DE1089513B - Process for the preparation of the antibiotic rifomycin and its components - Google Patents
Process for the preparation of the antibiotic rifomycin and its componentsInfo
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Description
Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Rifomycin und seiner Komponenten Die Herstellung von Rifomycin und seinen Komponenten A, B, C, D, E, bei dem ein Rifomycin erzeugender Stamm von Streptomyces mediterranei (A. T. C. C. Nr. 13 685) oder eine natürlich vorkommende oder künstlich hergestellte Mutante desselben in einem assimilierbare Quellen von Kohlehydraten, Stickstoff und anorganischen Salzen enthaltenden Kulturmedium so lange gezüchtet wird, bis das Medium eine wesentliche antibiotische Aktivität erworben hat, und man dann aus dem Medium Rifomycin und seine Komponenten gewinnen kann.Process for the preparation of the antibiotic rifomycin and its components The production of rifomycin and its components A, B, C, D, E, in which a Streptomyces mediterranei rifomycin producing strain (A. T. C. C. No. 13 685) or a naturally occurring or artificially produced mutant thereof in an assimilable source of carbohydrates, nitrogen and inorganic salts containing culture medium is grown until the medium has a substantial has acquired antibiotic activity, and then from the medium rifomycin and can win its components.
Der Stamm Streptomyces mediterranei wurde aus einer Bodenprobe aus der Umgebung von St. Raphael (Frankreich) isoliert und hat die folgenden charakteristischen Eigenschaften, die bei verschiedenen Medien in Schrägnährbodenkulturen nach Einwirkung bis zu 20 Tagen bei 28°C beobachtet wurden. Die Farbbebestimmung wurde nach dem Dictionary of Colour von Maerz und Paul, McGraw Hill, 1950, vorgenommen. Hafermehl-Agar Ziemlich gutes Wachstum mit glatter Oberfläche. Das vegetative Mycel ist glasig bis gelblich mit rosafarbener Unterseite. Das weißliche Luftmycel hat eine rosa Farbe. Spuren eines gelblichen löslichen Pigments.The strain Streptomyces mediterranei was selected from a soil sample the area around St. Raphael (France) and has the following characteristic Properties common to various media in inclined culture media after exposure observed for up to 20 days at 28 ° C. The color determination was after Dictionary of Color made by Maerz and Paul, McGraw Hill, 1950. Oatmeal agar Fairly good growth with a smooth surface. The vegetative mycelium is glassy to yellowish with a pink underside. The whitish aerial mycelium is pink Colour. Traces of a yellowish soluble pigment.
Hefeextrakt-Glukose-Agar Reichlich gelbliches bis rosa Wachstum mit zerklüfteter Oberfläche. Geringfügiges Luftmycel. Keine Pigmentation der Medien.Yeast Extract Glucose Agar Abundant yellowish to pink growth with rugged surface. Minor aerial mycelium. No pigmentation of the media.
Emerson-Glukose-Agar Reichliches gelbliches bis blaßorangefarbenes Wachstum mit zerklüfteter Oberfläche. Das Luftmycal wird rosa (2/B/8). Hellbernsteinfarbenes lösliches Pigment. Hafermehl-Mischagar(1) Gutes Wachstum, glatt, gelblich mit leicht oranger Färbung. Luftmycel weißlich bis rosa. Bernsteinfarbenes lösliches Pigment.Emerson Glucose Agar Abundant yellowish to pale orange in color Growth with a fissured surface. The aerial mycal turns pink (2 / B / 8). Light amber soluble pigment. Oatmeal Mix Agar (1) Good growth, smooth, yellowish with slightly orange color. Aerial mycelium whitish to pink. Amber colored soluble pigment.
Agar nach Benett Gutes Wachstum, gelblich bis orangegelb. Luftmycel wird rosa. Helles bernsteinfarbenes Pigment.Benett agar Good growth, yellowish to orange-yellow. Aerial mycelium turns pink. Light amber pigment.
Agar nach Penassay (Difoo) Schwaches Wachstum.Agar after Penassay (Difoo) Weak growth.
(1) Hafermehl-Mischagar enthielt außer Hafermehl (20 g gekochtes Haferflocken-Filtrat) : Enzymatisches Kasein-Hydrolysat 5, g; Saccharose 10 g; Agar 40 g, in 1000 ccm H20 destilliert, pg-Wert eingestellt auf 6,9. Hefeextrakt-Melasse-Agär(2) Reichliches zerklüftetes Wachstum, farblos bis gelblich. Weißliches Luftmycel. Dunkelbernsteinfarbenes, lösliches Pigment (12/H/10).(1) Oatmeal Mix Agar contained oatmeal (20 g cooked oatmeal filtrate) : Enzymatic Casein Hydrolyzate 5, g; Sucrose 10 g; Agar 40 g, in 1000 cc H20 distilled, pg value adjusted to 6.9. Yeast Extract Molasses Agar (2) Abundant fissured growth, colorless to yellowish. Whitish aerial mycelium. Dark amber, soluble pigment (12 / H / 10).
Dextrose-Saccharose-Agar nach Czapek Schwaches Wachstum, dünn und farblos bis leicht melonenfarbig (11/A/8). Spuren von, rosaweißem Luftmycel. Kein lösliches Pigmeigt.Dextrose sucrose agar acc. To Czapek Weak growth, thin and colorless to slightly melon-colored (11 / A / 8). Traces of pink-white aerial mycelium. No soluble pigment.
Kartoffel-Agar Schwaches Wachstum, dünn und farblos. Spuren von weißlichem Luftmycel. Kein lösliches Pigment. Kartoffelstückchen Schwache Entwicklung, glasig. Farbe des Stückchens unverändert.Potato Agar Weak growth, thin and colorless. Traces of whitish Aerial mycelium. No soluble pigment. Potato pieces Poor development, glassy. Color of the bit unchanged.
Glukose-Asparagin-Agar Ziemlich gutes Wachstum mit glatter Oberfläche. Dünnes vegetatives Mycel von leicht oranger, rosafarbener Färbung (10/B/21) und gelblicher Unterseite. Kein Luftmycel. Etwas leicht gelbliches Pigment.Glucose Asparagine Agar Fairly good growth with a smooth surface. Thin vegetative mycelium of light orange, pink color (10 / B / 21) and yellowish underside. No aerial mycelium. Slightly yellowish pigment.
(2) Hefeextrakt-Melasse-Agar enthielt: Glycerin 7,5 g; Melasse 7,5 g; Hefeextrakt 5 g; Na Cl 4 g; Agar-Agar 30 g; H20, destilliert, 1000 ccm; pn-Wert eingestellt 'auf 6,0. Glycerin Asparagin-Agar Wie Glukose-Asparagin-Agar. Nähragar MOiges Wachstum mit glatter Oberfläche; melonenfarben bis orange (2/B/10) mit gelblichoranger Unterseite. Luftmycol rosaweiß. Lösliches Pigment fehlt.(2) yeast extract molasses agar contained: glycerin 7.5 g; Molasses 7.5 G; Yeast extract 5 g; Na Cl 4 g; Agar-agar 30 g; H20, distilled, 1000 cc; pn value set to 6.0. Glycerin asparagine agar Like glucose asparagine agar. Nutrient agar MOige growth with smooth surface; melon-colored to orange (2 / B / 10) with yellowish-orange underside. Luftmycol pink-white. Soluble pigment is absent.
