DE1037068B

DE1037068B - Process for the production of biologically active preparations containing B group vitamins

Info

Publication number: DE1037068B
Application number: DEN12485A
Authority: DE
Inventors: Dr Harry Gerard Wijmenga; Jan Peter Willem Van Baal
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1955-07-14
Filing date: 1956-07-13
Publication date: 1958-08-21

Description

Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Vitamine der Bt2-Gruppe enthaltenden Zubereitungen Zusatz zum Patent 957 160 Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung gereinigter Konzentrate mit Intrinsic-Faktor-Aktivität, die ein Vitamin der Bl2-Gruppe enthalten. Process for the production of biologically active vitamins of the Bt2 group Preparations containing Addition to Patent 957 160 The invention relates a process for the production of purified concentrates with intrinsic factor activity, which contain a vitamin of the Bl2 group.

Das Haaptpatent 957 160 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von insbesondere gegen perniziöse Anämie wirksamen Präparaten, die eine Kombination des z. B. in der Schleimhaut des Verdauungssystems vorhandenen Intrinsic-Faktor-Wirkstoffs mit einem Vitamin der B12-Gruppe enthalten. Bei diesem Verfahren werden wäßrige Lösungen der Kombination aus eiweißartigem Wirkstoff und Vitamin mit einer auf unter 0°C gekühlten organischen Flüssigkeit, die mit Wasser mischbar ist, z. B. The main patent 957 160 relates to a method for the production of especially effective against pernicious anemia preparations containing a combination of z. B. intrinsic factor active ingredient present in the lining of the digestive system with a vitamin of the B12 group. In this process, aqueous Solutions of the combination of protein-like active ingredient and vitamin with one on under 0 ° C cooled organic liquid that is miscible with water, e.g. B.

Alkohol oder Aceton, versetzt, und die bei einer Temperatur unter 0°C erhaltene Fällung wird isoliert.Alcohol or acetone, added, and those at a temperature below The precipitate obtained at 0 ° C. is isolated.

In Weiterentwicklung dieses Herstellungs- und Reinigungsverfahrens wurde nunmehr festgestellt, daß man eine besonders einfache und wirksame Reinigung der aktiven Kombination aus Intrinsic-Faktor-Wirkstoff und Vitamin B12 dadurch erreichen kann, daß man ein beispielsweise nach dem Hauptpatent durch Fällung mit Methyl- oder Äthylalkohol bzw. Aceton erhaltenes festes Konzentrat mit einer wäßrigen Lösung behandelt, die 35 bis 50 Volumprozent eines Alkanols oder eines Alkanons mit nicht mehr als 3 Kohlenstoffatomen aufweist, worauf man die sich ergebende flüssige Phase, welche den aktiven Bestandteil enthält, abtrennt und aufarbeitet. Es kommen auch Gemische von Methanol, Äthanol, Isopropanol, Propanol und Aceton, die 50 bis 6501, Wasser enthalten, zur Extraktion des festen Konzentrats in Betracht. Bei der Behandlung des Konzentrats gemäß dem vorliegenden Verfahren werden die aktiven Bestandteile selektiv herausgelöst. Dies ist überraschend, denn bei fraktionierter Fällung hat man festgestellt, daß die Aktivität hauptsächlich in den Fraktionen enthalten ist, die bei einer Konzentration des organischen Fällungsmittels von 40 bis 60 Volumprozent ausgefällt werden. In further development of this manufacturing and cleaning process it has now been found that cleaning is particularly simple and effective the active combination of intrinsic factor active ingredient and vitamin B12 can, for example, according to the main patent by precipitation with methyl or solid concentrate obtained from ethyl alcohol or acetone with an aqueous solution treats the 35 to 50 volume percent of an alkanol or an alkanone with not has more than 3 carbon atoms, whereupon the resulting liquid phase, which contains the active ingredient, separates and works up. There are also coming Mixtures of methanol, ethanol, isopropanol, propanol and acetone, the 50 to 6501, Contain water, for the extraction of the solid concentrate into consideration. In the treatment of the concentrate according to the present process become the active ingredients selectively extracted. This is surprising because fractional precipitation has it is found that the activity is mainly contained in the fractions those at a concentration of the organic precipitant of 40 to 60 percent by volume be precipitated.

Als Ausgangsmaterial kann man ein festes, gegebenenfalls getrocknetes Konzentrat, beispielsweise in Pulverform, oder einen bereits gereinigten Niederschlag verwenden, wie man ihn z. B. gemäß dem Verfahren des Patents 1 000 963 erhält, oder auch ein Konzentrat gemäß Patentanmeldung N 12021 IVa/30h. The starting material can be a solid, optionally dried Concentrate, for example in powder form, or an already purified precipitate use how to use it e.g. B. obtained in accordance with the procedure of patent 1 000 963, or also a concentrate according to patent application N 12021 IVa / 30h.

