DE112011100663T5

DE112011100663T5 - Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat

Info

Publication number: DE112011100663T5
Application number: DE112011100663T
Authority: DE
Inventors: Gary M. Pigeau; Jan-Maarten A. Geertman
Original assignee: logen Energy Corp
Current assignee: logen Energy Corp
Priority date: 2010-02-25
Filing date: 2011-02-23
Publication date: 2012-12-27
Also published as: WO2011103671A1; US20110207192A1; US8759049B2; CN102791867A; CN102791867B; PL401887A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat. Das Verfahren umfasst Fermentieren des Zuckerhydrolysats in einem Fermentationssystem mit Hefe, um eine ein Fermentationsprodukt umfassende Fermentationsbrühe herzustellen; Einführen von Säure und einem Oxidationsmittel, wie Chlordioxid, in das Fermentationssystem, um mikrobielle Kontaminanten in dem Fermentationssystem in einem oder mehreren Stadien Chlordioxid bei einem pH von weniger als 3,0 auszusetzen; und Gewinnen des Fermentationsprodukts. In einem Beispiel der Erfindung wird ein aus einem Heferecyclingschritt erhaltener Hefeschlamm mit Säure und dem Oxidationsmittel behandelt.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts. Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat.
Hintergrund der Erfindung
Lignocellulosehaltiges Ausgangsmaterial ist ein allgemein verwendeter Begriff, um Cellulose, Hemicellulose und Lignin umfassende, aus Pflanzen erhaltene Biomasse zu beschreiben. Viel Aufmerksamkeit und Anstrengung ist in den letzten Jahren auf die Herstellung von Brennstoffen und Chemikalien, vor allem Ethanol, aus lignocellulosehaltigem Ausgangsmaterial, wie landwirtschaftlichen Abfällen und forstwirtschaftlichen Abfällen verwendet worden, aufgrund ihrer geringen Kosten und weiten Verfügbarkeit. Diese landwirtschaftlichen und forstwirtschaftlichen Abfälle werden typischerweise verbrannt oder deponiert; daher bietet die Verwendung dieser lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterialien zur Ethanolherstellung eine attraktive Alternative zur Entsorgung. Noch ein weiterer Vorteil dieser Ausgangsmaterialien ist, dass das Ligninnebenprodukt, das nach dem Celluloseumwandlungsprozess bleibt, anstelle von fossilen Brennstoffen als Brennstoff verwendet werden kann, um den Prozess anzutreiben. Mehrere Studien haben gefolgert, dass die Herstellung von Ethanol aus lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterialien nahezu keine Treibhausgase generiert, wenn der gesamte Herstellungs- und Verbrauchszyklus berücksichtigt wird.
Der erste chemische Verarbeitungsschritt, um lignocellulosehaltiges Ausgangsmaterial zu Ethanol oder anderen Fermentationsprodukten umzuwandeln, umfasst das Abbauen des faserförmigen lignocellulosehaltigen Materials, um aus dem Ausgangsmaterial Zuckermonomere zur Umwandlung in ein Fermentationsprodukt in einem darauffolgenden Fermentationsschritt freizusetzen.
Es gibt verschiedene bekannte Verfahren zur Herstellung von fermentierbaren Zuckern aus lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterialien, wovon eines eine Säure- oder Basenvorbehandlung, gefolgt von der Hydrolyse von Cellulose mit Cellulase-Enzymen und β-Glucosidase umfasst. Der Zweck der Vorbehandlung ist, die Oberflächenfläche der Cellulose zu vergrößern und das faserförmige Ausgangsmaterial zu einer schlammigen Textur umzuwandeln, mit begrenzter Umwandlung der Cellulose zu Glucose. Säurevorbehandlung hydrolysiert typischerweise die Hemicellulosekomponente des Ausgangsmaterials, so dass Xylose, Glucose, Galactose, Mannose und Arabinose erhalten werden, und man denkt, dass dies die Zugänglichkeit der Cellulose für Cellulase-Enzyme verbessert. Die Cellulase-Enzyme hydrolysieren Cellulose zu Cellobiose, die dann durch Beta-Glucosidase zu Glucose hydrolisiert wird. Hydrolyse der Cellulose und Hemicellulose kann auch mit einer einschrittigen chemischen Behandlung erreicht werden, in der das lignocellulosehaltige Ausgangsmaterial mit einer starken Säure oder Base unter Bedingungen kontaktiert wird, die ausreichend sind, um sowohl die Cellulose- als auch die Hemicellulosekomponenten des Ausgangsmaterials zu Zuckermonomeren zu hydrolysieren.
Nach Herstellung eines fermentierbaren Zucker umfassenden Stroms aus dem lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterial kann eine Feststoffseparation durchgeführt werden, um Lignin zu entfernen, gefolgt von Fermentation der Zucker zu Ethanol oder anderen Fermentationsprodukten. Wenn Glucose das vorwiegend vorliegende Substrat ist, wird die Fermentation typischerweise mit einer Saccharomyces spp. Hefe durchgeführt, die diesen Zucker und andere vorliegende Hexosezucker zu Ethanol umwandelt. Jedoch kann Glucose auch zu anderen kommerziellen Produkten, einschließlich Milchsäure, Sorbit, Essigsäure, Zitronensäure, Ascorbinsäure, Propandiol, Butandiol, Xylit, Aceton und Butanol fermentiert werden. Diese Umwandlung kann durch eine Vielzahl an Organismen durchgeführt werden, einschließlich Saccharomyces spp.
Die Pentosezucker Xylose und Arabinose, die während der Säurevorbehandlung aus der Hemicellulosekomponente des Ausgangsmaterials entstehen, können zu Ethanol fermentiert werden. Jedoch enthält eine weite Mehrheit der wild-typ Saccharomyces Stämme nicht natürlicherweise alle für das Umwandeln dieser Zucker zu Ethanol benötigten Gene. Daher müssen sie in die Hefe eingeführt werden, um diese Umwandlung zu ermöglichen. Rekombinante Hefen, die in der Lage sind, Xylose zu Ethanol umzuwandeln sind zum Beispiel in U.S. Patent Nrn. 5,789,210 und 6,475,768 und EP 1,727,890 beschrieben.
Ein Problem mit der Fermentation von Zucker zu Ethanol oder anderen Fermentationsprodukten ist, dass Bakterien sich schnell vermehren können, da die Optimumbedingungen der Fermentation auch ihrem Wachstum zuträglich sind. Unerwünschte Nebenprodukte, die durch bakterielle Verunreinigungen währen der Fermentation hergestellt werden können, schließen Milchsäure, Aceton und Propionsäure ein. Milchsäure ist ein häufiges durch Bakterien wie Lactobacillus spp, Pediococcus spp, Leuconostoc spp und/oder Weissella spp (unter anderen) während Ethanolfermentationen hergestelltes Nebenprodukt. Die Herstellung solcher unerwünschter Nebenprodukte vermindert die Ausbeute des erwünschten Fermentationsprodukts, da die Bakterien mit der Hefe um fermentierbare Zucker im Wettbewerb stehen und sie zu unerwünschten Nebenprodukten umwandeln, anstatt des Fermentationsprodukts von Interesse. Darüber hinaus können organische Säuren und andere Nebenprodukte inhibierend für die Hefe sein. Jeder dieser Faktoren kann durch eine Verlängerung der zum Durchführen der Fermentation benötigten Zeit, Erhöhung der benötigten Hefemenge und/oder Verminderung der Endausbeuten des erwünschten Fermentationsprodukts aus den fermentierbaren Zuckern zu Verminderungen der Effizienz der Fermentation beitragen.
Mikrobielle Kontamination ist besonders problematisch, wenn die Konzentration der Hefe in dem Fermenter durch Heferecycling erhöht ist. Heferecycling wird eingesetzt, um die Effizienz von Fermentationsprozessen zu erhöhen, die relativ zur Glucosefermentation langsamen Reaktionskinetiken unterliegen, so wie diejenigen, die die Umwandlung von Xylose zu Ethanol beinhalten, oder wenn es vorteilhaft ist, die volumetrischen Umwandlungsraten zu erhöhen. Erhöhungen in der volumetrischen Rate der Umwandlung von fermentierbarem Zucker zu Ethanol können durch anhaltendes Trennen der Hefe von der geernteten Fermentationsbrühe erreicht werden, wie durch Zentrifugation und das darauffolgende Rezirkulieren der Hefe zurück in den Fermenter. Indem auf diese Weise die Hefe wieder in den Fermenter eingebracht wird, wird die Konzentration der Hefe in dem Fermenter anhaltend auf einem hohen Level gehalten, ohne bedeutende Umlenkung von Zuckern auf Zellwachstum und weg von dem erwünschten Fermentationsprodukt. Jedoch werden als ein Ergebnis solch einer wiederholten Rezirkulation von Hefe ungewollte Mikroben, wie Bakterien, auch zusammen mit der recycled. Da Bakterien dazu neigen, sich schneller als Hefe zu teilen, kann dies zu bedeutsamen Leveln mikrobieller Kontamination führen.
De Oliva-Neto und Yokoya (Brazilian Journal of Microbiology, 2001, 3: 10–14) untersuchten den Effekt einer Vielzahl antimikrobieller Verbindungen auf die Viabilität von Saccharomyces cerevisiae, Lactobacillus und Leuconostoc in an Zuckerrohrsaft durchgeführten Fermentationen zur Herstellung von Ethanol. Dies schloss formulierte Chemikalien, wie Zink-Mangan-ethylenbis(dithiocarbamat), Methyldithiocarbamat, 3-Methyl-4-chlorphenol, 2-Benzyl-4-chlorphenol und o-Phenylphenol, 2-Chloracetamid und andere, die gewöhnlich zur Verwendung in der mikrobiellen Kontrolle in Zucker- und Alkoholfabriken empfohlen werden, ein. Getestete Antibiotika schlossen Penicillin, Clindamycin und Cephamandol ein. Die Ergebnisse zeigten, dass gegenwärtige in industriellen Brennstoffalkohol-Fermentationen verwendete chemische Biozide die Hefeviabilität reduzierten, während Antibiotika beim Reduzieren des bakteriellen Wachstums wirksam waren, ohne die Hefeviabilität zu beeinflussen.
Jedoch hat die Verwendung von Antibiotika in Brennstoffethanolanwendungen ihre Limitierungen, da bekannt ist, dass mikrobielle Verunreinigungen Antibiotikaresistenz entwickeln (Lushia und Heist, 2005, Ethanol Producer Magazin, Antibiotic-Resistant Bacteria in Fuel Ethanol Fermentations). Darüber hinaus können Antibiotika in die Getreideschlempe verschleppt werden, welche ein in Tiernahrungen verwendetes Nebenprodukt kommerzieller Ethanolwerke ist, und dieses wertvolle Nebenprodukt kann nicht verkauft werden, wenn Antibiotika in dem Prozess verwendet werden.
