DE1089511B

DE1089511B - Process for the preparation of 5a (11a) -dehydrotetracyclines

Info

Publication number: DE1089511B
Application number: DEA29174A
Authority: DE
Inventors: John Andrew Growich Jun; Philip Andrew Miller
Original assignee: American Cyanamid Co
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1957-04-05
Filing date: 1958-04-01
Publication date: 1960-09-22

Description

Verfahren zur Herstellung von 5a(11a)-Dehydrotetracyclinen Die Erfindung betrifft die Herstellung neuer Verbindungen aus der Tetracyclinreihe.Process for the preparation of 5a (11a) -Dehydrotetracyclines The invention relates to the production of new compounds from the tetracycline series.

Die erfindungsgemäß hergestellten neuen Verbindungen sind 5a(11a)-Dehydrotetracychne der allgemeinen Formel worin Z Wasserstoff, Chlor oder Brom bedeutet.The new compounds prepared according to the invention are 5a (11a) -Dehydrotetracychne of the general formula wherein Z is hydrogen, chlorine or bromine.

Ist Z in dieser Formel Chlor, so kann man das erfindungsgemäß hergestellte neue Chlortetracyclin-Analogon nach der Nomenklatur der Chemical Abstracts als 7-Chlor-4- dimethylamino-1,4,4a,5,6,11,12,12a-octahydro-3,6,10, 12a-tetrahydroxy-6-methyl-1,11,12-trioxo-2-naphthacencarboxamid und mit einem Trivialnamen als 7-Chlor-5a(lla)-dehydrotetracyclin bezeichnen. Ebenso kann man das Tetracyclin-Analogon der obigen Formel, in der Z Wasserstoff bedeutet, als 5a(11a)-Dehydrotetracyclin und das Bromtetracyclin-Analogon gemäß dieser Formel, wobei Z Brom bedeutet, als 7-Brom-5a(lla)-dehydrotetracyclin bezeichnen.If Z in this formula is chlorine, then that prepared according to the invention can be used new chlortetracycline analogue according to the nomenclature of the Chemical Abstracts as 7-chloro-4- dimethylamino-1,4,4a, 5,6,11,12,12a-octahydro-3,6,10,12a-tetrahydroxy-6-methyl-1,11,12-trioxo-2-naphthacene carboxamide and with a common name as 7-chloro-5a (lla) -dehydrotetracycline. as well one can use the tetracycline analogue of the above formula, in which Z is hydrogen, as 5a (11a) -dehydrotetracycline and the bromotetracycline analog according to this formula, where Z denotes bromine, denote as 7-bromo-5a (lla) -dehydrotetracycline.

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen der Tetracyclinreihe werden durch bestimmte Mutantenstämme von Streptomyces aureofaciens erzeugt. Die neuen Mutantenstämme sind Species des Stammes von Streptomyces aureofaciens, da sie alle direkte Abkömmlinge der Chlortetracyclin erzeugenden Species von Streptomyces aureofaciens sind, die, als A 377 bezeichnet, im USA.-Patent 2 482 055 beschrieben und bei den Northern Research Laboratory, Peoria, Illinois, hinterlegt und dort als NRRL 2209 registriert worden ist. Die Entwicklung der neuen Streptomyces-aureofaciens-Stämme aus dem ursprünglichen Stamm A 377, wie er aus dem Boden isoliert wurde, wird durch Behandlung von A 377 mit mutagenen Mitteln, wie ultravioletter Bestrahlung, Behandlung mit Nikotin oder Stickstoff-lost (nitrogen mustard), vorgenommen. Eine Spontanmutation von Chlortetracyclin produzierenden Stämmen von Streptomyces aureofaciens führt ebenfalls zu Stämmen, die die erfindungsgemäßen Antibiotika erzeugen können.The new compounds of the tetracycline series according to the invention are generated by certain mutant strains of Streptomyces aureofaciens. The new Mutant strains are species of the strain of Streptomyces aureofaciens, as all of them direct descendants of the chlortetracycline producing species from Streptomyces aureofaciens which, designated as A 377, are described in U.S. Patent 2,482,055 and in US Pat Northern Research Laboratory, Peoria, Illinois, and registered there as NRRL 2209 has been registered. The development of the new Streptomyces aureofaciens strains from the original strain A 377, as isolated from the soil, becomes by Treatment of A 377 with mutagenic agents such as ultraviolet radiation, treatment with nicotine or nitrogen-lost (nitrogen mustard). A spontaneous mutation of chlortetracycline producing strains of Streptomyces aureofaciens likewise to strains which can produce the antibiotics according to the invention.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von 5a(lla)-Dehydrotetracyclinen der Formel I umfaßt die aerobe Fermentation eines üblichen, chlorionenhaltigen, wäßrigen Nährmediums mit einem Streptomyces-aureofaciens-Stamm, der zur Herstellung der Verbindung der Formel I, in der Z Chlor bedeutet, adaptiert ist, oder die Fermentation eines wenig oder gar keine Chlorionen enthaltenden Mediums, wobei die Verbindung der Formel I hergestellt wird, in der Z Wasserstoff bedeutet, oder eines Mediums, das beträchtliche Mengen Bromionen enthält, wobei die Verbindung der Formel I, in der Z Brom bedeutet, hergestellt wird.The inventive method for the preparation of 5a (lla) -Dehydrotetracyclinen of formula I comprises the aerobic fermentation of a conventional, chlorine ion-containing, aqueous nutrient medium with a Streptomyces aureofaciens strain, which is used for the production of the compound of the formula I in which Z is chlorine, or the fermentation a medium containing little or no chlorine ions, the compound of the formula I is prepared, in which Z is hydrogen, or a medium, which contains considerable amounts of bromine ions, the compound of formula I, in the Z means bromine is produced.

Der usprüngliche Streptomyces-aureofaciens-Stamm, der die erfindungsgemäßen neuen Antibiotika erzeugt, wurde als S 1308 bezeichnet. Er ist etwas instabil. Wenn man ihn subkultiviert, so degeneriert er sehr rasch zu einer gemischten Kultur, aus der man eine Anzahl von stabileren Varianten verschiedenen Aussehens isolieren kann. Ganz allgemein sind alle diese Stämme charakteristisch für die Species Streptomyces aureofaciens, jedoch differieren sie untereinander und von früher beschriebenen Streptomyces-aureofaciens-Stämmen vor allen Dingen in der Pigmentierung. Praktisch alle diese Stämme zeigen eine charakteristische Ultraviolettfluoreszenz bei 3600 Angström, wenn sie auf Agar- und Maisquellwassermedien gezüchtet werden.The original Streptomyces aureofaciens strain which contains the present invention generated new antibiotics was designated as S 1308. It's a little unstable. if if it is subcultured, it degenerates very quickly into a mixed culture, from which one can isolate a number of more stable variants of different appearances can. In general, all of these strains are characteristic of the species Streptomyces aureofaciens, however, they differ from each other and from previously described Streptomyces aureofaciens strains mainly in pigmentation. Practically all of these strains show a characteristic ultraviolet fluorescence at 3600 Angstroms when grown on agar and corn steep water media.

Obgleich die neuen Streptomyces-aureofaciens-Stämme und ihre Varianten sich hauptsächlich von früher beschriebenen Stämmen von Streptomyces anreofaciens durch die Art der erzeugten Antibiotika unterscheiden, so differieren die bisher untersuchten Stämme doch auch etwas in der Pigmentierung auf verschiedenen Kulturmedien, wie im folgenden gezeigt wird. Vergleich der diffusionsfähigen, fluoreszierenden Pigmente im Agarmedium Stamm Q4-Agar AP4-Agar A 377 keine keine s1308 hellgelbgrün hellgelbgrün Zusammensetzung des Q4-Agars Saccharose ......................... 10 g M9S04 - 7H20 . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . 0,25 g KH1P04........................... 4 g (NH4)3P04 ......................... 2 g Maisquellwasser...................... 7,5 ml Roher Agar ......................... 30 g H20, q.s. .......................... 1000 ml pA, eingestellt auf 6,5 Zusammensetzung des AP4-Agars Saccharose ......................... 10 g MgS04 - 7 H20 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,25 g KH,P04........................... 2 g (NH4)3P04 ......................... 2 g Maisquellwasser...................... 4 g Bacto-Agar (gereinigt) ............... 20 g H,0, q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml Zusammensetzung des AP6-Agars Ebenso wie AP4-Agar, mit der Ausnahme, daß der Gehalt an Maisquellwasser 6 g/1 beträgt.Although the new Streptomyces aureofaciens strains and their variants mainly differ from the previously described strains of Streptomyces anreofaciens in the type of antibiotics produced, the strains investigated so far also differ somewhat in terms of pigmentation on different culture media, as will be shown below. Comparison of diffusible, fluorescent pigments in the agar medium Q4 strain agar AP4 agar A 377 none none s1308 light yellow green light yellow green Composition of the Q4 agar Sucrose ......................... 10 g M9S04 - 7H20. . . . . . ... . . . . . . . . . . . . . 0.25 g KH1P04 ........................... 4 g (NH4) 3P04 ......................... 2 g Corn steep water ...................... 7.5 ml Raw agar ......................... 30 g H20, qs .......................... 1000 ml pA adjusted to 6.5 Composition of the AP4 agar Sucrose ......................... 10 g MgS04 - 7 H20. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.25 g KH, P04. .......................... 2 g (NH4) 3P04 ......................... 2 g Corn steep water ...................... 4 g Bacto agar (purified) ............... 20 g H, 0, qs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml Composition of AP6 agar Same as AP4 agar, with the exception that the corn steep liquor content is 6 g / l.

