[Nachfüllbare Mikrosonde][Refillable Microprobe]
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Mikrosonde zur enzymatischen
Messung von Gasen in biologischen Proben, die es gestattet, die
Enzymlösung
zu entfernen, nachzufüllen
und/oder auszutauschen.The
The present invention relates to a microprobe for enzymatic
Measurement of gases in biological samples, which allows the
enzyme solution
to remove, refill
and / or exchange.
[Beschreibung und Einleitung
des allgemeinen Gebietes der Erfindung][Description and introduction
of the general field of the invention]
Der
qualitative und quantitative Nachweis von Gasen sowie in Flüssigkeiten
gelösten
Gasen und Ionen spielt in Wissenschaft und Technik eine große Rolle.
Die derzeit realisierten Sonden und Sensoren erlauben die Bestimmung
von Gasen, Ionen oder aus gasförmigen
Stoffen gebildeten Ionen beispielsweise in Verbrennungsanlagen,
bei der Kontrolle von Abgasen und in zahlreichen biologischen Systemen.
Dabei kommen verschiedene Messverfahren für die Substanzbestimmung zum
Einsatz, wobei die Verwendung eines bestimmten Analyseverfahrens
von Charakter und voraussichtlicher Konzentration des zu bestimmenden
Stoffes und dem Einsatz- bzw. Messort (Makro- oder Mikromaßstab) abhängt.Of the
qualitative and quantitative detection of gases as well as in liquids
dissolved
Gases and ions play a major role in science and technology.
The currently implemented probes and sensors allow the determination
of gases, ions or gaseous
Substances formed in, for example, incineration plants,
in the control of exhaust gases and in numerous biological systems.
In this case, different measuring methods for substance determination are used
Use, whereby the use of a certain analysis procedure
of character and anticipated concentration of the person to be determined
Material and the place of use or measurement (macro or micro scale) depends.
Zur
Detektion geeignet sind solche physikalischen und/oder chemischen
Eigenschaften des Analyten, die eindeutige Rückschlüsse auf seine Natur zulassen
und die sich proportional zu seiner Konzentration verändern. Zu
den eingesetzten Messverfahren zählen
potentiometrische und amperometrische Verfahren sowie Messungen
von Leitfähigkeit,
Temperatur, Druck bzw. Partialdruck, Resonanzfrequenz und magnetischer
Suszeptibilität.
Je nach Messanordnung und Natur des Analyten und der Messeinrichtung
kann die Änderung
der Eigenschaften des Analyten (Primärsubstanz) direkt bestimmt
werden, oder der Analyt wird in eine Sekundärsubstanz überführt, welche dann gemessen wird.
Im letztgenannten Fall müssen
Primär-
und Sekundärsubstanz
in einem definierten mathematischen Verhältnis zueinander stehen.to
Detection are suitable such physical and / or chemical
Properties of the analyte that allow unambiguous conclusions about its nature
and that change in proportion to its concentration. To
include the measuring method used
potentiometric and amperometric methods and measurements
of conductivity,
Temperature, pressure or partial pressure, resonance frequency and magnetic
Susceptibility.
Depending on the measuring arrangement and nature of the analyte and the measuring device
can the change
the properties of the analyte (primary substance) directly determined
or the analyte is converted to a secondary substance, which is then measured.
In the latter case must
Primary-
and secondary substance
in a defined mathematical relationship to each other.
Um
Analyten auch in Substanzgemischen bestimmen zu können, werden
häufig
Messapparaturen eingesetzt, bei denen der eigentliche Messbereich
durch eine semipermeable Membran vom zu untersuchenden Gemisch getrennt
ist. Im Idealfall kann diese Membran nur von einem oder wenigen der
zu analysierenden Stoffe passiert werden. Diese Membran kann beispielsweise
aus Glas, Kunststoffen/Polymeren oder metallischen Verbindungen
bestehen. Silikonmembranen sind seit langem in Messsonden für Kohlendioxid
und Sauerstoff im Einsatz. Der hohe elektrische Widerstand von Silikonen
gewährleistet
bei Benutzung in leitenden Medien, dass das elektrische Potenzial
der Messlösung
nicht den Sensorstromkreis beeinflusst.Around
Analytes can also be determined in substance mixtures
often
Measuring equipment used in which the actual measuring range
separated by a semipermeable membrane from the mixture to be examined
is. Ideally, this membrane can only contain one or a few of the
to be analyzed. This membrane can, for example
made of glass, plastics / polymers or metallic compounds
consist. Silicone membranes have long been in probes for carbon dioxide
and oxygen in use. The high electrical resistance of silicones
guaranteed
when used in conductive media, that the electrical potential
the measurement solution
does not affect the sensor circuit.
Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Mikrosonde, mit deren Hilfe
Substanzen in biologischen Proben im Mikromaßstab enzymatisch analysiert werden
können
und die es gestattet, die Enzymlösung
zu entfernen, nachzufüllen
und/oder auszutauschen. Die erfindungsgemäße Mikrosonde stellt damit
eine Weiterentwicklung der in S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle
(Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114) beschriebenen Mikrosonde
dar. Die erfindungsgemäße Mikrosonde
enthält
ferner die in DE 102 39 264.1 beschriebene
Silikondichtung, welche für
den zu messenden Analyten permeabel und gleichzeitig elektrisch
isolierend ist. Dabei ist diese bereits beschriebene Mikrosonde
sehr klein, hoch empfindlich und selektiv, so dass sie den Stoffwechsel
biologischer Proben nicht beeinträchtigt oder verändert. Die
Mikrosonde ist geeignet für
zellbiologische Messungen, z.B. zur Messung der Konzentration von
CO2 und O2 als Steuergrößen des
zellulären Energiestoffwechsels
und der zellulären
Stoffaufnahme oder zur Messung der Bildung von CO2 und
NH3 in Infektionsherden an Wirtszellen oder
an mikrobiellen Pathogenen. Durch Dotieren des Elektrolyten hinter
der Silikondichtung mit einem geeigneten Enzym ist es möglich, einen
bestimmten Primäranalyten
aus einer biologischen Probe selektiv zu einem Sekundäranalyten
umzusetzen.The present invention relates to a microprobe, with the aid of which substances in micro-scale biological samples can be analyzed enzymatically and which allows the enzyme solution to be removed, topped up and / or exchanged. The microprobe according to the invention thus represents a further development of the microprobe described in S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle (Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114). The microprobe according to the invention also contains the microprobe described in US Pat DE 102 39 264.1 described silicone gasket, which is permeable to the analyte to be measured and at the same time electrically insulating. In this case, this microprobe already described is very small, highly sensitive and selective, so that it does not affect or alter the metabolism of biological samples. The microprobe is suitable for cell biological measurements, for example for measuring the concentration of CO 2 and O 2 as control variables of cellular energy metabolism and cellular uptake or for measuring the formation of CO 2 and NH 3 in infection sites on host cells or on microbial pathogens. By doping the electrolyte behind the silicone gasket with a suitable enzyme, it is possible to selectively convert a given primary analyte from a biological sample to a secondary analyte.
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Herstellung
einer solchen Mikrosonde, die es gestattet, eine Vorrichtung einzubauen, um
die Enzymelektrolytlösung
auszutauschen und/oder nachzufüllen.The
The present invention relates to a novel process for the preparation
such a microprobe, which allows to install a device to
the enzyme electrolyte solution
exchange and / or refill.
[Stand der Technik][State of the art]
Derzeit
sind verschiedene Elektroden und Sensoren bekannt, mit denen gasförmige Stoffe
oder in Flüssigkeit
gelöste
Gase und Ionen bestimmt werden können.
Dabei werden verschiedene chemische und physikalische Parameter
genutzt, um die zu bestimmenden Analyten ggf. auch in Substanzgemischen
zu identifizieren. Viele Messmethoden bedienen sich verschiedener
Elektroden aus Edelmetallen und ihren Salzen. Das Salz kann dabei
je nach Ausführung
der Elektrode in gelöster
oder fester Form vorliegen. Die Detektion des Analyten kann beispielsweise
durch amperometrische oder potentiometrische Messung erfolgen. Nachteilig
für die
Messung sehr kleiner oder sich rasch ändernder Analytkonzentrationen
sind die meist zu hohe Nachweisgrenze des Sensors, eine zu geringe
Selektivität
für einen bestimmten
Analyten in einem Gemisch sowie der Zeitbedarf bis zum Erhalt des
Messsignals.Currently
Various electrodes and sensors are known with which gaseous substances
or in liquid
dissolved
Gases and ions can be determined.
There are different chemical and physical parameters
used to determine the analyte to be determined possibly in substance mixtures
to identify. Many measurement methods use different
Electrodes of precious metals and their salts. The salt can do that
depending on the version
the electrode in dissolved
or solid form. The detection of the analyte may, for example
by amperometric or potentiometric measurement. adversely
for the
Measurement of very small or rapidly changing analyte concentrations
are the usually too high detection limit of the sensor, one too small
selectivity
for a particular
Analytes in a mixture and the time required to obtain the
Measurement signal.
Allen
Messanordnungen ist gemein, dass sich zwischen dem Messmedium und
dem Detektionssystem eine semipermeable Membran befindet, die nur
für den
Analyten oder das Gemisch der zu analysierenden Substanzen durchlässig ist,
um auf diese Weise die Selektivität der Messung zu erhöhen.All measuring arrangements have in common that between the measuring medium and the Detekti Onssystem a semipermeable membrane is located, which is permeable only to the analyte or the mixture of substances to be analyzed, in order to increase the selectivity of the measurement.
Die DE 199 29 264 A1 beschreibt
einen als Durchflussmesszelle ausgebildeten Transducer zur Bestimmung
von Stoffkonzentrationen oder Stoffaktivitäten in Fluiden. Der Transducer
beinhaltet einen dem Durchfluss der Analyten dienenden Hohlraum, welcher
Füllungen
aus Stoff erkennenden Membranen und/oder Gelen enthalten kann. Diese
Membranen und/oder Gele können
zusätzlich
Biokomponenten wie Enzyme, Antikörper
oder Mikroorganismen enthalten. Es ist nicht möglich, diese Biokomponenten
auszutauschen oder zu ersetzen. Der Transducer ist nicht für die Bestimmung
trockener, gasförmiger Analyte
geeignet.The DE 199 29 264 A1 describes a designed as a flow cell transducer for determining substance concentrations or substance activities in fluids. The transducer includes a cavity for the flow of analytes, which may contain fillings of fabric-detecting membranes and / or gels. These membranes and / or gels may additionally contain biocomponents such as enzymes, antibodies or microorganisms. It is not possible to replace or replace these biocomponents. The transducer is not suitable for the determination of dry, gaseous analytes.
Die DE 694 02 705 T2 beschreibt
einen Sensor, mit dem Sauerstoff und Kohlendioxid in Körperflüssigkeiten
bestimmt werden können.
