DE10343798A1 - New 2-thio-1,4-naphthoquinone derivatives, obtained by culturing alpha-Proteobacterium MBIC3368, are angiogenesis inhibitors useful e.g. for combating tumor diseases and neointimal hyperplasia - Google Patents

New 2-thio-1,4-naphthoquinone derivatives, obtained by culturing alpha-Proteobacterium MBIC3368, are angiogenesis inhibitors useful e.g. for combating tumor diseases and neointimal hyperplasia Download PDF

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Abstract

2-Thio-1,4-naphthoquinone derivatives (I) and their salts and solvates are new. 2-Thio-1,4-naphthoquinone derivatives of formula (I) and their salts and solvates are new. [Image] R 1>H; 1-18C alkyl or 2-18C alkenyl (both linear, branched or cyclic and optionally mono- or polysubstituted); or acyl (e.g. CHO, COMe, COCCl 3, fumaryl, maleyl, succinyl, benzoyl or branched or heteroatom- or aryl-substituted acyl); R 2>- R 6>as for R 1>; optionally cyclic alkoxy (e.g. 1-4C alkoxy); alkylthio (e.g. SMe or SEt); sulfonyl group (e.g. SO 3H, SO 2Me, SO 2CF 3, SO 2C 6H 4CH 3or SO 2C 6H 4CH 2Br); nitrogen-containing substituent (e.g. NH 2, NHR, NRR', NC or NO 2); or halo, CN or hetero-substituent; R, R' : alkyl, aryl, heteroaryl or alkenyl. An independent claim is included for the preparation of (I). ACTIVITY : Cytostatic; Antibacterial; Vasotropic. 2-Methylthio-1,4-naphthoquinone (Ia) had D 500.07 Microg/ml for inhibition of proliferation of L5178y (mouse lymphoma) cells. MECHANISM OF ACTION : Thrombospondin (TSP) binding ligand; CD36-TSP system modulator; angiogenesis inhibitor.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue bioaktive Verbindungen aus einem Bakterium, das aus dem marinen Schwamm Dysidea avara isoliert wurde. Die Substanz wurde aufgrund ihrer chemischen Struktur 2-Methylthio-1,4-Naphthochinon (MTN) genannt. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Isolierung dieser Verbindung, diese enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung bei der Behandlung von Erkrankungen. Darüber hinaus werden Derivate von MTN beschrieben. Die Verbindungen sind stark bioaktiv und wirken besonders selektiv hemmend auf die Ausbildung von Blutgefäßen.The The present invention relates to novel bioactive compounds from a Bacterium isolated from the marine sponge Dysidea avara. The substance became 2-methylthio-1,4-naphthoquinone due to its chemical structure Called (MTN). The invention further relates to a method for Isolation of this compound, medicaments containing them and their use in the treatment of diseases. Furthermore derivatives of MTN are described. The connections are strong bioactive and have a particularly selective inhibiting effect on the training of blood vessels.

1. Hintergrund der Erfindung1. Background of the invention

sAls Angiogenese wird der morphogenetische Prozess bezeichnet, bei dem neue Kapillaren gebildet werden, die bei (höheren) multizellulären Tieren zur Versorgung der Gewebe mit Blut dienen. Dieser Prozess, der sowohl bei physiologischen Vorgängen wie der Gewebebildung als auch bei pathophysiologischen Veränderungen wie dem Wachstum von Tumoren abläuft, wird über eine Reihe von Signaltransduktionswegen gesteuert (Übersicht: Harris AL: Current status of antiangiogenetic factors. Br J Haematol 109:477–489, 2000). Obwohl der zugrunde liegende Mechanismus bereits seit 1971 bekannt ist (Folkman J: Tumor angiogenesis: tumor implications. N Engl J Med 285:1182–1186, 1971), wurden darauf aufbauende therapeutische Strategien erst in den letzten Jahren intensiv entwickelt (Übersicht: Brower V: Tumor angiogenesis – new drugs on the block. Nature Biotechnology 17:963–968, 1999). Heute stellt die Beeinflussung von angiogenetischen Prozessen ein bevorzugtes Forschungsfeld für biotechnologisch ausgerichtete Untersuchungen dar, die das Ziel verfolgen, neue Tumortherapeutika aufzufinden.SALS Angiogenesis is called the morphogenetic process in which new capillaries are formed in (higher) multicellular animals to supply the tissues with blood. This process, both in physiological processes like tissue formation as well as pathophysiological changes how the growth of tumors happens will over controlled a number of signal transduction pathways (overview: Harris AL: Current status of antiangiogenic factors. Br J Haematol 109: 477-489, 2000). Although the underlying mechanism has been around since 1971 is known (Folkman J: tumor angiogenesis: tumor implications. N Engl J Med 285: 1182-1186, 1971), therapeutic strategies based on them were first published in Intensive development in recent years (overview: Brower V: Tumor angiogenesis - new drugs on the block. Nature Biotechnology 17: 963-968, 1999). Today, the Influencing angiogenic processes is a preferred field of research for biotechnological focused studies aimed at finding new tumor therapeutics find.

Eine Reihe von niedermolekularen, meist synthetisch hergestellten organischen Substanzen lassen eine anti-angiogenetische Potenz sowohl in In-vitro- als auch in In-vivo-Modellen vermuten und sind deshalb von therapeutischem Interesse. Der Vorteil, den bioaktive Naturprodukte, die als sogenannte Sekundär-Metabolite insbesondere von Schwämmen – den ursprünglichsten Tieren – gebildet werden, ist offenbar. Schwämme sind als sessile Filtrierer in besonders hohem Maße auf Bildung von Sekundär-Metaboliten angewiesen. Diese Tiere benutzen diese Substanzen nicht nur zur Abwehr von Mikroorganismen, sondern auch von multizellulären Tieren, die ein Blutgefäßsystem ausbilden, und offenbar auch zur morphogenetischen Steuerung der Ausbildung ihres eigenen "Vaskularisierungssystems", des Wasserkanalsystems. Die letztgenannte Wirkung war überraschend.A Series of low molecular weight, mostly synthetically produced organic Substances show an anti-angiogenic potency in both in vitro and in vivo models suspect and are therefore of therapeutic interest. The advantage, the bioactive natural products, called so-called secondary metabolites in particular of sponges - the most original Animals - formed it is obvious. sponges are particularly sensitive to sessile filtration of secondary metabolites reliant. These animals use these substances not only for Defense against microorganisms, but also of multicellular animals, the a blood vessel system training, and apparently also to the morphogenetic control of Training their own "vascularization system", the water channel system. The latter effect was surprising.

Erst nachdem in Schwämmen Gene aufgefunden worden waren, die für Liganden und deren Rezeptoren codieren, die an der Regulation der Angiogenese bei höheren Tieren beteiligt sein können, konnte ein rationales Screening zum Auffinden derartiger Substanzen angegangen werden. Naturprodukte (Sekundär-Metabolite), die bioaktive Wirkung zeigen, scheinen synthetisch hergestellten Chemikalien meist überlegen zu sein. So konnten die bioaktiven Sekundär-Metabolite von Schwämmen, die bereits vor über 800 Millionen Jahren auftraten, während dieser langen Zeit auf optimale Wirkung hin selektioniert werden. Die Evolution hat damit die aufwendigen Synthese- und Selektionsverfahren, die bei der Entwicklung neuer Leitstrukturen mit Hilfe der kombinatorischen Chemie benötigt werden, übernommen.First after in sponges Genes had been found responsible for ligands and their receptors encode the regulation of angiogenesis in higher animals can be involved could do a rational screening to find such substances be addressed. Natural products (secondary metabolites), the bioactive Effectively, synthetically produced chemicals usually seem superior to be. Thus, the bioactive secondary metabolites of sponges, the already over 800 million years ago occurred during that long time optimal effect are selected out. Evolution has it the elaborate synthesis and selection procedures used in development new lead structures with the help of combinatorial chemistry are needed.