Bakterielle Kontrolle in industrieller Brennstoffalkohol-Fermentation kann auch durch Waschen der Hefezellsuspensionen mit Schwefelsäure durchgeführt werden. Kommerzielles Brennstoffethanol in Brasilien wird durch Fed-Batch oder andauernde Fermentation von Zuckerrohr durch Saccharomyces cerevisiae hergestellt, und verwendet Hefezellrecycling (de Oliva-Neto und Yokoya, oben). Das Ziel der Säurebehandlung ist, kontaminierende Mikroorganismen, die niedrigen pH-Bedingungen nicht widerstehen können, zu zerstören, ohne eine substanzielle Reduktion der Hefeviabilität oder Fermentationskapazität.
US2009/0117633 offenbart einen Prozess zur Herstellung von Ethanol aus Mais, in dem eine kombinierte Saccharifizierung und Fermentation bei pH-Werten wie 3,5 bis 4,0 durchgeführt werden. Die in der Saccharifizierung verwendeten Enzyme sind Amylasen, die für das Hydrolysieren von Stärke unter diesen relativ niedrigen pH-Werten adaptiert sind. Die Saccharifizierung/Fermentation bei niedrigem pH wird im Hinblick auf das Reduzieren bakterieller Kontaminanten wie Milchsäure produzierende und Essigsäure produzierende Bakterien durchgeführt, die am besten bei pH 5,0 und darüber wachsen. Daher glaubt man, dass Ethanolfermentation im pH-Bereich von 3,0 bis 4,5 überwiegen wird, weil die Hefe besser wachsen wird als verunreinigende Bakterien.
Die Verwendung von Oxidationsmitteln, um mikrobielle Kontamination in Ethanolfermentationen zu kontrollieren, ist ebenfalls bekannt. Zum Beispiel offenbaren Chang et al. (Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63: 1–6) die Verwendung von Sulfit und Wasserstoffperoxid, um bakterielle Kontamination in der Fermentation von Malzextrakt zu Ethanol mit Heferecycling zu kontrollieren.
Chlordioxid ist ein Oxidationsmittel, von dem bekannt ist, dass es einen bakterioziden Effekt hat, und das als Desinfektionsmittel von Trinkwasser und in der Nahrungsmittel und Getränkeindustrie verwendet worden ist. Es gibt verschiedene bekannte Verfahren zur Herstellung von Chlordioxid, (siehe Alternative Disinfectants and Oxidants Guidance Manual United States Environmental Protection Agency, April 1999, Kapitel 4, Chlorine Dioxide, welches hier durch Bezugnahme aufgenommen wird), eines derer reagieren lassen von Natriumchlorit mit Säure gemäß der folgenden Reaktion umfasst: 5NaClO₂ + 4H⁺ ↔ 4ClO₂ + 4Na⁺ + Na⁺Cl^– + 2H₂O
Natriumchlorit wird oft als „stabilisiertes Chlordioxid” oder „SDC” bezeichnet.
Die Verwendung von Chlordioxid in Ethanolfermentationen ist wie in WO 2007/097874 , WO 2009/026706 , WO 2007/149450 und Johnson und Kunz (The New Brewer, 1998, Coming Clean – A New Method of Washing Yeast Using Chlorine Dioxide Bd. 15#5-P56) dargelegt bekannt. WO 2007/097874 offenbart einen Prozess, in dem Chlordioxid zu einem Fermentationstank gegeben wird, zu einem zu einem Fermentationstank zugegebenen fermentierbaren Kohlenhydrat, oder zu einem zur Vorbereitung der Impfkultur einer Fermentation verwendeten Vermehrungs- und Konditionierungssystem. WO 2009/026706 offenbart die Verwendung von Chlordioxid, um bakterielle Kontamination in einem Fermentationsprozess, der Heferecycling einsetzt und Zucker aus lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterialien verwendet. Das Chlordioxid wurde verwendet, um einen von der Fermentation getrennten Hefeschlamm vor seiner Wiedereinführung in den Fermenter zu behandeln. WO 2007/149450 offenbart ein Verfahren zur Vermeidung des Wachstums bakterieller Kontaminanten in Hefefermentationen zur Herstellung von Ethanol durch die Zugabe von stabilisiertem Chlordioxid. Das stabilisierte Chlordioxid würde vor jeglicher bedeutsamer Vermehrung von Bakterien in dem System zugegeben, wie zu der Impfkultur oder zu fermentierbaren Zuckern vor ihrer Einführung in das Fermentationssystem. Da der pH der Lösung durch die Erzeugung von durch bakteriellen Kontaminanten hergestellten organischer Säuren erniedrigt wird, wird aktiviertes Chlordioxid in situ aus dem stabilisierten Chlordioxid erzeugt, und weiteres Wachstum der Bakterien wurde verhindert. Johnson und Kunz (The New Brewer, 1998, Coming Clean – A New Method of Washing Yeast Using Chlorine Dioxide Bd. 15#5-P56) offenbart die Verwendung von Chlordioxid, um Hefe während des Bierbrauens zu waschen als eine Alternative zu saurem Waschen.
Die Effekte der ClO₂ Konzentration auf die Abtötung von Bakterien und die Hefeviabilität sind in Ethanolfermentationen untersucht wurden (siehe im Miteigentum stehende und ebenfalls anhängige WO 2009/026707 ), aber es ist weniger Information betreffend den Effekt von anderen Variablen, wie des pH, auf die Effizienz von Chlordioxid verfügbar. Jedoch ist der Einfluss des pH auf die Effektivität von Chlordioxid in anderen industriellen Anwendungen untersucht worden. In der Getränkeindustrie ist berichtet worden, dass Chlordioxid eine konstante Effizienz bei einem pH-Level zwischen 4 und 10 hat, wobei die Sterilisationsrate bei hohem pH größer ist. („Chlorine Dioxide in the Beverage Industry", Petplanet Insider, September 2005, 6: 46–47). Chlordioxid-Bleichungsstadien in Anwendungen zur Papierbreibleichung werden bei sauren pH-Werten durchgeführt, obwohl es immer noch einigen Streit über den optimalen pH gibt (Reeve, 1996, Abschnitt IV: The Technology of Chemical Pulp Bleaching, Kapitel 3: Chlorine Dioxide in Delignification In Pulp Bleaching, Principles and Practice, Herausg. Dence und Reeve, Tappi Press), Foegeding et al. (1986, Journal of Food Science, 51(1): 197–201) untersuchten die Chlordioxid-Inaktivierung von Bacillus- und Clostridium-Sporen in mit Phosphorsäure bei pH-Werten 4,5, 6,5 und 8,5 gepuffertem Wasser, und es wurde herausgefunden, dass C. perfuringens-Sporen mehr bei pH 8,5 als bei 6,5 inaktiviert wurden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts bereit. Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat.
Hierin wird ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat offengelegt.
Gemäß einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren (A) zur Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat bereitgestellt, umfassend: (i) Fermentieren des Zuckerhydrolysats in einem Fermentationssystem, um eine ein Fermentationsprodukt umfassende Fermentationsbrühe herzustellen; (ii) Einführen von Säure und einem Oxidationsmittel, einschließlich aber nicht beschränkt auf Chlordioxid, in das Fermentationssystem, um jegliche mikrobiellen Kontaminanten in dem Fermentationssystem in einem oder mehreren Stadien Chlordioxid bei einem pH von weniger als 3,0 auszusetzen; und (iii) Gewinnen des Fermentationsprodukts.
Gemäß einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren (B) zum Erhalten eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat bereitgestellt, umfassend: (i) Entfernen suspendierter Faserfeststoffe von dem Zuckerhydrolysat, um eine geklärte Zuckerlösung zu erhalten; (ii) Fermentieren von Zucker in der geklärten Zuckerlösung in einer Fermentationsreaktion unter Verwendung von Hefe, um eine das Fermentationsprodukt umfassende Fermentationsbrühe herzustellen, (iii) Trennen der Hefe von der Fermentationsbrühe, um einen Hefeschlamm und ein Fermentationsprodukt herzustellen, (iv) Einführen von Säure und Chlordioxid in den Hefeschlamm, um jegliche mikrobiellen Kontaminanten in dem Hefeschlamm Chlordioxid bei einem pH von weniger als 3,0 auszusetzen; (v) Wiedereinführen wenigstens eines Teils des chlordioxidbehandelten Hefeschlamms zurück in den Schritt des Fermentierens, Schritt (ii), um die Konzentration an Hefe in der Fermentationsreaktion zu erhalten; und (vi) Gewinnen des Fermentationsprodukts.
In Ausführungsformen jedes der vorangehenden Aspekte umfasst das Zuckerhydrolysat wenigstens Xylose oder Glucose. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Zuckerhydrolysat beides, Xylose und Glucose. Das Zuckerhydrolysat kann aus einem lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterial erhalten werden. Dies kann einen Schritt der Vorbehandlung des lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterials mit Säure oder Base einschließen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform jedes Aspekts der Erfindung werden die Säure und das Oxidationsmittel in das Fermentationssystem eingeführt, um kontinuierlich jegliche mikrobiellen Kontaminanten in dem Fermentationssystem in einem oder mehreren Stadien dem Oxidationsmittel bei einem pH von weniger als 3,0 auszusetzen.
Ohne einschränkend zu wirken, kann das durch die Fermentation hergestellte Produkt entweder Ethanol oder Xylit sein. Wenn Ethanol das Fermentationsprodukt ist, kann es durch eine Saccharomyces spp. hergestellt werden, die Glucose und Xylose zu Ethanol umwandelt. Wenn Xylit das Fermentationsprodukt ist, kann es durch eine Candida spp. hergestellt werden, die Xylose zu Xylit umwandelt.
Gemäß Ausführungsformen jedes Aspekts der Erfindung wird im Schritt des Einführens das Chlordioxid in einer Konzentration von zwischen etwa 0,5 und etwa 1500 ppm zugefügt. In einem Beispiel der Erfindung hat das Chlordioxid eine Konzentration von zwischen etwa 100 und etwa 500 ppm. Vorzugsweise werden die mikrobiellen Kontaminanten und Hefe dem Chlordioxid bei einem pH von größer als 1,0 aber weniger als 2,5 ausgesetzt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der pH größer als oder gleich 1,0 und weniger als oder gleich 2,5. In einem Beispiel der Erfindung wird die Säure vor dem Chlordioxid zugegeben.
Wenn gemäß dem zweiten Aspekt der Erfindung Heferecycling verwendet wird, kann die aus dem Schritt der Entfernung der Faserfeststoffe resultierende geklärte Zuckerlösung einen oder mehrere aus der aus Glucose, Xylose, Galactose, Mannose, Arabinose, Fucose und Fructose bestehenden Gruppe umfassen. In weiteren Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung kann der Schritt des Fermentierens in einem von einer Serie von Fermentationsreaktoren durchgeführt werden und der chlordioxidbehandelte Schlamm wird dann in denselben oder einen anderen Fermentationsreaktor in der Serie wiedereingeführt.