Der Stamm S 1308 wächst auf Q4-Agar kräftig und bringt reichlich tiefgraue Sporen hervor. Auf AP4- und AP6-Agar ist die typische Kolonie stark tiefbraungelb pigmentiert, die in weißglühendem Licht vollständig braun bis braunrot mit einem diffusen Rand, konvex und weich wird und beim Altern im Zentrum Papillenbildung aufweist.The strain S 1308 grows vigorously on Q4 agar and produces plenty of deep gray Spurs out. On AP4 and AP6 agar, the typical colony is very dark brown-yellow pigmented, which in incandescent light completely brown to brownish red with a diffuse edge, convex and soft and with aging papilla formation in the center having.

Wachstum und Kultur des ursprünglich isolierten S 1308-Stammes führten zur Erkennung und Isolierung einer Reihe von Abarten verschiedenen Aussehens, die in der Farbe von weiß bis fahlgelb, tieforgange, hellbraun und dem typischen Braungelb und Braunrot variieren. Alle zeigen die charakteristische Ultraviolettfluoreszenz bei 3600 Angström mit Ausnahme der weißen Abarten.Growth and culture of the originally isolated S 1308 strain to detect and isolate a number of varieties of different appearances that in the color from white to pale yellow, deep orange, light brown and the typical brownish yellow and brown-red vary. All show the characteristic ultraviolet fluorescence at 3600 angstroms with the exception of the white varieties.