Die Angiogenese wird von intrazellulären Molekülen/Liganden gesteuert, die mit ihren entsprechenden Rezeptoren wechselwirken. Als Beispiele seien die Proteine aus der Reihe der Angiostatine (endogene Inhibitoren der Angiogenese) genannt, welche die Funktion von Wachstumsfaktoren (die z.B. an den VEGF/VEGF-Rezeptor binden) hemmen, sowie der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (der mit dem Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor zusammenwirkt) oder der vaskuläre, endotheliale Wachstumsfaktor (mit dem entsprechenden Rezeptor). Das aufeinander abgestimmte Wechselspiel dieser Systeme kontrolliert die physiologische/pathophysiologische Ausbildung der Gefäße und Kapillaren.The Angiogenesis is by intracellular Molecules / ligands controlled, which interact with their respective receptors. Examples are the proteins from the series of angiostatins (endogenous inhibitors of angiogenesis) called the function of growth factors (e.g., binding to the VEGF / VEGF receptor) fibroblast growth factor (the fibroblast growth factor receptor interacts) or the vascular, endothelial growth factor (with the corresponding receptor). The coordinated interaction of these systems is controlled the physiological / pathophysiological formation of the vessels and capillaries.

Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, neue bioaktive Substanzen bereitzustellen, die sich zum Einsatz gegen Tumoren und/oder zur Verhinderung der Angiogenese allgemein, insbesondere aber der Angiogenese bei Tumoren eignen.It is therefore an object of the invention, new bioactive substances to provide for use against tumors and / or for Prevention of angiogenesis in general, but in particular of angiogenesis are suitable for tumors.

Diese Aufgabe wird gelöst durch Verbindung der allgemeinen Formel 2:

Figure 00030001
wobei
R1 entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes C1-C18-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein monosubstituiertes oder polysubstituiertes, gerades, verzweigtes oder cyclisches C1-C18-Alkenyl oder eine Acylgruppe, wie z.B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder Heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppen sein kann,
und R2 bis R6 unabhängig voneinander entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes C1-C18-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Aryl- oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe, eine Acylgruppe, wie z.B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, oder eine verzweigte oder Heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppe, ein Alkoxysubstituent, wie z.B. -OMe, -OEt, -OnPr, -iPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu, dessen Alkylgruppe verzweigt, unverzweigt oder cyclisch ist, eine über ein Schwefelatom gebundene Alkylgruppe, wie z.B. -SMe, -SEt, oder eine Sulfonylgruppe, wie z. B. -SO3H, -SO2Me, -SO2CF3, -SO2C6H4CH3 oder SO2C6H4CH2Br, oder ein Stickstoffsubstituent, wie z.B. -NH2, -NHR, -NRR' (mit R, R' = Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkenyl), -NC oder -NO2, oder Fluor, Chlor, Brom, Iod, -CN oder ein Heterosubstituent sind, und pharmazeutisch annehmbare Salze oder Solvate der Verbindung.This object is achieved by the compound of general formula 2:
Figure 00030001
in which
R 1 is either H, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted C 1 -C 18 alkyl, wherein the alkyl may be straight, branched or cyclic, a monosubstituted or polysubstituted, straight, branched or cyclic C 1 -C 18 alkenyl or an acyl group such as formyl, acetyl, trichloroacetyl, fumaryl, maleyl, succinyl, benzoyl, branched or heteroatom or aryl-substituted acyl groups,
and R 2 to R 6 are independently H, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted C 1 -C 18 alkyl, wherein the alkyl may be straight, branched or cyclic, alkenyl, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted aryl or heteroaryl radical, a unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted benzyl group, an acyl group such as formyl, acetyl, trichloroacetyl, fumaryl, maleyl, succinyl, benzoyl, or a branched or heteroatom or aryl substituted acyl group, an alkoxy substituent such as -OMe, -OEt, -OnPr, -iPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu, whose alkyl group is branched, unbranched or cyclic, an alkyl group bonded via a sulfur atom, such as -SMe, -SSE, or a sulfonyl group, such as. For example, -SO 3 H, -SO 2 Me, -SO 2 CF 3 , -SO 2 C 6 H 4 CH 3 or SO 2 C 6 H 4 CH 2 Br, or a nitrogen substituent such as -NH 2 , -NHR , -NRR '(with R, R' = alkyl, aryl, heteroaryl, alkenyl), -NC or -NO 2 , or fluoro, chloro, bromo, iodo, -CN or a hetero substituent, and pharmaceutically acceptable salts or solvates of Connection.

In einer Ausführungsform ist R1 = CH3 und R2-R6 = H.In one embodiment, R 1 = CH 3 and R 2 -R 6 = H.

In einer anderen Ausführungsform ist R1 = CH3, R2 = SCH3 und R3-R6 = H.In another embodiment, R 1 = CH 3 , R 2 = SCH 3 and R 3 -R 6 = H.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist R1 = -CH2-CH(CH3)2 und R2-R6 = H. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist R1 = -C(CH3)3 und R2-R6 = H.In a preferred embodiment, R 1 is -CH 2 -CH (CH 3 ) 2 and R 2 -R 6 = H. In another preferred embodiment, R 1 is -C (CH 3 ) 3 and R 2 -R 6 = H.

Die Aufgabe wird auch gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung umfassend das Züchten eines Bakteriums in Kulturmedium, wobei besagtes Bakterium mit dem alpha-Proteobakterium MBIC3368 verwandt ist, 99% Sequenzidentität hinsichtlich der rDNA zu dem alpha-Proteobakterium MBIC3368 aufweist und mit dem marinen Schwamm Dysidea avara assoziiert vorkommt, und Isolieren mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 aus dem Kulturmedium und/oder der Bakterienbiomasse, wobei das Isolieren mindestens einen der folgenden Schritte umfaßt: a) Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt einem C1-C6-Alkohol, bevorzugter n-Butanol, b) Gelfitration.The object is also achieved by a method for producing a compound according to the present invention comprising cultivating a bacterium in culture medium, said bacterium being related to the alpha proteobacterium MBIC3368, having 99% sequence identity with respect to the rDNA to the alpha proteobacterium MBIC3368, and isolating at least one compound according to any one of claims 1-5 from the culture medium and / or the bacterial biomass, said isolating comprising at least one of the following steps: a) extraction with an organic solvent, preferably one C 1 -C 6 -alcohol, more preferably n-butanol, b) gel filtration.

Bevorzugt umfaßt das Verfahren weiterhin eine anschließende synthetische Derivatisierung der isolierten Verbindung.Prefers comprises the method further comprises a subsequent synthetic derivatization the isolated compound.

In einer anderen Ausführungsform wird eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung aus einem Schwamm der Spezies Suberites domuncula isoliert, bevorzugt durch Extrahieren in an sich bekannter Weise, oder eine erfindungsgemäße Substanz wird durch Züchten eines Bakteriums, das mit dem Schwamm Suberites domuncula assoziiert ist, und anschließendes Extrahieren mit einem organischen Lösungsmittel und/oder Gelfiltrieren isoliert.In another embodiment is a compound according to the present Invention isolated from a sponge of the species Suberites domuncula, preferably by extraction in a conventional manner, or a substance according to the invention is by breeding of a bacterium that associates with the sponge Suberites domuncula is, and subsequent Extract with an organic solvent and / or gel filtration isolated.