Agar nach Pridham Mäßiges Wachstum, glatt, farblos mit hummerroten (2/G/11) Flecken. Rosafarbenes Luftmycel. Keine Pigmentierung des Mediums.Pridham Agar Moderate growth, smooth, colorless with lobster red (2 / G / 11) spots. Pink aerial mycelium. No pigmentation of the medium.
Stärke-Agar Schwaches Wachstum, farblos bis leicht orangerosa. Stärkehydrolyse zweifelhaft. Kaum weißes Luftmycel. Dextrose-Trypton-Agar Reichliches Wachstum, orangefarben mit goldgelber bis orangerosa Rückseite. Rosa Luftmycel. Leicht goldgelbes lösliches Pigment.Starch agar Growth weak, colorless to slightly orange-pink. Starch hydrolysis doubtful. Hardly any white aerial mycelium. Dextrose Tryptone Agar Abundant growth, orange with golden yellow to orange-pink reverse side. Pink aerial mycelium. Slightly golden yellow soluble pigment.
Kobalt-Agar nach Hickey und Tresner Mäßiges Wachstum, glasig bis leicht rosaorange. Etwas Luftmycel. Etwas gelbliches lösliches Pigment. Tyrosin-Agar Schwaches Wachstum. Ca-Malat-Agar Ziemlich gutes Wachstum, farblos. Luftmycel weißlich mit rosa Färbung. Kein lösliches Pigment. Teilweise Digestion von Ca-Malat.Cobalt agar according to Hickey and Tresner Moderate growth, glassy to light pink orange. Some aerial mycelium. Slightly yellowish soluble pigment. Tyrosine Agar Weak Growth. Ca Malate Agar Growth fairly good, colorless. Aerial mycelium whitish with pink coloring. No soluble pigment. Partial digestion of calcium malate.
Albumin Agar nach Dorset Ziemlich gutes Wachstum, rosa. Kein Luftmycel oder Pigmentierung des Mediums.Dorset Albumin Agar Fairly good growth, pink. No aerial mycelium or pigmentation of the medium.
Gelatine Keine Pigmentierung. Verflüssigung langsam und unvollständig.Gelatin No pigmentation. Liquefaction slow and incomplete.
Nitrat Oberflächenwachstum mit rosa Luftmycel. Keine Reduktion zu Nitriten. Brühe wird gelblich.Nitrate surface growth with pink aerial mycelium. No reduction too Nitrites. Broth turns yellowish.
Lakmus-Milch Keine Peptonisierung oder Koagulation. Leicht alkalische Reaktion.Lakmus milk No peptonization or coagulation. Slightly alkaline Reaction.
Dextrose-Trypton-Agar Reichliches Wachstum, orangefarben mit geldgelber bis orangerosa Rückseite. Rosa Luftmycel. Leicht goldgelbes (9 J 6) lösliches Pigment.Dextrose Tryptone Agar Abundant growth, orange with yellow gold to orange-pink back. Pink aerial mycelium. Slightly golden yellow (9 J 6) soluble pigment.
Cellulose Kein Wachstum auf Filterpapierscheiben auf kohlehydratfreiem Agar auf Mineralgrundlage.Cellulose No growth on filter paper discs on carbohydrate-free ones Mineral based agar.
Temperatur Optimum 28°C. Bei 37°C findet Wachstum statt, jedoch sind die Charakteristika weniger deutlich.Temperature optimum 28 ° C. Growth takes place at 37 ° C, but there are the characteristics less clear.
Morphologie der Kolonie Auf Agar nach Benett bildet dieser Stamm kleine (gewöhnlich mit einem Durchmesser von nicht mehr als 2 mm) Kolonien mit gut bestimmbaren Umrissen, mit fester, jedoch zerklüfteter Oberfläche; bedeckt mit weißlichem Luftmycel. Eine große Anzahl von auf Agar gepflanzten Kolonien entwickelt kein Luftmycel, sie bleiben in ihrem orangeroten vegetativen DZycel, das zu einer beträchtlichen Dicke anwächst, bis sie ein felsenähnliches Aussehen annehmen.Colony morphology On Benett agar, this strain forms small ones (usually no more than 2 mm in diameter) colonies with well identifiable Outlined, with a firm but rugged surface; covered with whitish aerial mycelium. A large number of colonies planted on agar do not develop aerial mycelium, they do remain in their orange-red vegetative DZycel, which grows to a considerable thickness grows until they take on a rock-like appearance.
Sporenbildung ME/83 entwickelt gewöhnlich keine Sporen auf den oben aufgeführten Medien. Findet eine Sporenbildung statt, so erscheinen die Sporen in langen, leicht zusammengedrehten Ketten. Spiralen sind nicht gewöhnlich. Die Sporen sind ellipsoid bis länglich (0,8 bis 1,0 - 3,0 bis 5,0 #t). Tests unter Verwendung von Kohlenstoffquellen Kulturen auf Agar auf Mineralgrundlage mit verschiedenen zusätzlichenQuellen nach Pridham und Gottlieb zeigten keinerlei Wachstum auf (Raffinose, Acetat, Citrat, Glycin). Alle anderen getesteten Kohlenstoffe wiesen mäßiges bis gutes Wachstum auf (Xylose, Arabinose, Glukose, Rhamnose, Fructose, Mannose, Galactose, Lactose, Saccharose, Maltose, Glycerin, Mannit, Inosit, Succinat und Salicin).Sporulation ME / 83 does not usually develop spores on the above listed media. If spore formation takes place, the spores appear in long, slightly twisted chains. Spirals are not common. The spurs are ellipsoidal to elongated (0.8 to 1.0 - 3.0 to 5.0 #t). Tests using of carbon source cultures on mineral-based agar with various additional sources according to Pridham and Gottlieb showed no growth whatsoever (raffinose, Acetate, citrate, glycine). All other carbons tested showed moderate to good growth on (xylose, arabinose, glucose, rhamnose, fructose, mannose, galactose, Lactose, sucrose, maltose, glycerin, mannitol, inositol, succinate and salicin).
Streptomyces mediterranei kann wie folgt charakterisiert werden 1. Es gehört nicht zu der chromogenen Gruppe der Streptomycetes.Streptomyces mediterranei can be characterized as follows 1. It does not belong to the Streptomycetes chromogenic group.
2. Auf den meisten Medien nimmt das vegetative Wachstum eine gelbliche bis leicht rosaorange Farbe an, jedoch niemals ein intensives Orangerot bis Kirschfarben.2. On most media, vegetative growth takes on a yellowish tinge to slightly pink-orange in color, but never an intense orange-red to cherry color.
3. Das Luftmycel ist rosaweiß, nimmt jedoch niemals eine orange- oder lavendelfarbene Färbung an. Schwache Sporenbildung auf den meisten Medien.3. The aerial mycelium is pinkish white, but never takes an orange or lavender color. Weak sporulation on most media.
4. Acetat, Citrat, Raffinose und Glycin können nicht als Kohlenstoffquellen verwendet werden.4. Acetate, citrate, raffinose and glycine cannot be used as carbon sources be used.
