DE1053732B

DE1053732B - Process for the purification of ACTH preparations

Info

Publication number: DE1053732B
Application number: DEN13943A
Authority: DE
Inventors: Dr Jan Daniel Herman Homan; Laurens Pieter Ederzeel
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1956-07-28
Filing date: 1957-07-26
Publication date: 1959-03-26

Description

Verfahren zur Reinigung von ACTH-Präparaten Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Reinigung von Zubereitungen des Adrenocorticotropenhormons, das im folgenden mit »ACTH« bezeichnet ist, mittels selektiver Adsorption und Elution an Cellulosederivaten. Die günstige Wirkung dieser aus Säugetier-Hypophysenvorderlappen hergestellten Präparate, z. B. gegen rheumatoideArthritis, Asthma, bestimmte Augenkrankheiten und bei ausgedehnten Verbrennungen, ist allgemein bekannt.Methods for Purifying ACTH Preparations The invention relates to refer to a process for purifying preparations of adrenocorticotropic hormone, which is referred to as »ACTH« in the following, by means of selective adsorption and elution of cellulose derivatives. The beneficial effects of these derived from mammalian anterior pituitary lobes manufactured preparations, e.g. B. against rheumatoid arthritis, asthma, certain eye diseases and with extensive burns, is well known.

Man hat für die Reinigung von ACTH-Präparaten verschiedene Methoden angewandt, wie Ultrafiltration, Verteilung im Gegenstrom oder Chro-matographie. Die häufigst angewandte Methode ist die von A s t w o o d und Mitarbeitern (j. Am. Soc., 73, S. 2969, 2970 [1951]: Es wird rohes ACTH an Oxycellulose, adsorbiert und sodann-mit 0,1 n-Salzsäure frei gemacht. Bei Durchführung dieser Methode werden Aktivitätsausbeuten erzielt, die nicht über etwa 40 bis 601/o hinausgehen. Es ist zu bemerken, daß in der Literatur zwar manchmal höhere Ausbeuten angegeben wurden, die aber in der Praxis nur in seltenen Fällen realisiert werden konnten.Various methods have been used to purify ACTH preparations, such as ultrafiltration, countercurrent distribution or chromatography. The most frequently used method is that of A stwoo d and co-workers ( J. Am. Soc., 73, p. 2969, 2970 [1951]: crude ACTH is adsorbed on oxycellulose and then released with 0.1N hydrochloric acid When this method is carried out, activity yields are achieved which do not exceed about 40 to 601 / o. It should be noted that, although higher yields have sometimes been given in the literature, these could only be achieved in practice in rare cases.

Außerdem wurden bei Reinigung von ACTH-Präparaten unter Verwendung der handelsüblichen Oxycellulose stark schwankende Ausbeuten erzielt. Überdies ist ein großer Teil, manchmal sogar bis zu 90% dieser Oxycellulose nicht brauchbar, da die mit ihr erzielten Ausbeuten sehr gering sind, d. h. unter 30,1/o liegen.In addition, when ACTH preparations were purified using commercially available oxycellulose, yields varied greatly. Moreover, a large proportion, sometimes even up to 90% of these Oxycellulose not useful because the yields obtained with it are very low, d. H. are below 30.1 / o.

Ein weiteres Reinigungsverfahren unter Verwendung von Cellulose ist in j. Biol. Chernistry, 187, S. 719 (1950), beschrieben. Dieses Verfahren findet jedoch jetzt in der Praxis keine Verwendung mehr, weil, wie jedem Fachmann bekannt ist, sehr viel bessere Ergebnisse mit Oxycellulose erhalten werden. Das vorliegende Verfahren führt aber, wie die folgenden Vergleichsversuche zeigen, 'bei Verwendung des gleichen Ausgangsmaterials, zu wesentlich besseren Ausbeuten als das Verfahren von Astwood (_T. Am. Chem. So#c., 73, S. 2969, 2970 [19511), das bis jetzt als das beste bekannt war.Another cleaning method using cellulose is described in j. Biol. Chemistry, 187, p. 719 (1950) . However, this process is no longer used in practice because, as is known to any person skilled in the art, much better results are obtained with oxycellulose. However, as the following comparative experiments show, the present process leads to significantly better yields than the process of Astwood (_T. Am. Chem. So # c., 73, p. 2969, 2970 [19511) when using the same starting material. which was known as the best so far.