Ebenso wird die Aufgabe gelöst durch eine Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung als Medikament, ebenso wie durch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 zusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen.As well the task is solved by a compound according to the present invention Invention for use as a medicament, as well as by a pharmaceutical A composition comprising a compound of the invention according to any one of claims 1-5 together with suitable additives or auxiliaries.

Bevorzugt liegt die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vor.Prefers If the compound is in the form of a depot substance or as a precursor together with a suitable, pharmaceutically acceptable dilution solution or vehicle in front.

In einer Ausführungsform liegt die Zusammensetzung in Form einer Dosierungseinheit vor, wobei eine Dosierungseinheit die Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 in einer Menge enthält, die im Bereich von 5 μg bis 50 μg, bevorzugt von 10 μg bis 40 μg, bevorzugter von 15 μg bis 30 μg, am bevorzugtesten bei ungefähr 20 μg liegt.In an embodiment the composition is in the form of a dosage unit, wherein a dosage unit the compound according to any one of claims 1-5 contains in an amount in the range of 5 μg up to 50 μg, preferably of 10 μg up to 40 μg, more preferably 15 μg up to 30 μg, most preferably at about 20 μg.

In einer Ausführungsform liegt die Verbindung in der Zusammensetzung in einer Menge vor, die ausreicht, um bei Verabreichung an einen Säuger eine Blutkonzentration zu erzielen, die im Bereich 0,3 bis 3,0 μg/ml liegt.In an embodiment is the compound present in the composition in an amount sufficient to give a blood concentration when administered to a mammal to reach within the range of 0.3 to 3.0 ug / ml.

Bevorzugt enthält die pharmazeutische Zusammensetzung weitere Chemotherapeutika.Prefers contains the pharmaceutical composition further chemotherapeutic agents.

In einer Ausführungsform liegt die pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung vor.In an embodiment if the pharmaceutical composition is in the form of tablets, Dragees, capsules, drop solutions, Suppositories, injectables or infusion preparations for oral, rectal or parenteral use.

Die Aufgaben der Erfindung werden ebenso gelöst durch die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder Infektionen durch gram-negative Bakterien, ebenso wie durch die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Hemmung von Angiogenese, wobei bevorzugt wird, daß die Angiogenese bei Tumorerkrankungen verhindert oder gehemmt wird.The Objects of the invention are also solved by the use of a Compound according to the present invention Invention for the manufacture of a medicament for the treatment of tumor diseases or infections by gram-negative bacteria, as well as by the use of a compound according to the present invention for the manufacture of a medicament for prevention or inhibition angiogenesis, with angiogenesis being preferred in tumors is prevented or inhibited.

Die Aufgaben der Erfindung werden ebenso gelöst durch die Verwendung einer Verbindung gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Hemmung der neointimalen Proliferation, wobei bevorzugt wird, daß die Verbindung auf einen Stent aufgebracht wird, bevorzugt als Beschichtung.The Objects of the invention are also solved by the use of a Compound according to the present invention Invention for the manufacture of a medicament for preventing or Inhibition of neointimal proliferation, it being preferred that the compound is applied to a stent, preferably as a coating.

In einer Ausführungsform liegt die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer vor, zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz.In an embodiment if the compound is in the form of a depot substance or precursor, together with a suitable, pharmaceutically acceptable Dilution solution or Carrier.

In einer Ausführungsform wird die Verbindung in einer Menge eingesetzt, die im Bereich von 5 μg bis 50 μg, bevorzugt von 10 μg bis 40 μg, bevorzugt von 15 μg bis 30 μg, am bevorzugtesten bei ungefähr 20 μg liegt.In an embodiment the compound is used in an amount ranging from 5 μg to 50 μg, preferred of 10 μg up to 40 μg, preferably 15 μg up to 30 μg, most preferably at about 20 μg.

In einer Ausführungsform wird die Verbindung in einer Menge eingesetzt, die ausreicht, um bei Verabreichung an einen Säuger eine Blutkonzentration zu erzielen, die im Bereich von 0,3 bis 3,0 μg/ml liegt.In an embodiment the compound is used in an amount sufficient to when administered to a mammal to achieve a blood concentration that is in the range of 0.3 to 3.0 μg / ml.

Das phylogenetisch älteste Liganden/Rezeptor-System, das die Angiogenese kontrolliert, ist das CD36-Thrombospondin-System (TSP-System) (Calvo D, Dopazo J, Vega MA: The CD36, CLA-1 (CD36L1), and LIMPII (CD36L2) gene family: cellular distribution, chromosomal location, and genetic evolution. Genomics 25:100–106, 1995). CD36, zuerst auch Glycoprotein IV genannt, wurde zunächst auf den Membranen von Blutplättchen nachgewiesen. Wenn der spezifische Ligand, das Thrombospondin (TSP), an den CD36-Rezeptor bindet, kommt es zur Hemmung der Angiogenese. Von den Erfindern konnte unter Zuhilfenahme molekularbiologischer Methoden nachgewiesen werden, dass auch die Schwämme – als die phylogenetisch ältesten Tiere – bereits ein Mitglied aus der CD36-Rezeptor-Familie besitzen. Als Untersuchungsmodell diente der Meeresschwamm Suberites domuncula. Darauf aufbauend wurde erfolgreich ein Screening nach dem entsprechenden Liganden durchgeführt, der dann auch mit Hilfe der PCR-Technik aufgefunden wurde. Es konnte gezeigt werden, dass dieser Ligand das für das TSP spezifische Bindungsmotiv aufweist. Durch Funktionsanalysen und unter Anwendung eines rekombianten TSP-verwandten Polypeptids konnte gezeigt werden, dass dieses Molekül in S. domuncula als Modellsystem die Ausbildung des Kanalsystems, durch welches das umgebende Meerwasser durch den Schwamm geleitet wird, hemmt. Die chemische Struktur diese Substanz ist ein 2-Methylthio-1,4-naphthochinon (MTN). Aufbauend auf diesem In-vivo-Modell konnte nun ein Naturstoff identifiziert werden, der von einem in einem Schwamm vorkommenden Mikroorganismus (Bakterium) gebildet wird. Es kann angenommen werden, dass dieses Bakterium eine Co-Evolution mit dieser ursprünglichen Tierspezies (Schwamm) durchgemacht hat. Daraus kann man ableiten, dass dabei MTN als funktionell hochaktiver und hochspezifischer Wirkstoff herausselektioniert wurde.The phylogenetically oldest Ligand / receptor system that controls angiogenesis the CD36 thrombospondin system (TSP system) (Calvo D, Dopazo J, Vega MA: The CD36, CLA-1 (CD36L1), and LIMPII (CD36L2) gene family: cellular distribution, chromosomal location, and genetic evolution. Genomics 25: 100-106, 1995). CD36, first also called glycoprotein IV, was first on the membranes of platelets demonstrated. When the specific ligand, thrombospondin (TSP), binds to the CD36 receptor, inhibition of angiogenesis occurs. The inventors could with the help of molecular biological Methods are proven that even the sponges - as the phylogenetically oldest animals - already own a member of the CD36 receptor family. As an examination model the sea sponge served Suberites domuncula. Based on this was successfully performed a screening for the corresponding ligand, the was then found using the PCR technique. It showed that this ligand will do that for has the TSP specific binding motif. Through functional analyzes and using a recombinant TSP-related polypeptide could be shown to be this molecule in S. domuncula as a model system the formation of the canal system through which the surrounding seawater through the sponge inhibits. The chemical structure of these Substance is a 2-methylthio-1,4-naphthoquinone (MTN). Building a natural product could now be identified on this in vivo model that of a microorganism occurring in a sponge (Bacterium) is formed. It can be assumed that this Bacterium a co-evolution with this original one Animal species (sponge) has gone through. It can be deduced from this that MTN is considered to be functionally highly active and highly specific Drug was selected out.