Für die Herstellung von Rifomycin ist die Erfindung nicht auf den oben beschriebenen Stamm von Streptomyces mediterranei oder andere der gleichen Beschreibung entsprechende Stämme beschränkt, sondern umfaßt die Verwendung von Varianten dieser Stämme, die beispielsweise durch Auswahl der durch Behandlung von Sporensuspensionen mit mutagenen Mitteln, wie z. B. UV-Bestrahlung, Senfgas usw., gebildeten Varianten oder Mutanten erhalten werden.For the production of rifomycin, the invention is not limited to Streptomyces mediterranei strain described above or others of the same Description of appropriate strains is limited, but includes the use of Variants of these strains, for example, by selecting the by treatment of Spore suspensions with mutagenic agents, such as. B. UV radiation, mustard gas, etc., formed variants or mutants are obtained.
Zur Herstellung von Rifomycin wird Streptomyces mediterranei oder ein beliebiger anderer Rifomycirx erzeugender Mikroorganismus bei 25 bis 37°C und vorzugsweise bei 28°C in einer submersen belüfteten Kultur in einem wäßrigen Kulturmedium gezüchtet, welches eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält. Als Kohlenstoffquelle können die unten angeführten Kohlehydrate und Kohlenstoffderivate verwendet werden, z. B. Glukose, Xylose, Lactose, Saccharose, Maltose, Glycerin, Mannit, Inosit, Succinatstärke, Dextrin usw. Wertvolle Stickstoffquellen sind beispielsweise Aminosäuren und Gemische derselben. Peptide und Proteine und ihre Hydrolysate, z. B. Pepton, Fleischextrakte, Hefeextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, lösliche Fischbestandteile, wäßrige Fraktionen von Saatgetreide, bei der Destillation von Branntwein. erhaltene lösliche Stoffe. Die Fermentation wird während 24 bis 120 Stunden durchgeführt. Der anfängliche, gewöhnlich auf etwa 7 bis 8 eingestellte pH-Wert sinkt im Verlauf der Fermentierung auf 5 bis 7 ab. Gewöhnlich werden die besten Ergebnisse bei einer Fermentierungszeit von 48 bis 72 Stunden erhalten. Nach dieser Zeit wird eine ausgezeichnete Ausbeute des Antibiotikums erhalten.For the production of rifomycin, Streptomyces mediterranei or any other rifomycirx producing microorganism at 25 to 37 ° C and preferably at 28 ° C in a submerged aerated culture in an aqueous culture medium cultured which contains an assimilable source of nitrogen. As a carbon source the carbohydrates and carbon derivatives listed below can be used, z. B. glucose, xylose, lactose, sucrose, maltose, glycerin, mannitol, inositol, succinate starch, Dextrin etc. Valuable nitrogen sources are, for example, amino acids and mixtures the same. Peptides and proteins and their hydrolysates, e.g. B. peptone, meat extracts, Yeast extract, soybean meal, corn steep liquor, soluble fish ingredients, aqueous Fractions of seed grain, in the distillation of brandy. obtained soluble Fabrics. The fermentation is carried out for 24 to 120 hours. The initial one pH, usually adjusted to about 7 to 8, decreases as the fermentation proceeds down from 5 to 7. Usually, the best results will be obtained with a fermentation period received from 48 to 72 hours. After this time there will be an excellent yield of the antibiotic received.
Nach Abschluß der Fermentation kann Rifomycin nach folgender Methode isoliert werden: Das Fermentationsmedium wird bei einem Endp H-Wert von 5,0 bis 7,0 oder nach Einstellung auf 7,5 bis 8;5 bei 26 bis 28°C oder weniger filtriert. Das Filtrat wird schnell auf einen sauren pH-Wert eingestellt, um die beste Beständigkeit der antibiotischen Substanz sicherzustellen. Der aktive Stoff wird durch wasserunlösliche Lösungsmittel, z. B. Butanol, Äthyl-, Propyl-, Butyl- oder Amylacetat oder Chloroform, extrahiert. Das Verhältnis zwischen dem Volumen des Mediums und dem des Lösungsmittels kann je nach dem verwendeten Lösungsmittel schwanken. Gewöhnlich wird ein Verhältnis von 2:1 bis 10:1 angewendet.After the fermentation is complete, rifomycin can be prepared using the following method be isolated: The fermentation medium is at an Endp H value from 5.0 to 7.0 or after adjusting to 7.5 to 8; 5 at 26 to 28 ° C or less filtered. The filtrate is quickly adjusted to an acidic pH to the to ensure the best resistance of the antibiotic substance. The active substance is by water-insoluble solvents, e.g. B. butanol, ethyl, propyl, butyl or amyl acetate or chloroform. The ratio between the volume of the medium and that of the solvent can vary depending on the solvent used vary. Usually a ratio of 2: 1 to 10: 1 is used.
Ein Teil des antibiotischen Stoffes ist in saurem Medium unlöslich und kann unmittelbar aus dem Medium, gegebenenfalls durch Filtrieren, gewonnen werden. In jedem Fall muß das Filtrat mit dem organischen Lösungsmittel extrahiert werden, um den größten Teil der antibiotischen Wirksamkeit zu gewinnen. Der unlösliche Teil kann in demselben Lösungsmittel gelöst und mit dem organischen Extrakt, der bei der Extraktion des Filtrats erhalten wird, vereinigt werden. Das zurückbleibende wäßrige Medium enthält nach der Extraktion noch eine mikrobiologische Wirksamkeit, die nicht durch übliche organische Lösungsmittel extrahiert werden kann. Sie kann jedoch durch Absorption auf Holzkohle bei leicht saurem pH-Wert isoliert und durch Auswaschen mit wasserlöslichen Alkoholen, wie z. B. Methanol oder Äthanol, gewonnen werden.Part of the antibiotic substance is insoluble in an acidic medium and can be obtained directly from the medium, optionally by filtration. In any case, the filtrate must be extracted with the organic solvent, to gain most of the antibiotic effectiveness. The insoluble part can be dissolved in the same solvent and with the organic extract that comes with the extraction of the filtrate is obtained, are combined. The leftover aqueous medium still contains a microbiological effectiveness after extraction, which cannot be extracted by common organic solvents. she can but isolated by absorption on charcoal at a slightly acidic pH and through Wash out with water-soluble alcohols, such as. B. methanol or ethanol obtained will.
Auch das Mycel hält etwas, mikrobiologische Aktivität zurück. Diese kann aus dem Mycel mittels der obengenannten Lösungsmittel oder einfach durch mehrfaches Waschen mit Wasser extrahiert werden, und von der sauergestellten wäßrigen Lösung wird die antibiotische Aktivität auf die vorstehend erwähnten Lösungsmittel übertragen.The mycelium also holds back some microbiological activity. These can be made from the mycelium by means of the above solvents or simply by multiples Wash with water, and extracted from the acidified aqueous solution the antibiotic activity is transferred to the above-mentioned solvents.