Unter Verwendung von Oxycellulose wurden fünfzehn Versuche, ausgehend von einem bestimmten Ausgangsmaterial entsprechend der Vorschrift der oben angegebenen Literaturstelle, durchgeführt. Daneben liefen zwölf Versuche, bei denen, ausgehend von dem gleichen Ausgangsmaterial, unter Verwendung von Carboxymethylcellulose das ACTH-Präparat gemäß der Erfindung hergestellt wurde. Die durchschnittlichen Ergebnisse dieser Versuchsreihen sind in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben, wobei die Streuungsbreite in Klammern aufgeführt ist. Die Aktivität der erhaltenen Präparate wurde nach zwei verschiedenen Methoden geprüft. Reinigung mit Oxycellulose Reinigung mit Carboxyinethyl- 1 cellulose gem.ß der Erfindung Zahl der Experimente .......................... 15 12 Durchschnittliche Ausbeute, ausgedrückt in Saffran- Einheiten pro g Drüsenpulver ................. 79 (70 bis 89) 94 (85 bis 104) Durchschnittliche Ausbeute, bestimmt nach dem Sayerstest in Einheiten pro g Drüsenpulver .... 226 (195 bis 262) 288 (240 bis 346) Es hat sich nun gezeigt, daß ein besonders wirtschaftliches Verfahren zur Herstellung gereinigter ACTH-Präparate mittels selektiver Adsorption und Elution an Cellulosederivaten darin besteht, daß man als Adsorptionsmittel Carboxylmethyleellulose, im folgenden als CMC bezeichnet, verwendet, wobei man die Adsorption bei einem pII-Wert von unter etwa 8, vorzugsweise bei einem pl,-Wert von 2,5 bis 4,5 durchführt und die Elution bei einem von der Adsorptionsstufe al),weichenden pff-Wert, vorzugsweise bei einem p.H-Wert von weniger als 2, durchführt. Die Reinigung wird zweckmäßig in einem wäßrigen System vorgenommen, -,vobei eine CMC verwendet wird, die bei den p11-Werten der Adsorptions- und der Elutionsstufe unlöslich ist.Fifteen experiments were carried out using oxycellulose, starting from a certain starting material in accordance with the instructions in the above-mentioned literature reference. In addition, twelve tests were run in which, starting from the same starting material, using carboxymethyl cellulose, the ACTH preparation according to the invention was produced. The average results of these test series are shown in the table below, the range of variation being shown in brackets. The activity of the preparations obtained was tested by two different methods. Cleaning with oxycellulose cleaning with carboxyinethyl 1 cellulose according to the invention Number of experiments .......................... 15 12 Average yield expressed in saffron Units per gram of glandular powder ................. 79 (70 to 89) 94 (85 to 104) Average yield, determined according to the Sayerstest in units per g of glandular powder .... 226 (195 to 262) 288 (240 to 346) It has now been shown that a particularly economical process for the production of purified ACTH preparations by means of selective adsorption and elution on cellulose derivatives consists in using carboxyl methylellulose, hereinafter referred to as CMC, as the adsorbent, the adsorption being carried out at a pII value of below about 8, preferably at a pI value of 2.5 to 4.5, and the elution is carried out at a pff value which differs from the adsorption stage a1), preferably at a pH value of less than 2. The purification is expediently carried out in an aqueous system, using a CMC which is insoluble in the p11 values of the adsorption and elution stages.

Durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Ausbeuten von 50 bis 80114, abhängig vom Reinheitsgrad und der Herkunft des zu reinigenden ACTH, erzielt.By using the process according to the invention, yields of 50 to 80114 are achieved, depending on the degree of purity and the origin of the ACTH to be purified.