Figure 00070001
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Nach der Aufklärung der Wirkungsweise von MTN im homologen System (d.h. S. domuncula) wurde geprüft, ob MTN auch eine Wirkung in einem heterologen Modellsystem besitzt; hierzu wurde das als sehr geeignet angesehene Modell der Chorioallantois-Membran (CAM) des Hühnchenembryos (Auerbach R, Lewis R, Shinners B, Kubai L, Akhtar N: Angiogenesis assays: a critical overview. Clinical Chem. 49:32–40, 2003) ausgewählt. Überraschenderweise wurde hierbei gefunden, daß die erfindungsgemäßen Substanzen , insbesondere MTN ebenso wie DMTN und die Derivate der Ansprüche 4-5 das Wachstum der Kapillaren, die von dem zentralen Blutgefäß ausgehen, schon bei sehr niedrigen Dosen hemmen.To the Enlightenment the mode of action of MTN in the homologous system (i.e., S. domuncula) was tested, whether MTN also has an effect in a heterologous model system; For this purpose, the model of the chorioallantoic membrane considered to be very suitable was considered (CAM) of the chicken embryo (Auerbach R, Lewis R, Shinners B, Kubai L, Akhtar N: Angiogenesis assays: a critical overview. Clinical Chem. 49: 32-40, 2003). Surprisingly was found here that the substances according to the invention , in particular MTN as well as DMTN and the derivatives of claims 4-5 the growth of the capillaries emanating from the central blood vessel, inhibit even at very low doses.

Weiterhin wurde überraschenderweise gefunden, dass die erfindungsgemäßen Substanzen, insbesondere MTN, DMTN und die Derivate der Ansprüche 4-5 bei höheren Konzentrationen eine Hemmung der Zellteilung von Tumorzellen bewirken. Diese Zelltoxizität ist sogar tumorspezifisch; am empfindlichsten werden lymphatische Tumoren gehemmt.Farther was surprisingly found that the substances according to the invention, in particular MTN, DMTN and the derivatives of claims 4-5 at higher Concentrations cause an inhibition of cell division of tumor cells. This cell toxicity is even tumor-specific; the most sensitive are lymphatic Tumors inhibited.

Auf Grund dieser Daten stellen MTN und seine Derivate sehr vielversprechende Substanzen zur Therapie von Tumoren dar, speziell von solchen, die nur aufgrund einer intensiven Vaskularisierung an Größe zunehmen können. Insbesondere ist zu erwarten, dass das Wachstum von solchen Tumoren (z.B. Karzinomen) gehemmt wird, die aus der TNM/T1-Phase in die TNM/T2- und insbesondere die TNM/T3-Phase übergehen. Während dieses Prozesses kommt es zu einer intensiven Vaskularisierung. Verstärkt wird die Vaskularisierung-abhängige Hemmung des Tumorwachstums durch den zytotoxischen Effekt (bei höheren Dosen eintretende Proliferationshemmung von Tumorzellen) von MTN und seinen Derivaten.On Because of this data, MTN and its derivatives are very promising Substances for the treatment of tumors, especially of those that only increase in size due to intense vascularization can. In particular, it is expected that the growth of such tumors (e.g., carcinomas) resulting from the TNM / T1 phase in the Transition TNM / T2 and in particular the TNM / T3 phase. During this process comes it leads to an intensive vascularization. Enhanced is the vascularization-dependent inhibition tumor growth through the cytotoxic effect (at higher doses proliferative inhibition of tumor cells) of MTN and its Derivatives.

Als weitere Anwendung dieser überraschenden Hemmung der Vaskularisierung kommt die Anwendung bei der Beschichtung von Stents in Betracht. Ziel einer medikamentösen Stent-Beschichtung ist es, die neointimale Proliferation zu hemmen, um über diesen Weg eine Wiederverengung der Blutgefäße nach Implantation eines (Edelstahl)stents zu verhindern. Die bisherigen Versuche zur neointimalen Proliferations-Hemmung durch Gold oder weitere anorganische Materialien haben sich als nicht erfolreich erwiesen. Jedoch scheint sich eine Anwendung von Stent-Beschichtungen mit organischen bioaktiven Substanzen, wie Rapamycin, als potentiell erfolgversprechend zu erweisen. Ziel der Stent-Beschichtung ist es, die Thrombozytenadhäsion zu vermindern und die Proliferation der glatten Muskelzellen zu hemmen. Deshalb ist hier auch ein Weg aufgezeigt, durch kovalente Verbindung der zur Patentierung vorgeschlagenen Substanzen mit Polymeren einen Überzug für die Stents herzustellen.When further application of this surprising Inhibition of vascularization is the application in the coating of stents into consideration. The aim of a drug stent coating is it to inhibit neointimal proliferation, to regain this pathway the blood vessels after Implantation of a (stainless steel) stent to prevent. The previous Attempts to neointimal proliferation inhibition by gold or other inorganic materials have not been successful proved. However, there seems to be an application of stent coatings with organic bioactive substances, such as rapamycin, as potential to prove promising. The goal of stent coating is to increase platelet adhesion diminish and inhibit the smooth muscle cell proliferation. Therefore, here is a way indicated by covalent connection the substances proposed for patenting with polymers have a coating for the stents manufacture.

Zur kovalenten Bindung der zum Patent vorgeschlagenen Substanzen an das polymere Trägermaterial ist es möglich, die Verbindungen zum jeweiligen Hydrochinon zu reduzieren und über die 4-OH-Gruppe durch eine Esterbindung mit einer langkettigen Carbonsäure zu verknüpfen (siehe Abbildung), deren anderes Ende mit dem Polymer verbunden ist. Das im Körper durch Lipasen freigesetzte Hydrochinon wird spontan zum Naphthochinon, dem eigentlichen Wirkstoff, oxidiert. Über die Kettenlänge der als "Spacer" verwendeten Carbonsäure lässt sich die Geschwindigkeit der hydrolytischen Freisetzung des Wirkstoffs, und somit dessen Konzentration, regulieren.to covalent binding of the substances proposed for the patent the polymeric carrier material Is it possible, to reduce the compounds to the respective hydroquinone and on the 4-OH group by an ester bond with a long-chain carboxylic acid to link (see Figure) whose other end is connected to the polymer. The in the body hydroquinone released by lipases spontaneously becomes naphthoquinone, the actual active ingredient, oxidized. About the chain length of can be used as a "spacer" carboxylic acid the rate of hydrolytic release of the active substance, and thus its concentration, regulate.

Figure 00080001
Figure 00080001

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, die stark bioaktive Substanz aus einem marinen Organismus bzw. einem assoziierten Mikroorganismus zur potentiellen Therapie von Tumoren darzustellen. Dazu werden dessen Herstellung und dessen Verwendungen dargelegt.One The aim of the present invention is the highly bioactive substance from a marine organism or an associated microorganism to represent the potential therapy of tumors. To do this its preparation and uses.