Sobald der größte Teil der antibiotischen Aktivität auf das Lösungsmittel übergegangen ist, wird dieses im Vakuum auf ein kleines Volumen unter einem Stickstoffstrom bei unter 30°C destilliert. Durch Zugabe von Petroläther oder anderen Kohlenwasserstoffgemischen wird eine braune Substanz ausgefällt, die eine große Wirksamkeit gegenüber grampositiven Bakterien und Mycobakterien hat. Dieses Rohprodukt ist ein amorphes Pulver mit einer leicht braunen bis dunkelbraunen Farbe, welche manchmal eine grünliche Nuance hat. Es besteht aus einem Gemisch von Substanzen mit antibiotischer Wirksamkeit. Eine Chromatographie auf Whatman-Papier Nr. 1 unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus 3 °/° Ammoniumchlorid und 10/, Ascorbinsäure enthaltendem Wasser, die auf einer mit Sarcina luthea geimpften Agarplatte entwickelt wurde, zeigt wenigstens fünf Hemmungszonen, die in ansteigender Reihenfolge des R f-Wertes, beginnend mit dem Ablagerungspunkt des Tropfens, mit A bis E bezeichnet werden. Die Bezirke C und D sind gewöhnlich größer als die anderen Bezirke. Das Vorhandensein von anderen Fraktionen kann nicht ausgeschlossen werden. Fig. 1 zeigt ein nach der obigen Beschreibung erhaltenes Chromatogramm.As soon as most of the antibiotic activity has been transferred to the solvent, this is distilled in vacuo to a small volume under a stream of nitrogen at below 30 ° C. By adding petroleum ether or other hydrocarbon mixtures, a brown substance is precipitated which is highly effective against gram-positive bacteria and mycobacteria. This crude product is an amorphous powder with a light brown to dark brown color, which sometimes has a greenish shade. It consists of a mixture of substances with antibiotic activity. Chromatography on Whatman No. 1 paper using a mixed solvent of 3 ° / ° ammonium chloride and 10 % ascorbic acid-containing water, developed on an agar plate inoculated with Sarcina luthea, shows at least five zones of inhibition, arranged in ascending order of R f Value, starting with the point of deposition of the drop, can be denoted by A to E. Districts C and D are usually larger than the other districts. The presence of other political groups cannot be ruled out. Fig. 1 shows a chromatogram obtained as described above.
An Stelle der Ausfällung des antibiotischen Gemischs aus dem Extraktionslösungsmittel kann dieses auch mittels Pufferlösungen bei einem pH-Wert von. 7,0 bis 7,5 und dann bei 10,0 bis 10,5 extrahiert werden. Die Einstellung des pH-Wertes gestattet eine annähernde Trennung der verschiedenen das gesamte Rohpulver bildenden Fraktionen. Bei einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5 wird Rifomycin B mit ausgeprägter saurer Natur selektiv extrahiert. Die anderen Fraktionen werden bei höheren pH-Werten extrahiert. Infolge der geringen Beständigkeit der Antibiotika in neutralem und alkalischem Medium ist die Verwendung von Pufferlösungen mit einem Gehalt von 0,5 bis 30/, Ascorbinsäure oder anderen Substanzen mit dem gleichen stabilisierenden Effekt erforderlich. Das Volumenverhältnis des Lösungsmittels zu der alkalischen Pufferlösung schwankt je nach denn verwendeten Lösungsmittel und dem angewendeten pH-Wert. Aus einer Lösung in Äthylacetat mit einer 1 °/°igen Aktivität werden drei Extraktionen mit einem Zehntel des Volumens der Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,0 bis 7,5 durchgeführt, um die Fraktion B in die wäßrige Phase überzuleiten, und drei Extraktionen mit einem Fünftel des Volumens der Pufferlösung mit einem pH-Wert von 10,0 bis 10,5 und einem Gehalt von 107, Ascorbinsäure sind notwendig, um die anderen Komponenten in die wäßrige Phase zu bringen.Instead of precipitating the antibiotic mixture from the extraction solvent, this can also be done by means of buffer solutions at a pH of. 7.0 to 7.5 and then extracted at 10.0 to 10.5. The adjustment of the pH allows an approximate separation of the various fractions forming the entire raw powder. At a pH of 7.0 to 7.5, rifomycin B with a pronounced acidic nature is selectively extracted. The other fractions are extracted at higher pH values. Due to the poor resistance of antibiotics in neutral and alkaline medium, the use of buffer solutions with a content of 0.5 to 30 %, ascorbic acid or other substances with the same stabilizing effect is necessary. The volume ratio of the solvent to the alkaline buffer solution varies depending on the solvent used and the pH value used. From a solution in ethyl acetate with a 1% activity, three extractions are carried out with one tenth the volume of the buffer solution with a pH of 7.0 to 7.5 in order to pass fraction B into the aqueous phase, and three Extractions with a fifth of the volume of the buffer solution with a pH value of 10.0 to 10.5 and a content of 107 ascorbic acid are necessary in order to bring the other components into the aqueous phase.
Aus der wäßrigen Phase werden die Antibiotika in einem halbgereinigten Zustand durch Sauerstellung und Extraktion mit einem Lösungsmittel, wie z. B. Äthylacetat oder Chloroform, Verdampfung des Lösungsmittels und Fällung mit Petroläther erhalten. Die Antibiotika können auch durch Sauerstellung aus der wäßrigen Phase ausgefällt und gewonnen werden.The antibiotics are removed from the aqueous phase in a semi-purified Condition by acidification and extraction with a solvent, such as. B. ethyl acetate or chloroform, evaporation of the solvent and precipitation with petroleum ether. The antibiotics can also be precipitated from the aqueous phase by acidification and be won.
Die Reinigung des Rohgemisches kann durch Chromatographie auf verschiedenen Adsorptionsmitteln, wie z. B. synthetischem Magnesiumsilikat, vorgenommen werden, welche vorher mit einer methanolischen Lösung von Chlorwasserstoffgas behandelt wurden. Das rohe Gemisch wird in einem Lösungsmittel, z. B. Äthylacetat, gelöst, auf einer Kolonne adsorbiert und mit dem gleichen Lösungsmittel oder mit Lösungsmittelgemischen mit zunehmender Polarität ausgewaschen. Die Waschwasser mit den höchsten mikrobiologischen Werten sind diejenigen, die Rifomycin C und D enthalten.The purification of the raw mixture can be done by chromatography on different Adsorbents, such as. B. synthetic magnesium silicate, are made, which was previously treated with a methanolic solution of hydrogen chloride gas became. The crude mixture is dissolved in a solvent, e.g. B. ethyl acetate, dissolved, adsorbed on a column and with the same solvent or with solvent mixtures washed out with increasing polarity. The washing water with the highest microbiological Values are those that contain rifomycin C and D.
Im nachfolgenden werden das Verfahren zur Gewinnung von fünf Hauptkomponenten des rohen Antibiotikums sowie einige physikalische und chemische Eigenschaften beschrieben, welche ihre Identifizierung gestatten.The following are the procedure for obtaining five main components of the raw antibiotic and some physical and chemical properties are described, which allow their identification.
Rifomycin A. Sein Rf Wert beträgt 0,00 bis 0,10 bei Chromatographie mittels des oben beschriebenen Systems. Rifomycin A wird aus dem rohen Gemisch durch Gegenstromtrennung irr einem Zweiphasensystem gewonnen. Methanol - 0,01 n-Salzsäure - Benzol - Petroläther (10:5:15:5). Nach 160 Durchgängen wird Rifomycin A in den Rohren 150 bis 160 unmittelbar aus der leichten Phase gewonnen. Nach Konzentration und Fällung in Petroläther wird Rifomycin A in Form eines dunkelbraunen amorphen Pulvers gewonnen.Rifomycin A. Its Rf value is 0.00 to 0.10 on chromatography by means of the system described above. Rifomycin A is made from the crude mixture through Countercurrent separation obtained in a two-phase system. Methanol - 0.01 N hydrochloric acid - Benzene - petroleum ether (10: 5: 15: 5). After 160 passages, rifomycin A is in the Tubes 150 to 160 obtained directly from the light phase. After concentration and precipitation in petroleum ether gives rifomycin A in the form of a dark brown amorphous Powder won.