Das Verfahren gemäß der Erfindung kann man bei jedem festen Konzentrat, das eine Intrinsic-Faktor- und Vitamin-Bl2-Aktivität aufweist, anwenden, gleichgültig in welchem Reinheitszustand es vorliegt. Wäßrige Lösungen dieser Konzentrate kann man beispielsweise auch durch Trocknen im Vakuum, durch Lyophilisieren, durch Sprühtrocknen usw. in feste Konzentrate überführen. The method according to the invention can be used with any solid concentrate, that has intrinsic factor and vitamin Bl2 activity, use it, no matter in what state of purity it is present. Aqueous solutions of these concentrates can for example, by drying in vacuo, by lyophilization, by spray drying etc. in solid concentrates.

Als Vitamin B12 enthaltende Substanz, die man vor Anwendung des Verfahrens der Erfindung zu dem Intrinsic-Faktor-Konzentrat hinzufügt, kommt jede Zubereitung, die eine oder mehrere Substanzen der Vitamin-Bl2-Gruppe enthält, in Betracht, beispielsweise das für orale Zwecke ausreichend gereinigte kristalline Vitamin B12 Es ist empfehlenswert, die Behandlung in Gegenwart von einem oder mehreren Salzen vorzunehmen, beispielsweise von Alkalichloriden, Phosphaten usw. Dies hat z. B. zur Folge, daß man die Flüssigkeit nach der Behandlung leicht von der übrigbleiben den festen Substanz abtrennen kann. Eine geringe Salzmenge hat bereits eine sehr günstige Wirkung. In dieser Hinsicht wirkt Natriumchlorid sehr vorteilhaft. As a substance containing vitamin B12, which you should know before using the procedure the invention adds to the intrinsic factor concentrate, comes any preparation, which contains one or more substances of the vitamin Bl2 group, into consideration, for example crystalline vitamin B12, which has been sufficiently purified for oral use. to carry out the treatment in the presence of one or more salts, for example of alkali chlorides, phosphates, etc. This has z. B. the consequence that the liquid after the treatment, the solid substance can easily be separated from the remaining substance. A small amount of salt already has a very beneficial effect. In this regard Sodium chloride has a very beneficial effect.

Um die Ausbeute zu verbessern, kann man die Behandlung ein oder mehrere Male wiederholen. Man erhält besonders günstige Ergebnisse, wenn man die Behandlung bei 0° C oder bei tieferer Temperatur durchführt. Vorzugsweise führt man die Behandlung in schwach saurem Medium, beispielsweise bei einem p-Wert von 6 bis 7, durch. Das Gemisch kann man beispielsweise durch Verwendung eines Puffers, z. B. KH2PO4 + Na2HPO4 od. dgl., auf diesen p-Wert einstellen. To improve the yield, one or more treatments can be used Repeat times. One gets particularly favorable results if one does the treatment carried out at 0 ° C or at a lower temperature. The treatment is preferably carried out in a weakly acidic medium, for example at a p-value of 6 to 7. That Mixture can, for example, by using a buffer, e.g. B. KH2PO4 + Na2HPO4 or the like, set to this p-value.

Auf Grund verschiedener Versuche hat sich erwiesen, daß man mit 40 bis 50 Volumprozent Äthanol äußerst günstige Ergebnisse erzielt. Bei Anwendung dieses Prozentsatzes werden verhältnismäßig wenige Ballastsubstanzen mitgelöst, wodurch man eine gute Reinigung der Zubereitung erzielt. Various experiments have shown that at the age of 40 up to 50 percent by volume of ethanol achieves extremely favorable results. When applying this Percentage, relatively few ballast substances are also dissolved, which means a good cleaning of the preparation is achieved.

In bekannter Weise kann man aus der flüssigen Phase eine feste Zubereitung herstellen, beispielsweise durch Lyophilisieren, Verdampfen zur Trockene oder durch Feinversprühen. In a known manner, a solid preparation can be obtained from the liquid phase produce, for example by lyophilizing, evaporating to dryness or by Fine spray.