Ein großer Vorteil bei der Verwendung von CMC gegenüber Oxvcellulose als Adsorbens liegt darin, daß diese Substanz in reproduzierbarer Weise hergestellt werden kann und infolgedessen nur geringe oder keine Schwankungen in der Ausbeute zu beoba,chten sind.A big advantage of using CMC over Oxvcellulose as an adsorbent lies in the fact that this substance is produced in a reproducible manner and consequently little or no variation in yield to be observed.

Da CMC beträchtlich voluminöser ist als Oxycellulose, bietet es eine viel größere Kontaktfläche, was wiederum eine leichtere Adsorption an und eine leichtere Elution vorn CMC zur Folge hat. Noch dazu hat CMC günstige Eigenschaften bezüglich der während der Reinigung angewandten Verfahrensweisen, wie z. B. Filtration, Flüssigkeitsbewegungen usw.Since CMC is considerably more bulky than oxycellulose, it offers one much larger contact area, which in turn means easier adsorption to and easier Elution from the CMC. In addition, CMC has favorable properties in terms of the procedures used during cleaning, such as. B. Filtration, fluid movement etc.

Besonders günstige Ergebnisse werden nach der erfindungsgemäßen Verfahrensweise dann erzielt, wenn das ACTH bei einem zwischen 2,5 und 4,5 liegenden pff am CMC adsorbiert wird. Die Elution des Adsorbats wird vorzugsweise mit einer verdünnten starken Säure, z. B. Halogenwasserstoffsäure, Schwefel- oder Phosphorsäure, durchgeführt. Vorzugsweise wird die Elution bei einem pH kleiner als 2 unter Verwendung von 0,1 n-Salzsäure durchgeführt. Das pli der Elutionsstufe ist also kleiner als das bei der Adsorption angewandte. In manchen Fällen jedoch kann die Adsorption im schwach sauren Medium stattfinden, während man für die Elution ein schwach alkalisches Medium wählt.Particularly favorable results are achieved according to the procedure according to the invention when the ACTH is adsorbed on the CMC at a pff between 2.5 and 4.5. The elution of the adsorbate is preferably carried out with a dilute strong acid, e.g. B. hydrohalic acid, sulfuric or phosphoric acid performed. The elution is preferably carried out at a pH of less than 2 using 0.1 N hydrochloric acid. The pli of the elution stage is therefore smaller than that used for adsorption. In some cases, however, adsorption can take place in a weakly acidic medium, while a weakly alkaline medium is chosen for the elution.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geht man im allgemeinen von einer angesäuerten ACTH-Lösung aus. Wäßrige Systeme, die einen bestimmten Anteil an mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln enthalten, sind ebenfalls geeignet. Man verwendet vorzugsweise organische Säuren, wie z. B. Essigsäure, Propionsäure, Milchsäure usw., zur Ansäuerung.The process according to the invention is generally carried out from an acidified ACTH solution. Aqueous systems that have a certain proportion of water-miscible solvents are also suitable. Man preferably uses organic acids, such as. B. acetic acid, propionic acid, lactic acid etc., for acidification.

