutation des Verfahrens und die möglichen Modifikationen ausdrücklich in Betracht gezogen, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben. Ebenso wird jede Teilmenge oder Kombination davon ausdrücklich in Betracht gezogen und offenbart. Dieses Konzept gilt für alle Aspekte dieser Offenbarung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Schritte in Verfahren, die die offenbarten Zusammensetzungen verwenden. Wenn also verschiedene zusätzliche Schritte ausgeführt werden können, versteht es sich, dass jeder dieser zusätzlichen Schritte mit beliebigen spezifischen Verfahrensschritten oder Kombinationen von Verfahrensschritten der offenbarten Verfahren ausgeführt werden kann und dass jede solche Kombination oder Teilmenge von Kombinationen ausdrücklich in Betracht gezogen wird und als offengelegt betrachtet werden sollte.
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BEISPIELE
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Die folgenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und sollten nicht als Einschränkungen interpretiert werden. Es sind verschiedene alternative Techniken und Verfahren für Fachleute verfügbar, die es auf ähnliche Weise ermöglichen würden, die folgenden Beispiele erfolgreich durchzuführen.
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Beispiel 1: Waschen von Zellen unter Verwendung von 5 % Humanalbumin erhöht die Effizienz der Zellernte
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1 zeigt die Prozesse des Erntens modifizierter NK-92®(HER2.taNK)-Zellen aus großen Bioreaktoren unter Verwendung von entweder X-VIVO™10 oder 5 % HA (Humanalbumin). Obwohl Zellen unter Verwendung beider Verfahren konzentriert werden können, erfordert die Ernte in X-VIVOT™10 zwei zusätzliche Schritte, die zu einer längeren Prozesszeit sowie zu Zellstress und -verlust aufgrund von Zentrifugation führen. Das Ernten von Zellen in 5 % HUMANALBUMIN vereinfacht den Prozess und verbessert die Ernteeffizienz.
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Beispiel 2: Lebensfähigkeit von NK-92®-Zellen nach dem Auftauen in 5 % Humanalbumin
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Gefrorene modifizierte NK-92
®(HER2.taNK)-Zellen wurden in einem 37 °C Wasserbad aufgetaut. 100 µl der aufgetauten Zellen wurden zu jeweils 900 µl des X-VIVO™10-Mediums, von 5 % Humanalbumin bzw. von PBS gegeben. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung eines Nucleocounter NC-200™ gemessen und ist in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3. Zelllebensfähigkeit nach dem Auftauen in 5 % HUMANALBUMIN
| Experiment | Studiennummer | Auftaumedium | % Lebensfähigkeit |
| Auftauen von gefrorenen HER2.taNK-Zellen | NKSTUDYTP_028 | X-VIVO™10 | 94,4 |
| 5 % Humanalbumin | 86,5 |
| PBS | 74,6 |
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Die Ergebnisse zeigen, dass in 5 % Humanalbumin aufgetaute Zellen eine Lebensfähigkeit von 86,5 % hatten, die zwar nicht so hoch wie bei X-VIVO™10 (94,4 %) war, jedoch signifikant höher als die Lebensfähigkeit von in PBS aufgetauten Zellen (74,6 %). In 5 % Humanalbumin aufgetaute Zellen und in X-VIVO™10 aufgetaute Zellen wurden zur Expansion jeweils in G-Rex-Flaschen in Wachstumsmedien überführt und in 25 1 Wachstumsmedien bzw. 10 1 Wachstumsmedien in Xuri-Beuteln weiter expandiert.