Vorzugsweise ist die Temperatur, wenn der Hefeschlamm mit Säure und Chlordioxid behandelt wird, zwischen etwa 4°C und etwa 37°C.
Die Konzentration mikrobieller Kontaminanten in dem Hefeschlamm kann auf wenigstens 100-fach niedriger als die der Hefe reduziert werden. In einer anderen Ausführungsform wird die Konzentration mikrobieller Kontaminanten in dem Hefeschlamm auf unter etwa 10³ CFU/mL reduziert
In noch einer weiteren Ausführungsform ist die Konzentration von Hefezellen in dem Hefeschlamm zwischen etwa 10 g/L bis etwa 300 g/L, oder von etwa 20 g/L bis etwa 200 g/L (Trockenzellgewicht).
Die vorliegende Erfindung überwindet durch die Anwesenheit mikrobieller Kontaminanten verursachte Schwierigkeiten in Verbindung mit der effizienten Umwandlung von Ausgangsmaterial zu Ethanol oder anderen Fermentationsprodukten im Stand der Technik. Insbesondere basiert die Erfindung auf der Entdeckung, dass der kombinierte Effekt eines Oxidationsmittels und niedrigen pH in bedeutsamen Verbesserungen in der Reduktion mikrobieller Kontaminanten in Fermentationssystemen resultieren kann. Vorteilhafterweise kann der Prozess der vorliegenden Erfindung nicht in irgendeiner bedeutsamen Reduktion der Viabiliät oder Fermentationskapazität der Hefe resultieren. Daher können die Ausbeute des erwünschten Fermentationsprodukts und die Reinheit des aus der Fermentation resultierenden Produkts gegenüber konventionellen Systemen bedeutsam verbessert werden. Darüber hinaus können aufgrund der verbesserten Wirksamkeit bei niedrigerem pH verglichen mit Prozessen, die nicht bei pH-Werten unter 3,0 betrieben werden, niedrigere Level an Oxidationsmittel benötigt werden. Vorteilhafterweise könnte dies den Chemikalienbedarf und daher die Kosten des Prozesses reduzieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Diese und andere Merkmale der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung offenkundiger werden, in der Bezug auf die beigefügten Zeichnungen genommen wird, wobei:
1 ein Prozessflussdiagramm zeigt, das Heferecycling während der Fermentation mit Zugabe von Säure gefolgt von Chlordioxid zu einem nach Trennung der Hefe vom Fermenter erhaltenen Hefeschlamm (hierin auch als „Hefecreme” bezeichnet) gemäß einer Ausführungsform der Erfindung veranschaulicht.
2 ein Balkendiagramm ist, das Bakterienauszählungen (CFU/mL) einer kontaminierten Hefecreme nach Behandlung mit einer Bolusdosis von 0, 200 und 500 ppm Chlordioxid entweder bei pH 5 (gefüllte Balken) oder nach vorangegangener Titration mit Schwefelsäure auf pH 2 (offene Balken) zeigt.
3 ein Balkendiagramm ist, das Bakterienauszählungen (CFU/mL) einer kontaminierten Hefecreme nach Behandlung ohne Säure oder Chlordioxid (Kontrolle), Titration mit Mineralsäure auf pH 2 ohne Chlordioxidbehandlung (pH-Kontrolle) und Titration auf pH 2, gefolgt von Behandlung mit einer Bolusdosis von 0, 50, 100, 150 und 200 ppm Chlordioxid zeigt.
4 ein Balkendiagramm ist, das Bakterienauszählungen (CFU/mL) einer kontaminierten Hefecreme nach Behandlung mit 0, 200 und 500 ppm Chlordioxid entweder bei pH 5 (gefüllte Balken) oder nach vorangegangener Titration mit Schwefelsäure auf pH 2 (offene Balken) zeigt.
5 ein Balkendiagramm ist, das Fermentationsausbeuten zu Ethanol aus Glucose und Xylose und Xyloseaufnahmeraten zeigt. Fermentation von lignocellulosehaltigem Hydrolysat wurde mit kontaminierter Hefecreme nach Behandlung mit 0, 200 und 500 ppm Chlordioxid nach vorangegangener Titration mit Schwefelsäure auf pH 2 durchgeführt.
6 ein Balkendiagramm ist, das Bakterienauszählungen (CFU/mL) einer aus einer industriellen Fermentation erhaltenen Hefecreme vor und nach Titration mit Säure auf einen pH 2,0 und vor und nach kombinierter Behandlung von Chlordioxid und Säure, um einen pH von 2,0 zu erreichen. Gefüllte Balken und offene Balken zeigen Bakterienauszählungen vor Behandlung beziehungsweise nach Behandlung an.
Ausführliche Beschreibung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterial.
Die folgende Beschreibung ist lediglich beispielhaft die einer Ausführungsform und ohne Einschränkung der Kombinationen der Merkmale, die notwendig sind, um die Erfindung zu verwirklichen.
Das Zuckerhydrolysat für den Prozess kann aus Zucker und Stärkepflanzen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Weizen, Mais, Zuckerrüben und Zuckerrohr abgeleitet werden. Verfahren zur Herstellung von fermentierbaren Zucker enthaltenden Zuckerhydrolysaten aus solchen Ausgangsmaterialien sind wohlbekannt.
Das Ausgangsmaterial für den Prozess der vorliegenden Erfindung kann auch ein lignocellulosehaltiges Material sein, das jegliche Art Pflanzenbiomasse, wie, aber nicht beschränkt auf, nicht-holzige Pflanzenbiomasse, kultivierte Pflanzen, wie, aber nicht beschränkt auf, Gräser, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, C4 Gräser, wie Rutenhirse, Spartgras, Weidelgras, Miscanthus, Rohrglanzgras oder einer Kombination davon, Zuckerverarbeitungsreste, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, Bagasse, wie Zuckerrohrbagasse, Rübenpulpe oder eine Kombination davon, landwirtschaftlichen Reste, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, Sojabohnenpflanzenreste, Maispflanzenreste, Reisstroh, Reisspelzen, Gerstenstroh, Zuckerrohrstroh, Maiskolben, Weizenstroh, Rapsstroh, Haferstroh, Haferspelzen, Maisfasern oder einer Kombination davon, forstwirtschaftliche Biomasse, zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, recycelte Holzmassenfasern, Sägemehl, Hartholz, zum Beispiel Espenholz, Weichholz oder eine Kombination davon. Des Weiteren kann das lignocellulosehaltige Ausgangsmaterial cellulosehaltiges Abfallmaterial oder forstwirtschaftliche Abfallmaterialien, wie, aber nicht beschränkt auf, Zeitungspapier, Pappkarton und ähnliches sein. Lignocellulosehaltiges Ausgangsmaterial kann eine Faserspezies umfassen oder alternativ kann lignocellulosehaltiges Ausgangsmaterial eine Mischung von Fasern umfassen, die aus verschiedenen lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterialien stammen.
Lignocellulosehaltige Ausgangsmaterialien umfassen Cellulose in einer Menge von größer als etwa 20%, bevorzugter größer als etwa 30%, bevorzugter größer als etwa 40% (w/w). Zum Beispiel kann das lignocellulosehaltige Ausgangsmaterial von etwa 20% bis etwa 50% (w/w) Cellulose umfassen, oder irgendeine Menge dazwischen. Das lignocellulosehaltige Ausgangsmaterial umfasst auch Lignin in einer Menge von größer als etwa 10%, typischer in einer Menge größer als etwa 15% (w/w). Das lignocellulosehaltige Ausgangsmaterial kann auch kleine Mengen an Saccharose, Fructose und Stärke umfassen, Zusätzlich kann das Ausgangsmaterial Pektin enthalten.
Die vorliegende Erfindung kann mit einem lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterial praktiziert werden, dass vorbehandelt worden ist. Vorbehandlungsverfahren sollen eine ausreichende Kombination an mechanischer und chemischer Wirkung liefern, um die Faserstruktur aufzubrechen und die Oberflächenfläche des Ausgangsmaterials zu erhöhen, um es für hydrolytische Enzyme wie Cellulasen zugänglich zu machen. Mechanische Wirkung schließt typischerweise die Verwendung von Druck, Reiben, Mahlen, Schütteln, Zerkleinern, Kompression/Expansion ein und chemische Wirkung schließt die Verwendung von Säure oder Base und Lösungsmitteln ein.
Die Vorbehandlung ist vorzugsweise eine die Zugabe von Säure oder Base einschließende chemische Behandlung. Dies schließt jegliche Säure oder Base ein, die geeignet ist, die Faserstruktur des lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterials aufzubrechen und die Zugänglichkeit des lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterials gegenüber dem Hydrolysiertwerden in einer nachfolgenden enzymatischen Hydrolyse zu erhöhen. Nichtlimitierende Beispiele für solche Zwecke geeigneter Säuren und Basen schließen Schwefelsäure, Salpetersäure, Salzsäure, schwefelige Säure, Phosphorsäure, Ammoniak, Ammoniumhydroxid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Kalk und Magnesiumhydroxid ein.
Vorbehandlung mit Säure hydrolysiert die in dem lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterial anwesende Hemicellulose, oder einen Teil davon, zu monomeren Zuckern, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Xylose, Arabinose, Mannose und/oder Galactose, und organischen Säuren, wie Essigsäure, Galacturonsäure und Glucuronsäure. Saccharose, Fructose und Stärke können auch in dem Zuckerhydrolysat vorliegen. Vorzugsweise wird die Säurevorbehandlung so durchgeführt, dass eine nahezu vollständige Hydrolyse der Hemicellulose und eine kleine Menge an Umwandlung von Cellulose zu Glucose auftritt. Die Cellulose wird in einem nachfolgenden Schritt, der Cellulase-Enzyme und Beta-Glucosidase verwendet, zu Glucose hydrolysiert. Typischerweise wird eine verdünnte Säure bei einer Konzentration von etwa 0,02% (w/v) bis etwa 2% (w/v), oder irgendeine Menge dazwischen, (gemessen als das Prozentgewicht reiner Säure in dem Gesamtgewicht des trockenen Ausgangsmaterials plus wässriger Lösung) zur Vorbehandlung verwendet. Vorzugsweise wird die Säurevorbehandlung bei einer Temperatur von etwa 180°C bis etwa 250°C, oder irgendeiner Temperatur dazwischen, durchgeführt, für eine Zeit von etwa 60 Sekunden bis etwa 600 Sekunden, oder irgendeine Zeit dazwischen, bei einem pH von etwa 0,8 bis etwa 2,0, oder irgendeinem pH dazwischen.