Rifomycin A ist in Wasser unlöslich, jedoch in alkalischen Mitteln löslich. Bei Lösung in Äthylacetat zeigt es im sichtbaren Bereich ein Absorptionsspektrum bei 460 m&,. Nach Schütteln der Äthylacetatlösung mit einer sauren wäßrigen 1 °/°igen Stannochloridlösung liegt das Absorptionsmaximum bei 422 m#t. Der gleiche Effekt kann bei Schütteln mit einer wäßrigen 1 °/°igern Ascorbinsäurelösung beobachtet werden. Das Maximum bei 460 mp. kann, durch Schütteln der Äthylacetatlösung mit einer 0,1 0%igen Kahum-Ferricyanid-Lösung erhalten werden. Rifomycin. hat wahrscheinlich die Natur eines Chinons mit der Möglichkeit einer reversiblen Oxydo-Reduktion.Rifomycin A is insoluble in water, but in alkaline agents soluble. When dissolved in ethyl acetate, it shows an absorption spectrum in the visible range at 460 m & ,. After shaking the ethyl acetate solution with an acidic aqueous solution 1% stannous chloride solution, the absorption maximum is 422 m # t. The same The effect can be observed when shaking with an aqueous 1% ascorbic acid solution will. The maximum at 460 mp. can by shaking the ethyl acetate solution with a 0.1 0% potassium ferricyanide solution can be obtained. Rifomycin. probably has the nature of a quinone with the possibility of reversible oxydo-reduction.
Rifomycin B. Sein Rf-Wert liegt bei 0,20 bis 0,30 bei Chromatographie mittels der vorstehenden Gemischen. Rifomycin B ist ausgeprägt sauer und kann durch Lösen des rohen Gemisches in einem Lösungsmittel, wie z. B. Äthylacetat oder Chloroform, und Extrahieren aus der organischen Lösung mit einem Phosphatpuffer bei neutralem p$-Wert (6,5 bis 7,5) gewonnen werden. Rifomycin. B wird in die wäBrige Phase übergeführt und kann entweder durch Zugabe von Säuren gefällt oder erneut aus der angesäuerten Wasserlösung mit Äthylacetat extrahiert werden. Nach Konzentration der Äthylacetatfraktion wird Rifomycin B in halbgereinigtem Zustand ausgefällt. Durch weitere Kristallisationen aus Äthylacetat oder Benzol wird das reine Produkt erhalten.Rifomycin B. Its Rf value is 0.20-0.30 on chromatography by means of the above mixtures. Rifomycin B is very acidic and can go through Dissolving the crude mixture in a solvent such as. B. ethyl acetate or chloroform, and extracting from the organic solution with a phosphate buffer at neutral p $ value (6.5 to 7.5) can be obtained. Rifomycin. B is converted into the aqueous phase and can either be precipitated by adding acids or again from the acidified Water solution can be extracted with ethyl acetate. After concentration of the ethyl acetate fraction becomes rifomycin B in semi-purified State failed. Through more Crystallizations from ethyl acetate or benzene will give the pure product.
Rifomycin B hat die Form von gelben glänzenden Kristallen. Es wird bei 165°C dunkel und schmilzt nicht unter 300°C. Der pH-Wert der gesättigten Wasserlösung liegt bei 3,6. Es ist sehr leicht in Wasser und verdünnter Mineralsäure sowie in Bicarbonatlösungen unter Entwicklung von Kohlendioxyd löslich. In konzentrierter Schwefelsäure löst es sich unter roter Färbung. In Methanol, Äthanol, Chloroform, Äthylacetat und Acetonen ist es schwach, in Benzol sehr schwach, und in Petroläther, Tetrachlorkohlenstoff, Äthyläther und Kohlenwasserstoffen ist es überhaupt nicht löslich. Es entfärbt Kaliumpermanganatlösungen, reduziert die Fehlingsche Lösung und Tollens Reagenz, adsorbiert Brom und wird katalytisch durch Wasserstoff reduziert. Bei Behandlung mit salpetriger Säure und alkalischen Mitteln findet eine intensive Rotfärbung statt. Es setzt sich mit Ninhydrin nicht um, obgleich es sich nach starker Säurehydrolyse umsetzt, läßt sich nicht diazotisieren und setzt sich nicht mit aromatischen Diazoderivaten um. Es gibt keine Molish Reaktion und reduziert Triphenyltetrazolium nicht. Es reagiert jedoch mit Ferrichlorid und gibt eine Rotfärbung.Rifomycin B is in the form of shiny yellow crystals. It will dark at 165 ° C and does not melt below 300 ° C. The pH of the saturated water solution is 3.6. It is very light in water and dilute mineral acid as well as in Bicarbonate solutions soluble with evolution of carbon dioxide. In concentrated Sulfuric acid, it dissolves with a red color. In methanol, ethanol, chloroform, It is weak in ethyl acetate and acetone, very weak in benzene, and in petroleum ether, It is not at all carbon tetrachloride, ethyl ether and hydrocarbons soluble. It decolorizes potassium permanganate solutions and reduces Fehling's solution and Tollen's reagent, adsorbs bromine and is catalytically reduced by hydrogen. When treated with nitrous acid and alkaline agents, an intensive one takes place Red coloring instead. It does not react with ninhydrin, although it is stronger Reacts acid hydrolysis, can not be diazotized and does not sit with aromatic Diazo derivatives. There is no Molish reaction and it reduces triphenyltetrazolium not. However, it reacts with ferric chloride and gives it a red color.
Die Elementaranalyse ergab die folgenden mittleren Werte: C = 61,75°/0, H = 6,72°/0, N = 1,88°/0; O = 29,22 °%. Hieraus kann die folgende Rohformel abgeleitet werden: C3gH47`63N014. Rifomycin ist optisch aktiv und hat eine Drehung von [a]26. -11° (0,1 Methanol, bestimmt in einem photoelektrischen Polarimeter).The elemental analysis gave the following mean values: C = 61.75 ° / 0, H = 6.72 ° / 0, N = 1.88 ° / 0; O = 29.22%. The following raw formula can be derived from this become: C3gH47`63N014. Rifomycin is optically active and has a rotation of [a] 26. -11 ° (0.1 methanol, determined in a photoelectric polarimeter).
