DE1042594B

DE1042594B - Process for the pure preparation of water-soluble proteins

Info

Publication number: DE1042594B
Application number: DER17357A
Authority: DE
Inventors: Dr Wilhelm Sachsenmaier
Original assignee: Roehm and Haas GmbH
Current assignee: Roehm and Haas GmbH
Priority date: 1955-09-02
Filing date: 1955-09-02
Publication date: 1958-11-06
Also published as: FR1156220A; DK90846C

Description

Verfahren zur Reindarstellung von wasserlöslichen Eiweißstoffen Es ist bekannt, Eiweißstoffe aus ihrer wäßrigen Lösung durch den Zusatz bestimmter organischer oder anorganischer Säuren in Form von un- bzw. schwer-löslichen Anlagerungsverbindungen auszufällen. Durch die Wahl der Fällungsbedingungen, vornehmlich der Konzentration der Fällungsmittel, gelingt es, aus einem Gemisch mehrerer Eiweißstoffe diese in der Form der genannten Anlagerungsverbindungen fraktioniert abzutrennen.Process for the pure preparation of water-soluble proteins Es is known to remove certain proteins from their aqueous solution by adding organic or inorganic acids in the form of insoluble or sparingly soluble addition compounds to fail. By choosing the precipitation conditions, primarily the concentration the precipitant, a mixture of several proteins succeeds in turning them into the form of the addition compounds mentioned to be separated off in a fractionated manner.

Andererseits ist es bekannt, Eiweißverbindungen aus ihrer wäßrigen Lösung durch den Zusatz von Salzen, beispielsweise von Ammoniumsulfat, auszufällen. Bei der Abtrennung der Eiweißstoffe werden diese zusammen mit dem als Fällungsmi.ttel benutzten Salz gewonnen. Beispielsweise enthält das handelsübliche Rohtrypsin etwa 40 bis 50 °/m Arnmoniumsulfat. Eine Reindarstellung des Trypsin.s ist durch Dialyse möglich. Es ist aber bekannt, daß dieses Verfahren umständlich und langwierig ist.On the other hand, it is known to extract protein compounds from their aqueous Solution to precipitate by the addition of salts, for example ammonium sulfate. When separating the proteins, these are used together with the as precipitation agent used salt obtained. For example, the commercially available raw trypsin contains about 40 to 50 ° / m ammonium sulfate. A pure display of the trypsin is by dialysis possible. However, it is known that this process is cumbersome and lengthy.

Auch die Aneinanderreihung der beiden genannten Verfahren ist bereits beschrieben. Man geht etwa derart vor, daß man zunächst die schwerlösliche Anlagcrungsverbindung des Eiweißstoffes mit Trichloressigsäure abtrennt und anschließend in verdünnter Salzsäure löst. Bei der Wahl geeigneter Konzentrationsverhältnisse gelingt es, aus der sauren Lösung die Eiweißstoffe durch den Zusatz von z. B. Ammoniumsulfat als solche auszufällen. Wegen der großen Löslichkeit der Eiweißstoffe in Wasser ist es nur möglich, das Eiweiß in salzfreier Form durch Dialyse zu gewinnen.The stringing together of the two procedures mentioned has already been completed described. One proceeds roughly in such a way that one first removes the poorly soluble investment compound separates the protein with trichloroacetic acid and then in dilute Hydrochloric acid dissolves. With the choice of suitable concentration ratios, it succeeds from the acidic solution, the proteins by the addition of z. B. ammonium sulfate as to fail such. Because of the high solubility of the proteins in water it is only possible to obtain the protein in a salt-free form through dialysis.

Es wurde nun gefunden., daß sich wasserlösl:ich° Eiweißstoffe, die mit bestimmten organischen und bzw. oder anorganischen Säuren in Wasser schwerbis unlöslich-- Anlagerungsverbindungen bilden, in praktisch vollkommen erlektroytfre@ier Form gewinnen lassen, wenn man die wäßrige Aufschlämmung dieser Anlagerungsverbindungen, aus denen die löslichen Verunreinigungen vorher mit Wasser ausgewaschen wurden, mit Anionenaus.tauschern behandelt und aus der erhaltenen wäßrigen Eiweißlösung, gegebenenfalls nach vorherigem Neutralisieren, vorhandene Anionen und Kationen mit geeigneten Ionenaustauschern entfernt und die Eiweißstoffe aus der wäßrigen Lösung in an sich bekannter Weise gewinnt.It has now been found that water-soluble proteins, the with certain organic and / or inorganic acids in water difficult to insoluble - form addition compounds, in practically completely electrolyte-free @ ier Let form win when you the aqueous slurry of these addition compounds, from which the soluble impurities were previously washed out with water, treated with anion exchangers and from the resulting aqueous protein solution, optionally after previous neutralization, anions and cations present with suitable ion exchangers removed and the proteins from the aqueous solution wins in a known manner.