Eine besondere Reinigung des Adduktes erzielt man durch Isolieren desselben aus der sich ergebenden Flüssigkeit, indem man die Alkanon- oder die Alkanolkonzentration auf 60 bis 75 Volumprozent erhöht, wobei die Verbindung mit der I.F.-Aktivität gemeinsam mit dem gebundenen Vitamin Bl2 ausfällt, so daß man schließlich eine Zubereitung mit einer starken hämatopoetischen Wirkung bei Patienten mit perniziöser Anämie erhält. A special cleaning of the adduct is achieved by isolating it the same from the resulting liquid by calculating the alkanone or the alkanol concentration increased to 60 to 75 percent by volume, the compound being associated with I.F. activity with the bound vitamin Bl2 precipitates, so that one finally a preparation with a strong hematopoietic effect in patients with pernicious anemia receives.

Je nach dem angewendeten Lösungsmittel, dem verwendeten Fällungsmittel und der Art des Ausgangsproduktes können sich die Grenzen der Alkanol- und der Alkanonkonzentrationen innerhalb der angegebenen Werte, bei denen die günstigste Reinigung stattfindet, verändern. Depending on the solvent used and the precipitant used and the nature of the starting product, the limits of the alkanol and alkanone concentrations can vary within the specified values, at which the cheapest cleaning takes place, change.

Wenn man von einem zuvor gereinigten Konzentrat ausgeht, das eine gute klinische Aktivität bei täglicher Zufuhr von i 30 mg zeigt, dieses Konzentrat mit Äthanol behandelt und die aktive Verbindung aus der sich ergebenden Lösung ausfällt, erhält man die Substanz mit der stärksten I.F.-Aktivität, indem man die Äthanolkonzentration der Lösung auf 60 Volumprozent erhöht. So wird z. B. im Beispiel 2 die Darstellung einer Zubereitung beschrieben, welche den aktiven Bestandteil in einer 10 fachen Konzentration des Ausgangsmaterials enthält. If you start from a previously cleaned concentrate, that's one thing This concentrate shows good clinical activity with a daily intake of 30 mg treated with ethanol and the active compound precipitates from the resulting solution, the substance with the strongest I.F. activity is obtained by measuring the ethanol concentration of the solution increased to 60 percent by volume. So z. B. in example 2 the representation a preparation described, which the active ingredient in a 10-fold Contains concentration of the starting material.

Es ist nicht erforderlich, daß das Ausfällen der aktiven Verbindung aus der gewonnenen Flüssigkeit mit der gleichen Flüssigkeit durchgeführt wird, die man als Lösungsmittel in dem wäßrigen System verwendet. Zum Ausfällen verwendet man gewöhnlich eine der hierfür gebrauchten Flüssigkeit, und zwar beispielsweise Methanol, Methanol, Aceton oder eine Kombination dieser Flüssigkeiten. It is not necessary for the active connection to fail from the recovered liquid is carried out with the same liquid that is used as the solvent in the aqueous system. Used for failure usually one of the liquids used for this purpose, for example Methanol, methanol, acetone, or a combination of these liquids.

Den Niederschlag, den man aus der Lösung durch Ausfällen der aktiven Verbindung erhält, kann man in bekannter Weise trocknen, beispielsweise durch Lyophilisieren, Trocknen im Vakuum oder durch Überleiten von warmer Luft. The precipitate obtained from the solution by precipitating the active Compound obtained can be dried in a known manner, for example by lyophilization, Drying in a vacuum or by passing warm air over them.

Die Wirkung der Zubereitung kann man durch tägliche Zufuhr einer bestimmten Menge bei Patienten mit nicht behandelter perniziöser Anämie untersuchen. Die Zubereitung führt man per os zu. Die Wirkung der Zubereitung wird auf Grund der Zunahme der Erythrozytenzahl je mm3 Blut während einer bestimmten Behandlungszeit festgestellt. Der Erythrozytengehalt wird häufig 14 oder 21 Tage nach Beginn der Verabreichung der Zubereitung bestimmt. Zusätzlich wird häufig das Retikulozytenmaximum in Prozenten bestimmt. Die folgenden Beispiele, bei denen sich die Prozentangaben auf Volumprozente beziehen, erläutern die Erfindung. The effect of the preparation can be increased by taking one daily dose in patients with untreated pernicious anemia. The preparation is supplied per os. The effect of the preparation is due the increase in the number of erythrocytes per mm3 of blood during a certain treatment period established. The erythrocyte count is often 14 or 21 days after the onset of Administration of the preparation intended. In addition, the reticulocyte maximum is often determined as a percentage. The following examples, where the percentages refer to volume percent, explain the invention.