Die Adsorption der ACTH-Lösung am CMC wird unter Rühren durchgeführt, eluiert wird das ACTH z. B. nach Filtrieren oder Zentrifugieren. Der Adsorptionsvorgang kann auch in einer mit CMC gefüllten Säule durchgeführt werden, das ACTH wird dann anschließend aus dieser Säule eluiert.The adsorption of the ACTH solution on the CMC is carried out with stirring, the ACTH is eluted z. B. after filtration or centrifugation. The adsorption process can also be carried out in a column filled with CMC, the ACTH is then then eluted from this column.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die Aktivitätsausbeuten wurden in vitro nach der 'Methode von Saffran (Endocrinolog , 56, S. 523 k:,y [19551) bestimmt, da die Werte dieser Methode leichter reproduzierbar sind und die Streuung der Werte erheblich geringer ist als in der häufiger angewandten Methode von M. S a y e r s und Mitarbeiter (Endocrinolo,-y, 42, S. 379 [19481). Die Saffranschen Werte, auf die sich die Angaben in den folgenden Bei spielen stützen, haben Ungenauigkeitsgrenzen von etwa 15 1/o für p = 0,05. The following examples illustrate the invention. The activity yields were determined in vitro by the method of Saffran (Endocrinolog , 56, p. 523 k :, y [19551) , since the values of this method are more easily reproducible and the spread of the values is considerably smaller than in the more frequently used method by M. S a y ers and co-workers (Endocrinolo, -y, 42, p. 379 [19481). The Saffran values, on which the information in the following examples are based, have inaccuracy limits of around 15 1 / o for p = 0.05.

Beispiel 1 12 g ACTH mit einer Aktivität von 0,6 IE/mg werden in 500 cm3 0,1 n-Essigsäure bei einem p11-Wert von 3,1 gelöst. Dann wird 1 g CMC mit einem Substitutionsgrad von 0,4 (entsprechend 9,71/o Carboxylgruppen) zugegeben und dann bei Zimmertemperatur 12 Stunden lang gerührt. Nach Abfiltrieren vom unlöslichen Material wird dieses mit 0,1 n-Essi,-säure gewaschen und anschließend mit 0,1 n-Salzsäure eluiert, bis im Eluat kein Protein mehr nachgewiesen werden kann. Die Mutterlauge wird nochmals mit 1 g CMC durchgeführt, danach wird, wie oben beschrieben, ausgewaschen und elniert. Das Eluat wird mit dem zuerst erhaltenen vereinigt. Die Chlorionen des Elnats werden mittels eines Anionenaustauschers durch Acetationen ersetzt. Nach Lyophilisieren, d. h. Ausfrieren und Absublimieren des Lösungsmittels bei tiefer Temperatur und niederem Druck werden 422m-ACTH mit einer Aktivität von 13,5 IE/mg erhalten; dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von 7911/o. Beispiel 2 12 g ACTH mit einer Aktivität von 0,6 IE/mwerden wie im Beispiel 1 behandelt. Diesmal jedoch, im Gegensatz zu der Verfahrensweise von Beispiel 1, wird die ACTH-Lösung nur einmal mit CMC behandelt. Man erhält 180 mg ACTH mit einer Aktivität von 28,4 IE/mg; dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von 71 1/o.Example 1 12 g of ACTH with an activity of 0.6 IU / mg are dissolved in 500 cm3 of 0.1 n-acetic acid with a p11 value of 3.1 . Then 1 g of CMC with a degree of substitution of 0.4 (corresponding to 9.71 / o carboxyl groups) is added and the mixture is then stirred at room temperature for 12 hours. After the insoluble material has been filtered off, it is washed with 0.1 N acetic acid and then eluted with 0.1 N hydrochloric acid until protein can no longer be detected in the eluate. The mother liquor is carried out again with 1 g of CMC, after which it is washed out and eluted as described above. The eluate is combined with that obtained first. The chlorine ions in the elnate are replaced by acetate ions by means of an anion exchanger. After lyophilizing, i.e. H. Freezing out and sublimation of the solvent at low temperature and low pressure gives 422m-ACTH with an activity of 13.5 IU / mg; this corresponds to an activity yield of 7911 / o. Example 2 12 g of ACTH with an activity of 0.6 IU / m are treated as in Example 1 . This time, however, in contrast to the procedure of Example 1, the ACTH solution is treated only once with CMC. 180 mg ACTH are obtained with an activity of 28.4 IU / mg; this corresponds to an activity yield of 71 1 / o.