Eine potentiometrische Testprobe in einem Gemisch von Wasser und Methanol zeigt zwei saure funktionelle Gruppen: pgl 1/2 etwa 2,8 (Äquivalent-Molekulargewicht 780), p$21/2 etwa 6,0 (äquivalentes Molekulargewicht 765). Das in Cyclohexanol nach Rast festgestellte Molekulargewicht beträgt etwa 750. Das UV- und das sichtbare Spektrum in Wasser zeigt bei 220 bis 230 m#t (E; ro = 513) einen Gipfel und zwei Maxima bei 305 m#t (EI- = 246) und 430 m#t (Eift = 202). Das Maximum im sichtbaren Spektrum in Äthylacetat liegt bei 415 m#t. Das UV- und sichtbare Spektrum von Rifomycin B in Pufferphosphat bei einem pH-Wert von 7,3 zeigt Maxima bei 223 m#t ( I EI-_ = 555), 304 mp. (Ei m = 275) und bei 425 m#t ( 1 E,' #. = 220). Das Spektrum ist in Fig. 2 gezeigt.A potentiometric test sample in a mixture of water and methanol shows two acidic functional groups: pgl 1/2 about 2.8 (equivalent molecular weight 780), p $ 21/2 about 6.0 (equivalent molecular weight 765). The molecular weight determined in cyclohexanol according to Rast is about 750. The UV and the visible spectrum in water shows a peak at 220 to 230 m # t (E; ro = 513) and two maxima at 305 m # t (EI- = 246 ) and 430 m # t (Eift = 202). The maximum in the visible spectrum in ethyl acetate is 415 m # t. The UV and visible spectrum of rifomycin B in buffer phosphate at a pH of 7.3 shows maxima at 223 m # t ( I EI-_ = 555), 304 mp. (Ei m = 275) and at 425 m # t ( 1 E , ' #. = 220). The spectrum is shown in FIG.
Das Infrarotspektrum des Rifomycins wird in Fig. 3 gezeigt. Es zeigt Absorptionsmaxima bei den folgenden Werten in cm-1: 3465, 3330, 1742, 1730 (Gipfel), 1705 (Gipfel), 1673, 1602, 1575, 1550, 1445, 1342, 1300, 1267, 1240 (Schulter), 1205, 1180, 1165, 1102, 1073, 1048, 1020, 975, 948, 915, 905, 850; 795, 760, 730, 680.The infrared spectrum of the rifomycin is shown in FIG. It shows Absorption maxima at the following values in cm-1: 3465, 3330, 1742, 1730 (peak), 1705 (peak), 1673, 1602, 1575, 1550, 1445, 1342, 1300, 1267, 1240 (shoulder), 1205, 1180, 1165, 1102, 1073, 1048, 1020, 975, 948, 915, 905, 850; 795, 760, 730, 680.
Rifomycin B, das von saurer Natur ist, bildet sowohl mit anorganischen als auch mit organischen Basen Salze. Es wurde das Mono- und Dinatriumsalz hergestellt, wobei das erstere schwach und das letztere frei in Wasser löslich ist. Die Lösungen haben einen pH-Wert von 5,0 bzw. 7,0. Diese Lösungen sind sehr beständig.Rifomycin B, which is acidic in nature, forms with both inorganic as well as salts with organic bases. The mono- and disodium salt was produced, the former being weakly and the latter freely soluble in water. The solutions have a pH value of 5.0 or 7.0. These solutions are very persistent.
Salze mit folgenden organischen Basen wurden hergestellt: Dibenzylamin, Chinin, 1-p-Chlorbenzyl-2-pyrrolidyl-methylbenzoimidazol. Alle diese Salze haben eine geringe Löslichkeit in Wasser und scheinen für therapeutische Zwecke verwendbar zu sein.Salts with the following organic bases were produced: dibenzylamine, Quinine, 1-p-chlorobenzyl-2-pyrrolidyl-methylbenzoimidazole. All of these have salts have poor solubility in water and appear useful for therapeutic purposes to be.
Rifomycin C und D. Diese Fraktionen zeigen fest identische Rf Werte bei dem beschriebenen chromatographischen Gemisch (Rf = 0,45 bis 0,55). Die Hemmungszonen grenzen aneinander an und sind durch einen langen Hals verbunden. Rifomycin C und D werden in halbreinem Zustand aus dem rohen Gemisch durch Gegenstromteilung in einem Zweiphasensystem erhalten, das aus Methano1-0,01 n-Sälzsäure-Benzol-Petroleumäther (10:5:15: 5) besteht. Bei 85 Durchgängen liegt das Maximum des Rifomycins C zwischen dem 55. und 65. Rohr und das des Rifomycins D zwischen dem 35. und 45. Rohr. Durch Extrahieren der Rohrinhalte mit Benzol oder Äthylacetat oder Chloroform oder anderen ähnlichen Lösungsmitteln., Konzentration der Extrakte und Fällung mit Petroleumäther oder anderen Kohlenwasserstoffgemischen werden die beiden Rifomycine als amorphes Pulver mit hohem Reinheitsgrad erhalten.Rifomycin C and D. These fractions show firmly identical Rf values for the chromatographic mixture described (Rf = 0.45 to 0.55). The inhibition zones adjoin each other and are connected by a long neck. Rifomycin C and D are in the semi-pure state from the raw mixture by countercurrent division in a two-phase system obtained from methano1-0.01 n-hydrochloric acid-benzene-petroleum ether (10: 5: 15: 5) exists. At 85 passes, the maximum of rifomycin C is between the 55th and 65th tube and that of rifomycin D between the 35th and 45th tube. By Extract the tube contents with benzene or ethyl acetate or chloroform or others Similar solvents., Concentration of the extracts and precipitation with petroleum ether or other hydrocarbon mixtures, the two rifomycins are considered amorphous Obtain powder with a high degree of purity.
Rifomycin C und D erscheinen als dunkelbraune Pulver mit grünlicher Nuance. Sie sind in den üblichen organischen Lösungsmitteln löslich, in. Wasser jedoch praktisch unlöslich. Man erhält eine wäßrige Lösung in einem Puffermittel bei einem pH-Wert von 8,0 bis 10,0 durch Zugabe von Ascorbinsäure als Stabilisierungsmittel. Das UV- und sichtbare Spektrum von Rifomycin C und D sind identisch. Die Maxima bei 385 bis 390 und 460 %t in Methanol und Äthylacetat sind sehr charakteristisch. Das Maximum bei 460 m#t in Äthylacetat wird nach Schütteln der Äthylacetatlösung von Rifomycin C oder D mit einer 0,1 °/oigen wäßrigen Lösung von Stannochlorid oder einer 1,0 °/oigen wäßrigen Lösung von Ascorbinsäure nach 422 m#t verlagert. Nach weiterem Schütteln mit einer 0,1 °/oigen wäßrigen Kalium-Ferricyanid-Lösung zeigt das Spektrum erneut ein Maximum bei 460 m#t. Dadurch wird gezeigt, daß Rifomycin C und D, wie Chinon, Substanzen mit reversiblen Oxido-Reduktionseigenschaften sind.Rifomycin C and D appear as dark brown powders with a greenish tinge Nuance. They are soluble in common organic solvents, in water but practically insoluble. An aqueous solution in a buffer agent is obtained at a pH of 8.0 to 10.0 by adding ascorbic acid as a stabilizing agent. The UV and visible spectrum of rifomycin C and D are identical. The maxima at 385 to 390 and 460% t in methanol and ethyl acetate are very characteristic. The maximum at 460 m # t in ethyl acetate is after shaking the ethyl acetate solution of rifomycin C or D with a 0.1% aqueous solution of stannous chloride or a 1.0% aqueous solution of ascorbic acid to 422 m # t. To Further shaking with a 0.1% aqueous potassium ferricyanide solution shows the spectrum again a maximum at 460 m # t. This shows that rifomycin C and D, like quinone, are substances with reversible oxido-reducing properties.