Der Sensor enthält
eine PTFE-Membran für
den Durchtritt der Analyten, eine Silber/Silberchlorid-Elektrode
und aprotische Lösungsmittel,
denen kein oder nur wenig wässriges
Medium zugesetzt wird. Die Analyten werden elektrochemisch reduziert
und amperometrisch gemessen.The DE 694 02 705 T2 describes a sensor with which oxygen and carbon dioxide can be determined in body fluids. The sensor contains a PTFE membrane for the passage of the analytes, a silver / silver chloride electrode and aprotic solvents to which no or only slightly aqueous medium is added. The analytes are electrochemically reduced and measured amperometrically.
Die DE 196 02 861 C2 beschreibt
einen Sauerstoffsensor, der aus einer Dialysemembran, einer Silber-Silberchlorid-Anode
und einer Kathode aus Silber oder Platin besteht. Die Membran wird
aus einem Gel hergestellt, das sowohl ein Salz als auch ein Enzym
enthält.
Dieser Sensor ist als Durchflussapparatur ausgebildet und ist daher
nur für
in Trägerflüssigkeiten
gelöste
Analyte einsetzbar, jedoch nicht für trockene Gase. Außerdem ist
das in der Membran enthaltene Enzym nicht austausch- oder nachfüllbar.The DE 196 02 861 C2 describes an oxygen sensor consisting of a dialysis membrane, a silver-silver chloride anode and a cathode of silver or platinum. The membrane is made from a gel containing both a salt and an enzyme. This sensor is designed as a flow-through apparatus and can therefore only be used for analytes dissolved in carrier liquids, but not for dry gases. In addition, the enzyme contained in the membrane is not exchangeable or refillable.
Eine
Bakterien enthaltende Mikrosonde zur Bestimmung von Nitrat ist in
WO 99/45376 erläutert. Die
zur Denitrifizierung eingesetzen Bakterien können jedoch nicht ersetzt oder
rege neriert werden. Auch die in der DE 695 14 427 T2 beschriebene Elektrode zur
enzymatischen Bestimmung von Glucose, Sauerstoff und Lactat in Körperflüssigkeiten
gestattet es nicht, die verwendeten Enzyme auszutauschen oder zu
ersetzen.A microprobe containing bacteria for the determination of nitrate is explained in WO 99/45376. However, the bacteria used for denitrification can not be replaced or regenerated. Also in the DE 695 14 427 T2 described electrode for the enzymatic determination of glucose, oxygen and lactate in body fluids does not allow to replace or replace the enzymes used.
Die DE 38 13 709 A1 beschreibt
eine Elektrode zur Bestimmung von Glucose in Körperflüssigkeiten und beinhaltet eine
Katalase enthaltende Polymermembran. Bei dieser Elektrode kann verbrauchtes
Enzym nur durch Austausch der kompletten, enzymhaltigen Polymermembran
ersetzt werden.The DE 38 13 709 A1 describes an electrode for the determination of glucose in body fluids and includes a catalase-containing polymer membrane. For this electrode, spent enzyme can only be replaced by replacing the complete enzyme-containing polymer membrane.
Alle
genannten Elektroden und Sensoren sind jedoch nicht für die Messung
physiologisch relevanter Konzentrationen in kleinsten Volumina biologischer
Proben geeignet.All
However, these electrodes and sensors are not for the measurement
physiologically relevant concentrations in the smallest volumes of biological
Suitable samples.
Das
Messprinzip vieler Sensoren beruht auf einer stöchiometrischen Umsetzung eines
Primäranalyten
zu einem Sekundäranalyten.
Biosensoren enthalten zu diesem Zweck häufig Enzyme, die einen bestimmten
Primäranalyten
spezifisch und quantitativ in einen Sekundäranalyten umsetzen. In vielen Fällen enthält die Messanordnung
einen Stromkreis, der auf die Konzentration bzw. Aktivität des Sekundäranalyten
reagiert und ein von dessen Konzentration abhängiges Messsignal liefert.
Bei potentiometrischen Sonden, die auf Grund der erforderlichen Messempfindlichkeit
Messsignale in der Größenordnung
von 50 μV
erkennen müssen,
muss der Stromkreis des Sensors von der Probe elektrisch isoliert sein,
damit das elektrische Potenzial der Probenflüssigkeit nicht das Messergebnis
verfälscht.
Vorteilhaft ist weiterhin, mit Hilfe geeigneter Membranen eine Verdünnung des
Sekundäranalyten
durch Hinausdiffundieren aus dem Sensor zu unterbinden. Silikone können chemisch
so beschaffen sein, dass sie elektrisch isolierende und (gas-)permeable
Eigenschaften vereinen. Die in der DE
102 39 264.1 beschriebene Silikondichtung für Mikrosonden
erfüllt
die Bedingung, elektrisch isolierende und (gas-)permeable Eigenschaften
auf kleinstem Raum zu vereinen, so dass eine Mikrosonde, die diese
Dichtung enthält,
die Bestimmung sehr ge ringer Gaskonzentrationen in sehr kleinen
Volumina gestattet. Die in S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle
(Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114) beschriebene Mikrosonde
sowie die in DE 102 39 264.1 beschriebene
Sonde mit Silikondichtung verwenden eine Enzymlösung, um den gasförmigen Primäranalyten
quantitativ und stöchiometrisch
in den zu messenden ionischen Sekundäranalyten umzusetzen. Allerdings
gestatten es diese Sondenausführungen
nicht, das Enzym auszutauschen und/oder nachzufüllen, so dass die Verwendbarkeit
der Sonden für
die Bestimmung von Gasen durch die Haltbarkeitsdauer des Enzyms
beschränkt ist.The measuring principle of many sensors is based on a stoichiometric conversion of a primary analyte to a secondary analyte. For this purpose, biosensors often contain enzymes that specifically and quantitatively convert a given primary analyte into a secondary analyte. In many cases, the measuring arrangement contains a circuit which responds to the concentration or activity of the secondary analyte and supplies a measurement signal dependent on its concentration. For potentiometric probes, which due to the required measurement sensitivity must detect measurement signals in the order of 50 μV, the sensor circuit must be electrically isolated from the sample so that the electrical potential of the sample fluid does not distort the measurement result. It is also advantageous, with the aid of suitable membranes to prevent dilution of the secondary analyte by outward diffusion from the sensor. Silicones can be chemically designed to combine electrically insulating and (gas) permeable properties. The in the DE 102 39 264.1 The described silicone gasket for microprobes fulfills the requirement to combine electrically insulating and (gas-) permeable properties in a small space, so that a microprobe containing this gasket allows the determination of very low gas concentrations in very small volumes. The microprobe described in S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle (Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114) as well as those described in U.S. Pat DE 102 39 264.1 The silicone seal probe described above uses an enzyme solution to quantitatively and stoichiometrically convert the primary gaseous analyte into the ionic secondary analyte to be measured. However, these probe designs do not allow the enzyme to be exchanged and / or replenished so that the availability of probes for the determination of gases is limited by the shelf-life of the enzyme.
[Aufgabe][Task]
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es, eine Mikrosonde zur enzymatischen
Messung von Gasen bereitzustellen, die es gestattet, niedrige Gaskonzentrationen
in kleinsten Volumina zu bestimmen sowie die Enzymlösung zu
entfernen, nachzufüllen und/oder
auszutauschen.task
The present invention is a microprobe for enzymatic
To provide measurement of gases that allows low gas concentrations
in the smallest volumes to determine and the enzyme solution too
remove, refill and / or
exchange.
[Lösung der Aufgabe][Solution of the task]
Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
Mikrosonden, die eine miniaturisierte Sondenspitze, eine elektrisch
isolierende und für
das zu messende Gas hoch permeable Dichtung und ein Reservoir für Flüssigkeiten
enthalten.These
The object is achieved by
Micro probes containing a miniaturized probe tip, an electric
insulating and for
the gas to be measured highly permeable seal and a reservoir for liquids
contain.
Unter „miniaturisiert" wird dabei eine
Sondenspitze verstanden, deren Außendurchmesser kleiner oder
gleich 5 μm
ist, wobei die Sondenspitze eine Silikondichtung enthält, welche
eine hohe Permeabilität
für den
zu messenden Analyten aufweist und elektrisch isolierende Eigenschaften
besitzt.Under "miniaturized" is doing a
Probe tip understood whose outer diameter is smaller or
equal to 5 microns
is, wherein the probe tip includes a silicone gasket, which
a high permeability
for the
has to be measured analytes and electrically insulating properties
has.
Unter „Reservoir
für Flüssigkeiten" wird dabei eine
Vorrichtung verstanden, die es gestattet, die Enzymlösung zu
entfernen, nachzufüllen
und/oder auszutauschen. Bevorzugt ist das Reservoir in Form einer
Durchflusskammer ausgebildet, die beispielsweise aus einem Behälter besteht,
in den je eine Einlass- und eine Auslassvorrichtung ragen. Besonders evorzugt
werden Einlass und Auslass miteinander kombiniert, indem die Sonde
mit nur einem Zugang versehen wird, durch den zum Befüllen und/oder Nachfüllen von
Enzymlösung
eine Einfüllkapillare eingeführt wird.Under "Reservoir
for liquids "becomes one
Device understood that allows the enzyme solution to
remove, refill
and / or exchange. Preferably, the reservoir is in the form of a
Flow chamber formed, for example, consists of a container,
in each of which an inlet and an outlet device protrude. Especially preferred
Inlet and outlet are combined with each other by the probe
is provided with only one access, by the filling and / or refilling of
enzyme solution
a filling capillary is introduced.
Die
vorliegende Erfindung stellt eine Weiterentwicklung der in S. Hanstein,
D. de Beer and H. Felle (Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114) beschriebenen
Mikrosonde sowie der Mikrosonde mit der in DE 102 39 264.1 beschriebenen Silikondichtung
dar, indem die vorliegende Erfindung den Austausch und/oder das
Nachfüllen
der Enzymlösung
gestattet. Durch die Möglichkeit,
die Enzymlösung
Austauschen und/oder Nachfüllen
zu können, ist
die erfindungsgemäße Mikrosonde
mehrfach verwendbar und besitzt im Vergleich zu bisher beschriebenen
Mikrosonden eine höhere
Lebensdauer, wodurch ein großer
Zeit- und Kostenvorteil erzielt wird.The present invention provides a further development of the microprobe described in S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle (Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114) as well as the microprobe with the in DE 102 39 264.1 described silicone seal by the present invention allows the replacement and / or refilling of the enzyme solution. Owing to the possibility of being able to exchange and / or top up the enzyme solution, the microprobe according to the invention can be used several times and has a longer service life in comparison to previously described microprobes, thereby achieving a great time and cost advantage.
Die
erfindungsgemäße Mikrosonde
findet Anwendung bei der enzymatischen Bestimmung von Substanzen
im Mikromaßstab.
Die Erfindung gestattet die Konstruktion sehr kleiner, hoch empfindlicher, selektiver
und mehrfach verwendbarer Sensoren, welche den Stoffwechsel biologischer
Proben nicht beeinträchtigen
oder verändern.