2. MTN und MTN-Derivate2. MTN and MTN derivatives

Erfindungsgemäß wird die oben genannte Aufgabe zunächst durch die Substanz MTN und die MTN-Derivate als bioaktive Substanzen gelöst. Es ist überraschend, dass in den hier angewandten Tumorsystemen eine so stark ausgeprägte Antitumor-Aktivität, wie weiter unten diskutiert, nachgewiesen werden konnte. Weiterhin war unbekannt, dass MTN oder dessen Abkömmlinge anti-angiogenetische Aktivität aufweisen. Dieser Effekt tritt überraschenderweise bereits bei sehr geringen Dosen bzw. beim Einsatz von kleinen Mengen im Bereich von 0,2 ng – 2 ng auf, die lokal bereits zu einer Hemmung bzw. vollständigen Verhinderung der Angiogenese führen.According to the invention above task first through the substance MTN and the MTN derivatives as bioactive substances solved. It is surprising that in the tumor systems used here such a pronounced anti-tumor activity, as on discussed below, could be demonstrated. Furthermore, it was unknown that MTN or its descendants anti-angiogenic activity exhibit. This effect occurs surprisingly even at very low doses or when using small quantities in the Range of 0.2 ng - 2 ng on, the local already to an inhibition or complete prevention lead to angiogenesis.

Weiterhin wurde gefunden, dass MTN und die abgeleiteten MTN-Derivate der allgemeinen Formel 2 ausgeprägte Antitumor-Eigenschaften besitzen. Erfindungsgemäß sind somit Verbindungen der allgemeinen Formel 2:

Figure 00090001
worin
R1 entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes C1-C18-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein monosubstituiertes oder polysubstituiertes, gerades, verzweigtes oder cyclisches C1-C18-Alkenyl oder eine Acylgruppe, wie z.B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder Heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppen sein kann,
und R2 bis R6 unabhängig voneinander entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes C1-C18-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Aryl- oder Heteroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe, eine Acylgruppe, wie z.B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, oder eine verzweigte oder Heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppe, ein Alkoxysubstituent, wie z.B. -OMe, -OEt, -OnPr, -iPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu, dessen Alkylgruppe verzweigt, unverzweigt oder cyclisch ist, eine über ein Schwefelatom gebundene Alkylgruppe, wie z.B. -SMe, -SEt, oder eine Sulfonylgruppe, wie z. B. -SO3H, -SO2Me, -SO2CF3, -SO2C6H4CH3 oder SO2C6H4CH2Br, oder ein Stickstoffsubstituent, wie z.B. -NH2, NHR, -NRR' (mit R, R' = Alkyl, Aryl, Heteraryl, Alkenyl.), -NC oder NO2, oder Fluor, Chlor, Brom, Iod, -CN oder ein Heterosubstituent sind.Furthermore, it has been found that MTN and the derived MTN derivatives of the general formula 2 have pronounced antitumor properties. Thus, according to the invention, compounds of the general formula 2 are:
Figure 00090001
wherein
R 1 is either H, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted C 1 -C 18 alkyl, wherein the alkyl may be straight, branched or cyclic, a monosubstituted or polysubstituted, straight, branched or cyclic C 1 -C 18 alkenyl or an acyl group such as formyl, acetyl, trichloroacetyl, fumaryl, maleyl, succinyl, benzoyl, branched or heteroatom or aryl-substituted acyl groups,
and R 2 to R 6 are each independently H, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted C 1 -C 18 alkyl, wherein the alkyl may be straight, branched or cyclic, alkenyl, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted aryl or heteroaryl radical, a unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted benzyl group, an acyl group such as formyl, acetyl, trichloroacetyl, fumaryl, maleyl, succinyl, benzoyl, or a branched or heteroatom or aryl substituted acyl group, an alkoxy substituent such as -OMe, -OEt, -OnPr, -iPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu, whose alkyl group is branched, unbranched or cyclic, an alkyl group bonded via a sulfur atom, such as -SMe, -SSE, or a sulfonyl group, such as. B. -SO 3 H, -SO 2 Me, -SO 2 CF 3 , -SO 2 C 6 H 4 CH 3 or SO 2 C 6 H 4 CH 2 Br, or a nitrogen substituent such as -NH 2 , NHR, -NRR '(with R, R' = alkyl, aryl, heteraryl, alkenyl.), -NC or NO 2 , or fluoro, chloro, bromo, iodo, -CN or a hetero substituent.

Für die hier erstmals als Naturstoff beschriebene Verbindung 2-Methylthio-1,4-naphthochinon (MTN) gilt R1 = CH3 und R2-R6 = H. Das synthetische Derivat 2,3-Dimethylthio-1,4-naphthochinon (DMTN) besitzt das Substitutionsmuster R1 = CH3, R2 = SCH3 und R3-R6 = H.For the compound 2-methylthio-1,4-naphthoquinone (MTN) described here for the first time as natural product, R 1 = CH 3 and R 2 -R 6 = H. The synthetic derivative 2,3-dimethylthio-1,4-naphthoquinone ( DMTN) has the substitution pattern R 1 = CH 3 , R 2 = SCH 3 and R 3 -R 6 = H.

Weiterhin wurde gefunden, dass MTN sowie die MTN-Derivate eine ausgeprägte und nicht vorhersehbare antitumorale und anti-angiogenetische Eigenschaft besitzen. Aufgrund dieser Eigenschaft und basierend auf dem Befund, dass MTN und die MTN-Derivate weitgehend untoxisch für Säugetiere (Beispiel Maus) sind, sind die hier beschriebenen Substanzen zur Behandlung von Tumoren im allgemeinen und speziell von solchen Tumoren, deren Wachstum von einer Vaskularisierung abhängt, geeignet. Daneben ist der Einsatz zur Behandlung/Verhütung von Restenose-Prozessen angezeigt. Es wird empfohlen, diese Substanzen entweder in der vorliegenden Form oder in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz anzuwenden.Furthermore, it was found that MTN and the MTN derivatives have a pronounced and not foreseeable have a bare antitumoral and anti-angiogenetic property. Because of this property and based on the finding that MTN and the MTN derivatives are largely non-toxic to mammals (example mouse), the substances described herein are for the treatment of tumors in general and especially of those tumors whose growth depends on vascularization, suitable. In addition, the use for the treatment / prevention of restenosis processes is indicated. It is recommended to use these substances either in the present form or in the form of a depot substance or as a precursor together with a suitable, pharmaceutically acceptable diluting solution or vehicle.

Die genannten antitumoralen bzw. anti-angiogenetischen Eigenschaften waren ebenso bei den Derivaten der Ansprüche 4 und 5 in gleicher Weise und Wirksamkeit wie bei MTN festzustellen.The said anti-tumor or anti-angiogenic properties were also in the derivatives of claims 4 and 5 in the same way and to determine efficacy as with MTN.

Diese erfindungsgemäßen Verbindungen können mit den üblichen Lösungsmitteln, Hilfs- und Trägerstoffen zu Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- und Infusionszubereitungen verarbeitet werden, um therapeutisch zur peroralen, rektalen oder parenteralen Applikation Verwendung zu finden.These Compounds of the invention can with the usual solvents Auxiliaries and carriers to tablets, dragees, capsules, dripping solutions, suppositories, injections and infusion preparations are processed to be therapeutic for peroral, rectal or parenteral administration use to find.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer oben genannten Verbindung, das MTN, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Substanz bevorzugt aus einem marinen Organismus, wie zum Beispiel einem marinen Bakterium, das mit dem Schwamm Dysidea avara assoziiert vorkommt, isoliert wird.The The present invention further relates to a process for the preparation an above compound, the MTN, characterized is that the substance is preferred from a marine organism, such as for example, a marine bacterium that dysidea with the sponge avara is associated, is isolated.