Zur Erläuterung der Farbunterschiede der neuen Streptomyces-aureofaciens-Stämme, die die erfindungsgemäßen Antibiotika erzeugen, wurden sechs ausgesuchte Stämme auf Maisquellwasser =Agar gezüchtet, wobei die folgenden Beobachtungen gemacht wurden. Streptomyces-aureofaciens-Stamm S 1308 wurde unterschieden von Streptomyces-aureofaciens-Stamm A 377 (NRRL 2209) durch Beobachtung der Wachstumscharakteristika auf verschiedenen Medien, die bei 26,5°C bebrütet wurden. 1. Glycerin-asparagin-Rindfleischextrakt-Agar Glycerin ....... . ..................... 1,00/0 L-Asparagin ................. . ....... 0,050/0 Rindfleischextrakt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,2 % K H2 P04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 0/0 Bacto-Agar .......................... 1,5 0/ 0 Destilliertes Wasser, q. s............... 100,0 0/0 pB-Einstellung mit 50 0/0K O H auf ..... 7,0 p$ nach der Sterilisation.. ............ . 7,2 Farb-Beobachtungenl : S. aureofaciens AP 4-Maisquellwasser-Agar 6 Tage Bebrütung bei 26,5° C Stamm Einzelne Kolonien 1 Massen-Wachstum s1308 (kupferbraun) (dunkelbraun) copper brown dark brown S. 1308-V 146 (cedernholz) (dunkelholzrot) cedar dark redwood S 1308-V 237 (dunkelledergegerbt) (amtier) darg luggage tau amtier S1308-29 (orange-rost) (orange-rost) orange rast orange rust 1) Farben nach dem Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corporation of America. Farb-Beobachtungenl: S. aureofaciens: AP 6-Maisquellwasser-Agar 6 Tage Bebrütung bei 26,5° C Stamm Einzelne Kolonien 1 Massen-Wachstum S1308 henna bis dunkel- (dunkelbraun) braun Dark brown S 1308-V 146 sandelholz (kastanienbraun) chestnut brown S 1308-V 237 (dunkelledergegerbt) (dunkelleder- Dark Luggage tan gegerbt) Dark Luggage tan S1308-29 (eichenbraun) (eichenbraun) Oak brown Oak brown 1) Farben nach dem Color Harmony Manual, Thrid Edition, Container Corporation of America. Die die neuen Antibiotika gemäß der Erfindung erzeugenden Mutantenstämme besitzen dieselben allgemeinen Charakteristika wie die Tetracyclin erzeugenden Stämme. Sie differieren untereinander etwa ähnlich, wie die Tetracyclin und Chlortetracyclin erzeugenden Stämme sich untereinander unterscheiden, wie es bereits in mehreren wissenschaftlichen Aufsätzen beschrieben worden ist. Die nachfolgenden Daten dienen zur Erläuterung der Unterschiede der neuen Stämme von dem ursprünglichen Stamm A 377, der als NRRL 2209 zugänglich ist. Streptomyces aureofaciens Stamm S1308 Stamm A377 Wachstum gut, (kamel) camell gut Lufthyphen gering bis mäßig, weiß bis grau gering bis ausreichend, weiß bis hellgrau Spoienbildung ausreichend mit grauem Foci hellgiau Diffusionsfähiges hellgelbgrün hellgelb Pigment Unterseite kamel bis hellbraun gelb bis hellorangegelb 1) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corporation of America. 2. Dextrin-Czapek-Dox-Agar Dextrin ............................... 1,0 0/ 0 Na N 03 ............................... 0,2 0/, K,H P 04 ............................. 0,1 01, Mg S 04 - 7H,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,05 0/0 KG .................................. 0,05 0/0 Fe S 04 - 711,0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0010/0 Bacto-Agar .................. ...... 1,5 0/0 Destilliertes Wasser, q. s. . . . . . . . . . . . . . . 100,0 0/ 0 p$ nach Sterilisation.................... 7,2 Streptomyces aureofaciens Stamm S1308 Stamm A377 Wachstum gering, hyalin gut Lufthyphen keine reichlich, mousegrayl to lead gray (mausgrau bis bleigrau), wasser- klare Oberflächenkügelchen Sporenbildung keine profus Diffusionsfähiges keine Spuren: fahlgelb Pigment Unterseite Pigmentspuren rotorange apigmentös, rosa in Spuren 1) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corporation of America. 3. AP4-Maisquellwasser-Agar Maisquellwasser ....................... 0,4 0/0 Sucrose ........ ...................... 1,0 0/0 Mg S 04 - 7H2.0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0250/, K H2P 04 ............................. 0,2 0/, (NH4)2HP04 ......................... 0,2 0/, Bacto-Agar ........................... 2,0 0/ 0 Leitungswasser, q. s..................... 100,0 0/ 0 pg nach der Sterilisation ............... 6,5 Streptomyces aureofaciens Stamm S1308 Stamm A377 Wachstum gut ausgezeichnet Lufthyphen mäßig bis reichlich, fawn (fahl) reichlich, fawnl (fahl) Sporenbildung reichlich, gleichmäßig profus, gleichmäßig Lösliches Pigment tieforangebraun mit gelbgrünem Überzug hellgelb bis amtier Unterseite chocolate brownl (schokoladenbraun) Light tau' (hell lohfarben) 1) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corporation of America. 4. Andere Agar-Medien Streptomyces aureofaciens Medium Stamm S1308 Stamm A377 Nähr-Agar ausreichendes Wachstum: puttyl) (kittfarben) GutesWachstum.Keine Lufthyphen. bis mustardbrownl) (senfbraun). Lufthyphen. Unterseite: fahlgelb. Fahlgelbes Unterseite: Puttyl) (kittfarben), wirdmustard- lösliches Pigment. brown1) (senfbraun). Kein lösliches Pigment. Glucose-Asparagin- Reichliches Wachstum: cinnamon') to da-rk Gutes Wachstum. Lufthyphen, die Fleischextrakt luggage tau') (zimtfarben bis dunkelleder- mit wachsender Sporenbildung . gegerbt). Reichliche Lufthyphen: weiß bis immer grauer werden. Unterseite: fahl. Sporenbildung: reichlich. Unterseite: hellgelb bis rosaorange. Spuren dank luggage tau. (dunkelledergegerbt). von gelborangem löslichem Pig- Orangebraunes lösliches Pigment. ment. AP4-Maisquellwasser- Gutes Wachstum: camell) to oak brownl) (kamel- Ausgezeichnetes Wachstum. Pro- Agar farben bis eichenbraun). Gute bis reichliche fuses Luftmycel. Profuse Sporen- Lufthyphen: fawnl) (fahl). Sporenbildung: Bildung: fa-,vnl) (fahl). Unter- gut bis reichlich. Unterseite: chocolatebrownl) seite: light tau') (hell-lohfarben). (schokoladenbraun). Tieforangebraunes Pig- Hellgelb bis amberfarbenes lös- ment, lösliches Pigment mit gelbgrünem liches Pigment. Überzug. ' AP6-Maisquellwasser- Reichliches Wachstum: brick rede) to copper Ausgezeichnetes Wachstum. Pro- Agar brown1) (ziegelrot bis kupferbraun). Reichlich fuses Luftmycel. Profuse Sporen- bis profuse Lufthyphen: beige') (beige) Reich- Bildung: fawnl) (fahl). Unter- liche Sporenbildung. Unterseite: chocolate seite: tanl) (lohfarben). Hell- browrrl) (schokoladenbraun). Tiefrotbraunes amberfarbenes lösliches Pigment. lösliches Pigment mit gelbgrünem Überzug. Q4-Agar Ausgezeichnetes Wachstum: copperbrownl) to Ausgezeichnetes Wachstum: fahl- chocolate brown1) (kupferbraun bis schoko- gelb. Profuses Luftmycel: dark ladenbraun). Profuses Luftmycel: beige') brown1) (dunkelbraun). Profuse (beige). Profuse Sporenbildung. Unterseite: Sporenbildung. Unterseite orange chocolate brown1) (schokoladenbraun). Sehr bis orangegelb. Orangebraunes tief rotbraunes lösliches Pigment mit gelb- lösliches Pigment. grünem Überzug. Kartoffelschnitzel Profuses, feuchtes, weiches, klümpchenförmiges Profuses, feuchtes, weiches, klümp- (Potatoe slants) Wachstum: orange rust') to deep brownl) to chenförmiges Wachstum: light light brown1) (orange-rost bis tiefbraun bis brown yellowl) to beige to cedar') hellbraun). Kein lösliches Pigment. (hellbraungelb bis beige bis zedern- farben). Kein lösliches Pigment. Purpurmilch Geringes, aber erkenntliches Wachstum in Form Geringes weißes bisfahlgelbesWachs- (Purple milk) eines Kragens von Brite chartreuse yellowl) tum in Form eines Kragens. (hellchartreusegelb) Aussehen. Anscheinend Geringfügiger pn-Wechsel, an- partielle Peptonisation, jedoch nur gering- scheinend keine sichtliche Peptoni- fügiger pn-Wechsel. sation in 14 Tagen. z) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corporation of America, 5. Mikroskopische Beobachtungen Streptomyces aureofaciens Stamm S1308 Stamm A377 Medium Mycei Sporen Mycel Sporen Glycerin-Asparagin- gekrümmt, spheroid bis gekrümmt, spheroid bis Fleischextrakt- kontinuierlich, eiförmig, Durch- kontinuierlich, eiförmig, Durch- Agar verzweigt, Durch- messe' 1,2 bis 1,5#t verzweigt, Durch- messe' 1,2 bis 1,5 #t messe' 1,2 bis 2,0 #t messe' 1,0 bis 1,2 #t AP4-Maisquell- gekrümmt, spheroid bis gekrümmt, spheroid bis wasser-Agar kontinuierlich, eiförmig, Durch- kontinuierlich, eiförmig, Durch- verzweigt, Durch- messe' 1,2 bis 1,5 #t verzweigt, Durch- messe' 1,2 bis 1,5 #t messe' 0,8 bis 1,0 #t messe' 0,8 bis 1,0 #t Die Mycel- und Sporenmorphologie des Stammes S 1308 ist augenscheinlich derjenigen des Stammes A 377 ähnlich. Beide Stämme zeigen ein kontinuierliches, gekrümmtes, verzweigtes Mycel mit gelegentlicher Tendenz der Lufthyphen zur Spiralbildung. Charakteristische Sporen sind eiförmiger bis spheroider Gestalt.To explain the color differences of the new Streptomyces aureofaciens strains which produce the antibiotics according to the invention, six selected strains were grown on corn steep liquor = agar, the following observations being made. Streptomyces aureofaciens strain S 1308 was distinguished from Streptomyces aureofaciens strain A 377 (NRRL 2209) by observing the growth characteristics on various media incubated at 26.5 ° C. 1. Glycerin-asparagine-beef extract agar Glycerin ........ ..................... 1.00 / 0 L-asparagine .................. ....... 0.050 / 0 Beef extract. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.2 % K H2 P04. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.05 0/0 Bacto agar .......................... 1.5 0 / 0 Distilled water, q. s ............... 100.0 0/0 pB setting with 50 0 / 0K OH to ..... 7.0 p $ after sterilization .. ............. 7.2 Color observations: S. aureofaciens AP 4 corn steep water agar 6 days incubation at 26.5 ° C Strain Single Colonies 1 mass growth s1308 (copper brown) (dark brown) copper brown dark brown P. 1308-V 146 (cedar wood) (dark wood red) cedar dark redwood S 1308-V 237 (dark leather tanned) (official) darg luggage tau official S1308-29 (orange-rust) (orange-rust) orange rast orange rust 1) Colors according to the Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corporation of America. Color observations: S. aureofaciens: AP 6 corn steep water agar 6 days incubation at 26.5 ° C Strain Single Colonies 1 mass growth S1308 henna to dark (dark brown) brown Dark brown S 1308-V 146 sandalwood (chestnut brown) chestnut brown S 1308-V 237 (dark leather tanned) (dark leather Dark Luggage tan tanned) Dark Luggage tan S1308-29 (oak brown) (oak brown) Oak brown Oak brown 1) Colors according to the Color Harmony Manual, Thrid Edition, Container Corporation of America. The mutant strains producing the new antibiotics according to the invention have the same general characteristics as the tetracycline producing strains. They differ from one another in a similar way to how the strains producing tetracycline and chlortetracycline differ from one another, as has already been described in several scientific papers. The following data serve to explain the differences between the new strains and the original strain A 377, which is available as NRRL 2209. Streptomyces aureofaciens Strain S1308 strain A377 Growth good, (camel) camell good Aerial hyphae low to moderate, white to gray low to sufficient, white to light gray Sufficient spoil formation with gray foci hellgiau Diffusible light yellow green light yellow pigment Underside camel to light brown yellow to light orange yellow 1) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corporation of America. 2. Dextrin Czapek Dox Agar Dextrin ............................... 1.0 0 / 0 Na N 03 ............................... 0.2 0 /, K, HP 04 ............................. 0.1 01, Mg S 04-7H, 0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.05 0/0 KG .................................. 0.05 0/0 Fe S 04-711.0 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.0010 / 0 Bacto agar .................. ...... 1.5 0/0 Distilled water, qs. . . . . . . . . . . . . . 100.0 0 / 0 p $ after sterilization .................... 7.2 Streptomyces aureofaciens Strain S1308 strain A377 Little growth, good hyaline Aerial hyphae none abundant, mousegrayl to lead gray (mouse gray to lead gray), water- clear surface globules Sporulation no profuse Diffusible no traces: pale yellow pigment Underside traces of pigment, red-orange apigmentous, pink in traces 1) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corporation of America. 3. AP4 corn steep water agar Corn steep water ....................... 0.4 0/0 Sucrose ........ ...................... 1.0 0/0 Mg S 04 - 7H2.0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0.0250 /. K H2P 04 ............................. 0.2 0 /, (NH4) 2HP04 ......................... 0.2 0 /, Bacto agar ........................... 2.0 0 / 0 Tap water, q. s ..................... 100.0 0 / 0 pg after sterilization ............... 6.5 Streptomyces aureofaciens Strain S1308 strain A377 Growth good excellent Aerial hyphae moderate to abundant, fawn (sallow) abundant, fawnl (sallow) Spore formation abundant, evenly profuse, evenly Soluble pigment deep orange-brown with a yellow-green coating, light yellow to official Underside chocolate brownl (chocolate brown) light tau '(light tan) 1) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corporation of America. 4. Other agar media Streptomyces aureofaciens Medium strain S1308 strain A377 Nutrient agar sufficient growth: puttyl) (putty-colored) good growth, no aerial hyphae. to mustardbrownl) (mustard brown). Aerial hyphae. Underside: pale yellow. Pale yellow Underside: puttyl) (putty-colored), becomes mustard-soluble pigment. brown1) (mustard brown). No soluble pigment. Glucose-Asparagine- Abundant Growth: cinnamon ') to da-rk Good growth. Aerial hyphae that Meat extract luggage tau ') (cinnamon-colored to dark leather - with growing spore formation . tanned). Abundant aerial hyphae: white until becoming gray. Bottom: pale. Sporulation: abundant. Underside: light yellow to pinkish orange. traces thanks to luggage tau. (dark leather tanned). of yellow-orange soluble pig- Orange-brown soluble pigment. ment. AP4-Corn spring water- Good growth: camell) to oak brownl) (Kamel- Excellent growth. Pro- Agar colors to oak brown). Good to copious fuses aerial mycelium. Profuse spore Aerial hyphae: fawnl) (pale). Spore formation: Formation: fa-, vnl) (pale). Under- good to plentiful. Underside: chocolatebrownl) side: light tau ') (light tan). (chocolate brown). Deep orange-brown pig- light yellow to amber-colored ment, soluble pigment with a yellowish green pigment. Coating. 'AP6-Maisspellwasser- Abundant growth: brick rede) to copper Excellent growth. Per- Agar brown1) (brick red to copper brown). Abundant fuses aerial mycelium. Profuse spore to profuse aerial hyphae: beige ') (beige) rich education: fawnl) (pale). Under- lichen spore formation. Bottom: chocolate side: tanl) (tan). Bright- browrrl) (chocolate brown). Deep red-brown amber soluble pigment. soluble pigment with a yellow-green coating. Q4 agar Excellent growth: copperbrownl) to Excellent growth: pale chocolate brown1) (copper brown to chocolate yellow. Profuse aerial mycelium: dark shop brown). Profuse aerial mycelium: beige ') brown1) (dark brown). Profuse (beige). Profuse sporulation. Underside: spore formation. Underside orange chocolate brown1) (chocolate brown). Very to orange-yellow. Orange brown deep red-brown soluble pigment with yellow-soluble pigment. green coating. Potato schnitzel Profuses, moist, soft, lump-shaped Profuses, moist, soft, lumpy (Potatoe slants) growth: orange rust ') to deep brownl) to chen-shaped growth: light light brown1) (orange-rust to deep brown to brown yellowl) to beige to cedar ') light brown). No soluble pigment. (light brown yellow to beige to cedar Colours). No soluble pigment. Purple milk Little but noticeable growth in the form Little white to pale yellow wax (Purple milk) of a collar of British chartreuse yellowl) tum in the form of a collar. (light chartreuse yellow) appearance. Apparently minor pn change, an- partial peptonization, but only marginally no visible peptonization docile pn change. sation in 14 days. z) Color Harmony Manual, Third Edition, Container Corporation of America, 5. Microscopic observations Streptomyces aureofaciens Strain S1308 strain A377 medium Mycei spores mycelium spores Glycerine-asparagine- curved, spheroid to curved, spheroid to Meat extract- continuous, egg-shaped, through- continuous, egg-shaped, through- Agar branched, diameter '1.2 to 1.5 #t branched, diameter' 1.2 to 1.5 #t measure '1.2 to 2.0 #t measure' 1.0 to 1.2 #t AP4-Maisquell- curved, spheroid to curved, spheroid to water agar continuous, egg-shaped, through- continuous, egg-shaped, through- branched, diameter '1.2 to 1.5 #t branched, diameter' 1.2 to 1.5 #t measure '0.8 to 1.0 #t measure' 0.8 to 1.0 #t The mycelial and spore morphology of strain S 1308 is apparently similar to that of strain A 377. Both strains show a continuous, curved, branched mycelium with an occasional tendency of the aerial hyphae to form spirals. Characteristic spores are ovoid to spheroid in shape.