Sie ist geeignet für Mikrosonden,
die im zellbiologischen Bereich zum Einsatz kommen, z.B. zur Messung
der Konzentration von CO2 und O2 als
Steuergrößen des
zellulären Energiestoffwechsels
und der zellulären
Stoffaufnahme oder zur Messung der Bildung von CO2 und
NH3 in Infektionsherden an Wirtszellen oder
an mikrobiellen Pathogenen. Die erfindungsgemäße Mikrosonde enthält eine
in DE 102 39 264.1 beschriebene,
für den
Analyten hoch permeable Silikondichtung. Durch Dotieren des Elektrolyten
hinter der Silikondichtung mit einem geeigneten Enzym (vgl. DE 102 39 264.1 ) ist es
möglich,
einen bestimmten Primäranalyten
aus einer biologischen Probe selektiv zu einem Sekundäranalyten
umzusetzen. In Kombination mit einer geeigneten Messelektrode ist es
möglich,
den Sekundäranalyten
amperometrisch oder potentiometrisch zu messen. Bei Verwendung des
erfindungsgemäßen, als
Durchflusskammer ausgebildeten Reservoirs der Enzymelektrolytlösung ist
die Mikrosonde außerdem
mehrfach verwendbar und damit kostengünstiger als die bisher beschriebenen
Sonden dieser Art.The microprobe according to the invention is used in the enzymatic determination of substances on a microscale. The invention allows the construction of very small, highly sensitive, selective and reusable sensors that do not interfere or alter the metabolism of biological samples. It is suitable for micro-probes used in the field of cell biology, for example for measuring the concentration of CO 2 and O 2 as control variables of cellular energy metabolism and cellular uptake or for measuring the formation of CO 2 and NH 3 in infection sites on host cells or on microbial pathogens. The microprobe according to the invention contains an in DE 102 39 264.1 described, for the analyte highly permeable silicone gasket. By doping the electrolyte behind the silicone gasket with a suitable enzyme (see. DE 102 39 264.1 ), it is possible to selectively convert a given primary analyte from a biological sample to a secondary analyte. In combination with a suitable measuring electrode, it is possible to measure the secondary analyte amperometrically or potentiometrically. When using the reservoir according to the invention, designed as a flow chamber of the enzyme electrolyte solution, the microprobe is also reusable and thus cheaper than the previously described probes of this type.
Konstruktionsbedingt
eignet sich die erfindungsgemäße Mikrosonde
besonders für
mehrfach verwendbare Sonden, mit denen beispielsweise Kohlendioxid
hinter einzelnen Stomata (Spaltöffnungen) von
Pflanzenblättern
als Steuergröße von Öffnungs- und Schließbewegungen
der Stomata gemessen werden kann.By design
the microprobe according to the invention is suitable
especially for
Reusable probes with which, for example, carbon dioxide
behind individual stomata (stomata) of
plant leaves
as a control variable of opening and closing movements
the stomata can be measured.
Die
Bereitstellung der erfindungsgemäßen Mikrosonden
erfolgt durch die Herstellung zweier aufeinander abgestimmter Glas-Mikropipetten mit miniaturisierten
Spitzen aus kommerziell erhältlichen Glaskapillaren,
die Herstellung einer für
den Analyten permeablen, elektrisch isolierenden Silikondichtung in
einer ersten Mikropipette, das Anbringen eines Einlassröhrchens
(erstes Kapillarröhrchen)
an der Außenseite
einer zweiten Mikropipette, das Einschieben der zweiten in die erste
Mikropipette, darauf folgendes Einfügen eines zweiten Kapillarröhrchens (Auslassröhrchen)
und einer Referenzelektrode in den Hohlraum zwischen erster und
zweiter Mikropipette, Fixieren der ineinander geschobenen Teile
und Anbringen eines konventionellen Elektrodenhalters.The
Provision of the microprobes according to the invention
takes place by the production of two coordinated glass micropipettes with miniaturized
Tips from commercially available glass capillaries,
the production of a for
the analyte permeable, electrically insulating silicone gasket in
a first micropipette, attaching an inlet tube
(first capillary tube)
on the outside
a second micropipette, inserting the second into the first
Micropipette, then inserting a second capillary tube (outlet tube)
and a reference electrode in the cavity between the first and
second micropipette, fixing the nested parts
and attaching a conventional electrode holder.
Die
kommerziell erhältlichen
Glaskapillaren werden auf einer dem Fachmann bekannten Vorrichtung
zum Ausziehen von Glaskapillaren zu Mikropipetten gezogen. Für die äußere Glas-Mikropipette der
Sonde werden Glaskapillaren mit einem Außendurchmesser von 2,6 bis
3,4 mm und einem Innendurchmesser von 1,3 bis 1,7 mm eingesetzt,
die optional ein Innenfilament besitzen können.The
commercially available
Glass capillaries are on a device known in the art
pulled out to micropipettes to pull out glass capillaries. For the outer glass micropipette the
Probe will be glass capillaries with an outside diameter of 2.6 to
3.4 mm and an inner diameter of 1.3 to 1.7 mm,
which can optionally have an inner filament.
Dem
Fachmann ist bekannt, dass er üblicherweise
zwei Ausziehvorgänge
mit diesen Vorrichtungen durchführen
muss, um Kapillaren mit einem Durchmesser bis 2 mm zur Herstellung
von Mik ropipetten zu erhalten. Da auf Grund der üblichen Konstruktion der Ziehgeräte Kapillaren
mit einem Außendurchmesser
größer als
2 mm oft nicht in zwei Ausziehvorgängen zu einer Mikropipette
ausgezogen werden können,
ist das bereichsweise Verringern des Kapillardurchmessers auf etwa
2 mm durch einen vorgeschalteten Ziehvorgang bevorzugt. Durch zwei
weitere Ausziehvorgänge
wird der eingeengte Kapillarabschnitt zu einer Mikropipette mit
einem zwischen 2 und 5 μm
wählbaren
Außendurchmesser
der Spitze ausgezogen. Bei Messungen in Pflanzenblättern wird
der maximal mögliche
Durchmesser durch die jeweilige Öffnungsweite
der Blattporen (Stomata) bestimmt. Je kleiner der Außendurchmesser
ist, um so weniger beeinträchtigt
der Sondenkörper
den durch die Blattpore erfolgenden Gaswechsel. Andererseits steigt
die Meßempfindlichkeit
der Sonde mit dem Außendurchmesser.
In der Praxis wird der Außendurchmesser
der Sondenspitze so gewählt,
daß er
etwa 50% der zu erwartenden stomatären Öffnungsweite beträgt.The skilled worker is aware that it usually has to perform two Ausziehvorgänge with these devices in order to obtain capillaries with a diameter of up to 2 mm for the production of Mik ropipetten. Since capillaries with an outer diameter greater than 2 mm can often not be pulled out in two pull-out operations to form a micropipette due to the conventional design of the pullers, the partial reduction of the capillary diameter to about 2 mm by an upstream drawing operation is preferred. By two further pull-out operations, the constricted capillary section is pulled out to a micropipette with an outer diameter of the tip selectable between 2 and 5 μm. For measurements in plant leaves, the maximum possible diameter is determined by the respective opening width of the leaf pores (stomata). The smaller the outer diameter, the less the probe body affects the gas exchange occurring through the leaf pore. On the other hand, the measuring sensitivity of the probe increases with the outer diameter. In practice, the outer diameter of the probe tip is chosen so that it is about 50% of the expected stomatal opening width.
Anschließend wird
die Mikropipette 3 mit einer Lösung von 0,01-0,05%igem Tributylchlorsilan
in Chloroform nach einem dem Fachmann bekannten Verfahren innen
silanisiert.Subsequently, the micropipette 3 silanized with a solution of 0.01-0.05% tributylchlorosilane in chloroform according to a method known in the art.
Anschließend wird
eine Silikondichtung wie prinzipiell in DE 102 39 264.1 beschrieben hergestellt:
Das
Herstellungsverfahren ist abhängig
von den Spitzendimensionen der Sonde.Subsequently, a silicone gasket as in principle DE 102 39 264.1 prepared described:
The manufacturing process depends on the tip dimensions of the probe.
Für Sonden
mit einem Durchmesser kleiner als 4 μm wird das folgende Verfahren
eingesetzt:
Ein nicht vernetzendes Silikonöl 10 mit niedriger
Viskosität
wird in die Behälter-Kapillare 9 eingefüllt (siehe 2)
und diese waagerecht unter dem Objektiv 6 eines Mikroskops
montiert. Die frisch silanisierte Mikropipette 3 wird bis
zur Verjüngung
der Spitze mit sterilem destilliertem Wasser gefüllt. Hierzu wird die Spitze
in destilliertes Wasser getaucht und durch den Unterdruck auf eine
Länge von
etwa 1 mm mit Wasser gefüllt.
Der optionale Zusatz eines nichtionischen Tensids, beispielsweise
4 Vol-% n-Butanol, erleichtert das nachfolgende Einsaugen des Silikons.
Um während
des Einsaugens die Gefahr der Blockierung der Spitze durch Verunreinigungen
des Wassers zu minimieren, wird weiteres Wasser von hinten mit einer
Füllkapillare 13 zugegeben,
bis die Spitze bis zum Beginn der Verjüngung mit Wasser gefüllt ist. Dem
von hinten zugeführten
Wasser können
optional 50 ppm (w/v) Chloramphenicol zugesetzt werden.For probes less than 4 μm in diameter, the following procedure is used:
A non-crosslinking silicone oil 10 low viscosity is added to the container capillary 9 filled in (see 2 ) and this horizontally under the lens 6 mounted on a microscope. The freshly silanized micropipette 3 Is filled to the taper of the tip with sterile distilled water. For this purpose, the tip is dipped in distilled water and filled by the negative pressure to a length of about 1 mm with water. The optional addition of a nonionic surfactant, for example, 4% by volume of n-butanol, facilitates the subsequent suction of the silicone. In order to minimize the risk of blockage of the tip due to contamination of the water during the suction, more water is from the rear with a Füllkapillare 13 added until the tip is filled with water until the onset of rejuvenation. Optionally, 50 ppm (w / v) chloramphenicol can be added to the water supplied from the rear.
Die
mit Wasser gefüllte
abzudichtende Glas-Mikropipette 3 wird in die Behälter-Kapillare 9 eingeführt. Am
anderen Ende 8 der ersten Glas-Mikropipette 3 wird
der Adapterkopf 16 aufgesetzt (siehe 4),
an dessen Ende sich eine 50ml-Spritze 21 befindet. Die Gummidichtung 15 wird
mit Hilfe der Dichtungsschraube 14 am Ende 8 der
Glas-Mikropipette 3 befestigt. Anschließend wird die Adaptervorrichtung
am Metallrohr 17 in einen Mikromanipulator eingespannt.
Das Metallrohr 17 ist über
einen Kunststoffschlauch 18 und einen Dreiwegehahn 19 mit
einer 50ml-Spritze 21 mit Luerlock-Anschluss 20 verbunden.