Zur Ausfällung der Eiweißstoffe als unlösliche Anlagerungsverbindungen sind organische oder anorganische Säuren, wie Di- oder Monochloressigs.äure, Gerbsäure, Phosphormolybdänsäure, Phosphorwolframsäure, Pikrinsäure, Sulfosalicylsäure und Metaphosphorsäure, geeignet. Mit besonderem Vorteil wird zur Fällung Trichloressigsäure benutzt. Der voluminöse Niederschlag der entstandenen AnIagerungsverbindung wird abfiltriert und gewaschen. Danach wird der Niederschlag in Wasser aufgeschlämmt und zweckmäßig durch Rühren oder ähnliche Maßnahmen in Bewegung gehalten. Durch den Zusatz eines Anionenaustauschers, der z. B. ein vernetztes Polystyrol mit quaternären Ammoniumgruppen oder mit Hydroxyl-und Aminogruppen sein kann und der in der Form der freien Base oder ihres Salzes, z. B. des Chlorids, angewendet werden kann, wird die Säure der Anlagerungsverbi.ndung allmählich an den Austauscher gebunden und dadurch der leicht wasserlösliche Ei-,.veißstoff in Freiheit gesetzt. Diese Aufspaltung der Eiweiß-Säure-Anlagerungsverbindung geht so vor sich, daß jeweils nur der geringe in Lösung befindliche Säureanteil gebunden und damit eine laufende Verschiebung des zwischen gelöstem und ungelöstem Anteil bestehenden Gleichgewichts bewirkt wird.For the precipitation of proteins as insoluble addition compounds are organic or inorganic acids, such as di- or monochloroacetic acid, tannic acid, Phosphomolybdic acid, phosphotungstic acid, picric acid, sulfosalicylic acid and Metaphosphoric acid. Trichloroacetic acid is particularly advantageous for the precipitation used. The voluminous precipitate of the accumulation compound formed is filtered off and washed. The precipitate is then suspended in water and kept in motion by stirring or similar measures. By the addition of an anion exchanger, the z. B. a crosslinked polystyrene with quaternary Ammonium groups or with hydroxyl and amino groups and which can be in the form the free base or its salt, e.g. B. of chloride, can be applied the acid of the addition compound gradually bound to the exchanger and this sets free the easily water-soluble egg and white matter. This split the protein-acid addition connection proceeds in such a way that in each case only the slight acid content in solution is bound and thus a constant shift the equilibrium existing between the dissolved and the undissolved portion is brought about.

Je nach der Menge und der Anwendungsform des benutzten Austauschers und, nach. der Umsetzungsdauer enthält die aus der Aufschlämmung entstandene Lösung freie Säure, deren vollkommene Entfernung mit einem Anionenaustauscher in der Hydroxylform in an sich bekannter Weise möglich ist. Die Reindarstellung von Tryps.in erfolgt in nachstehender Weise.Depending on the amount and application of the exchanger used and after. the reaction time contains the resulting solution from the slurry free acid, the complete removal of which with an anion exchanger in the hydroxyl form is possible in a manner known per se. The pure display of Tryps.in takes place in the following way.