Ein Verfahren, die Säurevorbehandlung des Ausgangsmaterials durchzuführen, ist Dampfexplosion unter Verwendung der in U.S. Patent Nr. 4,461,648 (welches hierein durch Bezugnahme aufgenommen wird) beschriebenen Prozessbedingungen. Ein anderes Verfahren, um den Ausgangsmaterialschlamm vorzubehandeln schließt kontinuierliche Vorbehandlung ein, was bedeutet, dass das lignocellulosehaltige Ausgangsmaterial kontinuierlich durch einen Reaktor gepumpt wird. Kontinuierliche Säurevorbehandlung ist dem Fachmann bekannt, siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 5,536,325 , WO 2006/128304 und U.S. Patent Nr. 4,237,226 (die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden). Andere Techniken, die im Stand der Technik bekannt sind und die wie erforderlich verwendet werden können, schließen die in U.S. Patent Nr. 4,556,430 (welches hierein durch Bezugnahme aufgenommen wird) offenbarten ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Nach der Vorbehandlung kann das lignocellulosehaltige Ausgangsmaterial getrennt werden, um einen das vorbehandelte Ausgangsmaterial umfassenden Feststoffestrom und einen lösliche Komponenten umfassenden wässrigen Strom zu erhalten. Dies kann durch Waschen des vorbehandelten Ausgangsmaterials mit einer wässrigen Lösung durchgeführt werden, um einen Waschstrom zu erzeugen, und einen das vorbehandelte Ausgangsmaterial umfassenden Feststoffestrom. Alternativ wird das vorbehandelte Ausgangsmaterial einer Feststoffe-Flüssigkeitstrennung unterzogen, unter Verwendung bekannter Verfahren wie Zentrifugation, Mikrofiltration, Schichtenfilterfiltration, Kreuzstromfiltration, Druckfiltration, Vakuumfiltration und dergleichen. Wenn eine Säurevorbehandlung verwendet wird, umfasst die wässrige Phase durch die Hydrolyse von Hemicellulose erzeugte Zucker, sowie die während der Vorbehandlung zugegebenen Säure und jegliche während der Vorbehandlung freigewordene organische Säuren. Dieser Strom kann danach verarbeitet werden, um die mineralischen und organischen Säuren zu entfernen, und dann optional zu dem das vorbehandelte Ausgangsmaterial umfassenden Feststoffestrom zurückgeleitet werden. Der aus dem säurevorbehandelten Ausgangsmaterial erhaltene wässrige Strom kann auch fermentiert werden. Zum Beispiel kann in diesem Strom vorhandene Xylose zu Alkoholen, einschließlich Ethanol und Butanol; Zuckersäuren, einschließlich Xylonsäure und Arabonsäure; Zuckeralkoholen, einschließlich Xylit, Arabit, Erythrit, Galactit und Mannit; organischen Säuren, einschließlich Zitronensäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure, Essigsäure, Itaconsäure und Milchsäure; Ketonen, einschließlich Aceton, und Aminosäuren, einschließlich Glutaminsäure, fermentiert werden.
Das vorbehandelte lignocellulosehaltige Ausgangsmaterial wird typischerweise in eine wässrige Lösung, wie Brauchwasser, Frischwasser, Dampfkondensat oder Prozessrecyclingströme geschlämmt. Die Konzentration des vorbehandelten lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterials in dem Schlamm hängt von der Partikelgröße, Wasserretention, Pumpenkapazität und anderen Eigenschaften des Ausgangsmaterials ab. Typischerweise ist die Konzentration zwischen etwa 3% und etwa 30% (w/w), oder irgendeine Menge Faserfeststoffe (auch als suspendierte oder ungelöste Feststoffe bekannt) dazwischen, oder zwischen etwa 10% und etwa 20% (w/w) Faserfeststoffe, oder irgendeine Menge dazwischen. Die Faserfeststoffekonzentration kann höher sein, wenn Entwässerung des Ausgangsmaterialschlamms vor der Vorbehandlung durchgeführt wird, wie zum Beispiel in PCT/CA2009/001191 (hierin durch Bezugnahme aufgenommen) dargelegt. Der wässrige Schlamm hat vorzugsweise eine Feststoffekonzentration, die es ermöglicht ihn zu pumpen. Es wird bevorzugt, dass die Faserfeststoffe wenigstens etwa 20% bis etwa 70% Cellulose nach Gewicht umfassen, oder irgendein Gewichtsprozent dazwischen. Zum Beispiel können die Faserfeststoffe 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% oder 70% nach Gewicht Cellulose umfassen.
Der pH des vorbehandelten Ausgangsmaterials wird typischerweise so angepasst, dass er in einem Bereich ist, der optimal für die verwendeten Cellulase-Enzyme ist. Im Allgemeinen wird der pH des vorbehandelten Ausgangsmaterials in einem Bereich von etwa 3,0 bis etwa 7,0, oder irgendeinem pH dazwischen, angepasst. Zum Beispiel kann der pH in einem Bereich von etwa 4,0 bis etwa 6,0, irgendeinem pH dazwischen, zwischen etwa 4,5 und etwa 5,5 oder irgendeinem pH dazwischen, oder etwa 3,0, 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, oder irgendein pH dazwischen sein.
Die Temperatur des vorbehandelten Ausgangsmaterials wird typischerweise so angepasst, dass sie im Optimumbereich der Cellulase-Enzyme ist. Im Allgemeinen ist eine Temperatur von etwa 45°C bis etwa 55°C, oder irgendeine Temperatur dazwischen, für die meisten Cellulase-Enzyme geeignet, zum Beispiel eine Temperatur von 45, 46, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55°C, oder irgendeine Temperatur dazwischen.
Die Cellulase-Enzyme und das Beta-Glucosidase-Enzym werden vor, während oder nach der Anpassung von Temperatur und pH des wässrigen Schlamms nach der Vorbehandlung zu dem vorbehandelten Ausgangsmaterial gegeben. Vorzugsweise werden die Cellulase-Enzyme und das Beta-Glucosidase-Enzym nach der Anpassung der Temperatur und des pH des Schlamms zu dem vorbehandelten lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterial gegeben.
Mit dem Begriff „Cellulase-Enzyme” oder „Cellulasen” ist eine Mischung von Enzymen gemeint, die Cellulose hydrolysiert. Die Mischung kann Cellobiohydrolasen (CBH), Endoglucanasen (EG), und β-Glucosidase einschließen. In einem nicht limitierenden Beispiel kann eine Cellulasemischung CBH, EG und β-Glucosidase-Enzyme einschließen. Das CBH-Enzym hydrolysiert vorwiegend Cellulosepolymerketten von ihren Enden her, um Cellobiose freizusetzen, und das EG-Enzym hydrolysiert vorwiegend Cellulosepolymer in der Mitte der Kette. Wenn das vorbehandelte Ausgangsmaterial Xylan umfasst, ist es besonders vorteilhaft, wenn die Enzymhydrolyse auch in der Gegenwart von einem oder mehreren Xylanase-Enzymen durchgeführt wird. Beispiele von Xylanase-Enzymen, die zu diesem Zweck verwendet werden können, schließen Xylanase 1, 2 und β-Xylosidase ein, welche typischerweise in Cellulasemischungen vorliegen.
Die Umwandlung von Cellobiose zu Glucose wird durch das Enzym β-Glucosidase durchgeführt. Mit dem Begriff „β-Glucosidase” ist jegliches Enzym gemeint, das das Glucosedimer, Cellobiose, zu Glucose hydrolysiert. Die Aktivität des β-Glucosidase-Enzyms wird durch die Enzymkommission durch seine Aktivität als EC 3.2.1.21 definiert.
Der Prozess der vorliegenden Erfindung kann mit jedem Typ von zur Hydrolyse von Cellulose zu Glucose geeigneten Cellulase-Enzymen durchgeführt werden, unabhängig von ihrer Quelle. Nichtlimitierende Beispiele von Cellulasen, die in der Ausübung der Erfindung verwendet werden können, schließen solche aus Pilzen der Gattungen Aspergillus, Humicola, Chrysosporium, Myceliophtora, Penicillium, Neurospora, Hypocrea und Trichoderma und von Bakterien der Gattungen Bacillus und Thermobifida ein.
Die Dosierung des Cellulase-Enzyms wird gewählt, um die Cellulose des vorbehandelten Ausgangsmaterials zu Glucose umzuwandeln. Zum Beispiel kann eine angemessene Cellulasedosierung etwa 0,1 bis etwa 40,0 Filterpapiereinheiten (FPU oder IU) pro Gramm Cellulose sein, oder irgendeine Menge dazwischen, zum Beispiel 0,1, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0, 8,0, 10,0, 12,0, 14,0, 16,0, 18,0, 20,0, 22,0, 24,0, 26,0, 28,0, 30,0, 32,0, 34,0, 36,0, 38,0, 40,0 FPU (oder IU) pro Gramm Cellulose, oder irgendeine Menge dazwischen.
Die enzymatische Hydrolyse mit Cellulase-Enzymen stellt eine Glucose, nichtumgewandelte Cellulose und Lignin umfassende Lösung her. Andere Komponenten, die in dem Hydrolysatschlamm vorliegen können, schließen Xylose, Arabinose, Mannose und Galactose, Essigsäure, Glucuronsäure und Galacturonsäure, sowie Siliziumdioxid, unlösliche Salze und andere Verbindungen ein.
Obwohl die Herstellung eines Zuckerhydrolysats durch Vorbehandlung, gefolgt von Cellulosehydrolyse des vorbehandelten Ausgangsmaterials mit Cellulase-Enzymen beschrieben worden ist, sollte verständlich sein, dass der wässrige Zuckerstrom aus einer Säure- oder Basenbehandlung, um eine vollständige Hydrolyse der Hemicellulose und Cellulosekomponenten des Ausgangsmaterials zu ihren jeweiligen monomeren Bestandteilen zu bewirken, entstehen kann. Die Hydrolyse kann in zwei Stadien durchgeführt werden (siehe U.S. Patent Nr. 5,536,325 , welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) oder kann in einem einzigen Stadium ausgeführt werden.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird ein Zuckerhydrolysat von einer oder mehreren Hefen fermentiert, um eine das Fermentationsprodukt umfassende Fermentationsbrühe herzustellen. Das Zuckerhydrolysat kann aus verschiedenen Stadien in der Verarbeitung des Ausgangsmaterials entstehen. Wie zuvor beschrieben, kann ein von einem das vorbehandelte Ausgangsmaterial umfassenden Feststoffestrom getrenntes Hemicellulosehydrolysat zur Fermentation gesendet werden. Dieses Zuckerhydrolysat wird typischerweise Xylose, Glucose, Arabinose, Mannose und Galactose umfassen. Nach Trennung des Hemicellulosehydrolysats von den Feststoffen kann die Cellulose in dem vorbehandelten Ausgangsmaterial enzymatischer Hydrolyse unterzogen werden, um Glucose zu ergeben und der resultierende Glucosestrom kann zur Fermentation gesendet werden. Alternativ wird ein sowohl Cellulose als auch aus der Hemicellulosehydrolyse resultierende monomere Zucker umfassender Strom vorbehandelten Ausgangsmaterials enzymatischer Hydrolyse mit Cellulase-Enzymen unterzogen. Dies ergibt ein Zuckerhydrolysat, das sowohl während der Vorbehandlung aus der Hemicellulose freigesetzte Zucker als auch aus der enzymatischen Hydrolyse von Cellulose resultierende Glucose umfasst. In einer weiteren Ausführungsform wird ein Hemicellulosehydrolysat von dem vorbehandelten Ausgangsmaterial getrennt und wird dann zu dem Strom zugegeben, der aus der enzymatischen Hydrolyse von Cellulose erhaltene Glucose umfasst, wodurch ein Strom hergestellt wird, der sowohl Glucose als auch aus Hemicellulose abgeleitete monomere Zucker umfasst, der wiederum zur Fermentation gesendet wird. In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das zur Fermentation gesendete Zuckerhydrolysat durch eine vollständige saure oder alkalische Hydrolyse erhalten, in der sowohl die Cellulose- als auch die Hemicellulosekomponenten des Ausgangsmaterials zu ihren monomeren Bestandteilen hydrolysiert sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zur Fermentation gesendete Zuckerhydrolysat im Wesentlichen frei von ungelösten Feststoffen, wie Lignin oder anderen nichthydrolysierten Komponenten. Dies ist besonders in Ausführungsformen der Erfindung vorteilhaft, die einen nachfolgenden Schritt des Trennens und Recycelns der Hefe von der Fermentationsbrühe einsetzen, da es wünschenswert ist, jegliches bedeutsame Recyceln von ungelösten Feststoffen zusammen mit der Hefe zu vermeiden. Die Trennung kann durch bekannte Techniken durchgeführt werden, einschließlich Zentrifugation, Mikrofiltration, Schichtenfilterfiltration, Kreuzstromfiltration, Druckfiltration, Vakuumfiltration und dergleichen.