Durch Schließen
des Dreiwegehahns 19 und Kolbenhub der Spritze 21 wird
ein Unterdruck erzeugt und unter mikroskopischer Kontrolle nicht
vernetzendes Silikon 10 in die Glas-Mikropipette 3 eingesaugt.
Da die Grenzflächenspannung
zwischen Silikonphase und wässriger
Phase in der Spitze 3 überwunden
werden muss, geschieht dies ruckartig. Dabei wird die notwendige
scharfe Phasengrenze ohne Ausbuchtungen nur dann erzielt, wenn die
wässrige Phase
proteinfrei ist. Überschüssiges Silikon
wird in zwei Schritten aus der Spitze heraus gedrückt: Zuerst wird
der Spritzenkolben so weit gesenkt, bis der Stopfen maximal fünfmal so
lang ist, wie er in der endgültigen
Dichtung sein soll. Anschließend
werden Glas-Mikropipette 3,
Adapter und Spritze aus der Behälter-Kapillare 9 entfernt.
Die Verkürzung
des Stopfens auf die endgültige
Länge der
Dichtung wird durch Senken des Spritzenkolbens vorgenommen, wobei überschüssiges nicht
vernetzendes Silikon 10 abläuft.The water-filled glass micropipette to be sealed 3 gets into the container capillary 9 introduced. On the other end 8th the first glass micropipette 3 becomes the adapter head 16 put on (see 4 ), at the end of which a 50ml syringe 21 is located. The rubber seal 15 is using the seal screw 14 at the end 8th the glass micropipette 3 attached. Subsequently, the adapter device on the metal tube 17 clamped in a micromanipulator. The metal pipe 17 is over a plastic hose 18 and a three-way stopcock 19 with a 50ml syringe 21 with Luerlock connection 20 connected. By closing the three-way stopcock 19 and piston stroke of the syringe 21 A negative pressure is generated and under microscopic control non-crosslinking silicone 10 into the glass micropipette 3 sucked. As the interfacial tension between silicone phase and aqueous phase in the top 3 must be overcome, this happens jerkily. The necessary sharp phase boundary without bulges is only achieved if the aqueous phase is protein-free. Excess silicone is forced out of the tip in two steps: First, lower the syringe plunger until the stopper is no more than five times as long as it should be in the final seal. Subsequently, glass micropipettes 3 , Adapter and syringe from the container capillary 9 away. The shortening of the plug to the final length of the seal is made by lowering the syringe plunger, with excess non-crosslinking silicone 10 expires.
Das
vernetzende Silikonöl 12 wird
auf den Halter 11 aufgetragen und in Kontakt mit der Glas-Mikropipette 3 gebracht,
die mit dem nicht vernetzenden Silikonöl 10 befüllt ist
(siehe 3). Der Halter 11 mit dem vernetzenden
Silikon 12 wird auf die Spitze der Glas-Mikropipette 3 zugeführt, und
das vernetzende Silikon 12 wirkt mindestens 5 Sekunden,
vorzugsweise 45 Sekunden auf das nicht vernetzende Silikonöl ein. Anschließend wird
die Glas-Mikropipette 3 aus dem vernetzenden Silikonöl 12 heraus
gezogen. Nach Erneuern des vernetzenden Silikonöls auf dem Halter 11 wird
der Vorgang, bestehend aus Zuführen
des Halters 11 mit vernetzendem Silikon 12 auf
die Spitze der Glas-Mikropipette 3, Einwirken des vernetzenden
auf das nicht vernetzende Silikonöl sowie Herausziehen der Glas-Mikropipette 3 aus
dem vernetzenden Silikonöl,
einmal wiederholt. Die Unterbrechnung der Einwirkung und die Begrenzung
auf zwei Anwendungen des vernetzenden Silikonöls 12 verhindern dessen
Haftung an der Außenseite
der Glas-Mikropipette 3 bzw.
das Herausziehen des Silikonölgemisches
aus der Spitze der Glas-Mikropipette 3 beim Entfernen der
Glas-Mikropipette 3 aus dem vernetzenden Silikonöl. Die Glas-Mikropipette 3 darf nicht
weiter als 10 μm
in das vernetzende Silikonöl 12 hinein
ragen, da sonst der Sondendurchmesser durch außen anhaftendes vernetzendes
Silikonöl
erhöht
wird. Durch das zweistufige Einfüllen
der Silikonöle
(zuerst das nicht vernetzende, dann das vernetzende Silikonöl) tritt
die Vernetzung erst dann ein, wenn sich die Silikonöle in der
korrekten Position innerhalb der Sondenspitze befinden. Die niedrige
Viskosität
des nicht vernetzenden Silikonöls
und die angegebene Silanisierung der Mikropipette 3 sind
Voraussetzungen für
die Platzierbarkeit des Gemisches aus beiden Silikonölen innerhalb
der Spitze der Glas-Mikropipette 3 mit einem Durchmesser
kleiner 4 μm.
Die Vermischung der beiden Silikonöle im Mikro-Maßstab wird
durch die Diffusionsbewegung der Silikonmoleküle geleistet.The cross-linking silicone oil 12 gets on the holder 11 applied and in contact with the glass micropipette 3 brought with the non-crosslinking silicone oil 10 filled (see 3 ). The holder 11 with the cross-linking silicone 12 gets to the top of the glass micropipette 3 supplied, and the crosslinking silicone 12 acts on the non-crosslinking silicone oil for at least 5 seconds, preferably 45 seconds. Subsequently, the glass micropipette 3 from the cross-linking silicone oil 12 pulled out. After renewing the cross-linking silicone oil on the holder 11 is the process consisting of feeding the holder 11 with cross-linking silicone 12 on top of the glass micropipette 3 , Exposure of the crosslinking to the non-crosslinking silicone oil and pulling out the glass micropipette 3 from the cross-linking silicone oil, repeated once. The interruption of the action and the limitation to two applications of the cross-linking silicone oil 12 prevent its adhesion to the outside of the glass micropipette 3 or the extraction of the silicone oil mixture from the tip of the glass micropipette 3 removing the glass micropipette 3 from the cross-linking silicone oil. The glass micropipette 3 must not exceed 10 μm in the cross-linking silicone oil 12 protrude, otherwise the probe diameter is increased by externally adhering cross-linking silicone oil. Due to the two-stage filling of the silicone oils (first the non-crosslinking, then the crosslinking silicone oil), the crosslinking does not occur until the silicone oils are in the correct position within the probe tip. The low viscosity of the non-crosslinking silicone oil and the indicated silanization of the micropipette 3 are prerequisites for the placement of the mixture of both silicone oils within the tip of the glass micropipette 3 with a diameter smaller than 4 μm. The mixing of the two silicone oils on a micro scale is achieved by the diffusion movement of the silicone molecules.
Im
Gegensatz zu DE 102 39 264.1 wird
keine enzymhaltige Lösung,
sondern steriles destilliertes Wasser 7 von hinten in diese
erste Glas-Mikropipette 3 gefüllt. Unter „hinten" wird dabei diejenige Oberfläche der
Silikondichtung verstanden, die der kleineren Öffnung der Mikropipette abgewandt
ist. Das Aushärten
der Silikondichtung erfolgt bei Raumtemperatur in etwa 2-6 Stunden
oder kann alternativ auch bei 40-80 °C in Anwesenheit von Feuchtigkeit
erfolgen, was den Aushärteprozess
um einige Stunden beschleunigt. Besonders bevorzugt sind Aushärtezeiten
von 4 Stunden bei Raumtemperatur bzw. 1 Stunde bei etwa 60 °C in Anwesenheit
von Feuchtigkeit.In contrast to DE 102 39 264.1 is not an enzyme-containing solution, but sterile distilled water 7 from behind in this first glass micropipette 3 filled. By "back" is meant that surface of the silicone gasket which faces away from the smaller opening of the micropipette.The curing of the silicone gasket takes place at room temperature in about 2-6 hours or alternatively can also take place at 40-80 ° C in the presence of moisture. which accelerates the curing process by a few hours, curing times of 4 are particularly preferred Hours at room temperature or 1 hour at about 60 ° C in the presence of moisture.
Für Sonden
mit einem Durchmesser der Sondenspitze größer oder gleich 4 μm wird das
folgende Verfahren eingesetzt: Auf die Verwendung nicht vernetzenden
Silikonöls 10 kann
verzichtet werden, indem die trockene, frisch silanisierte äußere Glas-Mikropipette 3 wie
oben beschrieben einmal in vernetzendes Silikonöl 12 getaucht wird.
Anschließend
härtet
die Silikondichtung wie oben beschrieben aus. Nach dem Aushärten der
Silikondichtung wird von hinten steriles destilliertes Wasser, das
bevorzugt 4 vol.-% n-Butanol enthält, in die Glas-Mikropipette 3 gefüllt. Die
Glas-Mikropipette 3 wird sofort mit dehnbarer Verschlussfolie,
beispielsweise Parafilm®, verschlossen und bei
4-8 °C gelagert,
bis die wässrige
Phase nach 12-36 h an die Dichtung gelangt ist.For probes with a diameter of the probe tip greater than or equal to 4 μm, the following procedure is used: On the use of non-crosslinking silicone oil 10 can be dispensed by using the dry, freshly silanized outer glass micropipette 3 Once in crosslinking silicone oil as described above 12 is dipped. Subsequently, the silicone gasket hardens as described above. After curing of the silicone gasket, sterile distilled water, which preferably contains 4% by volume of n-butanol, is introduced from the rear into the glass micropipette 3 filled. The glass micropipette 3 is immediately sealed with a stretchable sealing film, such as Parafilm ® , and stored at 4-8 ° C until the aqueous phase has reached the seal after 12-36 h.
Eine
zweite Glaskapillare mit Innenfilament wird in einem ein- oder zweistufigen
Verfahren zu einer Mikropipette ausgezogen, deren Spitzendimensionen
ein Platzieren innerhalb der Spitze der ersten Mikropipette gestatten
(siehe unten). Ein zweistufiges Ausziehen der zweiten Glaskapillare
ist dabei bevorzugt. Die Spitze der zweiten Pipette muss sich innerhalb
der ersten Mikropipette bis auf die unten angegebenen Distanzen
annähern
lassen. Die zweite Mikropipette wird nach dem dem Fachmann bekannten
Verfahren silanisiert S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle (Sensors
and Actuators 2001, B81, 107- 114).
Durch das Filament wird das Füllen
der Spitze mit einem dem Fachmann bekannten Protonen-sensitiven
hydrophoben Cocktail zur Herstellung der in S. Hanstein, D. de Beer
and H. Felle (Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114) beschriebenen pH-sensitiven
Mikroelektrode von hinten erleichtert, wobei unter hinten das Ende
der Glas-Mikropipette verstanden wird, welches den größeren Durchmesser
besitzt. (Cocktail: vergl. Ausführungsbeispiel Punkt 3, „Verfahren
zur Herstellung der pH-sensitiven Mikroelektrode") Die Silanisierung verhindert in der
zusammen gebauten Sonde das Eindringen von wässriger Lösung sowie Referenzpuffer (siehe
unten) in die Glasspitze. Anschließend wird die Glas-Mikropipette 25 wie
in DE 102 39 264.1 beschrieben
mit einer Lösung
aus einem Protonen sensitiven Cocktail und PVC in THF befüllt. Durch
Verdampfen des Lösungsmittels
THF bildet sich ein festes PVC-Gel.