Beispiel 1 375 g gepulvertes I.F.-Konzentrat, dem man während der Darstellung so viel Cyanocobalamin zugefügt hat, daß die gesamte Bindungskapazität für Cobalamin abgesättigt ist, so daß es etwa 0,28pg Vitamin Bla (Cyanocobalamin) je mg in gebundener Form enthält, verwendet man als Ausgangsmaterial. Diese Zubereitung ist klinisch in einer täglichen Dosis von 38 mg wirksam. In einem Mixgerät wird das Pulver mit kaltem 45 obigem Äthanol befeuchtet, das 9 g NaCl je Liter enthält. Dann gibt man so viel von dieser äthanolischen Lösung zu dem Gemisch, daß insgesamt 41 hiervon verwendet werden. Das Gemisch rührt man 18 Stunden bei -5"C und zentrifugiert es dann. Das gleiche Verfahren wiederholt man noch zweimal, jedesmal mit 4501,igem Äthanol, der 9 g NaCl je Liter enthält. Zu den vereinigten flüssigen Phasen gibt man kaltes 96 0!0ges Äthanol, bis man eine Endkonzentration von etwa 75010 erhält. Die Temperatur hält man zwischen 0 und -5"C. Den sich ergebenden Niederschlag sammelt man und trocknet ihn im Vakuum bei niedriger Temperatur. Die Endausbeute an einer roten Zubereitung mit einem Vitamin-Bl2-Gehalt von 2,3 y je mg beträgt 37,4 g. Example 1 375 g of powdered I.F. concentrate, which one during the Representation has added so much cyanocobalamin that the total binding capacity for cobalamin is saturated, so there is about 0.28pg of vitamin bla (cyanocobalamin) per mg contains in bound form, is used as the starting material. This preparation is clinically effective at a daily dose of 38 mg. In a blender is the powder moistened with cold ethanol 45 above, which contains 9 g NaCl per liter. Then add as much of this ethanolic solution to the mixture as that in total 41 of these can be used. The mixture is stirred for 18 hours at -5 "C and centrifuged it then. The same procedure is repeated twice more, each time with 4501 igem Ethanol containing 9 g NaCl per liter. Adds to the combined liquid phases one cold 96 0! 0ges ethanol until a final concentration of about 75010 is obtained. The temperature is kept between 0 and -5 "C. The resulting precipitate is collected one and dry it in vacuum at low temperature. The final yield on one red preparation with a vitamin Bl2 content of 2.3 y per mg is 37.4 g.

Beispiel 2 Zu einer Lösung eines I.F.-Konzentrates, von dem 30 mg Trockensubstanz täglich eine gute klinische Wirksamkeit zeigen, wenn man gleichzeitig 15 Fg B12 täglich zuführt, wird so viel Cyanocobalamin zugegeben, daß die gesamte Bindungskapazität abgesättigt wird. Dann gibt man unter Rühren und bei niedriger Temperatur 96 Obiges Äthanol zu. Die Fraktion, die in einem Äthanolkonzentrationsbereich von 0 bis 40010 ausfällt, wird inzwischen durch Zentrifugieren entfernt. Dann erhöht man die Äthanolkonzentration von 40 auf 75010, wodurch sich ein Niederschlag bildet. Diesen sammelt man durch Zentrifugieren, und er dient als Ausgangsmaterial für die Extraktion nach der Erfindung. Example 2 To a solution of an I.F. concentrate, of which 30 mg Dry matter daily show good clinical effectiveness when taken at the same time By supplying 15 μg of B12 per day, enough cyanocobalamin is added to make up all of the Binding capacity is saturated. Then you add while stirring and at lower Temperature 96 Above ethanol too. The fraction that is in an ethanol concentration range from 0 to 40010 precipitates is now removed by centrifugation. Then increased one the ethanol concentration from 40 to 75010, whereby a precipitate forms. This is collected by centrifugation, and it serves as the starting material for the Extraction according to the invention.

Dieses Ausgangsmaterial mit einem Trockenrückstand von 110 g und einem gesamten Vitamin-Bla-Gebalt von 50 mg suspendiert man in 1,5 1 kalter 45 °/Oiger Äthanollösung, die 17 g NaCl je Liter enthält. Nach 24stündigem Rühren bei -5"C trennt man die Flüssigkeit ab. Der Niederschlag wird zweimal mit 45 Ol0igem Äthanol, das 17g NaCl je Liter enthält, behandelt. Der unlösliche Teil wird getrocknet, und die Äthanolkonzentration der vereinigten Lösungen, insgesamt 2880 cm3, erhöht man stufenweise, um einen Eindruck von dem Gewicht der Fraktionen zu erhalten, die innerhalb bestimmterÄthanolkonzentrationsbereiche ausfallen. Die Niederschläge trocknet man im Vakuum. This starting material with a dry residue of 110 g and A total vitamin Bla content of 50 mg is suspended in 1.5 liters of cold 45 ° / Oiger Ethanol solution containing 17 g NaCl per liter. After stirring at -5 "C for 24 hours the liquid is separated off. The precipitate is washed twice with 45% ethanol, which contains 17g NaCl per liter. The insoluble part is dried, and the ethanol concentration of the combined solutions, a total of 2880 cm3, is increased gradually to get an idea of the weight of the fractions that are within certain ethanol concentration ranges fail. The precipitates are dried in a vacuum.