Eigenschaften von Rifomycin C. Elementaranalyse: C = 61,51 ()/o, H = 6,73 %, N = 4,21')/" O = 27,55 % (als Differenz). Rifomycin C ergibt mit den Reagenzien nach Tollens und Fehling, mit Ferrichlorid, Jodoform und Permanganat, positive Reaktionen. Die Ninhydrinreaktion ist negativ, wird jedoch nach starker Säurehydrolyse positiv. Das sichtbare Spektrum in Äthylacetat zeigt Maxima bei 388 m#t (F-1111 = 78) und bei 460 mV. (E'% = 134). Rifomycin C ist in Wasser, Mineralsäuren und Bicarbonat unlöslich, in Natriumcarbonat, Methanol, Äthylacetat, Chloroform und Aceton löslich und in Äthyläther und Petroleumäther wiederum unlöslich.Properties of rifomycin C. Elemental analysis: C = 61.51 () / o, H = 6.73%, N = 4.21 ') / "O = 27.55% (as the difference). Rifomycin C results with the reagents according to Tollens and Fehling, with ferric chloride, iodoform and permanganate, positive reactions. The ninhydrin reaction is negative but becomes positive after strong acid hydrolysis. The visible spectrum in ethyl acetate shows maxima at 388 m # t (F-1111 = 78) and at 460 mV. (E '% = 134). Rifomycin C is in water, mineral acids, and bicarbonate insoluble, soluble in sodium carbonate, methanol, ethyl acetate, chloroform and acetone and again insoluble in ethyl ether and petroleum ether.
Eigenschaften von Rifomycin D. Elementaranalyse: C = 62,17 %, H = 6,58 %, N = 3,53 "/a, 0 = 27,72 0/0 (als Differenz). Rifomycin D ergibt positive Reaktionen mit den Reagenzien nach Tollens und Fehling, mit Ferrichlorid, Jodoform und Permanganat. Die Ninhydrinreaktion ist vor und nach der Hydrolyse negativ. Das sichtbare Spektrum in Äthylacetat zeigt Maxima bei 388 m#L (Eid. = 97) und bei 460 m#t (Ei ö, = 115). Es ist in Wasser, Mineralsäuren, Bicarbonat, Äthyläther und Petroleumäther unlöslich, in N atriumcarbonat, Methanol, Äthylacetat, Chloroform und Aceton löslich.Properties of rifomycin D. Elemental analysis: C = 62.17%, H = 6.58%, N = 3.53 "/ a, 0 = 27.72 0/0 (as difference). Rifomycin D gives positive reactions with the Reagents according to Tollens and Fehling, with ferric chloride, iodoform and permanganate. The ninhydrin reaction is negative before and after hydrolysis. The visible spectrum in ethyl acetate shows maxima at 388 m # L (Eid. = 97) and at 460 m # t (Egg ö , = 115) It is insoluble in water, mineral acids, bicarbonate, ethyl ether and petroleum ether, and soluble in sodium carbonate, methanol, ethyl acetate, chloroform and acetone.
Rifomycin E. Diese Fraktion zeigt einen R f-Wert von etwa 0,7 bis 0,8 auf dem Chromatographiestreifen. Sie wird von dem rohen Gemisch durch Gegenstromteilung mit dem folgenden Gemisch erhalten: Methanol-0,01 n-Salzsäure-Benzol-Petroleumäther (10:5:15:5). Bei 160 Durchgängen wird der größte Teil des Rifomycins E in den ersten zehn Rohren durch Extraktion der angesäuerten wäßrigen Phase mit Athylacetat, Konzentration des Extrakts und Fällung mit Petroleumäther gewonnen. Die Fraktion Eist ein leichtes braunes amorphes Pulver Das sichtbare Spektrum in Äthylacetat zeigt ein Maximum bei 400 mp,, das nach Schütteln mit verdünnten Lösungen oder Kaliumferricyanid oder Stannochlorid unverändert bleibt.Rifomycin E. This fraction shows an R f value of about 0.7 to 0.8 on the chromatography strip. It is divided from the crude mixture by countercurrent flow obtained with the following mixture: methanol-0.01 N-hydrochloric acid-benzene-petroleum ether (10: 5: 15: 5). With 160 passes, most of the rifomycin E is in the first ten tubes by extraction of the acidified aqueous phase with ethyl acetate, concentration of the extract and precipitation with petroleum ether. The Eist faction is easy brown amorphous powder The visible spectrum in ethyl acetate shows a maximum at 400 mp, that after shaking with dilute solutions or potassium ferricyanide or Stannous chloride remains unchanged.
Wie oben bereits angeführt wurde, zeigen Rifomycin und seine Komponenten eine hochgradige Wirksamkeit gegenüber grampositiven Bakterien und Mycobakterien. Biologische Tests wurden separat mit Rifomycin: B und mit einem Gemisch der Rifomycine A, C, D und E, welches im nachfolgenden als »Rifomycin-Komplex« bezeichnet wird, durchgeführt.As stated above, rifomycin and its components show a high degree of effectiveness against gram-positive bacteria and mycobacteria. Biological tests were carried out separately with rifomycin: B and with a mixture of rifomycins A, C, D and E, which one hereinafter referred to as the "rifomycin complex" is designated, carried out.
Die fogende Tabelle erläutert die antibakterielle Aktivität von Rifomycin
und des Rifomycin-Komplexes in vitro bei einer großen Anzahl von grampositiven und
gramnegativen Mikroorganismen. Die Zahlen geben die minimale hemmende Konzentration
in y/cm8 an.
Die akute Toxizität von Rifomycin B wurde untersucht und wurde als
äußerst gering befunden, besonders in Anbetracht der Tatsache, daß das Antibiotikum
einen sehr hohen Wirksamkeitsgrad hat. Die folgende Tabelle gibt die Resultate wieder:
Die Aktivität des Rifomycin-Komplexes und von Rifomycin B in vitro wurde mit sehr zufriedenstellenden Ergebnissen an Mäusen untersucht, denen mehrere pathogene grampositive Mikroorganismen eingespritzt worden waren.The activity of the rifomycin complex and rifomycin B in vitro was examined with very satisfactory results in mice to which several pathogenic gram positive microorganisms had been injected.
Alle hier aufgeführten Injektionen wurden durch intraperitoneale Einspritzung einer tödlichen Dosis von 10 bis 100 einer 15 bis 20 Stunden alten Kultur des pathogenen Mikroorganismus vorgenommen. Während die Kontrolltiere stets 2 bis 3 Tage nach der Infektion starben, wurde das endgültige Überleben der behandelten Tiere jeweils 12 Tage nach Beginn der Versuche festgestellt.All of the injections listed here were by intraperitoneal injection a lethal dose of 10 to 100 of a 15 to 20 hour old culture of the pathogenic Microorganism made. While the control animals always 2 to 3 days after the Infection died, the ultimate survival of the treated animals was each Detected 12 days after the start of the experiments.
Einige der Versuche sind in der umstehenden Tabelle angegeben.Some of the experiments are given in the table below.
Es scheint, daß der Rifomycin-Komplex eine sehr starke Aktivität bei der Hemmung von Mäuseinfektionen von Streptococcus und Staphylococcus und im allgemeinen bei grampositiven Bakterien zeigt. Eine 100°/oige Dosis von 50 mg/kg erscheint für ein Antibiotikum mit einer intravenösen tödlichen Dosis von 50 von der Größenordnung von 250 bis 300 mg/kg sehr niedrig.It appears that the rifomycin complex has a very strong activity the inhibition of Streptococcus and Staphylococcus infections in mice and in general shows in gram-positive bacteria. A 100% dose of 50 mg / kg appears for an antibiotic with an intravenous lethal dose of 50 of the order of magnitude from 250 to 300 mg / kg very low.