Das feste PVC-Gel wird zunächst
mit unverdünntem
Protonen-sensitivem Cocktail und dann mit einem Referenzpuffer 24 überschichtet.A second inner filament glass capillary is pulled out in a one or two step process to a micropipette whose tip dimensions allow placement within the tip of the first micropipette (see below). A two-stage extraction of the second glass capillary is preferred. The tip of the second pipette must be within the first micropipette to reach the distances specified below. The second micropipette is silanized by the method known to those skilled in the art S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle (Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114). The filling of the tip with a proton-sensitive hydrophobic cocktail known to those skilled in the art is produced by the filament to produce the pH-sensitive ones described in S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle (Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114) Facilitated from the back of the microelectrode, where the rear end is the end of the glass micropipette, which has the larger diameter. (Cocktail: compare embodiment point 3 , "Method of Making the pH-Sensitive Microelectrode") Silanization in the assembled probe prevents the ingress of aqueous solution and reference buffer (see below) into the glass tip, and then the glass micropipette 25 as in DE 102 39 264.1 described with a solution of a proton-sensitive cocktail and PVC filled in THF. Evaporation of the solvent THF forms a solid PVC gel. The solid PVC gel is first diluted with undiluted proton-sensitive cocktail and then with a reference buffer 24 overlayed.
Bei
der vorliegenden Erfindung wird anschließend ein Einlassröhrchen 2 für Flüssigkeiten an
der Außenseite
dieser zweiten Glas-Mikropipette 25 angebracht und mit
einem Befestigungsmittel 22 fixiert. Als Einlassröhrchen eignet
sich eine handelsübliche
Kanüle.
Sie wird wie in 5 dargestellt mit Hilfe einer
Pinzette gebogen.In the present invention, then, an inlet tube 2 for liquids on the outside of this second glass micropipette 25 attached and with a fastener 22 fixed. The inlet tube is a commercially available cannula. It will be like in 5 shown bent with the help of tweezers.
Die
zweite Glas-Mikropipette 25 mit fixiertem Einlassröhrchen 2 wird
in die erste Glas-Mikropipette 3 eingefügt, aber noch nicht bis an
die Silikondichtung 23 vorgeschoben. Dann wird eine Referenzelektrode
sowie ggf. ein Auslassröhrchen 5 für Flüssigkeiten
(siehe oben) zwischen die beiden Glas-Mikropipetten geschoben. Danach wird
die zweite, innere Glas-Mikropipette 25 so
weit in die erste Glas-Mikropipette 3 eingeschoben, daß der Abstand
der Spitze der zweiten Pipette zur Spitze der ersten Pipette zwischen
5 und 100 μm
beträgt
etwa 5-25 μm
bei einem Außendurchmesser
der äußeren Pipette 3 größer oder
gleich 4 μm
und 25-100 μm
bei einem Außendurchmesser unter
4 μm. Dabei
ragt die innere Mikropipette 25 wie in DE 102 39 264.1 beschrieben an ihrem
der Silikondichtung abgewandten Ende um etwa 2,5 cm über die
erste, äußere Mikropipette 3 hinaus. Die
beiden Mikropipetten 3 und 25, das Auslassröhrchen 5 und
die Referenzelektrode 26 werden mit einem Befestigungsmittel 22 aneinander
befestigt. Der auf diese Weise entstandene Hohlraum zwischen äußerer (3)
und innerer (25) Mikropipette, in den Einlass- (2)
und ggf. Auslassröhrchen
(5) sowie die Referenzelektrode 26 ragen, bildet
die Sondenkammer 28 zum Einfüllen von Lösungen. Vorteilhaft ist die Verwendung
von speziellen handelsüblichen
Glasklebern als Befestigungsmittel, die durch UV-Licht innerhalb
von 12 h aushärten.The second glass micropipette 25 with fixed inlet tube 2 gets into the first glass micropipette 3 inserted, but not yet to the silicone seal 23 advanced. Then a reference electrode and possibly an outlet tube 5 for liquids (see above) pushed between the two glass micropipettes. After that, the second, inner glass micropipette 25 so far in the first glass micropipette 3 inserted, that the distance of the tip of the second pipette to the tip of the first pipette between 5 and 100 microns is about 5-25 microns with an outer diameter of the outer pipette 3 greater than or equal to 4 microns and 25-100 microns with an outer diameter less than 4 microns. The inner micropipette sticks out 25 as in DE 102 39 264.1 described at its end facing away from the silicone seal by about 2.5 cm above the first, outer micropipette 3 out. The two micropipettes 3 and 25 , the outlet tube 5 and the reference electrode 26 be with a fastener 22 attached to each other. The resulting cavity between external ( 3 ) and inner ( 25 ) Micropipette, into the inlet ( 2 ) and possibly outlet tubes ( 5 ) as well as the reference electrode 26 protrude, forms the probe chamber 28 for filling solutions. Advantageous is the use of special commercial glass adhesives as fasteners that cure by UV light within 12 h.
Das
heraus ragende Ende der zweiten Glas-Mikropipette 25 wird
nach Aushärten
des Befestigungsmittels mit einem konventionellen Elektrodenhalter 27 verbunden.
Die zweite Glas-Mikropipette 25,
der handelsübliche
Protonen-sensitive Cocktail und der Referenzpuffer (Elektrolyt) 24 bilden
gemeinsam mit einer einzubauenden Arbeitselektrode die pH-sensitive
Mikroelektrode 1. Vorteilhaft wird als Arbeitselektrode
ein konventioneller Elektrodenhalter verwendet, in den eine Elektrode
integriert ist und der es gestattet, die pH-sensitive Mikroelektrode mit einer weiteren
Elektrode zu verbinden.The protruding end of the second glass micropipette 25 after curing of the fastener with a conventional electrode holder 27 connected. The second glass micropipette 25 , the commercially available proton-sensitive cocktail and the reference buffer (electrolyte) 24 together with a working electrode to be incorporated form the pH-sensitive microelectrode 1 , Advantageously, a conventional electrode holder is used as the working electrode, in which an electrode is integrated and which makes it possible to connect the pH-sensitive microelectrode with another electrode.
Vor
dem Einsatz der Mikrosonde wird die Sondenkammer 28 mit
frischem Enzymelektrolyt 4 gespült. Der Zugang des Einlassröhrchens
bzw. die Zugänge
von Einlass- und Auslassröhrchen
werden mit einer Wasser undurchlässigen,
dem Fachmann bekannten Folie vor Verdunstung geschützt (beispielsweise
Parafilm, s. unten). Nach einer Equilibrierzeit von etwa 1h bei
weiten Spitzen bis 3h bei engen Spitzen bei Raumtemperatur kann
die Mikrosonde eingesetzt werden.Before using the microprobe, the probe chamber becomes 28 with fresh enzyme electrolyte 4 rinsed. The access of the inlet tube or the access of inlet and outlet tubes are protected from evaporation with a water-impermeable film known to the person skilled in the art (for example parafilm, see below). After a equilibration time of about 1h at wide peaks to 3h at narrow peaks at room temperature, the microprobe can be used.
Als
Ausgangsmaterial für
die Formung der aneinander angepassten Glas-Mikropipetten eignet sich
Borsilikatglas auf Grund seines niedrigeren Schmelzpunktes besser
als Aluminiumsilikatlgas. Chemisch widerstandsfähiger sind Aluminiumsilikat- und Quarzglas, deren
Formanpassung bedingt durch ihre höheren Schmelzpunkte die dem
Fachmann bekannten besonders leistungsfähigen Glas-Ziehgeräte erfordert.
Dabei können
die beiden Glas-Mikropipetten aus derselben oder aus verschiedenen
Glassorten bestehen.Borosilicate glass, due to its lower melting point, is better suited than aluminum silicate gas as a starting material for the shaping of the matched glass micropipettes. Chemically more resistant are aluminum silicate and quartz glass, the shape adaptation requires due to their higher melting points known to those skilled particularly efficient glass drawing equipment. The two glass micropipettes can consist of the same or different types of glass.
Als
nicht vernetzendes Silikonöl
kann beispielsweise ein nicht vernetzendes Silikonöl mit Trimethyl-Siloxy-Endgruppen
mit einer Viskosität
zwischen 0,02 und 0,2 Stokes verwendet werden, bevorzugt Dow Corning
Produkt (R) 200 Fluid mit einer Viskosität von 0,1 Stokes (25 °C) und einer
Aktivität
von 100 %.When
non-crosslinking silicone oil
For example, a non-crosslinking silicone oil having trimethyl-siloxy end groups
with a viscosity
between 0.02 and 0.2 Stokes, preferably Dow Corning
Product (R) 200 Fluid with a viscosity of 0.1 Stokes (25 ° C) and a
activity
of 100%.
Bei
dem vernetzenden Silikon handelt es sich bevorzugt um ein Gemisch
aus Dimethylsiloxan mit endständigen
Hydroxylgruppen und Trimethylsiloxan, beispielsweise um Dow Corning
Produkt (R) 1340 RTV Coating oder alternativ um Gemische aus einem
Silanol mit einer Viskosität
von 50-120 cSt, z.B. Dow Corning Produkt DC 2-1273, oder einem Silanol
mit einer Viskosität
von 2.000 cSt, z.B. Dow Corning Produkt DC 3-0133, jeweils gemischt
mit 5-10 Gew.-% Methyltrimethoxysiloxan.at
the crosslinking silicone is preferably a mixture
from dimethylsiloxane with terminal
Hydroxyl groups and trimethylsiloxane, for example to Dow Corning
Product (R) 1340 RTV Coating or alternatively mixtures of one
Silanol with a viscosity
from 50-120 cSt, e.g. Dow Corning product DC 2-1273, or a silanol
with a viscosity
of 2,000 cSt, e.g. Dow Corning Product DC 3-0133, mixed
with 5-10% by weight of methyltrimethoxysiloxane.
Als
Einlassröhrchen
kann beispielweise eine handelsübliche
Kanüle
mit einer Länge
von 25-45 mm und einem Durchmesser von 0,3-0,6 mm verwendet werden.When
inlet tubes
can, for example, a commercial
cannula
with a length
of 25-45 mm and a diameter of 0.3-0.6 mm.
Als
Auslassröhrchen
werden Kapillarröhrchen
verwendet, beispielsweise handelsübliche unbehandelte oder desaktivierte
Kapillarsäulen
für die Gaschromatographie
(„fused
silica, SiO2) mit einem Innendurchmesser
größer oder
gleich 100 μm
und 200-400 μm
Außendurchmesser.
Bei dem Sondentyp ohne separates Auslassröhrchen (siehe oben) wird zum
Befüllen
der Sondenkammer eine Einweg-Glaskapillare aus Borsilikatglas durch
die in die Sonde ragende Kanüle
eingeführt.