Man verwendet ein handelsübliches Rohtrypsin, das etwa 40 bis 50 % Ammoniumsulfat enthält. Aus einer 10- bis 20°/oigen wäßrigen Lösung des Rohtrypsins wird durch Zugabe von Trichloressigsäure eine Anlagerungsverbindung aus dieser Säure und Trypsin ausgefällt. Die Menge des Fällungsmitteis wird so gewählt, daß die Trichloressigsäu.rekonzentration in der Lösung mindestens 2,5 °/a beträgt. Der voluminöse weiße Niederschlag wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren von der Lösung abgetrennt, mit Wasser gewaschen und danach mit etwa der neunfachen Menge Wasser zu einer milchigen Aufschlämmung angerührt. Vorteilhafterweise gibt man zu dieser Aufschlämmung eine geringe Salzsäuremenge zu, und zwar derart, daß der Salzsäuregehalt etwa 0,05 bis 0,1 °/o ausmacht. Zu 100 1 der 10 °/a Feststoffe enthaltenden Aufschlämmung werden 10 kg eines Anionenaustauschers, z. B. des unter der Handelsbezeichnung »Amberlite IR 4B« bekannten Austauschers, zugesetzt, und durch Rühren oder eine entsprechende Maßnahme wird die Mischung in Bewegung gehalten. »Amberlite IR 4B« enthält ein phenolisches Gerüst mit Hydroxyl- und Aminogruppen. Die milchigweiße Aufschlämmung hellt sich bereits nach kurzer Zeit auf und wird nach etwa 20 MinUt2n klar. Nach weiteren- 10 Minuten wird die Lösen" die neben Trypsin noch Trichloressigsäure und Salzsäure enthält, durch eine Säule, die z. B. mit dem genannten Austauscher beschickt ist, geleitet.A commercially available raw trypsin is used, which is about 40 to 50% Contains ammonium sulphate. From a 10 to 20% aqueous solution of the raw trypsin becomes an addition compound from this acid by adding trichloroacetic acid and trypsin precipitated. The amount of precipitation agent is chosen so that the trichloroacetic acid concentration in the solution is at least 2.5 ° / a. The voluminous white precipitate is separated from the solution by filtration or centrifugation with water washed and then with about nine times the amount of water to a milky slurry touched. It is advantageous to add a small amount of hydrochloric acid to this slurry in such a way that the hydrochloric acid content is about 0.05 to 0.1%. to 100 1 of the slurry containing 10% / a solids are 10 kg of an anion exchanger, z. B. the exchanger known under the trade name »Amberlite IR 4B«, added, and by stirring or an equivalent measure, the mixture is in Movement kept. »Amberlite IR 4B« contains a phenolic structure with hydroxyl and amino groups. The milky white slurry will light up after a short time Time up and becomes clear after about 20 minutes. After a further 10 minutes, the Solve "which contains trichloroacetic acid and hydrochloric acid in addition to trypsin, by a Column z. B. is charged with said exchanger, passed.

Mit besonderem Vorteil verfährt man derart, daß die freie Säure durch Zugabe von z. B. Calciumcarbonat neutralisiert wird, wobei eine zu vernachlässigende Menge an Eiweiß ausfällt. Diese wird in einfacher Weise abfiltriert und die eine geringe Salzmenge enthaltende Trypsinlösung nacheinander durch eine Kationen- und Anionenaustauschersäule oder durch ein beide Austauscher enthaltendes Mischbett geleitet. Die behandelte Lösung enthält reines Trypsin, das in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Gefriertrocknung oder durch Fällen mit Alkohol in elektrolytfreier Form gewonnen wird.With particular advantage one proceeds in such a way that the free acid by adding z. B. calcium carbonate is neutralized, whereby a negligible amount of protein precipitates. This is filtered off in a simple manner and the trypsin solution containing a small amount of salt is passed successively through a cation and anion exchange column or through a mixed bed containing both exchangers. The treated solution contains pure trypsin, which is obtained in an electrolyte-free form in a manner known per se, for example by spray drying or freeze drying or by precipitation with alcohol.

Die Auswahl der geeigneten fällend wirkenden Säure, der anzuwendenden Konzentration der erfindungsgemäß zu behandelnden Aufschlämmung der Eiweißanlagerungsverbindungen und der Austauscher sowie die Art des Austauschers selbst sind in jedem einzelnen Falle durch einfach durchzuführende Versuche zu ermitteln.The selection of the suitable precipitating acid, the one to be used Concentration of the suspension of protein addition compounds to be treated according to the invention and the exchanger as well as the type of exchanger itself are in each individual Traps to be identified by experiments that are easy to carry out.

Bisher war es schwierig und äußerst umständlich, wasserlösliche Eiweißstoffe, besonders empfindliche Eiweißverbindungen mit biologischer Wirkung, wie Enzyme, ohne größere Verluste von gleichfalls wasserlöslichen Salzen, wie Ammoniumsulfat, die infolge der technischen Reinigung bzw. Fällung noch enthalten sind, so weit zu befreien, daß diese bei der weiteren Verarbeitung und Reinigung nicht mehr stören.So far it has been difficult and extremely cumbersome to extract water-soluble proteins, particularly sensitive protein compounds with a biological effect, such as enzymes, without major losses of likewise water-soluble salts, such as ammonium sulfate, which are still contained as a result of technical cleaning or precipitation, so far to free so that they no longer interfere with further processing and cleaning.