Wie hierin verwendet, soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung unter einem „Derivat" eine von der allgemeinen Formel (2) abgeleitete Verbindung verstanden werden, die z.B. durch verschiedene der oben für R1-R6 angegebenen Restgruppen substituiert ist, sowie Gemische verschiedener dieser Verbindungen, die z.B. auf die jeweils zu therapierende Erkrankung und/oder den Patienten auf Basis von diagnostischen Daten oder Daten über den Behandlungserfolg oder -verlauf abgestimmt zu einem „personalisierten" Medikament verarbeitet werden können. Unter einem Derivat wird auch eine Verbindung der Klasse der 2-Methylthio-1,4-napthochinone verstanden, die aus anderen (z.B.) marinen Organismen isoliert werden kann, als den hier (beispielhaft) erwähnten.As used herein, in the context of the present invention a "derivative" is to be understood as meaning a compound derived from general formula (2) which is substituted, for example, by various of the radical groups given above for R 1 -R 6 , as well as mixtures of various of these compounds which can be processed, for example, to the respective illness to be treated and / or the patient based on diagnostic data or data on the success or course of treatment to a "personalized" drug. A derivative is also understood as meaning a compound of the class of 2-methylthio-1,4-naphthoquinones which can be isolated from other (eg) marine organisms than the one mentioned here by way of example.

Unter einem „Vorläufer" einer Substanz soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum einen eine Substanz verstanden werden, die im Laufe ihrer Verabreichung zur Behandlung durch die Bedingungen im Körper (z.B. pH im Magen, oder ähnliches) so verändert wird oder aber durch den Körper nach Aufnahme so metabolisiert wird, daß sich als wirksame Substanz die erfindungsgemäße Verbindung oder deren Derivate bilden. Zum anderen werden als Voräufer aus Organismen isolierte Derivate von 2-Methylthio-1,4-napthochinon verstanden, die bereits die hierin angegebenen Eigenschaften des 2-Methylthio-1,4-naphthochinon aufweisen.Under a "precursor" of a substance in the context of the present invention on the one hand understood a substance be administered in the course of their administration by the Conditions in the body (e.g., pH in the stomach, or the like) so changed or through the body After ingestion is metabolized so that as an effective substance the compound of the invention or their derivatives. On the other hand, as a forerunner Organisms isolated derivatives of 2-methylthio-1,4-naphthoquinone understood already the properties of 2-methylthio-1,4-naphthoquinone given herein exhibit.

3. Formulierungen3. Formulations

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung mindestens einer der oben genannten Verbindungen zur Behandlung von Erkrankungen, wie z.B. von Tumorerkrankungen.One Another aspect of the present invention relates to the use at least one of the above compounds for treatment of diseases, e.g. of tumor diseases.

Diese Verwendung kann zum Beispiel in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz erfolgen. Im Falle der Behandlung von Tumoren kann eine Behandlung in einem Konzentrationsbereich zwischen 0,1 und 10 mg/kg Köpergewicht erfolgen.These Use can, for example, in the form of a depot substance or as precursor together with a suitable, pharmaceutically acceptable Dilution solution or vehicle respectively. In case of treatment of tumors may be a treatment in a concentration range between 0.1 and 10 mg / kg body weight respectively.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung, zusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen. Diese pharmazeutische Zusammensetzung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vorliegt.One Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical Composition comprising a compound of the invention together with suitable Additives or auxiliaries. This pharmaceutical composition may be characterized in that the compound in the form of a Depot substance or as a precursor together with a suitable, pharmaceutically acceptable Dilution solution or vehicle is present.

Besonders bevorzugt sind pharmazeutische Zusammensetzungen, in denen die erfindungsgemäße Verbindung in einer Menge vorliegt oder in denen die erfindungsgemäße Verbindung in solch einer Menge zugesetzt wird, dass ein Konzentrationsbereich zwischen 0,3 und 3,0 μg/ml (Blutspiegel) bei der Behandlung in vivo vorliegt.Especially preferred are pharmaceutical compositions in which the compound of the invention is present in an amount or in which the compound of the invention in such an amount is added that a concentration range between 0.3 and 3.0 μg / ml (Blood level) in the treatment in vivo.

Bevorzugt ist eine pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die weitere Chemotherapeutika enthält. Diese Chemotherapeutika können alle für den Fachmann üblichen Chemotherapeutika im Rahmen einer Krebstherapie umfassen (z.B. Taxol oder anti-angiogenetische Verbindungen wie Bay12-9566).Preferred is a pharmaceutical composition according to the present invention containing further chemotherapeutic agents. These chemotherapeutic agents can all chemo usual for the expert in the context of cancer therapy (eg, taxol or anti-angiogenic compounds such as Bay12-9566).

Erfindungsgemäß kann die oben genannte pharmazeutische Zusammensetzung in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung vorliegen. Solche Darreichungsformen und deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt.According to the invention, the above-mentioned pharmaceutical composition in the form of tablets, Dragees, capsules, drop solutions, Suppositories, injection or Infusion preparations for peroral, rectal or parenteral Use available. Such dosage forms and their preparation are known in the art.

Erfindungsgemäß können die Verbindungen in organische Matrizes eingebracht werden, die z.B. als Überzug für Stents therapeutisch eingesetzt werden können. Hierzu werden die erfindungsgemäß eingesetzten Substanzen derivatisiert mit dem Ziel, einen Linker an den bioaktiven Substanzen anzubringen. Über diesen Linker werden die Naphthochinone an ein organisches Polymer verknüpft. Als Linker kann dabei eine langkettige Carbonsäure verwendet werden, die über eine Esterbindung mit der 4-OH-Gruppe des zum Hydrochinon reduzierten Wirkstoffs verbunden wird. Die Freisetzung des Hydrochinons wird durch körpereigene Lipasen bewirkt. Das Hydrochinon wird anschließend spontan zum bioaktiven Naphthochinon oxidiert.According to the invention can Compounds are introduced into organic Matrizes, e.g. as a coating for stents can be used therapeutically. For this purpose, the inventively used Substances derivatized with the goal of a linker to the bioactive To attach substances. about this linker becomes the naphthoquinones to an organic polymer connected. As a linker while a long-chain carboxylic acid can be used which has a Ester bond with the 4-OH group of the hydroquinone reduced Active substance is connected. The release of the hydroquinone will through the body's own Lipases causes. The hydroquinone is then spontaneously bioactive Naphthoquinone oxidizes.

Als weitere Anwendung zur Herstellung eines Überzuges von Stents mit den erfindungsgemäß zur Anwendung kommenden Verbindungen werden diese unter Ausnutzung der aromatischen Eigenschaft der Substanz nicht-kovalent in eine ebenfalls aromatische Matrix eingeschlossen. Die physiko-chemische Reaktion, die zu dieser Reaktion führt, ist Stand der Technik.When Another application for producing a coating of stents with the According to the invention for use these compounds are taking advantage of the aromatic compounds Property of the substance non-covalent in a likewise aromatic Matrix included. The physicochemical reaction to this Reaction leads, is state of the art.