Die feine Glaskapillare mit einem entsprechenden Außendurchmesser
wird nach einem dem Fachmann bekannten Verfahren auf einem einstufigen
Ziehgerät
hergestellt.Capillary tubes are used as outlet tubes, for example commercially available untreated or deactivated capillary columns for gas chromatography (fused silica, SiO 2 ) with an inner diameter greater than or equal to 100 μm and 200-400 μm outer diameter. In the probe type with no separate outlet tube (see above), a borosilicate glass disposable glass capillary is inserted through the cannula projecting into the probe to fill the probe chamber. The fine glass capillary with a corresponding outer diameter is produced on a single-stage drawing apparatus by a method known to the person skilled in the art.
Als
Befestigungsmittel werden bevorzugt Cyanacrylat- oder spezielle,
durch UV-Licht härtende Glaskleber
verwendet. Für
die Fixierung des Einlassröhrchens
wird bevorzugt ein handelsüblicher
Cyanacrylatkleber verwendet, beispielsweise UHU-Sekundenkleber mit einer Viskosität von 70
mPa (UHU GmbH & Co.
KG, Bühl/Baden)
oder Tesa® Sekundenkleber
(Beiersdorf AG, Hamburg). Zum Befestigen der beiden Glas-Mikropipetten
aneinander kann beispielsweise der UV-Glaskleber (Greven Klebstoffe, Heddesheim,
Deutschland) oder alternativ der Methacrylatkleber Acrifix 192® (Röhm GmbH,
Darmstadt) verwendet werden.As fastening means preferably cyanoacrylate or special UV-curing glass adhesives are used. For fixing the inlet tube, a commercially available cyanoacrylate adhesive is preferably used, for example UHU super glue with a viscosity of 70 MPa (UHU GmbH & Co. KG, Bühl / Baden) or Scotch ® Super Glue (Beiersdorf AG, Hamburg). To attach the two glass micropipettes to each other, for example, the UV glass adhesive (Greven adhesives, Heddesheim, Germany) or alternatively the methacrylate adhesive Acrifix 192 ® (Röhm GmbH, Darmstadt) can be used.
Die
Enzymelektrolytlösung 4 dient
in der gebrauchsfertigen Mikrosonde dazu, einen Primäranalyten
quantitativ und stöchiometrisch
in einen Sekundäranalyten
umzusetzen, welcher anschließend
gemessen wird. Ein besonders geeignetes Enzym ist beispielsweise
Carboanhydrase.The enzyme electrolyte solution 4 used in the ready-to-use microprobe to quantitatively and stoichiometrically convert a primary analyte into a secondary analyte, which is then measured. A particularly suitable enzyme is, for example, carbonic anhydrase.
Das
Enzym kann mit geeigneten Oxidationsschutzmitteln stabilisiert werden.
Geeignete Oxidationsschutzmittel sind beispielsweise Ascorbinsäure, Glutathion,
Rosmarinsäure,
Benzoesäure
und Catechine.The
Enzyme can be stabilized with suitable antioxidants.
Suitable antioxidants are, for example, ascorbic acid, glutathione,
Rosemary acid,
benzoic acid
and catechins.
Als
Transducer zur Messung der Konzentration von Primär- oder
Sekundäranalyt
hinter der Silikondichtung kommen potentiometrische (pH, NH4 +) oder amperometrische
Mikrosonden zum Einsatz (vgl. S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle,
Sensors and Actuators 2001, B81, 107-114). Sie werden von dem Ende
her, das nicht mit der Dichtung versehen ist, in die Glas-Mikropipette 3 geschoben.Potentiometric (pH, NH 4 + ) or amperometric microprobes are used as transducers for measuring the concentration of primary or secondary analyte behind the silicone gasket (compare S. Hanstein, D. de Beer and H. Felle, Sensors and Actuators 2001, B81 , 107-114). They are inserted into the glass micropipette from the end not provided with the gasket 3 pushed.
Als
Referenzelektrode wird dabei eine Elektrode verwendet, die nicht
toxisch ist und ein Metall und dessen Salz enthält oder aus einem Metall und dessen
Salz besteht. Vorteilhaft wird eine Silber-Silberchlorid-Elektrode
als Referenzelektrode verwendet.When
Reference electrode while an electrode is used, not
is toxic and contains a metal and its salt or a metal and its
Salt exists. A silver-silver chloride electrode becomes advantageous
used as a reference electrode.
Als
Arbeitselektrode wird vorteilhaft ein konventioneller Elektrodenhalter
verwendet, in den eine Elektrode integriert ist, welche ein Metall
und dessen Salz enthält,
bevorzugt ein Edelmetall und dessen Salz.When
Working electrode is advantageously a conventional electrode holder
used, in which an electrode is integrated, which is a metal
and its salt contains,
preferably a precious metal and its salt.
[Ausführungsbeispiel][Embodiment]
1. Verfahren zum dreistufigen
Ausziehen der äußeren Glas-Mikropipette1. Method for three-stage
Extract the outer glass micropipette
Es
wird eine weitlumige äußere Glas-Mikropipette 3 aus
Borosilikatglas mit einem Innendurchmesser von 1,6 mm und einem
Außendurchmesser von
3 mm verwendet (z.B. von Fa. Hilgenberg GmbH, Malsdorf, Deutschland).
Das dreistufige Ausziehen erfolgt mit dem Vertikal-Ziehgerät LM-3/P-A
(List Medical, Göttingen,
Deutschland) mit 1 mm starker Standard-Heizwendel aus Pt/Ir (80/20,
jew. Gew.-%), Innendurchmesser der Wendel 4,5 mm.It becomes a wide-lipped outer glass micropipette 3 made of borosilicate glass with an inner diameter of 1.6 mm and an outer diameter of 3 mm used (eg from Fa. Hilgenberg GmbH, Malsdorf, Germany). The three-stage extraction takes place with the vertical puller LM-3 / PA (List Medical, Göttingen, Germany) with 1 mm thick standard heating coil of Pt / Ir (80/20, in each case% by weight), inner diameter of the helix 4 , 5 mm.
Innere
Glas-Mikropipette 25: Borsilikat, 1 mm AD, 0,5 mm ID, Clark
Electromedical Instruments, jetzt Harvard Apparatus, Holliston,
Ma, USA). 1. Zug von 16 mm Höhe
(oberer Anschlag) auf 5 mm Höhe
bei einem Strom von 21 A; Kapillare anschließend 7 mm höher im oberen Halter befestigen.
2. Zug von 12 mm Höhe
an unteren Anschlag (2 mm) bei einem Strom von 13 ± 0,5 A
je nach Wendelzustand und gewünschtem
Spitzendurchmesser. Äußere Glas-Mikropipette 3:
Borsilikat, 3 mm AD, 1,6 mm ID, Clark Electromedical Instruments,
jetzt Harvard Apparatus, Holliston, Ma, USA). 1. Zug von 16 mm Höhe auf 12
mm Höhe
bei 21 A; Kapillare anschließend
1,5 mm höher
in oberem Halter befestigen. 2. Zug von 13,5 mm auf 7 mm bei 21
A; Kapillare (danach?) 5 mm höher
in oberem Halter befestigen. 3. Zug von 12 mm an unteren Anschlag
bei 12,6 ± 0,5
A je nach Wendelzustand und gewünschtem
Spitzendurchmesser.Inner glass micropipette 25 : Borosilicate, 1 mm OD, 0.5 mm ID, Clark Electromedical Instruments, now Harvard Apparatus, Holliston, Ma, USA). 1. pull from 16 mm height (upper stop) to 5 mm height at a current of 21 A; Then fix the capillary 7 mm higher in the upper holder. 2. Pull from 12 mm height to bottom stop (2 mm) at a current of 13 ± 0.5 A depending on coil condition and desired tip diameter. Outer glass micropipette 3 : Borosilicate, 3mm OD, 1.6mm ID, Clark Electromedical Instruments, now Harvard Ap paratus, Holliston, Ma, USA). 1. pull from 16 mm height to 12 mm height at 21 A; Then secure the capillary 1.5 mm higher in the upper holder. 2. pull from 13.5 mm to 7 mm at 21 A; Fix capillary (after?) 5 mm higher in upper holder. 3. Pull from 12 mm to bottom stop at 12.6 ± 0.5 A depending on coil condition and desired tip diameter.
Vor
Herstellung der Dichtung werden die Mikropipetten 3 und 25 wie
beschrieben innen silanisiert.Before making the seal, the micropipettes 3 and 25 silanized inside as described.
2. Verfahren zur Herstellung
der Dichtung2. Process for the preparation
the seal
Die
frisch silanisierte Mikrokapillare wird wie beschrieben mit sterilem
destilliertem Wasser gefüllt und
die Silikondichtung wie beschrieben hergestellt. Als nicht vernetzendes
Silikonöl
wird Dow Corning Produkt 200 (R) Fluid mit einer Viskosität von 0,1 Stokes
(25 °C)
und einer Aktivität
von 100 eingesetzt. Die verwendete Behälterkapillare 9 hat
einen Innendurchmesser von 2 mm. Als vernetzendes Silikonöl dient
Dow Corning Produkt (R) 1340 RTV Coating.The fresh silanized microcapillary is filled with sterile distilled water as described and the silicone gasket made as described. As a non-crosslinking silicone oil, Dow Corning Product 200 (R) Fluid having a viscosity of 0.1 Stokes (25 ° C) and an activity of 100 is used. The container capillary used 9 has an inside diameter of 2 mm. The crosslinking silicone oil is Dow Corning Product (R) 1340 RTV Coating.
3. Verfahren zur Herstellung
der pH-sensitiven Mikroelektrode3. Process for the preparation
the pH-sensitive microelectrode
Eine
weitere Glas-Mikropipette 25 (Außendurchmesser 1 mm, Innendurchmesser
0,5 mm) aus Borosilikatglas oder chemisch widerstandsfähigerem Aluminium-Silikatglas,
beide mit Innenfilament, wird wie oben beschrieben silanisiert.
Ein dem Fachmann bekannter Protonen-sensitiver hydrophober Cocktail, bevorzugt
Fluka Produkt #95297, Hydrogen ionophore II-Cocktail A, Selectophore®,
wird in einem Gemisch aus 40 mg PVC/ml THF im Verhältnis 30:70 (V/V)
gelöst.