Lebensfähige Kulturen von Streptomyces-aureofaciens-Stamm S 1308 und von verschiedenen seiner Varianten, die die neuen erfindungsgemäßen Antibiotika erzeugen, wurden bei der American Type Culture Collection in Washington, D. C., hinterlegt. Sie erhielten die Eingangsnummern ATCC Nr. 12748 für Stamm S 1308, ATCC Nr. 12749 für Stamm S 1308-29, ATCC Nr. 12750 für Stamm S 1308-V 146 und ATCC Nr. 12751 für Stamm S 1308-V 237.Viable cultures of Streptomyces aureofaciens strain S 1308 and of several of its variants that make up the new antibiotics according to the invention were at the American Type Culture Collection in Washington, D. C., deposited. They received accession numbers ATCC No. 12748 for strain S 1308, ATCC No. 12749 for strain S 1308-29, ATCC No. 12750 for strain S 1308-V 146 and ATCC No. 12751 for strain S 1308-V 237.

Das antibakterielle Spektrum des 7-Chlor-5a(lla)-dehydrotetracyclins läuft dem des Tetracyclins und des Chlortetracyclins ziemlich parallel mit der Ausnahme, daß die Wirksamkeit der neuen Antibiotika gegen verschiedene pathogene Erreger, wie Staphylokokken und Streptokokken, sehr viel geringer ist. Die hauptsächliche Verwendung von 7-Chlor-Sa(1la)-dehydrotetracyclin besteht in der Umwandlung mittels eines reduktiven Entchlorierungsverfahrens in das gut bekannte Breitbandspektrumantibiotikum Tetracyclin. Ein geeignetes, katalytisches, reduktives Entchlorierungsverfahren wird in der deutschen Auslegeschrift 1073 482 beschrieben.The antibacterial spectrum of 7-chloro-5a (lla) -dehydrotetracycline runs fairly parallel to that of tetracycline and chlortetracycline, with the exception that the effectiveness of the new antibiotics against various pathogens such as staphylococci and streptococci is much lower. The primary use of 7-chloro-Sa (1la) -dehydrotetracycline is for conversion to the well-known broad spectrum antibiotic tetracycline by a reductive dechlorination process. A suitable, catalytic, reductive dechlorination process is described in German Auslegeschrift 1073 482.

Man kann die Umwandlung von 7-Chlor-Sa(11a)-dehydrotetracyclin in das Breitbandspektrumantibiotikum Chlortetracyclin auch auf biologischem Wege vornehmen, in dem man Kristalle des neuen erfindungsgemäß erzeugten Antibiotikums zu einer Fermentationslösung zufügt, in der übliche Chlortetracyclin synthetisierende Stämme von Streptomyces aureofaciens verwendet werden. Ein geeignetes biologisches Verfahren zur Durchführung dieser Umwandlung wird in der deutschen Auslegeschrift 1077 657 beschrieben.The conversion of 7-chloro-Sa (11a) -dehydrotetracycline into the broad spectrum antibiotic chlortetracycline can also be carried out biologically by adding crystals of the new antibiotic produced according to the invention to a fermentation solution in which the usual chlortetracycline-synthesizing strains of Streptomyces aureofaciens are used . A suitable biological process for carrying out this conversion is described in German Auslegeschrift 1077 657.

Die Fermentationsbedingungen für die neuen Mutantenstämme von Streptomyces aureofaciens zur Erzeugung von 7-Chlor-Sa(11a)-dehydrotetracyclin sind im allgemeinen dieselben, die aus den schon bekannten Verfahren zur Herstellung von Chlortetracyclin durch Fermentation bekannt sind. Das Fermentationsmedium enthält die üblichen Nährstoffe und Mineralsubstanzen. Geeignete Nährsubstanzen sind beispielsweise: Stärke, Dextrose, Rohrzucker, Glukose, Melasse, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Hefe, Fleischextrakte, Pepton, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Maisquellwasser, lösliche Rückstände der Brantweinherstellung (distillers solubles) oder Fischmehl. Zu den verwendbaren anorganischen Salzen zählen beispielsweise Calciumcarbonat, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid und die zahlreichen Spurenelemente, wie Mangan, Cobalt, Zink, Kupfer oder Eisen.The fermentation conditions for the new mutant strains of Streptomyces aureofaciens for the production of 7-chloro-Sa (11a) -dehydrotetracycline are generally the same as those from the already known process for the preparation of chlortetracycline known from fermentation. The fermentation medium contains the usual nutrients and mineral substances. Suitable nutrients are, for example: starch, dextrose, Cane sugar, glucose, molasses, soybean flour, peanut flour, yeast, meat extracts, Peptone, ammonium sulfate, urea, corn steep liquor, soluble residues from brandy wine production (distillers solubles) or fish meal. The inorganic salts that can be used include for example calcium carbonate, ammonium sulfate, ammonium chloride and the numerous Trace elements such as manganese, cobalt, zinc, copper or iron.

Auch die übrigen Fermentationsbedingungen, wie Wasserstoffionenkonzentration, Temperatur, Zeit, Geschwindigkeit der Belüftung, Herstellung des Impfstoffes, Sterilisierung, Impfung u. dgl., sind üblich und können den zur Herstellung von Chlortetracyclin in der USA.-Patentschrift 2482055beschriebenenBedingungen ähneln.The other fermentation conditions, such as hydrogen ion concentration, Temperature, time, speed of ventilation, preparation of vaccine, sterilization, Vaccination, and the like, are common and can be used in the manufacture of chlortetracycline in U.S. Patent 2,482,055.