Kurze Beschreibung der Figuren:Short description of Characters:

1 zeigt eine allgemeine Formel 2 der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung. 1 shows a general formula 2 of the compounds according to the present invention.

2 zeigt die Formel für 2-Methylthio-1,4-naphthochinon. 2 shows the formula for 2-methylthio-1,4-naphthoquinone.

3 zeigt die Formel für 2,3-Dimethylthio-1,4-naphthochinon. 3 shows the formula for 2,3-dimethylthio-1,4-naphthoquinone.

4 zeigt die Ergebnisse eines Chorioallantois-Membran-Tests (CAM-Test), wobei 4a das Kapillarmuster von Embryonen zeigt, die mit einem Agarblöckchen, das keine Testsubstanz enthielt, inkubiert wurden, während 4b und 4c das Kapillarmuster nach Behandlung mit 0,25 ng 2-Methylthio-1,4-naphthochinon bzw. 1 ng 2-Methylthio-1,4-naphthochinon zeigt. 4 shows the results of a chorioallantoic membrane test (CAM test), wherein 4a shows the capillary pattern of embryos incubated with an agar block containing no test substance during 4b and 4c shows the capillary pattern after treatment with 0.25 ng 2-methylthio-1,4-naphthoquinone or 1 ng 2-methylthio-1,4-naphthoquinone.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht, die zu Zwecken der Illustration, nicht zu ihrer Beschränkung dargeboten werden.The Invention will now be illustrated by the following examples, presented for purposes of illustration, not limitation become.

Beispiel 1: Darstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen als Naturstoff.Example 1: Representation the compounds of the invention as a natural product.

Der Bakterium-Stamm wurde wie folgt isoliert bzw. kultiviert. Aus dem zentralen Gewebe des Schwammes Dysidea avara wurde ein Probe von 5 mm2 herausgestanzt. Unter sterilen Bedingungen wurde die Gewebeprobe drei- bis viermal mit sterilem Seewasser von Gerüststrukturen gesäubert. Anschließend wurde die Probe zwischen zwei sterilen Glas-Objektträgern zerquetscht. Der gewonnene Extrakt wurde auf einen Verdünnungsfaktor von 10–1 bis 10–1 verdünnt. Von jeder Verdünnungsstufe wurde eine Agar-Kultur angelegt; das Kulturmedium war aus folgenden Komponenten zusammengesetzt: 0,25% Pepton, 0,15% Hefe-Extrakt, 0,15% Glycerol und 1,6% Agar (gelöst in 100% Seewasser). Die Platten wurden bei 30°C für 24 bis 72 Stunden inkubiert. Die Bakterien-Kolonien wurden über Verdünnungsreihen vereinzelt und somit rein dargestellt. Im Proliferations-Hemmassay erwies sich unter den acht isolierten Bakterien-Stämmen (D1 – D8) der als D1 bezeichnete Stamm als der aktivste und zwar speziell in dem Versuchsansatz, der auf Angiogenese-Hemmung ausgerichtet war. Die Charakterisierung des Bakteriums wurde gerade durchgeführt. Sequenzvergleiche der rDNA ergaben, dass der Bakterien-Stamm D1 eine 99-prozentige Identität zu dem alpha-Proteobakterium MBIC3368 aufweist.The bacterium strain was isolated or cultured as follows. From the central tissue of the sponge Dysidea avara, a 5 mm 2 sample was punched out. Under sterile conditions, the tissue sample was cleaned three to four times with sterile seawater from framework structures. Subsequently, the sample was crushed between two sterile glass slides. The recovered extract was diluted to a dilution factor of 10 -1 to 10 -1 . From each dilution step, an agar culture was applied; the culture medium was composed of the following components: 0.25% peptone, 0.15% yeast extract, 0.15% glycerol and 1.6% agar (dissolved in 100% seawater). The plates were incubated at 30 ° C for 24 to 72 hours. The bacterial colonies were separated by dilution series and thus presented purely. In the proliferation inhibition assay, among the eight isolated strains of bacteria (D1-D8), the strain designated D1 proved to be the most active, specifically in the experimental approach aimed at angiogenesis inhibition. The characterization of the bacterium has just been carried out. Sequence comparisons of the rDNA revealed that the bacterial strain D1 has a 99 percent identity to the alpha proteobacterium MBIC3368.

Der Bakterien-Stamm D1 wurde nach Kultivierung mit n-Butanol nach der Methode von Elyakov extrahiert (Elyakov GB, Kutznetsova TA, Mikhailov VV: From chemistry of marine natural products to marine technologies: research at pacific institute of bioorganic chemistry. Mar Tech Soc J 30:21–28, 1996). Nach der Inkubation wurde die Bakterien-Kultur (in 500 ml Aliquots) mit 150 ml n-Butanol versetzt. Die Suspension wurde bei 40°C 24 Stunden lang geschüttelt und anschließend 20 Minuten lang auf einem Magnetrührer gerührt. Durch nach Zentrifugation erhaltene n-Butanol-Phase wurde abgezogen und mit einem Rotationsverdampfer unter mittlerem Vakuum zur Trockne gebracht. Der trockene Rückstand (100–150 mg) wurde bei 5°C aufbewahrt.The bacterial strain D1 was extracted after cultivation with n-butanol according to the method of Elyakov (Elyakov GB, Kutznetsova TA, Mikhailov VV: From chemistry of marine natural products to marine technologies: research at the pacific institute of bioorganic chemistry.) Mar Tech Soc J 30: 21-28, 1996). After incubation, the bacterial culture (in 500 ml aliquots) was mixed with 150 ml of n-butanol. The suspension was shaken at 40 ° C for 24 hours and then stirred for 20 minutes on a magnetic stirrer. By The n-butanol phase obtained after centrifugation was drawn off and brought to dryness using a rotary evaporator under medium vacuum. The dry residue (100-150 mg) was stored at 5 ° C.

Zur Reinigung durch Gelfiltration wurde der Extrakt auf eine Säule (23 × 3 cm) aufgetragen, die mit Sephadex LH-20 gefüllt war. Als Elutionsmittel wurde Methanol eingesetzt; die Fraktionsgröße betrug 18 ml. Von den gewonnen Fraktionen wurden nach Aktivitätsbestimmung die Fraktionen 14 und 15 vereinigt und bis zur Trockne evaporiert. Anschließend erfolgte eine präparative „high-performance" flüssigkeitschromatographische Aufreinigung (HPLC-Trennung). Als Säule diente Xterra 19 × 300 mm (Waters); als Solvens wurde das Gemisch Wasser und Acetonitril eingesetzt; die Komponenten waren mit 0,05% Trifluoressigsäure versetzt. Der Gradient wurde wie folgt eingestellt: Start (0 min) mit 10% Acetonitril; nach 30 min wurde 100% Acetonitril eingesetzt. Die Flussrate betrug 12 ml/min. die Verbindung eluierte nach 23 min und ergab nach Trocknen 0,5 mg, die als blass gelbe Nadeln auskristallisierten.to Purification by gel filtration, the extract was applied to a column (23 × 3 cm) which was filled with Sephadex LH-20. As eluent methanol was used; the fraction size was 18 ml. Of the recovered Fractions were determined by activity Fractions 14 and 15 combined and evaporated to dryness. Subsequently a preparative "high-performance" liquid chromatography was carried out Purification (HPLC separation). As a column Xterra served 19 × 300 mm (Waters); as solvent, the mixture of water and acetonitrile was used; the components were mixed with 0.05% trifluoroacetic acid. The gradient was set as follows: start (0 min) with 10% acetonitrile; After 30 minutes, 100% acetonitrile was used. The flow rate was 12 ml / min. the compound eluted after 23 min and gave after drying 0.5 mg, which crystallized out as pale yellow needles.