Die zu diesem Zweck meist benutzte Dialyse ist sehr langwierig und führt vor allem bei biochemisch wirksamen Eiweißstoffen zu empfindlicher Wirksamkeitsminderung und Verlusten. Außerdem ist die Dialyse im wesentlichen nur für Laboratoriumszwecke geeignet, da die Dialysiergeräte Unzulänglichkeiten aufweisen, die sie für Einsätze im technischen Maßstab untauglich machen.The dialysis most often used for this purpose is very tedious and leads to a sensitive reduction in effectiveness, especially in the case of biochemically active proteins and losses. In addition, dialysis is essentially for laboratory use only suitable because the dialysis machines have shortcomings that make them suitable for use make it unsuitable on a technical scale.

Das weiterhin bekannte Ausfällen der Eiweißstoffe mit Ammoniumsulfat und Entfernen des Salzes mit Hilfe von Ion,-naustauschern vermeidet zwar das umständliche Dialvsieren, ist aber vor allem bei größeren Mengen unbefriedigend, da dem meist sehr hohn Salzgehalt entsprechend große Meng--n Ionenaustauscher erforderlich sind. Die Verwendung vors Ionenaustauschern bringt zudem, bedingt durch die Wasserstoff- bzw. Hydroxyl-Ionen. Verluste an Eiweißstoffen mit sich, die bei größeren Austauschermengen beachtlich ansteigen können.The well-known precipitation of proteins with ammonium sulfate and removing the salt with the help of ion exchangers avoids the cumbersome Dialing, however, is unsatisfactory, especially with larger quantities, as this is usually the case very high salt content correspondingly large quantities of ion exchangers are required. The use in front of ion exchangers also brings, due to the hydrogen or hydroxyl ions. Loss of protein with it, which occurs with larger amounts of exchanger can increase considerably.

Im Gegensatz dazu erfordert das Verfahren der Lrfindung, da das die Fällung bewirkende Ammo-:numsulfat bereits durch Auswaschen der praktisch unlöslichen Anlagerun:gsverbindungen aus Eiweißstoffen und Säuren entfernt ist, nur geringe Mengen an Austauschern, und zwar so viel, um die an die Anlagerungsverbindung gebundene Säure zu ersetzen. Darüber hinaus kann die Schädigung der Eiweißstoffe durch die Wasserstoff- bzw. Hydroxyl-Ionen der Austauscher auf die Weise vermieden werden, daß, wie aus den Beispielen ersichtlich wird, die Austauscher vorzugsweise in der Chlorid.form zugegeben werden. Das Verfahren gestattet eine wesentlich wirtschaftlichere Arbeitsweise als die bereits bekannten Verfahren und ist selbst zur Reinigung großer Mengen ohne Einschränkung geeignet. Beispiel 1 20 g trockenes Trypsin mit einem Gehalt von 45 % Ammoniumsulfat werden in 80 ccm destilliertem Wasser gelöst. Zur Entfernung der geringen unlöslichen Beimengungen wird die Lösung filtriert, erforderlichenfalls unter Verwendung von Kieselger. Der Filterrückstand wird nachgewaschen. Das Filtrat und das Waschwasser, etwa 120 ccm, werden mit der gleichen Volumenmenge wäßriger 5o/oiger Trichloressigsäurelösung vermischt und 10 Minuten gerührt. Der entstandene Niederschlag wird 1 Stunde absitzen gelassen und anschließend abzentrifugiert. Zur Entfernung der unerwünschten wasserlöslichen Beimengungen., besonders der Salze, wie Ammoniumsulfat, wird der abzentrifugierte Niederschlag zweimal mit destilliertem Wasser ausgewaschen und anschließend mit 80 ccm n/..-Salzsäure unter gleichzeitiger Zugabe von 4 g eines Anionenaustauschers mit dem Handelsnamen »Amberlite IRA 400« als Chlorid wieder aufgeschlämmt und 30 Minuten gerührt. Bei diesem Austauscher handelt es sich um ein vernetztes Polystyrol mit quaternären Ammoniumgruppen. Der Niederschlag löst sich in dieser Zeit völlig. Die Lösung wird anschließend filtriert und der Rückstand nachgewaschen. Als Filtrat und Waschwasser werden zusammen etwa 110 ccm erhalten.In contrast, the method of discovery requires that the Ammonosulfate causing precipitation by washing out the practically insoluble ones Adhesion compounds from proteins and acids are removed only to a small extent Amounts of exchangers, as much as the amount bound to the addition compound To replace acid. In addition, the protein substances can be damaged by the Hydrogen or hydroxyl ions in the exchangers are avoided in this way that, as can be seen from the examples, the exchangers preferably in the Chloride form can be added. The process allows a much more economical one Working method than the already known method and is great for cleaning itself Quantities suitable without restriction. Example 1 20 g of dry trypsin with a 45% ammonium sulphate content is dissolved in 80 ccm of distilled water. To the Removal of the small insoluble impurities, the solution is filtered, if necessary using Kieselger. The filter residue is washed off. The filtrate and the wash water, about 120 cc, become more aqueous by the same volume 5o / o trichloroacetic acid solution mixed and stirred for 10 minutes. The resulting Precipitate is allowed to settle for 1 hour and then centrifuged off. To the Removal of unwanted water-soluble additions, especially the salts, like ammonium sulfate, the centrifuged precipitate is distilled twice with Washed out water and then with 80 ccm n /..- hydrochloric acid with simultaneous Addition of 4 g of an anion exchanger with the trade name »Amberlite IRA 400« reslurried as chloride and stirred for 30 minutes. With this exchanger it is a cross-linked polystyrene with quaternary ammonium groups. Of the Precipitation dissolves completely during this time. The solution is then filtered and washed the residue. The filtrate and wash water together are about 110 cc received.