Jede einer Anzahl bekannter Hefen kann verwendet werden, um Zucker in dem Zuckerhydrolysat zu Ethanol und anderen Fermentationsprodukten umzuwandeln. Dies schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, Hefen der Gattungen Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces und Candida. Zusätzlich können kommerziell erhältliche Hefen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Turbohefe, Ethanol Red^® Safdistil^®, Thermosac^®, Fermiol^®, Fermivin^®, oder Superstart^TM. Die Hefe kann genetisch manipuliert sein, um sowohl Hexose- als auch Pentosezucker zu Ethanol zu fermentieren. Alternativ kann die Hefe ein Stamm sein, der durch eine oder mehrere nichtrekombinante Verfahren, wie adaptive Evolution oder ungerichtete Mutagenese und Selektion, in die Lage versetzt worden ist, Xylose und Glucose zu fermentieren.
Zum Beispiel kann die Fermentation mit rekombinanter Saccharomyces-Hefe ausgeführt werden. Die rekombinante Hefe kann ein Stamm sein, der durch rekombinanten Einbau von (a) für Xylosereduktase (XR) und Xylitdehydrogenase (XDH) kodierenden Genen (siehe zum Beispiel U.S. Patent Nrn. 5,789,210 , 5866,382 , 6,582,944 und 7,527,927 und EP 450530 ) und/oder (b) (einem) für eine oder mehrere Xyloseisomerasen (XI) kodierende(n) Gen(en) (siehe zum Beispiel U.S. Patente Nrn. 6,475,768 und 7,622,284 ) zur Xylosefermentation befähigt worden ist. Zusätzlich kann der modifizierte Hefestamm auch ein endogenes oder heterologes Gen überexprimieren, das für Xylulokinase (XK) kodiert.
Andere Hefen neben Saccharomyces cerevisiae können Hexose- und Pentosezucker zu Ethanol fermentieren. Dies schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf, Hefen der Gattungen Hansenula, Pichia, Kluyveromyces und Candida. WO 2008/130603 offenbart Hansenula polymorpha-Stämme mit erhöhter Herstellung von Ethanol aus Xylose. Darüber hinaus sind Pichia stipitis- und Candida shehatae-Mutanten durch die im U.S. Patent Nr. 5,126,266 offenbarten Verfahren isoliert worden.
In einem weiteren Beispiel der Erfindung wird die Xylose zu einem Zuckeralkohol umgewandelt. Der Zuckeralkohol kann aus Xylit, Arabit, Erythrit, Mannit und Galactit ausgewählt sein. Vorzugsweise ist der Zuckeralkohol Xylit. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Xylose durch Hefen zu Xylit fermentiert. Hefen, die in der Lage sind Xylose zu Xylit zu fermentiert, schließen Stämme von Candida, Pichia, Pachysolen, Hansenula, Debaryomyces, Kluyveromyces, Saccharomyces und Schizosaccharomyces ein.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist der Hefestamm Candida, vorzugsweise C. tropicalis.
Die Fermentation kann bei oder nahe den Temperatur- und pH-Optima des Fermentationsmikroorganismus durchgeführt werden. Der Temperaturbereich für die Fermentation kann zwischen etwa 10°C bis etwa 70°C sein, obwohl die Temperatur höher sein kann, wenn die Hefe natürlich oder genetisch modifiziert ist, thermostabil zu sein. In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Temperatur von etwa 10°C bis etwa 55°C, oder irgendeine Temperatur dazwischen, oder etwa 15°C bis etwa 45°C, oder irgendeine Temperatur dazwischen. Der pH der Fermentation kann zwischen etwa 3 und etwa 6 sein, oder irgendein pH dazwischen, zum Beispiel ein pH von 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, oder irgendein pH dazwischen. Die Impfkultur des Fermentationsmikroorganismus wird von anderen Faktoren abhängen, wie der Aktivität des Fermentationsmikroorganismus, der erwünschten Fermentationszeit, dem Volumen des Reaktors und anderen Parametern. Es wird verstanden werden, dass diese Parameter vom Fachmann wie erwünscht angepasst werden können, um optimale Fermentationsbedingungen zu erreichen.
Das Zuckerhydrolysat kann auch mit zusätzlichen für Wachstum und Fermentationsleistung des Fermentationsmikroorganismus benötigten Nährstoffen supplementiert werden. Zum Beispiel können Hefeextrakt, spezifische Aminosäuren, Phosphat, Stickstoffquellen, Salze, Spurenelemente und Vitamine zu dem Zuckerhydrolysat zugegeben werden, um Wachstum des Mikroorganismus zu unterstützen und dessen Produktivität zu optimieren. (Siehe auch Verduyn et al., 1992, Yeast 8(7): 501–170, Jørgensen, 2009, Appl Biochem Biotechnol, 153: 44–57 und Zhao et al., 2009, Journal of Biotechnology, 139: 55–60, die hierin jeweils durch Bezugnahme aufgenommen werden). Typischerweise wird die Fermentation unter anaeroben Bedingungen durchgeführt, obwohl aerobe oder microaerobe Fermentationen auch in den Bereich der Erfindung eingeschlossen werden.
Der Begriff „Fermentationssystem” umfasst jede Anordnung eines oder mehrerer Fermentationsreaktoren zur Fermentation von Zuckern durch Hefe zu einem Fermentationsprodukt. In einer Ausführungsform der Erfindung schließt dies Systeme ein, die Heferecycling verwenden. Das Fermentationssystem kann auch Tanks zur Konditionierung der Hefe umfassen. In einem typischen Einsatz kommerziellen Maßstabs wird die Fermentation in einem mehrere, wie 2 bis 6, oder irgendeine Zahl dazwischen, Reaktoren verwendenden System durchgeführt. Die Fermentationsreaktoren können in Serie oder parallel ausgerichtet sein. Die Fermentation kann im Batch durchgeführt werden, in kontinuierlichen oder in Fed-Batch Modi, mit oder ohne Schütteln. In einer Ausführungsform der Erfindung werden/wird der/die Fermentationsreaktor(en) leicht geschüttelt.
Die mikrobiellen Kontaminanten werden dem Oxidationsmittel durch Zugabe von Säure bei einem pH ausgesetzt, der geringer als 3,0 ist. Der pH kann größer als etwa 1 sein, aber weniger als 3,0. Dies schließt alle Unterwerte dazwischen ein, zum Beispiel einen pH von 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, oder irgendeinen pH dazwischen, ist in den Bereich der Erfindung eingeschlossen. Beispiele von pH-Werten, die eingesetzt werden können schließen von etwa 1,0 bis etwa 3,0, 1,0 bis 2,9, 1,0 bis 2,8, 1,0 bis 2,75, 1,0 bis 2,5, 1,0 bis 2,4, 1,0 bis 2,3, 1,0 bis 2,2, 1,0 bis 2,1, oder 1,0 bis 2,0 ein.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Säure eine Mineralsäure, wie Schwefelsäure, Salzsäure, schwefelige Säure, Phosphorsäure oder Salpetersäure.
Jeder Strom von dem Fermentationssystem, der mikrobielle Kontaminanten enthält, kann bei einem pH von weniger als 3,0 dem Oxidationsmittel ausgesetzt werden. Typischerweise werden solche Ströme zusammen mit den mikrobiellen Kontaminanten auch Hefe umfassen, obwohl das Oxidationsmittel und die Säure eingeführt werden könnten, um ein Zuckerhydrolysat vor der Zugabe von Hefe zu dekontaminieren.
Die Säure kann vor Zugabe des Oxidationsmittels zugegeben werden, oder eine Mischung des Oxidationsmittels und der Säure kann in das Fermentationssystem eingeführt werden. Das Oxidationsmittel reagiert schnell, und es ist daher typischerweise nicht vorteilhaft, es vor der Säurezugabe zuzugeben.
In Ausführungsformen der Erfindung, die Heferecycling verwenden, kann die Säure erst zu dem Hefeschlamm, der von der Fermentationsbrühe getrennt ist, zugegeben werden, gefolgt von Zugabe des Oxidationsmittels. Alternativ wird eine Mischung der Säure und des Oxidationsmittels vor der Oxidationsmittelbehandlung zu dem Hefeschlamm zugegeben.
Ein zur Verwendung in der Erfindung geeignetes Oxidationsmittel reduziert bakterielle Kontaminanten zu einem Level, durch das sie nicht länger Produktivität oder Produktausbeute der Fermentation reduzieren. Das Oxidationsmittel sollte keinen bedeutsamen Einfluss auf Hefeviabilität oder Fermentationskapazität haben. Darüber hinaus hat das zur Verwendung in der Erfindung ausgewählte Oxidationsmittel maximale Effektivität in der Reduktion bakterieller Kontaminanten bei einem pH von weniger als 3,0 oder weniger als 2,5. Ein geeignetes Oxidationsmittel kann vom Fachmann durch Routineexperimente ausgewählt werden. Ohne einschränkend zu wirken, kann das Oxidationsmittel Chlordioxid oder Ozon sein.