In einem Punkt weichen jedoch die Fermentationsbedingungen zur Erzeugung der erfindungsgemäßen Tetracyclinderivate von den Bedingungen der Chlortetracyclinfermentation ab. Die neuen Mutantenstämme von Streptomyces aureofaciens scheinen nämlich Riboflavinmangelorganismen zu sein. Daher sind die Ausbeuten an den neuen Antibioticis niedrig, wenn die Fermentation in Medien durchgeführt wird, die nur wenig oder überhaupt kein Riboflavin enthalten. Beispielsweise ergibt die Fermentation in einem üblichen Maisquellwassermedium ohne Zugabe von Riboflavin 2500 bis 4000 y der neuen Antibiotika pro ml. Die Zugabe von Spuren Riboflavin zu diesen Medien steigert die Ausbeute. Daher wird vorzugsweise ein Maisquellwassermedium mit hohem Riboflavingehalt verwandt. So wurde gefunden, daß bei einer Zugabe von 0,1 bis 2,0 Teilen Riboflavin pro Million Teile Nährmedium die Ausbeute auf 8000 bis 10000 y/ml ansteigt. Dies zeigt, daß die neuen Mutanten sehr hohe Antibiotikaausbeuten ergeben.At one point, however, the fermentation conditions for production give way of the tetracycline derivatives according to the invention from the conditions of the chlorotetracycline fermentation away. Namely, the new mutant strains of Streptomyces aureofaciens appear to be riboflavin-deficient organisms to be. Therefore, the yields of the new antibiotic are low when fermentation is performed in media that contain little or no riboflavin. For example, fermentation in a common corn steep liquor medium yields none Addition of riboflavin 2500 to 4000 y of the new antibiotics per ml. The addition of Traces of riboflavin on these media increase the yield. Therefore is preferred a corn steep water medium with a high riboflavin content is used. So it was found that with an addition of 0.1 to 2.0 parts of riboflavin per million parts of nutrient medium the yield increases to 8000 to 10000 y / ml. This shows that the new mutants result in very high antibiotic yields.

Es werden auch geringe Mengen Chlortetracyclin und Tetracyclin während der Fermentation erzeugt. Üblicherweise sind diese Mengen jedoch nicht groß genug, um die Erzeugung desHauptfermentationsprodukts zu behindern. Auch machen diese Mengen keine zusätzlichen Gewinnungsschritte erforderlich, da sie gewöhnlich im Fermentationsmedium nur in einer Menge bis ungefähr 200 bis 400 y/ml vorhanden sind, obgleich die relativen Mengen dieser drei Antibiotika beträchtlich mit dem im einzelnen verwendeten Mutantenstamm, dem Medium und den Fermentationsbedingungen wechseln.There will also be small amounts of chlortetracycline and tetracycline during produced by fermentation. Usually, however, these quantities are not large enough to impede the production of the main fermentation product. Also make these amounts no additional recovery steps required as they are usually in the fermentation medium are only present in an amount up to about 200 to 400 µg / ml, although the relative amounts Amounts of these three antibiotics significantly with the particular mutant strain used, change the medium and fermentation conditions.

WenndasFermentationsmedium nur wenigChloridionen enthält (vgl. USA.-Patent 2734018), so erzeugen die neuen Mutantenstämme von Streptomyces aureofacins das unchlorierte Tetracyclin-Analogon 5a(11a)-Dehydrotetracyclin. Es sei nochmals darauf hingewiesen, daß dieses Produkt identisch mit dem chloriertenAntibiotikum der Formel I ist mit der Ausnahme, daß es in 7-Stellung des Naphthacenringes kein Chloratom besitzt. Das unchlorierte Analogon kann katalytisch in der bei der chlorierten Verbindung beschriebenen Weise reduziert oder biologisch durch geeignete Fermentationsverfahren in Tetracyclin umgewandelt werden.If the fermentation medium contains only a small amount of chloride ions (see U.S. Patent 2734018), the new mutant strains of Streptomyces aureofacins produce das unchlorinated tetracycline analog 5a (11a) dehydrotetracycline. Let it be on again pointed out that this product is identical to the chlorinated antibiotic of the formula I is with the exception that there is no chlorine atom in the 7-position of the naphthacene ring owns. The unchlorinated analogue can be catalytically active in the case of the chlorinated compound described manner reduced or biologically by suitable fermentation processes converted to tetracycline.

Um das neue unchlorierte Antibiotikum herzustellen, ist es nur erforderlich, das Riboflavin enthaltende Fermentationsmedium in der in dem USA.-Patent 2734018 angegebenen Weise zu modifizieren, so daß das erhaltene Medium nur einen geringen Chloridionengehalt, d. h. weniger als ungefähr 50 Teile Chlorionen pro Million Teile, aufweist. Führt man das Fermentationsverfahren unter Verwendung der neuen Mutantenstämme in diesem chloridarmen Medium durch, so erhält man befriedigende Ausbeuten an 5a(lla)-Dehydrotetracyclin. Enthält das Fermentationsmedium wesentliche Mengen Bromidionen, so wird durch die neuen Mutantenstämme von Streptomyces aureofaciensdasBromtetracyclin-Analogon 7-Brom-5a(11a)-dehydrotetracyclin erzeugt. Dieses Produkt entspricht dem chlorierten Antibiotikum der Strukturformel I mit der Ausnahme, daß es in 7-Stellung am Naphthacenring statt Chlor Brom besitzt. Das neue Antibiotikum kann katalytisch in der oben bei der chlorierten und der nichtchlorierten Verbindung beschriebenen Verfahrensweise reduktiv oder biologisch durch geeignete Fermentationsverfahren im Bromtetracyclin umgewandelt werden.To make the new unchlorinated antibiotic all that is required is the fermentation medium containing riboflavin in that disclosed in U.S. Patent 2,734,018 to modify specified manner, so that the medium obtained is only a small Chloride ion content, d. H. less than about 50 parts chlorine ions per million parts, having. One conducts the fermentation process using the new mutant strains in this low-chloride medium, satisfactory yields of 5a (IIIa) -dehydrotetracycline are obtained. If the fermentation medium contains substantial amounts of bromide ions, the new mutant strains of Streptomyces aureofaciens the bromotetracycline analogue 7-bromo-5a (11a) -dehydrotetracycline generated. This product corresponds to the chlorinated antibiotic of the structural formula I with the exception that it has bromine in the 7-position on the naphthacene ring instead of chlorine. The new antibiotic can be catalytic in the above with the chlorinated and the non-chlorinated Compound described procedure reductively or biologically by suitable Fermentation process can be converted in the bromotetracycline.

Zur Herstellung dieses neuen Analogons ist es nur notwendig, das Fermentationsmedium so abzuändern, daß es wenigstens 50 Teile, vorzugsweise 100 bis 1500 Teile Bromionen und nicht mehr als 50 Teile Chlorionen pro Million Teile Fermentationsmedium enthält. Führt man die Fermentation mit den neuen Mutantenstämmen von Streptomyces aureofaciens in einem derartigen bromionenhaltigen Medium durch, so erhält man befriedigende Ausbeuten an 7-Brom-Sa(lla)-dehydrotetracyclin.To make this new analog, it is only necessary to use the fermentation medium to be modified so that there are at least 50 parts, preferably 100 to 1500 parts of bromine ions and contains no more than 50 parts of chlorine ions per million parts of fermentation medium. If the fermentation is carried out with the new mutant strains of Streptomyces aureofaciens in such a medium containing bromine ions, satisfactory results are obtained Yields of 7-bromo-Sa (IIIa) -dehydrotetracycline.

Die erfindungsgemäß hergestellten Dehydrotetracycline können aus der Fermentationsmaische durch übliche Mittel isoliert werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist die chromatographische Trennung, wobei die Fermentationsmaische mit einer geeigneten Säure, wie Salzsäure, Schwefelsäure, auf p$1 bis 2 eingestellt wird. Die Maische wird dann filtriert und das angesäuerte wäßrige Filtrat, das die Tetracycline enthält, mit einem Alkohol, wie n-Butanol, extrahiert, um einen alkoholischen Extrakt des aktiven Materials zu erhalten. Dieser Extrakt wird konzentriert und an einer Säule von Diatomeenerde in der üblichen Weise chromatographiert. Die Kolonne wird mit einer Mischung aus 80 °/o n-Butanol und 20 °/o Chloroform entwickelt. Die eluierten Fraktionen werden eingeengt und gefriergetrocknet. Das rohe, gefriergetrocknete Material wird in Methanol gelöst. Die Kristallisation des Antibiotikums als neutrale Substanz geht rasch vor sich. Die Kristalle werden abfiltriert, gewaschen und in üblicher Weise im Vakuum getrocknet. Rückstände von Chlortetracyclin und Tetracyclin, die noch vorhanden sind, kann man durch Kristallisieren entfernen, wobei man das Antibiotikum in angesäuertem Methanol löst, filtriert, mit schwachem Alkali neutralisiert und beispielsweise das gereinigte 7-Chlor-5a(1 1a)-dehydrotetracyclin auskristallisieren läßt.The dehydrotetracyclines produced according to the invention can be obtained from the Fermentation mash can be isolated by conventional means. A preferred method is the chromatographic separation, the fermentation mash with a suitable Acid, such as hydrochloric acid, sulfuric acid, is adjusted to p $ 1 to 2. The mash will then filtered and the acidified aqueous filtrate, which contains the tetracyclines, extracted with an alcohol, such as n-butanol, to produce an alcoholic extract of the active material. This extract is concentrated and attached to a column of diatomaceous earth chromatographed in the usual manner. The column is with a mixture of 80% n-butanol and 20% chloroform developed. The eluted Fractions are concentrated and freeze-dried. The raw, freeze-dried Material is dissolved in methanol. The crystallization of the antibiotic as neutral Substance goes on quickly. The crystals are filtered off, washed and in Usually dried in vacuo. Residues of chlortetracycline and tetracycline, that are still present can be removed by crystallization, whereby one can remove the Antibiotic dissolves in acidified methanol, filtered, neutralized with weak alkali and crystallize out, for example, the purified 7-chloro-5a (1 1a) -dehydrotetracycline leaves.