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Beispiel 3: Zytotoxizität von modifizierten NK-92®(HER2.taNK)-Zellen auf BT-474-Zielzellen
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Modifizierte NK-92® (HER2.taNK)-Zellen, die in Xuri-Beuteln gezüchtet wurden, wurden gesammelt und entweder mit X-VIVO™10-Medium oder 5 % Humanalbumin unter kontinuierlicher Zentrifugation gewaschen. Für jede Gruppe wurden Zytotoxizitätsassays an Zellen durchgeführt, die zum Zulauf zur kontinuierlichen Zentrifuge verwendet wurden (d. h. Zellen, die keinen Ernteprozess durchlaufen hatten, als Vorernteprobe bezeichnet); Zellen, die die kontinuierliche Zentrifuge verlassen haben (d. h. Zellen, die den Ernteprozess abgeschlossen haben, als Nachernteprobe bezeichnet); und Zellen aus der G-Rex-Flasche, die den Ernteprozess nicht durchlaufen hatten und als Kontrollzellen dienten. Zur Beurteilung der Zytotoxizität wurden die Zellen mit den mit Calcein beladenen Zielzellen zu einem Effektor:Ziel-Verhältnis von 10:1 gemischt. Die Calcein-Freisetzung wurde mit einem Fluoreszenzplattenleser nach 3 Stunden Co-Inkubation bewertet. Die Zytotoxizität wurde unter Verwendung eines Calcein-Freisetzungsassays bestimmt und als Mittelwert ± Standardabweichungsprozentsatz (%) der Calcein-Freisetzung ausgedrückt. Das Effektor:Ziel-Verhältnis betrug 10:1, und die Proben wurden dreifach getestet.
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Die Ergebnisse zeigen, dass die Zytotoxizität der modifizierten NK-92
®(HER2.taNK)-Zellen, die unter Verwendung von 5 % Humanalbumin als Waschpuffer geerntet wurden, die 88 ± 10 % betrug, im Wesentlichen dieselbe war wie die von HER2.taNK-Zellen, die unter Verwendung von X-VIVO™10 (90 ± 4 %) geerntet wurden. Die Zytotoxizität der HER2.taNK-Zellen, die unter Verwendung von 5 % Humanalbumin geerntet wurden, war ebenfalls im Wesentlichen dieselbe wie die Zytotoxizität der HER2.taNK-Kontrollzellen, d. h. der Zellen in der G-Rex-Flasche, die 90 ± 5 % betrug. Ferner beeinträchtigte die Verwendung von 5 % Humanalbumin als Zellwaschmedium die Zytotoxizität der HER2.taNK-Zellen nicht, was sich darin widerspiegelte, dass die Zytotoxizität der Vorernteprobe und die Zytotoxizität der Nachernteprobe ebenfalls im Wesentlichen ähnlich waren. Siehe Tabelle 4.
Tabelle 4. Zytotoxizität von HER2.taNK-Zellen auf BT-474-Zielzellen
| Experiment | Wasch- und Erntemedium | Testprobe | % Zytotoxizität |
| HER2.taNK-Zellen vs. BT-474-Zellen | X-VIVO™10 | Vorernte | 89 ± 2 |
| Nachernte | 90 ± 4 |
| G-Rex (Referenzkontrolle) | 89 ± 1 |
| HER2.taNK-Zellen vs. BT-474-Zellen | 5 % Albumin (human) | Vorernte | 86 ± 4 |
| Nachernte | 88 ± 10 |
| G-Rex (Referenzkontrolle) | 90 ± 5 |
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Die Ergebnisse zeigen, dass die Zytotoxizität der modifizierten NK-92
®(CD19-t-haNK- und PD-L1-t-haNK)-Zellen, die unter Verwendung von 5 % Albumin (human) als Waschpuffer (Nachernte) geerntet wurden, gegen Tumorzellen unterschiedlichen Ursprungs mit der Zytotoxizität der direkt aus dem Bioreaktor entnommenen Zellen (Vorernte) sowie der Referenzkontrollzellen, d. h. der Zellen in der G-Rex-Flasche, vergleichbar war. Siehe Tabelle 5.