Beispiel 3 12 g Rinder-ACTH mit einer Aktivität von 0,4 bis 0,5 IE/mg werden zu 400 cm3 Wasser gegeben, das mit so viel Essigsäure angesäuert ist, daß der p11-Wert der Lösung 3,1 wird. Diese Lösung wird 14 Stunden lang mit 1,8 g CMC vom Substitutionsgrad 0,3 (entsprechend einem Carboxylgehalt von 8,4) gerührt. Nach Absetzenlassen wird der Niederschlag einige Male mit 0,1 n-Essigsäure gewaschen, danach wird das Protein mit 0,12 n-Salzsäure eluiert.Example 3 12 g of bovine ACTH with an activity of 0.4 to 0.5 IU / mg are added to 400 cm3 of water which has been acidified with so much acetic acid that the p11 value of the solution becomes 3.1. This solution is stirred for 14 hours with 1.8 g of CMC with a degree of substitution of 0.3 (corresponding to a carboxyl content of 8.4). After allowing to settle, the precipitate is washed several times with 0.1 N acetic acid, after which the protein is eluted with 0.12 N hydrochloric acid.

Die Mutterlauge wird nochmals mit 1,8 g CMC durchgerührt, danach wird dieses CMC ebenfalls ausgewaschen und eluiert. Die Chlorionen der vereinigten Eluate werden gegen Acetationen ausgetauscht, danach wird die Lösung lyophilisiert. Man erhält so 525 mg ACTH mit einer Aktivität von 7,0 IE/i-ng; dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von etwa 681/o. Beispiel 4 5 g ACTH mit einer Aktivität von 1 IE/rng werden in 300 CM3 mit Propionsäure angesäuertem Wasser gelöst; der PH-Wert ist dann 4,5. Die Lösung wird 20 Stunden lang mit 2,5 g CMC aus Beispiel 3 gerührt. Die feste Substanz wird durch Zentrifugieren entfernt, dann wird das ACTH durch kurzes Waschen mit 0,1 Salzsäure eluiert. Das Eluat wird in der Kälte mit einem 10fachen Überschuß von Aceton gefällt. Man erhält 225 mg eines Präparats mit einer Aktivität von 12,3 IE/rng; dies entspricht einer Aktivitätsausbeute von 55 1/o.The mother liquor is again stirred with 1.8 g of CMC, then this CMC is also washed out and eluted. The chlorine ions of the combined eluates are exchanged for acetate ions, after which the solution is lyophilized. This gives 525 mg of ACTH with an activity of 7.0 IU / i-ng; this corresponds to an activity yield of about 681 / o. Example 4 5 g of ACTH with an activity of 1 IU / mng are dissolved in 300 cm3 of water acidified with propionic acid; the pH value is then 4.5. The solution is stirred with 2.5 g of CMC from Example 3 for 20 hours. The solid substance is removed by centrifugation, then the ACTH is eluted by washing briefly with 0.1 hydrochloric acid. The eluate is precipitated in the cold with a 10-fold excess of acetone. 225 mg of a preparation with an activity of 12.3 IU / mng are obtained; this corresponds to an activity yield of 55 1 / o.