Die erfindungsgemäß hergestellten neuen Antibiotika weisen am Kohlenstoffatom in 4-Stellung Epimere auf, wie dies bei anderen Tetracychnverbindungen bereits beschrieben ist. Das neue Isomer wird dadurch gebildet, daß man die Wasserstoffionenkonzentration einer konzentrierten Antibiotikumlösung auf 3,0 bis 5,0 einstellt und die Lösung stehenläßt, bis sich das Gleichgewicht der Isomerisierungsreaktion eingestellt hat.The new antibiotics produced according to the invention point at the carbon atom in the 4-position on epimers, as already described for other tetracycline compounds is. The new isomer is formed by taking the hydrogen ion concentration a concentrated antibiotic solution adjusts to 3.0 to 5.0 and the solution lets stand until the equilibrium of the isomerization reaction has been established.

Die Isomerisierung wird am einfachsten bei Raumtemperatur vorgenommen, obgleich bei höheren Temperaturen die Umwandlungsgeschwindigkeit größer ist. Der p"-ZVert sollte zwischen ungefähr 3,0 bis 5,0, vorzugsweise zwischen 3,5 und 4,5, liegen. Eine gewisse Epimerisierung geht auch bei Wasserstoffionenkonzentrationen außerhalb dieses Bereichs, sogar in destilliertem Wasser, vor sich, jedoch ist dann die Geschwindigkeit sehr niedrig. Die Antibiotikumkonzentration in der wäßrigen Lösung sollte so hoch wie möglich sein, um höhere Epimerisierungsgeschwindigkeiten zu erzielen. Die vollständigen Einstellung des Gleichgewichts kann ungefähr 24 Stunden bei 25° C erfordern. Unter besonderen Bedingungen ist eine zufriedenstellende Einstellung des Gleichgewichts schon in beträchtlich kürzerer Zeit möglich. Im allgemeinen jedoch werden die besten Ergebnisse erhalten, wenn man die Lösung eine Woche oder noch länger stehenläßt. Das Gleichgewicht scheint in den meisten Fällen bei ungefähr 50 °/o zu liegen, d. h., die Hälfte des Antibiotikums ist im Gleichgewicht in das Epimere umgewandelt.The isomerization is most easily carried out at room temperature, although the rate of conversion is greater at higher temperatures. Of the p "-ZVert should be between about 3.0 to 5.0, preferably between 3.5 and 4.5, lie. A certain epimerization also works with hydrogen ion concentrations outside of this range, even in distilled water, in front of you, however, then is the speed very low. The antibiotic concentration in the aqueous Solution should be as high as possible to allow for higher epimerization rates to achieve. The complete setting of the equilibrium can take about 24 hours at 25 ° C. Under special conditions is a satisfactory setting of equilibrium is possible in a considerably shorter time. In general, however will get the best results if you have the solution a week or more let stand longer. The equilibrium seems to be around in most cases To lie 50 ° / o, d. i.e., half of the antibiotic is in equilibrium in that Epimers converted.

Da die Konzentration ein wesentlicher Faktor zur Erhaltung hoher Ausbeuten in kurzen Reaktionszeiten ist, sollte ein Lösungsmittelsystem ausgewählt werden, das die höchste Konzentration an Antibiotikum gibt. Das Lösungsmittelsystem sollte auf einen pH-Wert im bevorzugten Bereich abgepuffert werden. Zu derartigen Lösungsmitteln zählen beispielsweise Methanol, Äthanol, Butanol, Aceton, 2-Äthoxy-äthanol, 2-Methoxy-propanol, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid und Mischungen dieser Lösungsmittel. Jedoch können auch andereLösungsmittel angewendet werden. Ein bevorzugtes Puffermittel ist Natriumdihydrogenphosphat, obgleich auch andere Puffer oder Pufferpaare verwendet werden können, die die Wasserstoffionenkonzentration im gewünschten Bereich halten.As the concentration is an essential factor in maintaining high yields in short reaction times, a solvent system should be selected that gives the highest concentration of antibiotic. The solvent system should be buffered to a pH in the preferred range. To such solvents include, for example, methanol, ethanol, butanol, acetone, 2-ethoxy-ethanol, 2-methoxy-propanol, Tetrahydrofuran, dimethylformamide and mixtures of these solvents. However, you can other solvents can also be used. A preferred buffering agent is sodium dihydrogen phosphate, although other buffers or pairs of buffers can be used that control the hydrogen ion concentration hold in the desired area.

Die erfindungsgemäß hergestellten neuen Antibiotika bilden dieselben Salze in derselben Weise wie die bekannten Tetracycline, d. h. Mineralsäuresalze, Alkali-und Erdalkalisalze. So kann man die Mineralsäuresalze durch Behandeln mit Säuren, wie Chlorwasserstoff, bei einem p.H von weniger als 4 herstellen. Die freie Base erhält man z. B. bei einem p,1 zwischen ungefähr 4 und 7. Die Alkali- und Erdalkahsalze werden durch Behandlung der amphoteren Verbindung mit annähernd einem Äquivalent der gewählten Base, wie Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd oder Calciumhydroxyd, bei einem p$ von ungefähr 7 oder höher erhalten. In ähnlicher Weise können die Salze der epimeren Verbindung hergestellt werden.The new antibiotics produced according to the invention form the same Salts in the same way as the known tetracyclines, i. H. Mineral acid salts, Alkali and alkaline earth salts. So you can treat the mineral acid salts with Make acids, such as hydrogen chloride, at a pH of less than 4. The free Base is obtained z. B. at a p, 1 between about 4 and 7. The alkali and alkaline earth salts by treating the amphoteric compound with approximately one equivalent the selected base, such as sodium hydroxide, potassium hydroxide or calcium hydroxide Get a p $ of approximately 7 or higher. Similarly, the salts the epimeric connection can be established.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Ausbeuten sind ausgedrückt in Gamma/ml (,y/ml). Beispiel 1 Sporen von einem Streptomyces-aureofaciens-Stamm, die zur Herstellung von 7-Chlor-5a(11a)-dehydrotetracyclin fähig sind, wie der Stamm S 1308, werden von einem Schrägagar mit sterilem destilliertem Wasser zur Bildung einer Suspension abgespült, die annähernd 60 bis 80 Millionen Sporen pro ml enthält. 0,33 ml dieser Suspension werden zur Beimpfung einer Brewer-RÖhie verwendet, -die 8 ml des folgenden Mediums enthält: Sucrose ................. 30 g Ammoniumsulfat . . . . . . . . . 2 g Calciumcarbonat . . . . . . . -. . 7 g Maisquellwasser . . . . . . . . . . 16,5 ml Leitungswasser, q. s. ...... 1000 ml Vor der Beimpfung wird das Medium 20 Minuten lang bei einem Druck von 1,05 atü sterilisiert, wobei sich der pH-Wert von 6,3 auf 6,9 ändert. Die beimpfte Schüttelröhre wird dann 24 Stunden bei 28° C auf einer in Längsrichtung schüttelnden Vorrichtung bebrütet.The following examples illustrate the invention. The yields are expressed in gamma / ml (.y / ml). Example 1 Spores from a Streptomyces aureofaciens strain capable of producing 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline, such as strain S 1308, are rinsed from an agar slant with sterile distilled water to form a suspension which approximates Contains 60 to 80 million spores per ml. 0.33 ml of this suspension is used to inoculate a Brewer tube containing 8 ml of the following medium: Sucrose ................. 30 g Ammonium sulfate. . . . . . . . . 2 g Calcium carbonate. . . . . . . -. . 7 g Corn steep water. . . . . . . . . . 16.5 ml Tap water, qs ...... 1000 ml Before inoculation, the medium is sterilized for 20 minutes at a pressure of 1.05 atmospheres, the pH value changing from 6.3 to 6.9. The inoculated shaking tube is then incubated for 24 hours at 28 ° C. on a device that shakes lengthways.