In der Lösung wird durch die Bestimmung des Gesamtstickstoffs und Ammoniakstoffs der Grad der Entsalzung ermittelt. Während zu Beginn 680/9 des Gesamtstickstoffs als Ammoniakstickstoff vorlagen, waren nach der Behandlung nur noch 8 % Ammoniakstickstoff enthalten.In the solution is determined by the determination of the total nitrogen and Ammonia substance determines the degree of desalination. While at the beginning 680/9 of the total nitrogen when ammonia nitrogen was present, only 8% ammonia nitrogen was left after the treatment contain.

Zum Filtrat, 110 ccm, werden 0,55 g Magnesiumsulfat zur Stabilisierung des Trypsins gegeben, und dieses wird mit 330 ccm 96fl/oigem Äthylalkohol gefällt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, mit Äthylalkohol gewaschen und getrocknet; die Ausbeute beträgt 2,2 g Trypsin.To the filtrate, 110 ccm, 0.55 g of magnesium sulfate are added for stabilization of trypsin, and this is precipitated with 330 cc of 96 per cent ethyl alcohol. The precipitate is centrifuged off, washed with ethyl alcohol and dried; the yield is 2.2 g of trypsin.

Beispiel 2 1,2 g salzhaltiges Trypsin werden in 30 ccm destilliertem Wasser gelöst und mit 30 ccm gesättigter 1,2o/aiger Pikrinsäurelösung gefällt (pH-Wert = 2,2). Nach 30 Minuten Stehen wird die Fä.lllung abzentrifugiert, mit Wasser ausgewaschen und anschließend durch Zusatz von 1 g »Amberlite IR 4B« als Chlorid in 20 ccm Wasser gelöst. Der genannte An.ionenaustauscher hat ein phenolisebes_ Gerüst mit Hydroxyl-und Aminogruppen. Der Niederschlag löst sich wieder vollständig auf. Die Lösung wird nach dem Filtrieren auf das gleiche Volumen wie das der Ausgangslösung gebracht und auf ihre Wirksamkeit untersucht. Es zeigt sich, daß der Wirksamkeitsverlust nur etwa 7 % beträgt, voraus ersichtlich ist, daß das Trypsin nicht denaturiert wurde. Die Lösung wurde außerdem auf den Gehalt an wasserlöslichen Eiweißstoffen untersucht, die wie im Beispiel 1 weitgehend entfernt waren.Example 2 1.2 g of salt-containing trypsin are distilled in 30 cc Dissolved water and precipitated with 30 cc of saturated 1.2% picric acid solution (pH value = 2.2). After standing for 30 minutes, the precipitate is centrifuged off and washed out with water and then by adding 1 g of “Amberlite IR 4B” as chloride in 20 ccm of water solved. The said anion exchanger has a phenolic structure with hydroxyl and Amino groups. The precipitate dissolves again completely. The solution will be after filtering brought to the same volume as that of the starting solution and examined for their effectiveness. It turns out that the loss of effectiveness is only about 7%, it can be seen beforehand that the trypsin does not denature became. The solution was also found on the content of water-soluble Investigated protein substances which, as in Example 1, were largely removed.