Beispiel 5 10 g ACTH mit einer Aktivität von 0,8 TE/rnwerden in 500 cm3 Wasser gelöst, dem so viel Milchsäure zugeffigt wird, bis ein pl, von 2,7 erreicht ist. Die Lösung wird 22 Stunden lang mit 2 g des CMC von Beispiel 3 durchgerührt. Nach Absitzenlassen und mehrmaligem Dekantieren mit Milchsäure vom pl, 2, 1 wird die Elution mit 0,2 n-Schwefelsäure durchgeführt, das Eluat wird in der Kälte mit einem Überschuß von Aceton gefällt. Man erhält 283 mg eineg Präparats von der Aktivität 15,0 IE/mg; das entspricht einer Aktivitätsausbeute von 53 Beispiel 6 8 g rohes ACTH mit einer Aktivität von 0,8 IE/mwerden in 400 cm3 10%igem Äthanol gelöst unter Zufügen von Essigsäure bis zu einem pH-Wert von 3,2. Diese Lösung wird 22 Stunden lang mit 2 g des CMC aus Beispiel 3 durchgerührt und nach Absetzenlassen und mehrmaligem Dekantieren mit 0,1 n-Essigsäure wird mit 0,12 n-Bromwasserstoffsäure eluiert. Die Bromionen werden mit einem Anionenaustauscher gegen Acetationen ausgetauscht bis zu eitlem PH Von etwa 3. Danach wird die Lösung lyophilisiert. Die Ausbeute an gereinigtem ACTH mit einer Aktivität von 16,2 IE/m- beträgt 253 mg, entsprechend einer Aktivitätsausbente von 6411/o.Example 5 10 g of ACTH with an activity of 0.8 TE / m are dissolved in 500 cm3 of water to which sufficient lactic acid is added until a p1 of 2.7 is reached. The solution is stirred with 2 g of the CMC from Example 3 for 22 hours. After allowing to settle and decanting several times with lactic acid of pl, 2, 1 , the elution is carried out with 0.2 N sulfuric acid, the eluate is precipitated in the cold with an excess of acetone. 283 mg of a preparation with an activity of 15.0 IU / mg are obtained; this corresponds to an activity yield of 53 Example 6 8 g of crude ACTH with an activity of 0.8 IU / m are dissolved in 400 cm3 of 10% ethanol with the addition of acetic acid up to a pH of 3.2. This solution is stirred for 22 hours with 2 g of the CMC from Example 3 and, after allowing it to settle and decanting several times with 0.1 N acetic acid, it is eluted with 0.12 N hydrobromic acid. The bromine ions are exchanged for acetate ions with an anion exchanger up to a pH of about 3. The solution is then lyophilized. The yield of purified ACTH with an activity of 16.2 IU / m3 is 253 mg, corresponding to an activity output of 6411 / o.

Beispiel 7 3 g ACTH (mit saurem Aceton erhaltenes Pulver, hergestellt nach der Extraktionsmethode von Li. j. Am. Chem. Soc., 74, S. 2124, 1952) mit einer Aktivität von 2,8 IE/mg werden in 100 cm3 Wasser aufgelöst. Während des Rührens wird 1 N N H4 0 H bis zu einem pH von 2,8 zugefügt. Danach werden 3 g CMC (Substitutionsgrad 0,5) zu der Lösung gegeben, die dann 25 Stunden lang gerührt wird. Nach Ab- sitzen der Feststoffe werden diese abgetrennt, einige Male mit 0, 1 n-Essigsäure gewaschen und anschließend mit 0,1 n-Salzsäure eluiert. Die Mutterlauge wird nochmals 25 Stunden lang mit 3 g CMC durchgerührt. Dann werden die Festbestandteile abgetrennt und gewaschen und danach wieder das Protein eluiert. In den vereinigten Eluaten werden Chlorionen gegen Acetationen ausgetauscht, danach wird die Lösung lyophilisiert. Man erhält so 308 mg ACTH mit einer Aktivität von 20,8 lEfmg; dies entspricht einer Aktivitätsausbente von 76%.Example 7 3 g of ACTH (powder obtained with acidic acetone, prepared by the extraction method of Li. J. Am. Chem. Soc., 74, p. 2124, 1952) with an activity of 2.8 IU / mg are in 100 cm3 Dissolved in water. While stirring, 1 NN H4 0 H is added up to a pH of 2.8 . Then 3 g of CMC (degree of substitution 0.5) are added to the solution, which is then stirred for 25 hours. After completion of the solids are separated sit this, several times with 0, washed 1 N acetic acid and then eluted with 0.1 N hydrochloric acid. The mother liquor is again stirred for 25 hours with 3 g of CMC. The solid components are then separated off and washed, and the protein is then eluted again. In the combined eluates, chlorine ions are exchanged for acetate ions, after which the solution is lyophilized. This gives 308 mg of ACTH with an activity of 20.8 lEfmg; this corresponds to an activity level of 76%.