Beispiel 2 Es wird ein Medium der folgenden Zusammensetzung hergestellt Inhaltsstoffe Mengen Ammoniumsulfat ................ 5 g Ammoniumchlorid ... .... .... .... 1,5 g Magnesiumchlorid ............... 2,0 g Stärke ......................... 55 g Kaliumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1,28 g Phosphorsäure .................. 0,4 g Calciumcarbonat ................ 9,0 g Lösung von Spurenelementen ..... 10 ml Schweineschmalz ...... t ....... . . 20 ml Wasser, q. s...................... 1000 ml Nach der Sterilisation des Nährmediums werden 25 ml hiervon in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben mit 1 ml des wie im Beispiel 1 bereiteten Impfstoffs beimpft. Die Fermentation wird 120 Stunden lang bei 25° C auf einer kreisförmig schüttelnden Schüttelvorrichtung vorgenommen, die 180 Umdr./Min. macht. Die Gärmaische wird fluorometrisch und spektrophotometrisch bestimmt, man findet einen Gehalt von 6 y/ml Chlortetracyclin und 100 y/ml 7-Chlor-Sa(lla)-dehydrotetracyclin.Example 2 A medium of the following composition is prepared Ingredients quantities Ammonium sulfate ................ 5 g Ammonium chloride ... .... .... .... 1.5 g Magnesium chloride ............... 2.0 g Starch ......................... 55 g Potassium chloride. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.28 g Phosphoric acid .................. 0.4 g Calcium carbonate ................ 9.0 g Solution of trace elements ..... 10 ml Lard ...... t ........ . 20 ml Water, q. s ...................... 1000 ml After the nutrient medium has been sterilized, 25 ml of it are inoculated with 1 ml of the vaccine prepared as in Example 1 in a 250 ml Erlenmeyer flask. The fermentation is carried out for 120 hours at 25 ° C on a circular shaker, the 180 rev / min. power. The fermentation mash is determined fluorometrically and spectrophotometrically, it contains 6 y / ml chlorotetracycline and 100 y / ml 7-chloro-Sa (IIIa) -dehydrotetracycline.

Beispiel 3 Beispiel 2 wird wiederholt, wobei man dasselbe Medium verwendet, das außerdem jedoch noch 0,32y/mlRiboflavin enthält. Die erhaltene Gärmaische enthält 71 y/ml Chlortetracyclin und 1450 y/ml 7-Chlor-5a(11a)-dehydrotetracyclin. Beispiel 4 Ein Medium der folgenden Zusammensetzung wird herzestellt Inhaltsstoffe Mengen Ammoniumsulfat ........ .... ... 5 g Calciumcarbonat . . . . . . . . . . . . . . . . 9 g Ammoniumchlorid ... ....... .... 1,5 g Magnesiumchlorid - 6 H2 0 . . . . . . . . 2 g Eisensulfat - 7 H2 0 . . . . . . . . . . . . . . 0,04 g Mangansulfat - 4H20 . . . . . . . . . . 0,05 g Cobaltchlorid - 6 H2 0 . . . . . . . . . . . . 0,001 g Zinksulfat - 7H2 0 . . . . . . . . . . . . . . . 0,1 g Maisquellwasser . . . . . . . . . . . . . . . . 25 bis 30 g Stärke......................... 55 g Schweineschmalz ............... 2 ml Wasser, q. s. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml Nach Sterilisation des Mediums in einem Autoklav werden 25 ml in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben mit 1 ml des wie im Beispiel 1 bereiteten Impfstoffes beimpft. Die Fermentation wird 120 Stunden lang bei 25° C auf einer kreisförmig schüttelnden Vorrichtung mit 180 Umdr./Min. vorgenommen. Die erhaltene Maische wird fluorometrisch und spektrophotometrisch bestimmt. Man, findet einen Gehalt von 84 y/ml Chlortetracyclin und 2830 y/ml 7-Chlor-5a(11a)-dehydrotetracyclin.Example 3 Example 2 is repeated using the same medium, but which also contains 0.32 μg / ml riboflavin. The fermentation mash obtained contains 71 μg / ml chlorotetracycline and 1450 μg / ml 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline. Example 4 A medium of the following composition is prepared Ingredients quantities Ammonium sulfate ........ .... ... 5 g Calcium carbonate. . . . . . . . . . . . . . . . 9 g Ammonium chloride ... ....... .... 1.5 g Magnesium chloride - 6 H2 0. . . . . . . . 2 g Iron sulfate - 7 H2 0. . . . . . . . . . . . . . 0.04 g Manganese sulfate - 4H20. . . . . . . . . . 0.05 g Cobalt chloride - 6 H2 0. . . . . . . . . . . . 0.001 g Zinc Sulphate - 7H2 0. . . . . . . . . . . . . . . 0.1 g Corn steep water. . . . . . . . . . . . . . . . 25 to 30 g Starch ......................... 55 g Pork lard ............... 2 ml Water, qs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1000 ml After the medium has been sterilized in an autoclave, 25 ml are inoculated with 1 ml of the vaccine prepared as in Example 1 in a 250 ml Erlenmeyer flask. The fermentation is continued for 120 hours at 25 ° C on a circular shaker at 180 rev / min. performed. The mash obtained is determined fluorometrically and spectrophotometrically. One finds a content of 84 y / ml chlortetracycline and 2830 y / ml 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracyclin.

Beispiel 5 Beispiel 4 wird wiedelhölt unter Verwendung desselben Mediums, das jedoch 2 y/ml Riboflavin enthält. Die Maische enthält 760 y/ml Chlortetracyclin und 9200 y/ml 7-Chlor-5a(11 a)-dehydrotetracyclin.Example 5 Example 4 is repeated using the same medium, which, however, contains 2 y / ml riboflavin. The mash contains 760 y / ml chlortetracycline and 9200 y / ml 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline.

Beispiel 6 200 ml einer mit S 1308 beimpften Maische, die 3940 y/ml 7-Chlor-5a(11a)-dehydrotetracyclin enthält und gemäß der Vorschrift des Beispiels 4 hergestellt wurde, werden auf einen pg von 1,5 mit konzentrierter Salzsäure eingestellt und danach filtriert. Der Filterkuchen wird mit 200 ml Wasser bei 40°C wieder aufgeschlämmt, auf ein pH von 1,5 eingestellt und filtriert. Zu den vereinigten Filtraten werden 54 g Natriumchlorid zugefügt und die erhaltene Lösung dreimal mit 60 ml n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte werden auf ungefähr 17 ml eingeengt, mit Wasser gesättigt und filtriert. Dieses Filtrat wird auf eine 5 - 30-cm-(2 - 12 inch) -Celite-Kolonne gegeben, die 1/z ml Wasser vom PH-Wert 2 (H Cl) pro g Celite enthält. Die Kolonne wird mit einer Mischung aus 80 O/, n-Butanol und 20 % Chloroform, die mit 0,01 n-H Cl gesättigt ist, entwickelt. Eine Gesamtausbeute von 34 Fraktionen von jeweils 10 ml wird gesammelt. Nach Vornahme von spektrophotometrischen Bestimmungen werden die antibiotikareichen Fraktionen, das sind die Fraktionen 12 bis 23, vereinigt und in Gegenwart von Wasser konzentriert, wobei man eine wäßrige Lösung erhält, und gefriergetrocknet. Die so erhaltene Rohsubstanz wird aus 1 ml Methanol umkristallisiert. Die Kristalle werden filtriert, mit Methanol-Äther (50 : 50) und darauf mit Äther allein gewaschen. Das Produkt wird bei 40° C im Vakuum getrocknet und ergibt 128 mg 7-Chlor-5a(11a)-dehydrotetracyclin, was 927 y/mg entsplicht und eine 16gewichtsprozentige Ausbeute der Maische darstellt.Example 6 200 ml of a mash inoculated with S 1308 containing 3940 y / ml Contains 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline and according to the procedure of the example 4 is adjusted to a pg of 1.5 with concentrated hydrochloric acid and then filtered. The filter cake is slurried again with 200 ml of water at 40 ° C, adjusted to a pH of 1.5 and filtered. Become the combined filtrates 54 g of sodium chloride were added and the resulting solution was washed three times with 60 ml of n-butanol extracted. The combined butanol extracts are concentrated to approximately 17 ml, saturated with water and filtered. This filtrate is spread over a 5 - 30 cm (2 - 12 inch) Celite column, containing 1 / z ml of water with a pH value of 2 (H Cl) per g of Celite contains. The column is filled with a mixture of 80 O /, n-butanol and 20% chloroform, saturated with 0.01 n-H Cl. A total yield of 34 fractions 10 ml each is collected. After making spectrophotometric determinations the fractions rich in antibiotics, i.e. fractions 12 to 23, are combined and concentrated in the presence of water to obtain an aqueous solution, and freeze-dried. The crude substance obtained in this way is recrystallized from 1 ml of methanol. The crystals are filtered, with methanol-ether (50:50) and then with ether washed alone. The product is dried in vacuo at 40 ° C. and yields 128 mg 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline, which corresponds to 927 y / mg and a 16 weight percent Represents yield of mash.