Tabelle 5. Zytotoxizität modifizierter NK-92
®-Zellen gegen Tumorzellen unterschiedlichen Ursprungs
| Modifizierte NK-92®-Effektorzellen | Tumortyp | Studiendatum | Testprobe | % Zytotoxizität1 |
| CD19-t-haNK-Zellen | B-Zell-Lymphom SUP-B15-Zellen | NKSTUDYTP_100 13. Juli 2018 | Referenz | 92 ± 7 |
| Vorernte | 102 ± 7 |
| Nachernte | 99 ± 3 |
| Leukämiezellen K562-Zellen | NKSTUDYTP_100 13. Juli 2018 | Referenz | 86 ± 7 |
| Vorernte | 72 ± 8 |
| Nachernte | 81 ± 5 |
| PD-L1-t-haNK-Zellen | Brusttumor-Zellen MDA-MB-231-Zellen (dreifach negativ) | NKSTUDYTP_095 11. Juli 2018 | Referenz | 87 ± 3 |
| Vorernte | 87 ± 1 |
| Nachernte | 86 ± 4 |
| 1 Modifizierte NK-92®-Zellen wurden zentrifugiert und in 5 % HA geerntet. Die Zellen wurden mit den mit Calcein beladenen Zielzellen unterschiedlichen Ursprungs gemischt, und die Ziellyse wurde durch Messen der Calcein-Freisetzung im Kulturmedium bewertet. Zellen aus G-Rex wurden als Referenzkontrolle verwendet. |
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Die Ergebnisse zeigen, dass die modifizierten NK-92
® (haNK und CD19-t-haNK und PD-L1-t-haNK)-Zellen, die unter Verwendung von 5 % Albumin (human) als Waschpuffer (Nachernte) geerntet wurden, eine wirksame antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) von Tumorzellen induzierten, wenn sie mit verschiedenen therapeutischen Antikörpern klinischer Qualität gekoppelt wurden. Eine vergleichbare ADCC wurde zwischen Referenz, Vorernte- und Nachernteproben beobachtet. Siehe Tabelle 6.
Tabelle 6. ADCC-Aktivität von modifizierten NK-92
®(haNK, CD19-t-haNK und PD-L1-t-haNK)-Zellen gegen Tumorzellen in Kombination mit therapeutischen Antikörpern klinischer Qualität
| Modifizierte NK-92®-Effektorzellen | Tumorzellen | Studiennummer und -datum | Testprobe | % Zytotoxizität1 |
| haNK-Zellen | Ramos-Zellen + Rituxan | NKSTUDYTP_058 16. Mai 2018 | Referenz | 101 ± 5 |
| Vorernte | 97 ± 2 |
| Nachernte | 93 ± 1 |
| CD19-t-haNK-Zellen | MDA-MB-231-Zellen + Avelumab | NKSTUDYTP_101 31. Juli 2018 | Referenz | 50 ± 9 |
| Vorernte | 42 ± 2 |
| Nachernte | 45 ± 2 |
| PD-L1-t-haNK-Zellen | MDA-MB-453-Zellen + Herceptin | NKSTUDYTP_103 17. August 2018 | Referenz | 58 ± 1 |
| Vorernte | 61 ± 2 |
| Nachernte | 70 ± 3 |
| 1 Modifizierte NK-92®-Zellen wurden zentrifugiert und in 5 % HA geerntet. Die Zellen wurden mit den mit Calcein beladenen Zielzellen unterschiedlichen Ursprungs in Gegenwart therapeutischer Antikörper gemischt, und die Ziellyse wurde durch Messen der Calcein-Freisetzung im Kulturmedium bewertet. Zellen aus G-Rex wurden als Referenzkontrolle verwendet. |
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Beispiel 4: Lebensfähigkeit und Rückgewinnung von NK-92®-Zellen, die durch kontinuierliche Zentrifugation in 5 % Albumin (human) geerntet wurden
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Modifizierte NK-92
®(HER2.taNK)-Zellen wurden unter kontinuierlicher Zentrifugation entweder in X-VIVO™10 oder 5 % Albumin (human) geerntet. Die Zelllebensfähigkeit von Vorernte- und Nachernteproben wurde unter Verwendung eines Nucleocounter-NC-200-Zellzählverfahrens und eines Trypanblau-Farbstoffausschlussverfahrens untersucht. Die prozentuale Rückgewinnung wurde als die Menge an Zellen, die aus kontinuierlicher Zentrifugation rückgewonnen wurden/Menge an Zellen, die in die kontinuierliche Zentrifugation eingetreten sind, berechnet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Lebensfähigkeit von Zellen, die entweder aus X-VIVO™10 oder 5 % Albumin (human) geerntet wurden, vergleichbar war, 96,7 % gegenüber 95,7 %. Ferner betrug die prozentuale Zellrückgewinnung bei Ernte unter Verwendung von 5 % Albumin (human) 91,9 %, was etwas höher war als die Ernte unter Verwendung von X-VIVO™10, die 89,9 % betrug. Ferner war die Lebensfähigkeit der Vorernteprobe und der Nachernteprobe ebenfalls vergleichbar, was darauf hinweist, dass das Waschen von Zellen mit 5 % Albumin (human) die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinträchtigte. Siehe Tabelle 7.