In der folgenden Tabelle sind diese Gewichte zusammengestellt: Fraktion Ausgefällt in den Ausbeute Farbe Alkoholkonzentrationsbereichen g Niederschlag unlöslich in 45 °/Oigem Alkohol 44,5 weiß-hellbraun 1 45 bis 50 12,0 hellrosa 2 50 bis 55 6,38 stark rot 3 55 bis 60 1,87 rot und gelb 4 60 bis 70 2,99 nahezu weiß 5 70 bis 75 0,94 weiß Zur Bestimmung der klinischen und der mikrobiologischen Aktivität vermischt man die Fraktion in 1, 2 und 3 nach Beendigung, löst sie in wenig Wasser und loyphilisiert sie. Mikrobiologisch wird mittels Lactobazillus Leichmannii ein Vitamin-B,2-Gehalt von 2,3 Fg je mg ermittelt, also insgesamt von 46,6 mg B12, was eine Ausbeute von mehr als 900!o bedeutet.These weights are compiled in the following table: Fraction precipitated in the yield color Alcohol concentration ranges g Precipitate insoluble in 45% alcohol 44.5 white-light brown 1 45 to 50 12.0 light pink 2 50 to 55 6.38 strong red 3 55 to 60 1.87 red and yellow 4 60 to 70 2.99 almost white 5 70 to 75 0.94 white To determine the clinical and microbiological activity, the fractions 1, 2 and 3 are mixed after completion, dissolved in a little water and loyphilized. A vitamin B, 2 content of 2.3 μg per mg is determined microbiologically using Lactobacillus Leichmannii, i.e. a total of 46.6 mg B12, which means a yield of more than 900%.

Bei der klinischen Bestimmung werden bei einer täglichen Dosis von 2,9 mg dieser Zubereitung ergänzt mit 5 y freiem Cyanocobalamin bereits nach 14 Tagen 3,30 Millionen Erythrozyten je mm3 Blut bei einem Anfangswert von 1,29 Millionen gezählt, wobei diese Zunahme fortdauert so daß nach 21 Tagen bereits 3,6 Millionen Erythrozyten je mm3 Blut vorliegen. Das Retikulozytenmaximum von 18,60(0, das bei diesem Patienten mit perniziöser Anämie am 11. Tag festgestellt wurde, weist ebenfalls auf die große klinische Wirksamkeit der Zubereitung hin. In clinical determination, a daily dose of 2.9 mg of this preparation supplemented with 5 y of free cyanocobalamin already after 14 Days 3.30 Millions of erythrocytes per mm3 of blood at an initial value of 1.29 million, this increase continuing so that after 21 days 3.6 million erythrocytes per mm3 of blood are already present. The reticulocyte maximum of 18.60 (0 found in this patient with pernicious anemia on day 11 also indicates the great clinical effectiveness of the preparation.

Beispiel 3 Als Ausgangsmaterial verwendet man einen acetonhaltigen Niederschlag, der durch einen Überschuß von Oxycobalaminkonzentrat zu einer wäßrigen Lösung eines I.F.-Konzentrats hergestellt wurde, so daß die gesamte Bindungsfähigkeit für Cobalamin abgesättigt war. Dieses Gemisch wird mit einem dreifachen Überschuß an Aceton behandelt, wobei die Temperatur unter 0° C gehalten wird. Den Niederschlag trennt man durch Zentrifugieren ab. Example 3 The starting material used is an acetone-containing one Precipitate, which by an excess of oxycobalamine concentrate to an aqueous Solution of an I.F. concentrate was prepared, so that the total binding capacity for cobalamin was saturated. This mixture is made with a three-fold excess treated on acetone, the temperature being kept below 0 ° C. The precipitation is separated off by centrifugation.

Dieses Ausgangsmaterial mit einem Trockenrückstand von 1535 g und einer Cobalaminaktivität, die insgesamt 495 mg Cyanocobalamin entspricht, suspendiert man in 20,51 40°/Oigem Äthanol und rührt über Nacht. Nach Zentrifugieren behandelt man den sich ergebenden Rückstand noch zweimal, jedesmal mit 16 145 Ol,igem Äthanol. This starting material with a dry residue of 1535 g and a cobalamin activity, which corresponds to a total of 495 mg of cyanocobalamin, suspended one in 20.51 40 ° / Oigem ethanol and stirred overnight. Treated after centrifugation the resulting residue twice more, each time with 16 145 oil, strength ethanol.