Die Elementaranalysen entsprechen ziemlich der empirischen Formel C"H21_2sN,C10$ für neutrales 7-Chlor-5a(lla)-dehydrotetracyclin. Die pKa wird in Dimethylformamid zu 6,05 gefunden. Das Neutralisationsäquivalent beträgt 475,5. Die spezifische Drehung [a]2,5, bestimmt an einer 0,502°/otgen Lösung in 0,1 n-HCl, beträgt -55,8°.The elementary analyzes correspond pretty much to the empirical formula C "H21_2sN, C10 $ for neutral 7-chloro-5a (lla) -dehydrotetracycline. The pKa is given in Dimethylformamide found at 6.05. The neutralization equivalent is 475.5. The specific rotation [a] 2.5, determined on a 0.502 ° / otgen solution in 0.1 N HCl, is -55.8 °.

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum wird von einer Probe der neutralen Verbindung in 0,1 n-Natriumhydroxydlösung bei einer Konzentration von 33,00 y/ml (Gewicht in Volumen) bestimmt. Das Infrarotabsorptionsspektrum des neutralen Produkts wird in der üblichen Weise mit dem Antibiotikum erhalten, das mit Kbr zu einer festen Phase in Form einer Scheibe gepreßt war. Beispiel 7 1 g der im Beispiel 6 erhaltenen freien Base wird in 3m1 Methanol aufgeschlämmt und konzentrierte Salzsäure zum Zwecke der Lösung hinzugefügt. Nach Filtration wird das pu der Lösung mit gesättigtem Natriumcarbonat auf 4,0 eingestellt. Es bilden sich sehr rasch Kristalle. Die Hydrochloridkristalle werden abfiltriert, mit einer Ather=1VIethanul-Mischung gewaschen und endlich mit Äther allein. Das im Vakuum getrocknete Produkt wiegt 500 mg.The ultraviolet absorption spectrum is of a sample of the neutral Compound in 0.1 N sodium hydroxide solution at a concentration of 33.00 y / ml (Weight in volume) determined. The infrared absorption spectrum of the neutral product is obtained in the usual way with the antibiotic that becomes a solid with Kbr Phase was pressed in the form of a disk. Example 7 1 g of that obtained in Example 6 free base is slurried in 3m1 methanol and concentrated hydrochloric acid for the purpose added to the solution. After filtration, the pu of the solution is saturated with sodium carbonate set to 4.0. Crystals form very quickly. The hydrochloride crystals are filtered off, washed with an ether = 1VIethanul mixture and finally with Ether alone. The product, dried in vacuo, weighs 500 mg.

Beispiel 8 Eine Mischung aus 75 °/0 7-Chlor-5a(1 1a)-dehydrotetracyclin und 250/, Chlortetracyclin wird gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren umkristallisiert und ergibt ein Produkt, das weniger als 2 % Chlortetracyclin, bestimmt durch fluorometrische Messungen, enthält.Example 8 A mixture of 75 ° / 0 7-chloro-5a (1 1a) -dehydrotetracycline and 250 /, chlortetracycline is recrystallized according to the method described above and gives a product which contains less than 2 % chlorotetracycline as determined by fluorometric measurements .

Beispiel 9 102 mg der neutralen Base werden in 0,17 ml Dimethylformamid gelöst und 0,34 ml Wasser hinzugefügt. Die sich rasch bildenden Kristalle werden abfiltriert, zweimal mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 40° C getrocknet, wobei man 78 mg des neutralen 7-Chlor-5a(11a)-dehydrotetracyclins erhält.Example 9 102 mg of the neutral base are dissolved in 0.17 ml of dimethylformamide dissolved and added 0.34 ml of water. The rapidly forming crystals will be filtered off, washed twice with water and dried in vacuo at 40 ° C, wherein 78 mg of the neutral 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline are obtained.

Beispiel 10 1 g der neutralen Base wird in einer geringen, aber ausreichenden Menge n-Butanol zu einer nahezu gesättigten Lösung gelöst. Die Lösung wird filtriert, mit konzentrierter Salzsäure auf ein pH von 1,5 eingestellt und Äther bis zur leichten ständigen Trübung zugefügt. Die Mischung wird angeimpft, 24 Stunden bei Raumtemperatur gealtert und danach das kristalline Produkt abfiltriert, mit n-Butanol, darauf mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Man erhält 0,78 g 7-Chlor-5a(11a)-dehydrotetracyclin-hydrochlorid. Das Produkt ist löslich in Wasser und gibt bei der Behandlung mit Silbernitrat einen Niederschlag von Silberchlorid.Example 10 1 g of the neutral base is used in a small but sufficient amount Amount of n-butanol dissolved to a nearly saturated solution. The solution is filtered, adjusted to a pH of 1.5 with concentrated hydrochloric acid and ether until light constant turbidity added. The mixture is inoculated, 24 hours at room temperature aged and then the crystalline product filtered off, with n-butanol, then with Ether washed and dried in vacuo. 0.78 g of 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline hydrochloride are obtained. The product is soluble in water and gives a when treated with silver nitrate Precipitation of silver chloride.

Beispiel 11 Die Verfahrensweise des Beispiels 4 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß das verwendete Medium weniger als ungefähr 50 Teile Chloridionen pro Million Teile besitzt. Es wird 5a(11a)-Dehydrotetracyclin erzeugt. Beispiel 12 Zu 5 mg 7-Chlor-5a(11a)-dehydrotetracyclin wird 1 ml Eisessig hinzugegeben. Die Mischung wird geschüttelt und zur Einstellung des Gleichgewichts 18 Stunden lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird filtriert. Die Papierchromatographie des Filtrats zeigt die Anwesenheit von 7-Chlor-5a(11a)-dehydro-4-epi-tetracyclin an.Example 11 The procedure of Example 4 is repeated using except that the medium used has less than about 50 parts of chloride ion per million parts. 5a (11a) dehydrotetracycline is produced. example 12 1 ml of glacial acetic acid is added to 5 mg of 7-chloro-5a (11a) -dehydrotetracycline. the Mixture is shaken and equilibrated for 18 hours left to stand at room temperature. It is then filtered. Paper chromatography of the filtrate shows the presence of 7-chloro-5a (11a) -dehydro-4-epi-tetracycline at.

Beispiel 13 Die Verfahrensweise des Beispiels 4 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß das Medium insofern modifiziert wird, daß es mehr als 50 Teile Bromidionen pro Million Teile und weniger als 50 Teile Chloridionen pro Million Teile enthält. Man erhält 7-Brom-5a(I1a)-dehydrotetracyclin.Example 13 The procedure of Example 4 is repeated using except that the medium is modified to be more than 50 parts Bromide ions per million parts and less than 50 parts chloride ions per million Parts contains. 7-Bromo-5a (I1a) -dehydrotetracycline is obtained.

Beispiel 14 Die Verfahrensweise des Beispiels 12 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß 5a(Ila)-Dehydrotetracyclin verwendet wird. Die Papierchromatographie des Filtrats zeigt an, daß 5a(11a)-Dehydro-4-epi-tetracyclin vorhanden ist.Example 14 The procedure of Example 12 is repeated using except that 5a (Ila) dehydrotetracycline is used. Paper chromatography of the filtrate indicates that 5a (11a) -dehydro-4-epi-tetracycline is present.

Beispiel 15 Die Verfahrensweise des Beispiels 12 wird wiederholt mit der Ausnahme, daß 7-Brom-5a(11 a)-dehydrotetracyclin verwendet wird. Die Papierchromatographie des Filtrats zeigt die Anwesenheit von 7-Brom-5a(lla)-dehydro-4-epi-tetracyclin an.Example 15 The procedure of Example 12 is repeated using with the exception that 7-bromo-5a (11a) -dehydrotetracycline is used. Paper chromatography of the filtrate shows the presence of 7-bromo-5a (IIIa) -dehydro-4-epi-tetracycline at.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the preparation of 5a (lla) -dehydrotetracyclines of the general formula wherein Z denotes hydrogen, chlorine or bromine, their salts with acids and bases and their complex compounds, characterized in that adaptation is carried out in a known manner with a strain of Streptomyces aureofaciens which is used to prepare a compound of the formula I in which Z denotes chlorine is, for the production of the compound of the formula I in which Z is chlorine, a customary aqueous nutrient medium containing chlorine ions, for the production of the compound of the formula I in which Z is hydrogen, a fermentation medium which contains little or no chlorine ions , and for the preparation of the compound of the formula I in which Z is bromine, a fermentation medium which contains considerable amounts of bromine ions, aerobically fermented and, if appropriate, reacts the fermentation products with acids, bases or complex-forming compounds.

2. The method according to claim 1, characterized in that riboflavin to the medium is added.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that for the preparation of the compound I, in which Z is hydrogen, a medium is used that contains less than 50 parts of chlorine and bromine ions per ml.

4. Procedure according to claim 1 or 2, characterized in that to produce the compound I, in which Z is bromine, a medium is used that has less than 50 parts of chlorine ions and contains at least 50 parts of bromine ions per ml.