Vorzugsweise reduziert die Oxidationsmittelbehandlung die Konzentration mikrobieller Kontaminanten (in kolonienformenden Einheiten pro mL Kultur oder CFU/mL) zu etwa 100-fach geringer als die Konzentration der Hefe. Bevorzugter reduziert die Oxidationsmittelbehandlung die Konzentration mikrobieller Kontaminanten auf etwa 10³ CFU/mL oder weniger. Zum Beispiel kann die Oxidationsmittelbehandlung die Konzentration mikrobieller Kontaminanten von etwa 10¹⁰ auf etwa 10³ CFU/mL reduzieren. Bakterielle Kolonien werden mittels Standard-Plattenzählverfahren ausgezählt. Verfahren zum selektiven Ausplattieren von bakteriellen Kolonien und zur Inhibition von Hefewachstum sind bekannt. Ein Beispiel eines solchen Verfahrens umfasst das Erstellen von Serienverdünnungen und das Ausplattieren auf cyclohexamidhaltigen Agarplatten, was selektiv Hefe, aber nicht Bakterien abtötet (siehe zum Beispiel Beispiel 1.1).
Das Oxidationsmittel kann in einer Konzentration von etwa 0,5 ppm bis etwa 1500 ppm, oder irgendeiner Konzentration dazwischen, in das Hefe und mikrobielle Kontaminanten umfassende Fermentationssystem eingeführt werden. In einem kontinuierlichen System würde das Oxidationsmittel typischerweise zu einem oder mehreren mikrobielle Kontaminanten enthaltenden Strömen zugegeben werden. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Oxidationsmittel, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Chlordioxid, in einer Konzentration zwischen etwa 60 und etwa 1000 ppm, oder zwischen etwa 75 und etwa 1000 ppm, einschließlich zwischen etwa 75 ppm und etwa 500 ppm, oder zwischen etwa 80 und etwa 1000 ppm, oder zwischen etwa 90 und etwa 1000 ppm, oder zwischen etwa 100 und etwa 500 ppm, oder irgendeiner Konzentration dazwischen, zugegeben werden. Zum Beispiel kann das Oxidationsmittel, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Chlordioxid, in einer Konzentration von 0,5, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, oder 1500 ppm, oder irgendeiner Konzentration dazwischen, zugegeben werden. Jedoch kann abhängig von dem verwendeten Oxidationsmittel eine höhere Dosis als dies erforderlich sein.
Das Chlordioxid kann unter Verwendung bekannter Verfahren generiert werden, zum Beispiel durch das Reagieren von Chlorgas mit Wasser und darauf Zugeben von Natriumchlorit, oder durch das Reagieren von Natriumhypochlorit mit einer Säure und Zugeben von Natriumchlorit. In einem Beispiel der Erfindung wird stabilisiertes Chlordioxid (SCD) angesäuert und das dann hergestellte Chlordioxid kann in die Fermentation, wie zu dem angesäuerten Hefeschlamm wenn Heferecycling verwendet wird, eingeführt werden. Alternativ kann nach dem Ansäuern SCD direkt zur Fermentation gegeben werden. In diesem letzteren Beispiel wird Chlordioxid in situ generiert werden. (Siehe zum Beispiel Kim et al., 2008, Food Microbiology, 25: 964–969 und WO 2007/149450 ).
Die Oxidationsmittelbehandlung wird bevorzugt bei einer Temperatur von zwischen etwa 4°C und etwa 40°C durchgeführt, oder irgendeiner Temperatur dazwischen, zum Beispiel 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40°C, oder irgendeiner Temperatur dazwischen. Die Dauer der Behandlung kann von 5 Sekunden bis etwa 60 Minuten sein, oder irgendeine Zeit dazwischen, zum Beispiel 5, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Sekunden oder 10, 20, 30, 40, 50, 60 Minuten, oder irgendeine Zeit dazwischen. Wie vom Fachmann anerkannt würde, können Chlordioxid umfassende Reaktionen schnell oder sogar unmittelbar voranschreiten. Dementsprechend können kürzere Aufenthaltszeiten verwendet werden, oder die Aufenthaltszeit kann gänzlich eliminiert werden, wenn dieses Oxidationsmittel verwendet wird. Jedoch ist die Praxis der Erfindung nicht durch irgendeine bestimmte Auswahl der Aufenthaltszeit während der Oxidationsmittelbehandlung beschränkt, da unmittelbare Reaktionsraten auch bedacht sind.
In denjenigen Ausführungsformen, die Heferecycling anwenden, ist die Konzentration von Zellen in dem dem Oxidationsmittel und der Säure ausgesetzten Hefeschlamm (hierin auch als „Hefecreme” bezeichnet) typischerweise von etwa 50 g/L bis etwa 300 g/L (Trockenzellgewicht). Zum Beispiel kann die Konzentration von Zellen in dem Hefeschlamm 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, oder 300 g/L (Trockenzellgewicht) sein. Bevorzugter ist die Konzentration von Zellen in dem Hefeschlamm von etwa 50 g/L bis etwa 300 g/L, oder von etwa 150 g/L bis etwa 250 g/L, oder von etwa 175 g/L bis etwa 225 g/L (Trockenzellgewicht).
Die Fermentation kann so durchgeführt werden, dass die Hefen von der Fermentation getrennt und in die Fermentationsreaktion zurückgesendet werden (hierin auch als „Heferecycling” bezeichnet). Dies umfasst Entnehmen von Fermentationsbrühe aus dem Fermentationsreaktor und Trennen der Hefe von dieser Lösung durch bekannte Trennungstechniken, um einen Hefeschlamm herzustellen. Beispiele geeigneter Trennungstechniken schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Zentrifugation, Mikrofiltration, Schichtenfilterfiltration, Kreuzstromfiltration, Druckfiltration, Absetzen, Vakuumfiltration und dergleichen. In einem Beispiel der Erfindung ist das Recycling kontinuierlich, was bedeutet, dass die Hefe kontinuierlich durch das Fermentationssystem recycelt wird. In einer alternativen Ausführungsform wird das Heferecycling im Batch-Modus betrieben.
Nach Behandlung des angesäuerten Hefeschlamms mit dem Oxidationsmittel wir der oxidationsmittelbehandelte Hefeschlamm in die Fermentationsreaktion wiedereingeführt. Eine Hefesäuberung kann nach der Trennung der Hefe von der Fermentation und vor Aussetzung gegenüber dem Oxidationsmittel und niedrigem pH angewendet werden. Vorzugsweise werden zwischen etwa 10% und etwa 99%, oder irgendeine Menge dazwischen, der gesamten Hefezellen in dem Hefeschlamm mit dem Oxidationsmittel und der Säure behandelt und dann recycelt. Bevorzugter werden zwischen 80% und 95% der Hefezellen behandelt und recycelt, und am meisten bevorzugt werden wenigstens 90% der Hefezellen behandelt und recycelt.
Es sollte nachvollziehbar sein, dass die Ausübung der Erfindung nicht durch die Zahl der Zyklen des Hefezellrecyclings begrenzt wird. Heferecycling kann wenigstens einmal, oder zwischen 5- und 70-mal, oder sogar öfter als das wiederholt werden. Ohne die Absicht, in irgendeiner Weise begrenzend zu sein, kann Heferecycling 5-, 10-, 15-, 20-, 25-, 30-, 35-, 40-, 45-, 50-, 55-, 60-, 65-, oder 70-mal wiederholt werden. Es sollte auch nachvollziehbar sein, dass die Oxidationsmittelbehandlung nicht mit jedem Recycling durchgeführt werden muss. Die Behandlungshäufigkeit kann vom Fachmann wie gewünscht angepasst werden, um die Ausführung zu optimieren und Bakterienzahlen zu minimieren.
Die Fermentation kann mehrere Fermentationsreaktoren anwenden. In solchen Ausführungsformen wird Hefe einem Reaktor im System entzogen, mit der Säure und Chlordioxid oder einem anderen geeigneten Oxidationsmittel behandelt und dann wieder in einen oder mehrere der Fermentationsreaktoren oder einen Konditionierungs- oder Wiederherstellungsreaktor zurück wiedereingeführt. Die angesäuerte, oxidationsmittelbehandelte Hefe kann in denselben Reaktor in der Serie oder in einen anderen Reaktor wieder eingespeist werden. Durch Rezirkulieren der Hefe auf diese Art wird ihre Konzentration erhalten und auf lignocellulosehaltiges Hydrolysat konditioniert, was die volumetrische Rate der Reaktion erhöht und auch die Ausbeute auf das erwünschte Produkt durch das Minimieren der Umleitung von Kohlenstoff und anderen Nährstoffen auf die Bakterienzellproduktion maximiert.
Nun Bezug auf 1 nehmend wird dort ein Fermentationssystem mit Heferecycling dargestellt. 1 ist als ein Beispiel eingeschlossen, wie die Erfindung ausgeführt werden kann, und soll in keiner Weise beschränkend wirken. Das heißt, die Erfindung kann mit oder ohne Heferecycling ausgeführt werden.
Ein wässriges, aus Vorbehandeln des lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterials erhaltenes Zuckerhydrolysat 6 wird zuerst in einen Fermentationsreaktor 8 eingespeist. Der Zuckerstrom wird zuvor behandelt, um unlösliches Lignin und andere suspendierte Flüssigkeiten zu entfernen. Der Zuckerstrom 6 wird mit Hefe aus einem Konditionierungstank 14 von Leitung 16 oder von der recycelte Hefe enthaltenden Leitung 38 kombiniert. In den Konditionierungstank 14 wiederum wird ein Luft und einen Teil des Zuckers aus Strom 6 enthaltender Strom eingespeist. Eine fermentierte, Ethanol umfassende Lösung wird aus dem Reaktor 8 über Leitung 18 entzogen und in eine Trennungseinheit 22, typischerweise eine Zentrifuge, eingespeist, die die Hefe von der fermentierten Lösung trennt. Abgetrenntes Bier, welches Ethanol enthält, wird dann zur Destillation gesendet, um eine an Ethanol angereicherte Lösung zu erhalten. Ein Teil des Hefeschlamms in Leitung 26 wird abgelassen, und nach dem Ablassen wird die Restmenge der Hefe mit einer wässrigen Lösung von Chlordioxid bei einem pH von weniger als 3 gewaschen und darauf durch Leitung 26 in einen Vorratstank 30 eingespeist, wo sie unter geeigneten Bedingungen gehalten werden. Die angesäuerte, chlordioxidbehandelte Hefe werden dann entlang der Leitung 34 eingespeist, welche sich in die Leitung 38 verzweigt, welche wiederum einen Teil der Hefe zurück zu Fermentier 8 einfügt, um Xylose zu Ethanol umzuwandeln. Die Restmenge der Hefe kann für Zellwachstum durch die Leitung 34 zum Konditionierungstank 14 gesendet werden, und anschließen daran wird die Hefe zum zweiten Fermenter 42 gesendet, und der Zyklus wird noch einmal wiederholt. Dieser Zyklus kann dann mit Fermenter drei 46 wiederholt werden.