Von den gesammelten Lösungen, insgesamt 491, wird eine Probe lyophilisiert, um die Wirkung der Behandlung zu ermitteln. Der Gehalt an Trockensubstanz der Probe beträgt 5,4 mg je Liter. Die gesammelten Lösungen enthalten infolgedessen etwa 265 g Trockensubstanz, so daß man in dieser Hinsicht eine sechsfache Konzentrierung erreicht hat.From the collected solutions, a total of 491, a sample is lyophilized, to determine the effect of the treatment. The dry matter content of the sample is 5.4 mg per liter. As a result, the solutions collected contain about 265 g dry matter, giving a six-fold concentration in this regard has reached.

Zu den gesammelten Lösungen, die eine Gesamtkonzentration an organischen Lösungsmitteln (Äthanol und etwas Aceton) von etwa 45010 aufweisen, fügt man nun etwa 1919601,iges Äthanol zu, um das aktive Prinzip auszufällen. Nach Trocknen im Vakuum hat der Niederschlag ein Gewicht von 165,5 g. Der Bl2a-Gehalt hiervon beträgt, gemessen als Cyanocobalaminaktivität nach der Lactobazillus-Leichmannii-Untersuchung, 2,4 r je mg. Among the collected solutions that have a total concentration of organic Have solvents (ethanol and a little acetone) of about 45010, you now add around 1919601, iges ethanol to precipitate the active principle. After drying in In a vacuum, the precipitate has a weight of 165.5 g. The Bl2a content of this is measured as cyanocobalamin activity according to the Lactobacillus Leichmannii test, 2.4 r per mg.

Das gesamte in dem Niederschlag festgestellte VitaminBl2 beträgt 397 mg. Dies entspricht einer Ausbeute von 80%, berechnet in bezug auf die ursprünglich gebundene Menge.The total of vitamin B1 found in the precipitate is 397 mg. This corresponds to a yield of 80%, calculated with respect to the original bound quantity.

Diese Zubereitung ist in einer täglichen Dosis von 2,5 mg bei oraler Verabreichung klinisch wirksam (siehe die Bestimmungsergebnisse in der folgenden Tabelle). Retikulozyten- Erythrozyten (Millionen/mm3 Blut) maximum Patient Zeit 0 1 14. Tag zu 21. Tag 01, 1 Tag A | 1,43 1,82 2,43 23,4 neunten B f 2,00 1 2,95 l 3,61 19,3 drei- zehnten Beispiel 4 Als Ausgangsmaterial verwendet man einen methanolhaltigen Niederschlag, der, wie im Beispiel 3 beschrieben, dargestellt wurde, jedoch mit dem Unterschied, daß als Vitamin-Bl2-Quelle ein lösliches Vitamin-'312-Konzentrat, das zu oraler Verabreichung geeignet ist, verwendet wurde, das, nach dem Absorptionsspektrum zu schließen, das Vitamin in Form von Cyanocobalamin enthielt, während für das Ausfällen 3 Volumina Methanol verwendet wurden.This preparation is clinically effective in a daily dose of 2.5 mg when administered orally (see the determination results in the following table). Reticulocyte Erythrocytes (millions / mm3 blood) maximum Patient time 0 1 14th day to 21st day 01, 1 day A | 1.43 1.82 2.43 23.4 ninth B f 2.00 1 2.95 l 3.61 19.3 three- tenth EXAMPLE 4 The starting material used is a methanol-containing precipitate, which was prepared as described in Example 3, with the difference that a soluble vitamin 312 concentrate which is suitable for oral administration is used as the vitamin B12 source which, according to the absorption spectrum, contained the vitamin in the form of cyanocobalamin, while 3 volumes of methanol were used for the precipitation.

Der Niederschlag mit einem gesamten Naßgewicht von 5630 g und einem Trockenrückstand von 1643 g, der insgesamt etwa 500 mg Bl2-Aktivität enthält, wird in 201 36°/Oigem Methanol suspendiert, das 20 g NaCl je Liter enthält. Nach 17stündigem Rühren wird das Gemisch zentrifugiert. The precipitate with a total wet weight of 5630 g and one Dry residue of 1643 g, which contains a total of about 500 mg of Bl2 activity, is in 201 36 ° / Oigem methanol suspended, which contains 20 g of NaCl per liter. After 17 hours The mixture is centrifuged while stirring.