Beispiel 8 12 g ACTH mit einer Aktivität von 0,6 IE/mg werden in 500 cm3 0,1 n-Essigsäure gelöst. Das pjj ist li,i. Die Lösung wird zweimal mit 0,5 g CMC (Substitutionsgrad 0,4) 24 Stunden lang gerührt. Die Fest -stoff e werden nach ihrer Abtrennung mit 0,1 n-Essigsäure gewaschen und anschließend mit 0, 1 n-Salzsäure eluiert. In den vereinigten Eluaten werden die Chlorionen gegen Acetationen ausgetauscht, danach wird die Lösung lyophilisiert. Auf diese Weise erhält man 322 mg ACTH Mit einer Aktivität von 14,8 IE/mg, was einer Aktivitätsausbeute von 6611/o entspricht.Example 8 12 g of ACTH with an activity of 0.6 IU / mg are dissolved in 500 cm3 of 0.1 n-acetic acid. The pjj is li, i. The solution is stirred twice with 0.5 g of CMC (degree of substitution 0.4) for 24 hours. The hard -Stoff e are subsequently eluted after separation with 0.1 N acetic acid and washed with 0, 1 N hydrochloric acid. The chlorine ions in the combined eluates are exchanged for acetate ions, after which the solution is lyophilized. In this way, 322 mg of ACTH are obtained with an activity of 14.8 IU / mg, which corresponds to an activity yield of 6611 / o.

Beispiel 9 30Omg ACTH, hergestellt nach Beispiel 8, mit einer Aktivität von 14,8 IE/mg, werden in 6 cm3 Ammoniumacetatlösung verteilt, wodurch der pH-Wert von 6,3 erzielt wird, und bei einer Temperatur von 0 bis 10' C auf eine chromatographische Säule von CMC (Substitutionsgrad 0,15) aufgehracht, die vorher mit obiger Ammonacetatlösung ins Gleichgewicht gebracht wurde. Bei obiger Temperatur wird das Chromatogramm mit der obigen Ammonacetatlösung so lange entwickelt, bis sämtliche inaktiven Komponenten mit der aus der Säule abfließenden Flüssigkeit entfernt wurden. Danach wird die Elution des aktiven Bestandteils, beispielsweise bei einer Temperatur von 0 bis 10' C, mit einem Puffer aus Ammonacetat-Ammonhydroxyd, pl, = 8,5, durchgeführt. Das Eluat wird als solches Ivophilisiert; man erhält 56 mg ACTH mit einer Aktivität von 48,6 IE/mg, was einer Aktivitätsausbeute von 61 % entspricht.Example 9 30O mg ACTH, prepared according to Example 8, with an activity of 14.8 IU / mg, are distributed in 6 cm 3 of ammonium acetate solution, as a result of which a pH of 6.3 is achieved, and at a temperature of 0 to 10 ° C on a chromatographic column of CMC (degree of substitution 0.15) , which was previously equilibrated with the above ammonium acetate solution. At the above temperature, the chromatogram is developed with the above ammonium acetate solution until all inactive components have been removed with the liquid flowing out of the column. The active ingredient is then eluted, for example at a temperature of 0 to 10 ° C., with a buffer of ammonium acetate-ammonium hydroxide, pI, = 8.5 . The eluate is ivophilized as such; 56 mg ACTH are obtained with an activity of 48.6 IU / mg, which corresponds to an activity yield of 61 %.

Claims

PATENT APPEAL-. 1. A process for purifying ACTH preparations by means of selective adsorption and elution on cellulose derivatives, characterized in that the adsorbent used is carboxymethyl cell silose, the adsorption being carried out at a pI value of below about 8, preferably at a pH of 2 , 5 to 4.5, and the elution is carried out at a pi value deviating from the adsorption stage, preferably at a pjj value of less than 2.

2. The method according to claim 1, characterized in that the elution is carried out with 0.1 n-hydrochloric acid. 3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that adsorption and elution are carried out in a chromatographic column. Publications considered: biol. Chemistry, 187, p. 719 (1950); Vimke, "Presentation of hormone preparations", 1955, pp. 143, 144.