Beispiel 3 1,2 g Trypsin werden wie im Beispiel 2 in Wasser gelöst, aber an Stelle von Pikrinsäure mit 30 ccm 5%iger Sulfosalicylsäure bei einem p11-Wert von 1,3 gefällt. Nach 30 Minuten Stehen wird die Fällung abzentrifugiert, mit Wasser gewaschen und anschließend durch Zusatz von 1 g »Amberlite IR 4B« als Chlorid in 20 ccm Wasser gelöst. Der Niederschlag löst sich wieder vollständig, In der Lösung wurde wie im Beispiel 2 die Wirksamkeit bestimmt, der Verlust beträgt 9 0/0. Die Lösung wurde auf den Gehalt an wasserlöslichen Nichteiweißstoffen untersucht, die wie im Beispiel 1 weitgehend entfernt waren. Beispiel 4 25g eines Papainpräparates, welches 60% Ammoniumsuliat enthält, werden in 250 ccm Wasser gelöst. 30 ccm dieser Lösung werden mit 30 ccm wäßriger 5%iger Trichloressigsäurelösung verrührt, und der Niederschlag wird nach 1/2stündigem Stehen abzentrifugie,rt, mit 10 ccm Wasser ausgewaschen, anschließend in 20 ccm doppeltdestilliertem Wasser aufgeschlämmt und dann durch Zugabe von 1 g »Amberlite IR 4B« als Chlorid wieder gelöst. Die Lösung wird nach dem Filtrieren auf das ursprüngliche Volumen gebracht und nach. Aktivierung mit 5 0/a, bezogen auf das Papain, Cysteinhydrochlorid die Wirksamkeit bestimmt, die dann mit der der Anfangslösung verglichen wird. Die Prüfung der nach der Behandlung gewonnenen Lösung auf wasserlösliche Begleitstoffe ließ eine einwandfreie Reinigung erkennen. Beispiel s 5 Volumteile einer 0,3%igen wäßrigen Hämoglobinlösung werden, durch Zusatz von 1 Volumteil einer 10%igen wäßrigen, Trichforessigsäurelös.ung gefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und gewaschen, bis das Waschwassser nur noch schwach sauer, pg-Wert = 5, reagiert, sodann in der gleichen Menge Wasser, aus der er gefällt wurde, aufgeschlämmt und unter Zusatz von 8 % »Amberlite IRA 400« als Chlorid gerührt; das braunrote Filtrat wird. nochmals mit 2 % des gleichen Ionenaustauschers 1 Stunde gerührt. Das Filtrat ist frei vom. Trichloressigsäure, es zeigt nach dem Einleiten von Kohlenoxydgas nahezu das gleiche Absorptionsspektrum im sichtbaren Licht wie die Ausgangslösung; die Ausbeute beträgt 30 bis 40 Gewichtsprozent. Beispiel 6 4 Volumteile einer 0,3'0/aigen wäßrigen Hämoglobiulösung werden durch Zusatz von 1 Volumteil einer 100/eigen wäßrigen Metaphosphorsäurel.ösung im Verhältnis 1 : 4 gefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und gewaschen, bis das Was,chw asser frei von Metaphosphat ist, dann in der gleichen Menge Wasser, aus der er gefällt wurde, aufgeschlämmt, mit Soda oder Natriumacetat genau neutralisiert und mit einem Gemisch aus je 3 0/0 »Amberlite IRA 400« in der Chlorid-- und Hydroxydform gerührt, die Lösung filtriert und nochmals mit je 0,3 % der gleichen Austauscher behandelt. Das braunrote Filtrat ist frei von Metaphosphat und zeigt nach dem Einleiten von Kohlenoxydgas nahezu das gleiche Absorptionsspektrum im sichtbaren Licht wie die Ausgangslösung; die Ausbeute beträgt 50 bis 70 Gewichtsprozent.Example 3 1.2 g of trypsin are dissolved in water as in Example 2, but instead of picric acid with 30 cc of 5% sulfosalicylic acid with a p11 value of 1.3 like. After standing for 30 minutes, the precipitate is centrifuged off with water washed and then washed by adding 1 g of "Amberlite IR 4B" as chloride in Dissolved 20 cc of water. The precipitate completely dissolves again, in the solution the effectiveness was determined as in Example 2, the loss is 9 0/0. the Solution was examined for the content of water-soluble non-protein substances, the as in Example 1 were largely removed. Example 4 25g of a papain preparation, which contains 60% ammonium sulate are dissolved in 250 ccm of water. 30 cc of this Solution are stirred with 30 ccm of aqueous 5% trichloroacetic acid solution, and the precipitate is centrifuged off after standing for 1/2 hour, rt, with 10 ccm of water washed out, then slurried in 20 cc double-distilled water and then redissolved as chloride by adding 1 g of “Amberlite IR 4B”. The solution is brought to the original volume after filtering and gradually. activation with 5 0 / a, based on papain, cysteine hydrochloride determines the effectiveness, which is then compared with that of the initial solution. Examination of after treatment The solution obtained for water-soluble accompanying substances allowed perfect cleaning recognize. Example s 5 parts by volume of a 0.3% aqueous hemoglobin solution are, precipitated by adding 1 part by volume of a 10% aqueous, Trichforessigsäurelös.ung. The precipitate is filtered off and washed until the wash water is only weak acidic, pg value = 5, reacts, then in the same amount of water from which it is precipitated was, slurried and stirred with the addition of 8% "Amberlite IRA 400" as chloride; the brownish-red filtrate becomes. again with 2% of the same ion exchanger for 1 hour touched. The filtrate is free from. Trichloroacetic acid, it shows after introducing carbon oxide gas has almost the same absorption spectrum in visible light as the starting solution; the yield is 30 to 40 percent by weight. Example 6 4 Parts by volume of a 0.3% aqueous hemoglobin solution are obtained by adding 1 Part by volume of a 100% aqueous metaphosphoric acid solution in a ratio of 1: 4 pleases. The precipitate is filtered off and washed until the water is water is free of metaphosphate, then in the same amount of water from which it is precipitated was slurried, exactly neutralized with soda or sodium acetate and with a Mixture of 3 0/0 each »Amberlite IRA 400« in the chloride and hydroxide form, the solution filtered and treated again with 0.3% each of the same exchanger. The brown-red filtrate is free of metaphosphate and shows after the introduction of Carbon oxide gas has almost the same absorption spectrum in visible light as that Starting solution; the yield is 50 to 70 percent by weight.