Obwohl drei Fermenter in 1 dargestellt werden, wird der Fachmann anerkennen, dass die Zahl der Fermenter wie erforderlich verändert werden kann. Außerdem können, obwohl die Fermenter parallel gezeigt werden, sie stattdessen in Serie angeordnet sein. Darüber hinaus ist bedacht, dass der Vorratstank 30 ausgeschlossen werden kann, in welchem Fall die Hefe anschließend zum Beispiel in dem Fermenter 8 gehalten wird. In noch einer weiteren Abwandlung wird die gesamte Hefe aus Leitung 34 über Leitung 38 zurück zum Fermenter 8 gesendet, ohne dass ein Teil zur Konditionierung abgeleitet wird. Alternativ wird die gesamte Hefe in Leitung 34 zum Konditionierungstank 14 gesendet und danach zum Fermenter 2 gesendet.
Wenn Ethanol das Produkt der Fermentation ist, wird es durch Destillation gewonnen. Die getrennte Fermentationsbrühe oder das Bier, dass zur Destillation gesendet wird, ist eine verdünnte Alkohollösung, welche im Wesentlichen frei von Feststoffen einschließlich nicht umgewandelter Cellulose ist, obwohl sie/es während der Fermentation zur Unterstützung des Wachstums der Mikroorganismen zugegebene Komponenten, sowie kleine Mengen an Hefe, die nach der Trennung 16 zurückbleiben können, enthalten kann. Das Bier wird vorzugsweise entgast, um Kohlendioxid zu entfernen, und dann durch eine oder mehr Destillationskolonnen gepumpt, um den Alkohol von den anderen Komponenten im Bier zu trennen. Die Kolonne(n) in der Destillationseinheit wird vorzugsweise in einem kontinuierlichen Modus betrieben, obwohl es anerkannt werden sollte, dass Batch-Prozesse von der vorliegenden Erfindung auch umfasst werden. Darüber hinaus kann/können die Kolonne(n) bei jedem geeigneten Druck betrieben werden, und Hitze für den Destillationsprozess kann an einem oder mehreren Punkten entweder durch direkte Dampfinjektion oder indirekt über Wärmeaustauscher zugegeben werden. Die Destillationseinheit kann eine oder mehrere gesonderte Bier- und Rektifikationskolonnen enthalten, in welchem Fall verdünntes Bier zur Bierkolonne gesendet wird, wo es teilweise konzentriert wird. Von der Bierkolonne geht der Dampf zu einer Rektifikationskolonne zur weiteren Reinigung. Alternativ wird eine Destillationskolonne eingesetzt, die einen integralen Anreicherungs- oder Rektifikationsabschnitt umfasst. Das verbleibende Wasser kann aus dem Dampf durch ein Molekularsiebharz entfernt werden, durch Absorption, oder andere dem Fachmann bekannte Verfahren. Der Dampf kann dann kondensiert und denaturiert werden.
Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter veranschaulicht werden. Jedoch ist anzuerkennen, dass diese Beispiele lediglich zu veranschaulichenden Zwecken dienen, und nicht verwendet werden sollten, um den Umfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Chlordioxidbehandlungen angesäuerter Hefecreme: antibakterielle Wirksamkeit und Dosierungserfordernisse
Beispiel 1.1: Synergistischer antibakterieller Effekt von Chlordioxid und pH.
Mit verdünnter Säure vorbehandeltes Weizenstroh wurde wie in U.S. Patent Nr. 4,461,648 (hierin durch Bezugnahme aufgenommen) dargestellt im industriellen Maßstab hergestellt und dann mit Cellulase-Enzymen und β-Glucosidase hydrolysiert, um ein aus den Hemicellulose und Cellulosekomponenten des Ausgangsmaterials gewonnnen Zucker enthaltendes Hydrolysat herzustellen. Dieses Hydrolysat wurde in einer industriellen Fermentation mit einem in der ebenfalls anhängigen und im Gemeinschaftsbesitz befindlichen WO 2009/026706 (hierin durch Bezugnahme aufgenommen) dargestellten Saccharomyces cerevisiae Hefestamm fermentiert, um Ethanol herzustellen. Heferecycling wurde während der Fermentation angewendet.
Eine von der Fermentationsbrühe getrennte und mit Bakterien, die in der industriellen Fermentation proliferierten, kontaminierten Hefecreme (hierin auch als „Hefeschlamm” bezeichnet) wurde bei 20°C mit Säure alleine, Chlordioxid alleine, oder einer Kombination der beiden behandelt. Im säurebehandelten Zustand wurde der pH mit Schwefelsäure von 5,0 auf 2,0 gesenkt. Im chlordioxidbehandelten Zustand wurde ein konzentrierter Stamm von Chlordioxid in Wasser (10 000 ppm) durch Durchleiten einer Mischung von Chlor- und Stickstoffgas durch Natriumchloritkolonnen bereitet. Das resultierende ClO₂-Gas wurde in 4 L kaltes entionisiertes Wassers geperlt, bis die gewünschte Konzentration erreicht war. Diese Chlordioxidlösung wurde verwendet, um die Hefecreme zu behandeln.
In der Kombinationsbehandlung wurde die Hefecreme zuerst mit Schwefelsäure für 5 Minuten auf pH 2,0 erniedrigt und danach mit der angezeigten Bolusdosis Chlordioxid für 5 Minuten behandelt. In Fällen wo der pH erniedrigt wurde, wurde die Hefecreme mit Natriumhydroxid nach 10 Minuten und vor dem Ausplattieren zur bakteriellen Auszählung zurück auf 5,0 titriert. Die Dauer der Säureexposition war auf 10 Minuten begrenzt, um der Dauer der Exposition für die anderen Behandlungen zu entsprechen.
Bakterielle Kolonien wurden durch Standardplattenzählverfahren ausgezählt. Um selektiv Bakterienkolonien zu auszuplattieren und Hefewachstum zu inhibieren, wurden Agarplatten mit tryptischem Soja (15 g/L pankreatischer Verdau von Casein, 5 g/L enzymatischer Verdau von Sojabohnenmehl, 5 g/L Natriumchlorid und 15 g/L Agar) mit 100 mg/L Cycloheximid verwendet. Die Proben wurden vor dem Ausplattieren seriell in sterile Saline (0,9% NaCl w/v) verdünnt.
2 illustriert den synergistischen Effekt von Chlordioxid und niedrigem pH. Fehlerbalken stellen die Standartabweichung des Mittels von doppelten Experimenten dar, jedes dreifach ausplattiert. Diese Daten zeigen, dass Erniedrigen des pH alleine oder Chlordioxid alleine bei der Reduktion der bakteriellen Population nicht so effektiv sind verglichen mit wenn der pH zuerst erniedrigt wird und dann gefolgt von einer Chlordioxidbehandlung bei dem niedrigen pH. Ein Erhöhen der Chlordioxidkonzentration hat einen vernachlässigbaren Effekt auf bakterielle Populationen bei pH 5,0 (vergleiche die gefüllten Balken bei 0, 200 und 500 ppm Chlordioxid). Ähnlich vermindert ein Erniedrigen des pH ohne Chlordioxid die bakterielle Population nicht (vergleiche offene und geschlossene Balken bei 0 ppm Chlordioxid). Chlordioxidbehandlungen von 200 ppm und 500 ppm, wenn mit erniedrigtem pH kombiniert, reduzierten die bakterielle Population um 10² CFU/mL beziehungsweise 10³ CFU/mL (siehe offene Balken bei 200 ppm und bei 500 ppm).
Beispiel 1.2: Effekt der Chlordioxiddosis auf bakterielle Kontamination einer Hefefermentationskultur.
Kontaminierte, aus der Fermentation des Beispiels 1.1 erhaltene Hefecreme wurde mit Schwefelsäure auf pH 2,0 titriert, mit verschiedenen Konzentrationen Chlordioxid behandelt (0, 50, 100, 150 und 200 ppm) und ausplattiert, um wie oben dargelegt die bakterielle Reduktion bei pH 2,0 zu bestimmen, mit der Ausnahme, dass die Temperatur der Behandlung 30°C statt 20°C war. Bakterielle Populationen wurden wie zuvor beschrieben ausgezählt. (Beispiel 1.1). Bakterielle Populationen wurden auch in einer Kontrollprobe ausgezählt, die nicht Chlordioxid oder pH-Titration unterzogen wurde.
3 illustriert die Ergebnisse. Fehlerbalken stellen die Standartabweichung des Mittels von doppelten Experimenten dar, jedes dreifach ausplattiert. Wie in der Figur gezeigt reduzierte eine Chlordioxidkonzentration von 100 ppm bei pH 2 und 30°C die Kontamination in einer Hefecreme um 10² CFU/mL. Mit 200 ppm Chlordioxid bei 30°C behandelte Hefecreme reduzierte die Bakterienzahlen um eine Größenordung von größer als 10⁵ CFU/mL, was eine größere Reduktion als die 500 ppm Behandlung bei Raumtemperatur darstellt (100-fache Reduktion; siehe 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass Erhöhen der Temperatur der Behandlung um 10°C weiter die Reaktivität des ClO₂ erhöhte, was eine erhöhte Wirksamkeit bei reduzierter Dosis ermöglicht. Insbesondere hatten bei 200 ppm, die 10³ CFU/mL Verdünnungsplatten kein bakterielles Wachstum, was anzeigt, dass die maximale bakterielle Reduktion höher als 10⁵ CFU/mL bei 200 ppm war. Die Zugabe von Säure alleine (pH Kontrolle) reduzierte die Bakterienpopulation nicht.
Beispiel 2: Anti-bakterielle Behandlungen mit niedrigem pH und Chlordioxid auf Hefekulturviabilität und Fermentationsleistung.
Eine Probe Hefecreme von Beispiel 1.1 wurde für Hefewachstum nach den darin beschriebenen Behandlungen ausplattiert. Das heißt, kontaminierte Hefecremes wurden bei 20°C mit Schwefelsäure alleine bei pH 2 oder in Kombination mit Chlordioxid bei 0, 200 und 500 ppm behandelt. Selektives Hefewachstum wurde durch serielles Verdünnen der Creme in steriler Saline (0,9% NaCl w/v) und Ausplattieren auf 34 mg/L Chloramphenicol zur Verhinderung bakteriellen Wachstums enthaltende YM Agarplatten (10 g/L Glucose, 5 g/L Pepton, 3 g/L Hefeextrakt, 3 g/L Malzextrakt, 20 g/L Agar) ermöglicht.
Die Ergebnisse werden in 4 gezeigt. Fehlerbalken stellen die Standartabweichung des Mittels von doppelten Experimenten dar, jedes dreifach ausplattiert. Die Figur zeigt klar, dass die Viabilität der Fermentationshefekultur weder durch die Säurebehandlung noch durch die Kombination von Säure und Chlordioxid beeinträchtigt wird. Wie ersichtlich ist, hat die Erhöhung der Chlordioxiddosis einen vernachlässigbaren Effekt auf Fermentationshefepopulationen unabhängig vom pH der Behandlung.