Obgleich Rifomycin B weniger aktiv ist, zeigt es nichtsdestoweniger noch einen besseren therapeutischen Koeffizienten unter Berücksichtigung seiner sehr niedrigen Toxizität. Beim Menschen wurden gute Blutspiegel der Antibiotika bei intramuskulärer Injektion von täglichen Dosen von 500 bis 1000 mg erzielt.Although rifomycin B is less active, it shows nonetheless still get a better therapeutic coefficient taking into account his very low toxicity. In humans, blood levels of the antibiotics were good obtained with intramuscular injection of daily doses of 500 to 1000 mg.
Das Antibiotikum hat sich als äußerst wertvoll bei Patienten erwiesen,
die Abszesse mit verschiedener Lokalisierung, wie z. B. Mastitis, purulenter Otitis
media usw., haben. Die verordneten täglichen Dosen betragen im allgemeinen etwa
2 g, die mit zwei intramuskulären Inj ektionen verabreicht wurden. Stets wurde ein
schneller Temperaturabfall und-ein Rückgang des Entzündungs-
Aktivität
des Rifomycin-Komplexes und von Rifomycin B in vivo bei subkutaner Verabreichung
während 7 Tage
Diese Ergebnisse wurden oft erzielt, nachdem sich die Behandlung mit anderen Antibiotika als erfolglos erwiesen hatte.These results have often been achieved after undergoing treatment other antibiotics had proven unsuccessful.
Nachfolgend werden zwei Beispiele für die Fermentation von Streptomyces mediterraneus angegeben. Beispiel 1 Eine Kultur von Str. mediterraneus wurde 6 bis 8 Tage auf einem Agar nach Bennet bei 28°C gehalten. Der Organismus wurde von dem Agar-Schrägnährboden abgespült und aseptisch in eine 500-cm3-Flasche geimpft, die 100 cm3 eines Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielt Fleischextrakt ....................... 5 g Hefeextrakt ......................... 5 g Pepton .....................:........ 5 g Kasein-Hydrolysat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g Glukose ............................. 20 g NaCl ............................... 1,5 g H20 .......................... bis zu 11 Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,3 eingestellt. Die geimpften Flaschen wurden 48 Stunden bei 28'C auf einem Wechselschüttler geschüttelt. Eine Flasche nut dem geimpften Material wurde in einen 10-1-Vorfermentator gepflanzt, der 41 des vorstehenden Mediums enthielt. Die Fermentierung wurde bei 28°C und 800 U/Min. des Rührwerks und einer Belüftung von 1/Vol/Vol/m vorgenommen. Nach 24 Stunden hatte das Mycel ein stark zerrissenes Aussehen. Das Volumen der gepackten Zellen betrug 3 bis 5 °/o.The following are two examples of the fermentation of Streptomyces mediterraneus indicated. Example 1 A culture of Str. Mediterraneus was grown from 6 to Maintained at 28 ° C. for 8 days on Bennet agar. The organism was from the The agar slant rinsed and inoculated aseptically into a 500 cm3 bottle 100 cm3 of a medium with the following composition contained meat extract ....................... 5 g yeast extract ......................... 5 g peptone ................... ..: ........ 5 g casein hydrolyzate. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 g glucose ............................. 20 g NaCl ............................... 1.5 g H20 ........... ............... until Re 11 The pH was adjusted to 7.3 with NaOH. The bottles were vaccinated Shaken for 48 hours at 28'C on an interchangeable shaker. A bottle of that inoculated material was planted in a 10-1 pre-fermenter, the 41st of the above Medium contained. Fermentation was carried out at 28 ° C and 800 rpm. of the agitator and an aeration of 1 / vol / vol / m. After 24 hours the mycelium had a badly torn look. The volume of the packed cells was 3 to 5 ° / o.
In der nächsten Stufe wurde ein 20-1-Glasgefäß zur Fermentierung verwendet, das 101 des aus den folgenden Bestandteilen bestehenden Fermentierungsmediums enthielt: Sojabohnenmehl.................... 5 g (NH4)2S04 . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 g MgS04-7H20 ....:............... 1g Glukose ......... » ................. 50 g KH,P04 .... ***'' ... . . . . . . . . . . . . . . 3 g CaCO3 ............................ 9g CUS04 5 H20 . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . 3,3 mg FeS04 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 mg ZnS04 - 7 11,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mg MnS04 - 4 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . .... 4 mg H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . bis zu 1 1 Der pH-Wert wurde mit Na OH auf 7,0 eingestellt. Die Sterilisierung erfolgte 30 Minuten lang bei 120°C.In the next step, a 20-1 glass jar was used for fermentation, which contained 101 of the fermentation medium consisting of the following ingredients: Soybean meal .................... 5 g ( NH4) 2S04. . . ... . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 g MgS04-7H20 ....: ............... 1g glucose ......... »............. .... 50 g KH, P04 .... *** '' .... . . . . . . . . . . . . . 3 g CaCO3 ............................ 9g CUS04 5 H20. . . . . . . . . . . . . . ... . . . . 3.3 mg FeS04 7 H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 mg ZnS04 - 7 11.0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 mg MnS04-4 H20. . . . . . . . . . . . . . . . .... 4 mg H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . up to 1 1 The pH was adjusted to 7.0 with Na OH. The sterilization was carried out at 120 ° C for 30 minutes.
Als Impfmaterial wurden 100/, des Inhalts des Vorfermentators verwendet. 100 % of the contents of the pre-fermenter were used as inoculum.
Die Fermentierung wurde bei 28°C unter Rühren bei 800 U/Min. des Rührwerks und einer Belüftung von 0,8 Vol/Vol/m und in Gegenwart eines Antischaummittels durchgeführt. Im Laufe der Fermentation nahm das Medium eine charakteristische orangerote Farbe an. Nach 48stündigem Wachstum wurde ein Volumen von 20 bis 25 °/o gepackten Zellen erhalten. Der pH-Wert betrug 5,6 bis 5,4. Die höchste antibiotische Wirksamkeit wurde nach 40 bis 50 Stunden (300 bis 400 y/ccm antibiotisches Gemisch) erhalten.The fermentation was carried out at 28 ° C with stirring at 800 rpm. of the agitator and an aeration of 0.8 vol / vol / m and in the presence of an antifoam agent. In the course of the fermentation the medium took on a characteristic orange-red color at. After 48 hours of growth, a volume of 20-25% became packed cells obtain. The pH was 5.6 to 5.4. The highest antibiotic effectiveness was obtained after 40 to 50 hours (300 to 400 y / cc antibiotic mixture).
Beispiel 2 Eine Kultur von Str. mediterraneus wurde in einer geschüttelten
Flasche, wie im Beispiel 1 beschrieben, her-
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DEL33941A Pending DE1089513B (en) | 1958-08-12 | 1959-08-11 | Process for the preparation of the antibiotic rifomycin and its components |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE1089513B (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE1237119B (en) * | 1960-12-30 | 1967-03-23 | Lepetit Spa | Process for the preparation of derivatives of rifamycin O |
-
1959
- 1959-08-11 DE DEL33941A patent/DE1089513B/en active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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DE1237119B (en) * | 1960-12-30 | 1967-03-23 | Lepetit Spa | Process for the preparation of derivatives of rifamycin O |
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