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the pure preparation of such water-soluble ones Proteins with certain organic and / or inorganic acids Form addition compounds that are sparingly soluble to insoluble in water, characterized in that that the aqueous slurry of these addition compounds from which the soluble impurities have been washed out with water beforehand, with anion exchangers treated and from the subsequently resulting aqueous protein solution, if necessary after prior neutralization, any anions and cations present with suitable ion exchangers removed and the egg, whitening substances from the aqueous solution in a manner known per se wins.

2. The method according to claim 1, characterized in that the addition compound treated from trichloroacetic acid to trypsin with an anion exchanger.

3. Procedure according to claim 1 and 2, characterized in that in the treatment of the The acidic solution obtained from the slurry is initially neutralized, if necessary The resulting protein precipitate is filtered off and that which is now still present in the solution Anions and cations removed with the help of suitable ion exchangers.

4. Procedure: according to claim 1 to 3, characterized in that the protein substances from the aqueous solution by spray drying or by freeze drying or by precipitation with an organic solvent, primarily with alcohol, filter off and dry wins in solid form. Publications considered: Archiv of Biochemistry, Vol. 27, p. 463 and f. (Reported in the Chemisches Zentralblatt, Vol. 1951, I, p.2302) ; Helvetica Chimica Acta, Vol. 37, 1954, pp. 1767-1778; Ullmann's Encyclopedia of technical chemistry, 3rd edition, Vol. 1, 1951, pp. 559, 601; Chemical engineering technology, Vol. 1955, No. 1, p. 5; Chemisches Zentralblatt, Vol. 1952, p. 305.