Hefefermentationsleistung wurde durch Inokulation der kontaminierten Kontrollhefe, der säurebehandelten Hefe und kombiniert säure-chlordioxidbehandelten Hefecremes (wie in Beispiel 1.1 dargelegt behandelt) in 400 mL lignocellulosehaltiges Hydrolysat ausgewertet. Das lignocellulosehaltige Hydrolysat wurde wie in Beispiel 1.1 dargelegt hergestellt. Vor der Inokulation wurde das Medium für zwei Minuten mit reinem CO₂ durchperlt, um Anaerobität zu gewährleisten. Den Zellen wurde die Fermentation bei 30°C, 150 rpm ermöglicht, bis der Zucker verbraucht war. Die CO₂-Produktion wurde für den Verlauf der Fermentation überwacht und Proben wurden für Trockenzellgewicht und HPLC-Analyse genommen.
Die Proben wurden unter Verwendung des Trockenzellgewichts auf Zellmasse untersucht (Rice et al. (1980) Am. Soc. Brew. Chem. J. 38: 142–45, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird). Für die Fermentabilitätsanalyse wurden Proben unter Verwendung einer 10 mL Spritze von den Bioreaktoren genommen. Von jeder Probe wurden Zellen in 2 mL Kulturproben durch Zentrifugation pelettiert und der Überstand abgegossen und durch einen 0,2 μm Spritzenfilter filtriert. Jede Überstandprobe wurde mit 5 mM Schwefelsäure verdünnt. Alle Verdünnungen wurden auf der Agilent 1100 Series Refractive Index Detector HPLC auf Glucose, Xylose, Xylose, Xylit, Glycerol und Ethanolgehalt untersucht, während Essig- und Milchsäure gleichzeitig unter Verwendung einer Agilent 1200 Series Variable Wavelength Detector HPLC untersucht wurden. Die zur Trennung verwendete Säule war die Varian Metacarb 87H Organic Acid Säule, die auf 50°C gehalten wurde mit einer 5 mM Schwefelsäure mobilen Phase bei einer Flussrate von 0,6 mL/min. Die Einheit war mit dem 1100 Series Auto-sampler and Pumping System ausgestattet und wurde mit der Chemstation Software kontrolliert.
Für die Fermentation von lignocellulosehaltigem Hydrolysat werden die Raten der Xyloseaufnahme und Ausbeuten an Ethanol aus Glucose und Xylose in 5 gezeigt. Unter Verwendung gleichwertiger Zellkonzentrationen weist die Xyloseverbrauchsrate im lignocellulosehaltigen Hydrolysat einen relativen Abfall sowohl bei der Säurebehandlung als auch bei kombinierter Säure-Chlordioxidbehandlung auf. Es folgt daraus, dass die Rate des Xyloseverbrauchs in der unbehandelten Kontrolle höher wäre, da die kontaminierenden Mikroben Xylose verbrauchen. Dies wird weiter durch die in der Ethanolausbeute aus Xylose beobachtete Änderung gestützt. Die abfallenden Raten zeigen an, dass Bakterien nicht länger Xylose verbrauchen und es ermöglichen, dass mehr dieses Zuckers durch die fermentierende Hefe zu Ethanol umgewandelt wird, so dass die Ausbeute gesteigert wird. Es kann auch beobachtet werden, dass der Abfall in den Raten, gekoppelt mit der Steigerung in den Ausbeuten mit der kombinierten Säure-Chlordioxidbehandlung größer ist als mit Säurebehandlung alleine.
Beispiel 3: Anti-bakterieller Effekt von Chlordioxid und pH bei Einsätzen im Industriemaßstab.
Ein Hydrolysat aus einem mit verdünnter Säure vorbehandelten lignocellulosehaltigen Ausgangsmaterial wurde wie in U.S. Patent Nr. 4,461,648 (hierin durch Bezugnahme aufgenommen) dargelegt hergestellt. Das Hydrolysat wurde mit dem in der ebenfalls anhängigen und im Gemeinschaftsbesitz befindlichen WO 2009/026706 (hierin durch Bezugnahme aufgenommen) dargelegten Hefestamm fermentiert, um Ethanol herzustellen.
Ein Volumen von 100 000 L Gesamtfermentationsbrühe wurde nach Vollendung der Fermentation in eine Bierfraktion und eine Hefecreme getrennt. Die Hefecreme würde auf etwa 170 g Trockenzellgewicht/L konzentriert. Vor dem Recycling in das nächste Fermentationsbatch wurde die mit Bakterien kontaminierte Hefecreme bei 20°C mit Säure alleine behandelt (Batch 1) oder wurde mit Säure in Kombination mit Chlordioxid (Batch 2) behandelt. Während der Säurebehandlung wurde für jedes der zwei Batches der pH der konzentrierten Hefecreme unter Verwendung von Leitungszugabe 93%iger (w/v) Schwefelsäure auf 2,0 erniedrigt. Chlordioxid wurde in konzentrierter Form in einer nominellen Konzentration von 2700 ppm unter Verwendung eines kommerziell von Pureline, Palatine, IL erhältlichen Systems generiert. In der Kombinationsbehandlung wurde der Säuregrad der Hefecreme zuerst auf einen pH von 2,0 erniedrigt (gemäß Beispiel 1.1) und danach bei einer Bolusdosis von 200 ppm Chlordioxid mit einer Verweildauer von ungefähr 45 Sekunden behandelt. Nach der Behandlung wurde die Hefecreme in die Fermentation zurück eingespeist.
Bakterielle Kolonien wurden durch Standardplattenzählverfahren ausgezählt. Um selektiv Bakterienkolonien zu plattieren und Hefewachstum zu inhibieren, wurden Agarplatten mit tryptischem Soja (15 g/L pankreatischer Verdau von Casein, 5 g/L enzymatischer Verdau von Sojabohnenmehl, 5 g/L Natriumchlorid und 15 g/L Agar) mit 100 mg/L Cycloheximid verwendet. Die Proben wurden vor dem Ausplattieren seriell in sterile Saline (0,9% NaCl w/v) verdünnt.
6 illustriert die Wirksamkeit von kombinierter Säurebehandlung und Chlordioxidverwendung bei niedrigem pH. Erniedrigung des pH durch Zugabe von Schwefelsäure reduzierte bakterielle Kontaminationszählungen um 10² CFU/mL, wogegen Säurebehandlung in Kombination mit der Zugabe von Chlordioxid in der Lage war, die bakteriellen Kontaminationszählungen um 10⁴ CFU/mL zu vermindern.
Die vorliegende Erfindung ist im Hinblick auf eine oder mehrere Ausführungsformen beschrieben worden. Jedoch wird es für den Fachmann offensichtlich sein, dass eine Anzahl von Variationen und Abwandlungen gemacht werden können, ohne vom Bereich der wie in den Ansprüchen definierten Erfindung abzuweichen.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims

Ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat, umfassend: (i) Fermentieren des Zuckerhydrolysats in einem Fermentationssystem mit Hefe, um eine ein Fermentationsprodukt umfassende Fermentationsbrühe herzustellen; (ii) Einführen von Säure und Chlordioxid in das Fermentationssystem, um jegliche mikrobiellen Kontaminanten in dem Fermentationssystem in einem oder mehreren Stadien Chlordioxid bei einem pH von weniger als 3,0 auszusetzen; und (iii) Gewinnen des Fermentationsprodukts.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat, umfassend: (i) Entfernen suspendierter Faserfeststoffe von dem Zuckerhydrolysat, um eine geklärte Zuckerlösung zu erhalten; (ii) Fermentieren von Zucker in der geklärten Zuckerlösung in einer Fermentationsreaktion unter Verwendung von Hefe, um eine das Fermentationsprodukt umfassende Fermentationsbrühe herzustellen; (iii) Trennen der Hefe von der Fermentationsbrühe, um einen Hefeschlamm und ein Fermentationsprodukt herzustellen; (iv) Einführen von Säure und Chlordioxid in den Hefeschlamm, um jegliche mikrobiellen Kontaminanten und Hefe in dem Hefeschlamm Chlordioxid bei einem pH von weniger als 3,0 auszusetzen; (v) Wiedereinführen wenigstens eines Teils des chlordioxidbehandelten Hefeschlamms zurück in den Schritt des Fermentierens, um die Konzentration an Hefe in der Fermentationsreaktion zu erhalten; und (vi) Gewinnen des Fermentationsprodukts.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Schritt des Fermentierens (Schritt ii) in einem aus einer Serie von Fermentationsreaktoren durchgeführt wird und wobei im Schritt des Wiedereinführens (Schritt v) der chlordioxidbehandelte Hefeschlamm zurück in denselben oder in einen anderen Fermentationsreaktor in der Serie wieder eingeführt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Zuckerhydrolysat wenigstens Xylose, Glucose oder eine Kombination davon umfasst.
Das Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei im Schritt des Fermentierens das Fermentationsprodukt Ethanol ist und wobei die Hefe eine Saccharomyces spp. ist, die Glucose und Xylose zu Ethanol umwandelt.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5, wobei im Schritt des Einführens das Chlordioxid in einer Konzentration von zwischen etwa 0,5 und etwa 1500 ppm zugefügt wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei im Schritt des Einführens die Konzentration mikrobieller Kontaminanten in dem Hefeschlamm auf wenigstens 100-fach niedriger als die der Hefe reduziert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei im Schritt des Einführens die Konzentration mikrobieller Kontaminanten in dem Hefeschlamm auf unter etwa 10³ CFU/mL reduziert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei im Schritt des Einführens die Konzentration der Hefezellen in dem Hefeschlamm von etwa 10 g/L bis etwa 300 g/L Trockenzellgewicht ist.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–9, wobei während des Aussetzens der pH-Wert größer als etwa 1, aber weniger als 2,5 ist.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–10, wobei während des Aussetzens der pH-Wert größer als oder gleich 1, aber weniger als oder gleich 2,5 ist.
Das Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1–11, wobei während des Aussetzens die Säure vor dem Chlordioxid zugegeben wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei im Schritt des Einführens die Hefen in dem Fermentationssystem Chlordioxid bei einem pH von weniger als 3,0 ausgesetzt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat umfassend: (i) Fermentieren des Zuckerhydrolysats in einem Fermentationssystem mit Hefe, um eine ein Fermentationsprodukt umfassende Fermentationsbrühe herzustellen; (ii) Einführen von Säure und einem Oxidationsmittel in das Fermentationssystem, um jegliche mikrobiellen Kontaminanten in dem Fermentationssystem in einem oder mehreren Stadien dem Oxidationsmittel bei einem pH von weniger als 3,0 auszusetzen; und (iii) Gewinnen des Fermentationsprodukts.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Fermentationsprodukts aus einem Zuckerhydrolysat, umfassend: (i) Fermentieren des Zuckerhydrolysats in einem Fermentationssystem mit Hefe, um eine ein Fermentationsprodukt umfassende Fermentationsbrühe herzustellen; (ii) Kontinuierliches Einführen von Säure und einem Oxidationsmittel in das Fermentationssystem, um mikrobielle Kontaminanten in dem Fermentationssystem kontinuierlich in einem oder mehreren Stadien dem Oxidationsmittel bei einem pH von weniger als 3,0 auszusetzen; und (iii) Gewinnen des Fermentationsprodukts.