Tabelle 7. Lebensfähigkeit und Rückgewinnung der geernteten modifizierten NK-92
®(HER2.taNK)-Zellen
| Erntemedium | Studiendatum und -nummer | Testprobe | % Lebensfähigkeit | % Rückgewinnung |
| X-VIVO™10 | 22. Juni 2017 NKSTUDYPRT006 | Vorernte | 96,6 | 89,9 |
| Nachernte | 96,7 |
| 5 % ALBUMIN (HUMAN) | 27. Juni 2017 NKSTUDYPRT006 | Vorernte | 98 | 91,9 |
| Nachernte | 95,7 |
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Beispiel 5: Oberflächenexpression modifizierter NK-92®(CD19-t-haNK)-Zellen, die durch kontinuierliche Zentrifugation in 5 % Albumin (human) geerntet wurden
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Modifizierte NK-92
®-Zellen wurden unter Verwendung kontinuierlicher Zentrifugation in 5 % Albumin (human) geerntet, und die Oberflächenexpression der Proben wurde unter Verwendung eines auf Durchflusszytometrie basierenden Verfahrens untersucht. Die prozentuale Oberflächenmarkerexpression wurde durch Waschen mit 5 % Albumin (human) nicht beeinflusst, da ähnliche Expressionsmengen auf Zellen aus Nachernte-, Vorernte- und auch Referenzzellen beobachtet wurden. Siehe Tabelle 8 und Tabelle 9.
Tabelle 8. Phänotypisierung der geernteten CD19-t-haNK-Zellen
| Studiendatum & - nummer | Testprobe | Zelloberflächenmarker (%)1 |
| CD3 | CD56 | CD16 | CD54 | NKG2D | NKp30 |
| NKSTUDYTP_100 20. Juli 2018 | Referenz | 0,1 | 100 | 99 | 100 | 100 | 99 |
| Vorernte | 0,0 | 100 | 96 | 100 | 100 | 98 |
| Nachernte | 0,0 | 100 | 95 | 100 | 99 | 95 |
| 1 Prozent (%) der CD19-t-haNK-Zellen, die bei Durchflusszytometrie positiv für den Zelloberflächenmarker sind |
Tabelle 9. CAR-Expression auf den geernteten modifizierten NK-92
®(CD19-t-haNK)-Zellen
| Studiendatum & -nummer | Testprobe | % CAR+1 |
| NKSTUDYTP_100 | Referenz | 99 |
| 20. Juli 2018 | Vorernte | 99 |
| Nachernte | 99 |
| 1 Prozent der CD19-t-haNK-Zellen, die positiv für die CD19.CAR-Expression sind, bestimmt durch Durchflusszytometrie |
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Es versteht sich, dass die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur zur Veranschaulichung dienen und dass verschiedene entsprechende Modifikationen oder Änderungen Fachleuten vorgeschlagen werden und in den Geist und den Geltungsbereich dieser Anmeldung und den Umfang der beigefügten Ansprüche einbezogen werden sollen. Alle hier zitierten Veröffentlichungen, Sequenzzugangsnummern, Patente und Patentanmeldungen werden hiermit in ihrer Gesamtheit für alle Zwecke durch Bezugnahme aufgenommen.
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Informelle Sequenzliste
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 62624624 [0001]
- WO 1998/49268 [0003, 0047]
- US 8034332 [0003, 0021, 0050, 0076]
- US 7618817 [0021, 0050]
- US 8313943 [0021, 0050]
- US 9181322 [0021]
- US 9150636 [0021]
- US 10008955 [0021]
- US 20020068044 [0043, 0047]
- US 2013/0040386 [0050]
- US 2013/0189268 [0063]
- WO 1999024566 A1 [0063]
- US 7098008 [0063]
- WO 2000020460 A1 [0063]
- WO 2014039523 [0067]
- US 20140242701 [0067]
- US 20140274909 [0067]
- US 20130280285 [0067]
- WO 2014099671 [0067]