Diese (hydrophobe) Lösung
wird mit Hilfe einer Füllkapillare
von hinten in die zweite Glas-Mikropipette eingefüllt. Durch
die Verdunstung des THF bildet sich ein festes PVC-Gel. Das feste
PVC-Gel wird zunächst
mit unverdünntem
Protonen-sensitivem Cocktail überschichtet,
anschließend
mit Referenzpuffer. Referenzpuffer: 100 mM 2-[N-Morpholino-]ethansulfonsäure wird
mit einer Lösung
von 100 mM Tris(hydroxymethyl)-aminomethan gemischt und auf pH 8,3
eingestellt, dann werden 100 mM KCl hinzugefügt. Als Arbeitselektrode wird
ein konventioneller Elektrodenhalter verwendet, in den eine Elektrode integriert
ist und der es gestattet, die pH-sensitive Mikroelektrode mit einer
weiteren Elektrode zu verbinden.Another glass micropipette 25 (Outer diameter 1 mm, inner diameter 0.5 mm) of borosilicate glass or more chemically resistant aluminum silicate glass, both with internal filament, is silanized as described above. A well-known to those skilled in proton-sensitive hydrophobic cocktail, preferably Fluka Product # 95297, hydrogen ionophore II Cocktail A, Selectophore ® is a mixture of 40 mg in PVC / ml THF in a ratio of 30:70 (V / V). This (hydrophobic) solution is filled with the aid of a filling capillary from behind into the second glass micropipette. The evaporation of the THF forms a solid PVC gel. The solid PVC gel is first overcoated with undiluted proton-sensitive cocktail, then with reference buffer. Reference Buffer: 100mM 2- [N-morpholino] ethanesulfonic acid is mixed with a solution of 100mM tris (hydroxymethyl) aminomethane and adjusted to pH 8.3, then 100mM KCl is added. As a working electrode, a conventional electrode holder is used, in which an electrode is integrated and which makes it possible to connect the pH-sensitive microelectrode with another electrode.
4. Herstellung der Referenzelektrode4. Preparation of the reference electrode
Als
Referenzelektrode 26 (Einbau in die erste Glas-Mikropipette) wird
eine Silber-Silberchlorid-Elektrode verwendet. Herstellung: Ca.
1 mm der Teflonbeschichtung eines Teflon-beschichteten Silberdrahtes
(Durchmesser des Silberkerns 100 μm) werden
durch Hitze abgelöst
und die blanke Silberspitze 3 Minuten bei 100 μA in einer
3M KCl-Lösung chloridiert.As a reference electrode 26 (Incorporation into the first glass micropipette), a silver-silver chloride electrode is used. Production: Approx. 1 mm of the Teflon coating of a Teflon-coated silver wire (diameter of the silver core 100 microns) are removed by heat and the bare silver tip 3 Chlorinated at 100 μA for minutes in a 3M KCl solution.
5. Herstellung der Mikrosonde5. Preparation of the microprobe
Der
Zusammenbau erfolgt wie oben beschrieben. An die pH-sensitive Mikroelektrode 1 wird mittels
Cyanacrylatkleber (Bsp.: Tesa® Sekundenkleber (Beiersdorf
AG, Hamburg, Deutschland); UHU-Sekundenkleber (Viskosität 70 mPa;
UHU GmbH & Co.
KG, Bühl/Baden,
Deutschland) ein Einlassröhrchen 2,
z.B. in Form einer gebogenen Kanüle (Bsp.:
1 Sterican®,
0,4 × 40
mm (B. Braun Melsungen AG, Melsungen) fixiert. Beispiele für Auslassröhrchen 5 sind:
Fused Silica-Kapillarrohr unbehandelt, ID 0,15 mm, AD 0,22 mm (Best.-Nr.
0642472) oder Fused Silica-Kapillarrohr desaktiviert (unpolar) ID 0,15
mm, AD 0,22 mm (Best.-Nr. 06424460), SGE (Deutschland) GmbH, Darmstadt;
Fused-Silica Kapillaren unbehandelt, ID 0,1 mm, AD 0,363 mm (Art. 23735)
oder Fused-Silica Kapillaren desaktiviert (unpolar), ID 0,1 mm,
AD 0,363 mm (Art. 25740-U), Supelco, Taufkirchen, Deutschland. Vor
dem Befestigen der beiden Glas-Mikropipetten kann das Auslassröhrchen mit
Kleber an der inneren Glas-Mikropipette befestigt werden. Alternativ
ist es möglich,
statt Einlass und Auslass nur einen einzigen Zugang, z.B. eine Kanüle, an der
inneren Glas-Mikropipette zu befestigen. Zum späteren Befüllen kann dieser Zugang für das Einführen eines
Einlassröhrchens
verwendet werden. Mit Hilfe des Adapters (4) kann
Flüssigkeit
durch das Einlassröhrchen
in die fertige Mikrosonde gebracht werden. Druck- und Flüssigkeitsausgleich
erfolgen dabei über
den einfach ausgeführten Zugang.The assembly takes place as described above. To the pH-sensitive microelectrode 1 by means of cyanoacrylate glue (ex .: Tesa ® superglue (Beiersdorf AG, Hamburg, Germany); UHU superglue (viscosity 70 mPa; UHU GmbH & Co. KG, Bühl / Baden, Germany), an inlet tube 2 , For example in the form of a curved cannula (Ex .: 1 Sterican ®, 0.4 × 40 mm (B. Braun Melsungen AG fixed, Melsungen). Examples of outlet tubes 5 are: fused silica capillary tube untreated, ID 0.15 mm, OD 0.22 mm (stock number 0642472) or fused silica capillary tube deactivated (non-polar) ID 0.15 mm, OD 0.22 mm (Cat. No. 06424460), SGE (Germany) GmbH, Darmstadt; Fused silica capillaries untreated, ID 0.1 mm, OD 0.363 mm (item 23735) or fused silica capillaries deactivated (nonpolar), ID 0.1 mm, OD 0.363 mm (item 25740-U), Supelco, Taufkirchen , Germany. Before attaching the two glass micropipettes, the outlet tube can be attached to the inner glass micropipette with adhesive. Alternatively, instead of the inlet and outlet, it is possible to attach only a single access, eg a cannula, to the inner glass micropipette. For later filling this access can be used for insertion of an inlet tube. With the help of the adapter ( 4 ) liquid can be brought through the inlet tube into the finished microprobe. Pressure and fluid compensation take place via the simple access.
Die
beiden Glas-Mikropipetten werden mit Kleber, vorzugsweise UV Glaskleber
(Greven Klebstoffe, Heddesheim, Deutschland) aneinander befestigt.
Der Kleber härtet
durch Beleuchtung mit einer UV-Lampe in 12 h aus. Das freie, der
Spitze abgewandte Ende der zweiten Glas-Mikropipette 25 wird anschließend in
einen konventionellen Elektrodenhalter eingeführt. Dieser Elektrodenhalter
enthält
ein in Kunststoff gefasstes Ag-AgCl-Plättchen,
das als Arbeitselektrode (siehe oben) dient.The two glass micropipettes are attached to each other with adhesive, preferably UV glass adhesive (Greven adhesives, Heddesheim, Germany). The adhesive cures by illumination with a UV lamp in 12 h. The free, tip-remote end of the second glass micropipette 25 is then inserted into a conventional electrode holder. This electrode holder contains a plastic Ag AgCl plate, which serves as a working electrode (see above).
Derjenige
Bereich der äußeren Glas-Mikropipette,
in dem sich die chloridierte Spitze der Silberelektrode befindet,
wird mit einem 5 mm breiten Ring aus Acrylfarbe versehen, da das
elektrische Potential an der Ag/AgCl-Elektrode lichtsensitiv ist.
Die Sonde ist jetzt transport- und lagerfähig.The one
Area of the outer glass micropipette,
where the chlorided tip of the silver electrode is located,
is provided with a 5 mm wide ring of acrylic paint, as the
electrical potential on the Ag / AgCl electrode is light-sensitive.
The probe is now transportable and storable.
Um
die Mikrosonde zur CO2-Messung zu verwenden,
wird die Sondenkammer 28 mit einer Carboanhydrase-Lösung gespült. Hierzu
werden zunächst
eine 1%-ige Stocklösung
von Chloramphenicol in Ethanol, eine Pufferlösung aus 1 mM NaHCO3 und 100 mM NaCl (pH 8,3) und eine 0,1 M
neutrale Na-Ascorbat-Lösung
(Antioxidationsmittel) hergestellt. Die Enzymlösung wird anschließend aus
0,4 ml der beschriebenen NaHCO3-Pufferlösung, 3
mg lyophilisierter Carboanhydrase (Serva, Heidelberg, Deutschland),
2 μl Chloramphenicol-Stocklösung und
4 μl einer
0,1 M Na-Ascorbat-Lösung,
die mit KOH auf pH 8,3 voreingestellt wurde, angesetzt. Diese Lösung wird
in eine sterile 1 ml-Einwegspritze
aufgenommen und zum Spülen
und Füllen
der Sondenkammer 28 verwendet. Nach Abnehmen der Spritze werden
Einlass und Auslass der Sonde mit Parafilm® (American
National Can, Neenah, USA) verschlossen. Nach einer dreistündigen Equilibrierung
bei Raumtemperatur ist die Sonde einsatzfähig. Lagerung erfolgt im Kühlschrank
bei 4-8°C.To use the microprobe for CO 2 measurement, the probe chamber 28 rinsed with a carbonic anhydrase solution. For this purpose, first a 1% stock solution of chloramphenicol in ethanol, a buffer solution of 1 mM NaHCO 3 and 100 mM NaCl (pH 8.3) and a 0.1 M neutral Na ascorbate solution (antioxidant). The enzyme solution is then extracted from 0.4 ml of the described NaHCO 3 buffer solution, 3 mg of lyophilized carbonic anhydrase (Serva, Heidelberg, Germany), 2 .mu.l of chloramphenicol stock solution and 4 .mu.l of a 0.1 M Na ascorbate solution treated with KOH was preset to pH 8.3. This solution is taken up in a sterile 1 ml disposable syringe and used to rinse and fill the probe chamber 28 used. After removing the syringe inlet and outlet be closed the probe with Parafilm ® (American National Can, Neenah, United States). After 3 hours of equilibration at room temperature, the probe is ready for use. Store in the refrigerator at 4-8 ° C.
[Abbildungslegenden][Figure legends]
1 Schematische
Darstellung der erfindungsgemäßen nachfüllbaren
Mikrosonde: Zwischen einer äußeren Glas-Mikropipette 3 und
einer als pH-sensitive Mikroelektrode 1 ausgebildeten inneren Glas-Mikropipette 25 sind
ein Einlass- 2 und ein Auslassröhrchen 5 angebracht,
die das Einfüllen,
Nachfüllen
und/oder Austauschen der Enzymelektrolytlösung in der Sondenkammer 28 gestatten.
Der eingezeichnete 3mm-Balken ist als Maßstab zu verstehen. 1 Schematic representation of the refillable microprobe according to the invention: Between an outer glass micropipette 3 and one as a pH-sensitive microelectrode 1 trained inner glass micropipette 25 are an admission 2 and an outlet tube 5 attached, the filling, refilling and / or replacing the enzyme electrolyte solution in the probe chamber 28 allow. The drawn 3mm bar is to be understood as a scale.
2 Schematische
Darstellung der Einbringung des nicht vernetzenden Silikonöls 10 in
die Glas-Mikropipette 3 unter mikroskopischer Kontrolle 6.
Die Spitze der Glas-Mikropipette 3 ist mit destilliertem
Wasser 7 gefüllt.
Der Adapter wird am hinteren Ende 8 der Kapillare aufgesetzt.