Man nimmt eine zweite und dritte Behandlung mit einer 400i,igen Methanollösung vor, die 20 g NaCl je Liter enthält. Insgesamt erhält man 56 1 Lösung, der man 271 gekühltes Methanol hinzufügt. Hierbei bildet sich ein Niederschlag. Nach Trocknen desselben im Hochvakuum erhält man ein Endprodukt mit 2,55 y Bl2-Aktivität je mg in einer Ausbeute von 156,5 g. A second and third treatment is carried out with a 400 ml solution of methanol before, which contains 20 g NaCl per liter. A total of 56 1 solution is obtained, which is 271 add chilled methanol. A precipitate forms here. After drying of the same in a high vacuum, an end product with 2.55 yBl2 activity per mg is obtained in a yield of 156.5 g.

Dieses Endprodukt ist klinisch sehr wirksam. Orale Verabreichung in einer täglichen Dosis von 2,37 mg bei einem Patienten mit nichtbehandelter perniziöser Anämie verursacht eine Erythrozytenzunahme von 1,0 Millionen in 15 Tagen und 1,47 Millionen in 21 Tagen bei einem Anfangswert von 1,17 Millionen je mm3 Blut. Das Retikulozytenmaximum beträgt am 9. Tag des Versuchs 149 Olo Bei einem zweiten Patienten waren die gefundenen Erythrozytenwerte am Anfang 1,82 Millionen, nach 14 Tagen 2,94 Millionen und nach 21 Tagen 3,12 Millionen. This end product is very effective clinically. Oral administration at a daily dose of 2.37 mg in a patient with untreated pernicious disease Anemia causes an increase in red blood cells of 1.0 million in 15 days and 1.47 Millions in 21 days with an initial value of 1.17 million per mm3 of blood. That Reticulocyte maximum on day 9 of the experiment is 149 Olo in a second patient the erythrocyte values found were 1.82 million at the beginning and 2.94 after 14 days Million and after 21 days 3.12 million.

Das Retikulozytenmaximum am 7. Behandlungstag betrug 7,40/,.The reticulocyte maximum on the 7th day of treatment was 7.40 /,.

Beispiel 5 Als Ausgangsmaterial verwendet man einen acetonhaltigen Niederschlag, der, wie im Beispiel 3 beschrieben, dargestellt wurde. Als Vitamin-'3,2-Quelle wurde jedoch das im Beispiel 4 genannte Bl2-Konzentrat verwendet, bei dem das Vitamin als Cyanocobalamin vorliegt. 5,1 kg dieses Ausgangsmaterials mit einer gesamten Vitamin-Bl2-Aktivität entsprechend 350 mg B12 werden mit 15 1 30 obigem Aceton und dann zweimal mit je 12 1 35 °lOigem Aceton behandelt. Hierbei wird eine Temperatur im Bereich von -5 bis 0°C eingehalten. Bei den beiden zuletzt genannten Behandlungsstufen enthält das 35 obige Aceton stets 15 g NaCl je Liter. Example 5 The starting material used is an acetone-containing one Precipitate, which was prepared as described in Example 3. As a source of vitamin '3,2 however, the Bl2 concentrate mentioned in Example 4 was used, in which the vitamin is present as cyanocobalamin. 5.1 kg of this starting material with a total Vitamin Bl2 activity corresponding to 350 mg B12 with 15 1 30 above acetone and then treated twice with 12 liters of 35 ° acetone each time. Here is a temperature adhered to in the range from -5 to 0 ° C. For the last two treatment stages mentioned The above acetone always contains 15 g NaCl per liter.

Zu den gesammelten Lösungen, insgesamt 40 1, gibt man unter Rühren 25 l kaltes Aceton. Nach Stehen über Nacht bei -5"C wird der Niederschlag gesammelt und im Vakuum getrocknet. Insgesamt erhält man 80 g Endprodukt. Der Vitamin-'3,2-Gehalt beträgt 3,67y Bl2 je mg. Die Ausbeute an B12 beträgt beinahe 840/o, bezogen auf die Cyanocobalaminaktivität. To the collected solutions, a total of 40 liters, are added with stirring 25 l of cold acetone. After standing overnight at -5 "C, the precipitate is collected and dried in vacuo. A total of 80 g of end product is obtained. The vitamin '3.2 content is 3.67y Bl2 per mg. The yield of B12 is almost 840 / o based on the cyanocobalamin activity.