Die wassergefüllte Glas-Mikropipette
wird in die Behälter-Kapillare 9 mit dem
Silikonöl 10 eingeführt. Durch
Kolbenhub der Adapterspritze (s. 4) wird
ein Unterdruck erzeugt und Silikonöl 10 in die Glas-Mikropipette 3 gesaugt. 2 Schematic representation of the introduction of the non-crosslinking silicone oil 10 into the glass micropipette 3 under microscopic control 6 , The tip of the glass micropipette 3 is with distilled water 7 filled. The adapter will be at the back end 8th placed on the capillary. The water-filled glass micropipette is placed in the container capillary 9 with the silicone oil 10 introduced. By piston stroke of the adapter syringe (s. 4 ) creates a negative pressure and silicone oil 10 into the glass micropipette 3 sucked.
3:
Schematische Darstellung des Einbringens des vernetzenden Silikonöls 12.
Die Abbildung fasst zwei Abläufe
zusammen. Zunächst (rechts
dargestellt) wird das bereits durch die Spitze von 3 eingesaugte
sterile destillierte Wasser von hinten mit Hilfe einer Füllkapillare
aufgefüllt
bis zum Beginn der Verjüngung
von 3, wobei unter „hinten" diejenige Öffnung der
Glas-Mikropipette verstanden wird, welche den größeren Durchmesser besitzt. Dann
(links gezeigt) wird auf den Halter 11 aufgetragenes Silikonöl mit der
Glas-Mikropipette 3 in Kontakt gebracht. 3 : Schematic representation of the introduction of the crosslinking silicone oil 12 , The illustration summarizes two processes. First (shown on the right), the sterile distilled water already aspirated through the tip of Fig. 3 is filled from the rear with the aid of a filling capillary until the beginning of the tapering of Fig. 3, "back" being understood to mean the opening of the glass micropipette having the larger diameter Then (left shown) is on the holder 11 applied silicone oil with the glass micropipette 3 brought into contact.
4 Darstellung
im Querschnitt: Adapter zum Einsaugen von nicht vernetzendem Silikonöl 10 in
die Spitze einer Glas-Mikropipette 3.
Der Adapter besteht aus Dichtungsschraube 14, Gummidichtung 15,
Adapterkopf 16, einem Metallrohr 17 zum Einspannen
des Adapters in den Mikromanipulator und einem Kunststoffschlauch 18.
Der Kunststoffschlauch 18 ist mit einem Dreiwegehahn 19 zum
Be- und Entlüften
verbunden; der Dreiwegehahn 19 hat über einen Luerlock-Anschluss 20 Verbindung
zu einer 50 ml-Spritze 21. 4 Representation in cross section: Adapter for sucking in non-crosslinking silicone oil 10 in the tip of a glass micropipette 3 , The adapter consists of sealing screw 14 , Rubber seal 15 , Adapter head 16 a metal pipe 17 for clamping the adapter in the micromanipulator and a plastic tube 18 , The plastic hose 18 is with a three-way tap 19 connected to the ventilation and venting; the three-way tap 19 has a Luerlock connection 20 Connection to a 50 ml syringe 21 ,
5 Schematische
Darstellung der fertigen Mikrosonde: Die Mikrosonde besteht aus
zwei konzentrischen, ineinander geschobenen Glas-Mikropipetten (3 und 25).
Die innere Glas-Mikropipette 25 enthält einen mit Referenzpuffer 24 überschichteten Protonen
sensitiven Cocktail. Innere Glas-Mikropipette 25, mit Referenzpuffer überschichteter
Protonen-sensitiver Cocktail und Arbeitselektrode bilden gemeinsam
die pH-sensitive Mikroelektrode 1. Dabei wird als Arbeitselektrode
bevorzugt eine solche Elektrode verwendet, wie sie in einen konventionellen Elektrodenhalter
integriert ist (vgl. 27). Die pH-sensitive Mikroelektrode 1 wird
in der Spitze der äußeren Glas-Mikropipette 3 positioniert.
Die Spitze der pH-sensitiven Mikroelektrode (1) befindet
sich dabei etwa 20 μm
hinter der Spitze der äußeren Glas-Mikropipette 3,
die mit einer Silikondichtung 23 verschlossen ist. Der
Raum zwischen äußerer Glas-Mikropipette 3 und
pH-sensitiver Mikroelektrode 1 ist mit einer Enzymlösung 4 gefüllt. Eine
Referenzelektrode 26 verbindet die Enzymlösung 4 mit
der Erdung. Vor dem Zusammenbau von äußerer 3 und innerer 25 Glas-Mikropipette
wird an der Außenseite
der inneren Glas-Mikropipette ein Einlassröhrchen 2 befestigt,
das in der fertigen Mikrosonde das Einfüllen, Nachfüllen bzw. Austauschen von Enzymlösung 4 gestattet.
Dann werden die beiden Glas-Mikropipetten ineinandergescho ben, wobei
die innere Mikropipette 25 noch nicht bis an die Silikondichtung 23 geschoben
wird. Anschließend
kann ggf. ein Auslassröhrchen 5 zwischen
die beiden Mikropipetten geschoben werden, bevor die innere Glas-Mikropipette 25 bis
an die Silikondichtung 23 vorgeschoben wird. Beide Glas-Mikropipetten
(3 und 25), Einlass- 2 und ggf. Auslassröhrchen 5 werden
mit Hilfe eines Befestigungsmittels 22 aneinander befestigt.
Das hintere Ende 27 der pH-sensitiven Mikroelektrode wird
mit einem konventionellen Elektrodenhalter verbunden. 5 Schematic representation of the finished microprobe: The microprobe consists of two concentric, telescoped glass micropipettes ( 3 and 25 ). The inner glass micropipette 25 contains one with reference buffer 24 Overlaid proton-sensitive cocktail. Inner glass micropipette 25 , proton-sensitive cocktail coated with reference buffer and working electrode together form the pH-sensitive microelectrode 1 , In this case, the electrode used is preferably such an electrode as is integrated in a conventional electrode holder (cf. 27 ). The pH-sensitive microelectrode 1 gets in the top of the outer glass micropipette 3 positioned. The tip of the pH-sensitive microelectrode ( 1 ) is located about 20 microns behind the tip of the outer glass micropipette 3 that with a silicone gasket 23 is closed. The space between outer glass micropipette 3 and pH-sensitive microelectrode 1 is with an enzyme solution 4 filled. A reference electrode 26 connects the enzyme solution 4 with grounding. Before the assembly of outside 3 and inner 25 Glass micropipette becomes an inlet tube on the outside of the inner glass micropipette 2 attached, which in the finished microprobe filling, replenishment or replacement of enzyme solution 4 allowed. Then the two glass micropipettes are pushed together, with the inner micropipette 25 not yet to the silicone seal 23 is pushed. Then, if necessary, an outlet tube 5 be pushed between the two micropipettes before the inner glass micropipette 25 to the silicone seal 23 is advanced. Both glass micropipettes ( 3 and 25 ), Admission 2 and possibly outlet tubes 5 be using a fastener 22 attached to each other. The back end 27 The pH-sensitive microelectrode is connected to a conventional electrode holder.
6 Schematische
Darstellung der Spitze der fertigen Mikrosonde: In der Spitze der äußeren, ersten
Glas-Mikropipette 3 befindet sich eine Silikondichtung 23.
Der Raum hinter dieser Silikondichtung 23 ist mit Enzymelektrolyt 4 gefüllt. In
der Spitze der zweiten Glas-Mikropipette 25 befindet sich
ein Protonen-sensitiver Cocktail 24. Einlass- 2 und
Auslassröhrchen 5 für den Enzymelektrolyten 4 befinden
sich im Zwischenraum zwischen den beiden Glaskapillaren 3 und 25. 6 Schematic representation of the tip of the finished microprobe: In the tip of the outer, first glass micropipette 3 there is a silicone seal 23 , The space behind this silicone seal 23 is with enzyme electrolyte 4 filled. In the top of the second glass micropipette 25 there is a proton-sensitive cocktail 24 , Inlet- 2 and outlet tubes 5 for the enzyme electrolyte 4 are located in the space between the two glass capillaries 3 and 25 ,
Die
erste, äußere Glas-Mikropipette
verjüngt sich
in zwei Stufen. Einlass- und Auslassröhrchen enden noch vor dem Beginn
der ersten Verjüngungen. 5 zeigt
die erste Verjüngung.
Die zweite Verjüngung
ist nur in 6 zu sehen.The first, outer glass micropipette tapers in two stages. Inlet and outlet tubes end before the beginning of the first tapers. 5 shows the first rejuvenation. The second rejuvenation is only in 6 to see.
-
11
-
pH-sensitive
MikroelektrodepH-sensitive
microelectrode
-
22
-
Einlassröhrchen (erstes
Kapillarröhrchen)Inlet tube (first
capillary)
-
33
-
äußere Glas-Mikropipette
(erste Pipette)outer glass micropipette
(first pipette)
-
44
-
Enzym(elektrolyt-)lösungEnzyme (electrolyte) solution
-
55
-
Auslassröhrchen (zweites
Kapillarröhrchen)Outlet tube (second
capillary)
-
66
-
Objektiv
des Mikroskopslens
of the microscope
-
77
-
steriles
destilliertes Wassersterile
distilled water
-
88th
-
Stelle
zum Ansetzen des AdaptersJob
for attaching the adapter
-
99
-
Behälter-KapillareContainer capillary
-
1010
-
nicht
vernetzendes SilikonNot
Crosslinking silicone
-
1111
-
Halterholder
-
1212
-
vernetzendes
Silikoncrosslinking
silicone
-
1313
-
Füllkapillare
mit sterilem destilliertem Wasserfilling capillary
with sterile distilled water
-
1414
-
Dichtungsschraubesealing screw
-
1515
-
Gummidichtungrubber seal
-
1616
-
Adapterkopfadapter head
-
1717
-
Metallrohr
zum Einspannen des Adapters in den Mikromanimetal pipe
for clamping the adapter into the micromani
-
-
pulatorpulator
-
1818
-
Kunststoffschlauch
(nur Anfang und Ende eingezeichnet)Plastic tube
(only beginning and end drawn in)
-
1919
-
DreiwegehahnThree-way valve
-
2020
-
Luerlock-AnschlussLuer lock connector
-
2121
-
Spritze
(50 ml)syringe
(50 ml)
-
2222
-
Befestigungsmittelfastener
-
2323
-
Silikondichtungsilicone packing
-
2424
-
Elektrolyt
der pH-sensitiven Mikroelektrode (Referenzpufelectrolyte
the pH-sensitive microelectrode (reference puf
-
-
fer)fer)
-
2525
-
innere
Glas-Mikropipette (zweite Pipette)inner
Glass micropipette (second pipette)
-
2626
-
Referenzelektrodereference electrode
-
2727
-
Stelle
zum Ansetzen des ElektrodenhaltersJob
for attaching the electrode holder
-
2828
-
Sondenkammer
zum Einfüllen
von Enzym(elektrolyt)-Lösungprobe chamber
for filling
of enzyme (electrolyte) solution