Beispiel 6 Man geht von einem cyanocobalaminhaltigen Niederschlag von I.F. aus, der gemäß Beispiel 3 dargestellt wurde, jedoch mit der Ausnahme, daß die Ausfällung mit Äthanol anstatt mit Aceton vorgenommen wurde. Diesen Niederschlag mit einem Naßgewicht von 2,7 kg suspendiert man in 25 1 gekühlter 34 0/0iger Äthanollösung, die 20 g NaCl je Liter enthält, und rührt das Gemisch 13 Stunden bei -5"C. Dann zentrifugiert man es und behandelt den Niederschlag noch zweimal mit je 201 45 0(0igem Äthanol, das 20 g NaCl je Liter enthält. Example 6 A cyanocobalamin-containing precipitate is used by I.F. from, which was prepared according to Example 3, but with the exception that the precipitation was carried out with ethanol instead of acetone. This precipitate with a wet weight of 2.7 kg is suspended in 25 1 of cooled 34 0/0 ethanol solution, which contains 20 g of NaCl per liter, and the mixture is stirred for 13 hours at -5 "C. Then it is centrifuged and the precipitate is treated twice with 201 45 0 (0igem Ethanol containing 20 g NaCl per liter.

Zu den gesammelten Lösungen mit einem Gesamttrockenrückstand von 1400 g gibt man 24,8 1 kaltes 96 0!0ges Äthanol unter Rühren zu, während man die Temperatur bei etwa -5"C hält. Nach der Zugabe wird weiter 1 Stunde gerührt und danach der sich ergebende Niederschlag abzentrifugiert. Der Niederschlag, der sich durch Ausfällen im Bereich von 45 bis 60°/o Äthanol gebildet hat, wird im Hochvakuum getrocknet. Als Endausbeute erhält man 138 g eines Produktes, das 1,96y B12 je mg enthält. In einer täglichen oralen Dosis von 5,5 mg ist das Produkt klinisch hochaktiv, was sich aus folgender Tabelle ergibt: Erythrozyten (Millionenlmmi Blut) Retikulozyten- maximum Patient + Zeitz 1 14. Tag 1 21. Tag % Tag C 0,85 1,92 2,84 44,6 achten PATENTANSPRTJCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven, Vitamine der Bl24ruppe enthaltenden Zubereitungen nach Patent 957 160, dadurch gekennzeichnet, daß man ein festes Konzentrat im Intrinsic-Faktor-Wirksamkeit und Gehalt an Vitaminen der Bl2-Gruppe mit einer wäßrigen Lösung, die 35 bis 50 Volumprozent Alkanol und Alkanon mit nicht mehr als 3 Kohlenstoffatomen enthält, behandelt, worauf man die flüssige Phase abtrennt und daraus die wirksame Kombination aus Intrinsic-Faktor und Vitamin B12 isoliert.24.8 liters of cold 96% ethanol are added to the collected solutions with a total dry residue of 1400 g, while stirring, while the temperature is kept at about -5 ° C. After the addition, stirring is continued for 1 hour and then the mixture The precipitate, which has formed by precipitation in the range of 45 to 60% ethanol, is dried in a high vacuum. The final yield is 138 g of a product which contains 1.96 y B12 per mg oral dose of 5.5 mg, the product is clinically highly active, as can be seen from the following table: Erythrocytes (millions of lmmi blood) reticulocytes maximum Patient + Zeitz 1 14th day 1 21st day% day C 0.85 1.92 2.84 44.6 eighth PATENT CLAIMS: 1. Process for the production of biologically active preparations containing vitamins of the Bl2 group according to Patent 957 160, characterized in that a solid concentrate in the intrinsic factor activity and content of vitamins of the Bl2 group is mixed with an aqueous solution containing 35 contains up to 50 percent by volume of alkanol and alkanone with no more than 3 carbon atoms, after which the liquid phase is separated off and the effective combination of intrinsic factor and vitamin B12 is isolated from it.

Claims

2. The method according to claim 1, characterized in that as Alkanol Ethanol used.

3. The method according to claim 2, characterized in that the Treated concentrate in a solution containing 40 to 45 percent by volume of ethanol.

4. The method according to claim 1 to 3, characterized in that one the treatment is carried out in the presence of one or more salts.

5. The method according to claim 4, characterized in that as Salt used sodium chloride.

6. The method according to claim 1 to 5, characterized in that one the treatment is carried out at a temperature below 0 ° C.

7. The method according to claim 1 to 6, characterized in that one the alkanol or alkanone concentration of the resulting extract to about Bringing 60 to 75 percent by volume, and separating the precipitate formed.

8. The method according to claim 1 to 7, characterized in that one the alkanol or alkanone concentration of the resulting extract to one Brings concentration of 60 percent by volume.