Die erhaltene Substanz wurde mittels NMR-Analyse und aufgrund der MS-Spektren als 2-Methylthio-1,4-Naphthochinon (MTN) identifiziert; der Schmelzpunkt lag bei 176–178°C. Die entsprechenden Literaturdaten für den Schmelzpunkt sind 165–166°C (Kametani T, Nemoto H, Takeuchi M, Takeshita M, Fukumoto K: A novel alkylation in the 4-position of isoquinoline derivatives. J Chem Soc Perkin Trans 1:386–390, 1977) bzw. 185–186°C (Coll G, Morey J, Costa A, Saa JM: Direct lithiation of hydroxyaromatics. J Org Chem 53:5345–5348, 1988).The The substance obtained was determined by NMR analysis and MS spectra as 2-methylthio-1,4-naphthoquinone Identified (MTN); the melting point was 176-178 ° C. The corresponding Literature data for the melting point is 165-166 ° C (Kametani T, Nemoto H, Takeuchi M, Takeshita M, Fukumoto K: A novel alkylation in the 4-position of isoquinoline derivatives. J Chem Soc Perkin Trans 1: 386-390, 1977) or 185-186 ° C (Coll G, Morey J, Costa A, Saa JM: Direct lithiation of hydroxyaromatics. J Org Chem 53: 5345-5348, 1988).

Beispiel 2: Biologische Aktivität: Hemmung der Proliferation von TumorzellenExample 2: Biological Activity: Inhibition of proliferation of tumor cells

Testansatz:Test Batch:

Die Antitumor-Aktivität der 2-Thiomethylnaphthochinone wurde an einer Reihe von Tumor-transformierten Zellen wie L5178y Mäuselymphomzellen (ATCC CRL 1722) getestet. Wie beschrieben (Müller WEG, Zahn RK: Metabolism of 1-β-Darabinofuranosyluracil in mouse L5178y. Cancer Res 39:1102–1107, 1979) wurden die Zellen in RPMI-Medium, dem 10% fötales Kälberserum zugesetzt worden war, kultiviert. Als Inokulum-Konzentration wurden 10.000 Zellen/ml gewählt. Zum Startzeitpunkt wurde die ausgewählte Substanz zugegeben und die Kultur für 72 Stunden inkubiert. Danach wurde die Anzahl der lebenden Zellen mittels des kolorimetrischen XTT-Ansatzes bestimmt und mit einem ELISA-Reader ausgewertet (siehe: Scudiero DA, Shoemaker RH, Paull KD, Monks A, Tierney S, Nofziger TH, Currens MJ, Seniff D, Boyd MR: Cancer Res 48:4827–4833, 1988; Daum Th, Engels J, Mag M, Muth J, Lücking S, Schröder HC, Matthes E, Müller WEG: Antisense oligonucleotides: inhibitors of splicing of mRNA of human immunodeficiency virus. Intervirology 33:65–75, 1992).The Anti-tumor activity The 2-thiomethylnaphthoquinone has been transformed on a number of tumor Cells like L5178y mouse lymphoma cells (ATCC CRL 1722). As described (Müller WEG, Zahn RK: Metabolism of 1-β-darabinofuranosyluracil in mouse L5178y. Cancer Res. 39: 1102-1107, 1979) were the cells in RPMI medium, 10% fetal calf serum was added, cultured. As inoculum concentration were 10,000 cells / ml. At the start time, the selected substance was added and the culture for Incubated for 72 hours. After that, the number of living cells was determined by the colorimetric XTT approach and with a ELISA reader evaluated (see: Scudiero DA, Shoemaker RH, Paull KD, Monks A, Tierney S, Nofziger TH, Currens MJ, Seniff D, Boyd MR: Cancer Res 48: 4827-4833, 1988; Daum Th, Engels J, Mag M, Muth J, Lücking S, Schröder HC, Matthes E, Müller WAY: Antisense oligonucleotides: inhibitors of splicing of mRNA of human immunodeficiency virus. Intervirology 33: 65-75, 1992).

Die ED50-Konzentrationen einiger ausgewählter MTN-Derivate für die genannten Tumorzellinien wurden nach Durchführung des kolorimetrischen XTT-Tests durch lineare Regression bestimmt (L. Sachs, Angewandte Statistik. Springer, Berlin, 1984, 1–168). Die jeweiligen Mittelwerte mit der dazugehörigen Standardabweichung wurden aus 10 unabhängigen Experimenten ermittelt.The ED 50 concentrations of some selected MTN derivatives for the tumor cell lines mentioned were determined by linear regression after carrying out the colorimetric XTT test (L. Sachs, Angewandte Statistik, Springer, Berlin, 1984, 1-168). The respective mean values with the associated standard deviation were determined from 10 independent experiments.

Ergebnis:Result:

Die experimentellen Daten sind in folgender Tabelle zusammengefasst. Es wird deutlich, dass die MTN-Derivate schon bei niedrigen Konzentrationen bis zu 0,07 μg/ml die Zellproliferation nach 72 Stunden entscheidend reduzieren. Besonders stark hemmend – und hochselektiv – sind MTN und auch DMTN mit einer Aktivität (ED50-Konzentration) von 0,07 (bzw. 0,09) μg/ml im L5178y-Zell-System. Auch die übrigen Derivate besitzen eine ausgeprägte Wirkung auf die Zellproliferation. Die ED50-Konzentrationen der MTN-Derivate in Zellkulturansätzen von PC-12-Zellen sowie von HeLa-S3-Zellen liegen im vergleichbaren Bereich niedriger. Beispielhaft kann das Derivat MTN erwähnt werden, das bei L5178y-Zellen eine ED50-Konzentration von 0,07 μg/ml aufweist; geringer wirksam ist MTN bei Ansätzen mit HeLa S3-Zellen (1,0 μg/ml) oder PC-12-Zellen (2,5 μg/ml).The experimental data are summarized in the following table. It becomes clear that even at low concentrations of up to 0.07 μg / ml, the MTN derivatives decisively reduce cell proliferation after 72 hours. Particularly inhibitory - and highly selective - are MTN and also DMTN with an activity (ED 50 concentration) of 0.07 (or 0.09) μg / ml in the L5178y cell system. The other derivatives also have a pronounced effect on cell proliferation. The ED 50 concentrations of the MTN derivatives in cell culture mixtures of PC-12 cells and HeLa-S3 cells are lower in the comparable range. By way of example, mention may be made of the derivative MTN which has an ED 50 concentration of 0.07 μg / ml in L5178y cells; MTN is less potent in the presence of HeLa S3 cells (1.0 μg / ml) or PC-12 cells (2.5 μg / ml).

Figure 00160001
Figure 00160001

Umsetzbare Schlussfolgerung:Conclusive conclusion:

Deshalb wird geschlossen, dass das Antitumorspektrum sowohl von MTN als auch der MTN-Derivate breit ist. Besonders stark proliferationshemmend wirken die Verbindungen bei L5178y-Zellen. Vergleichende Hemmversuche zeigen, dass MTN und DMTN im Vergleich zu unsubstituiertem 1,4-Naphthochinon eine deutlich höhere Hemmaktivität aufweist. Ähnliche Ergebnisse ergaben sich bei Einsatz der Derivate der Ansprüche 4 und 5.Therefore it is concluded that the antitumour spectrum of both MTN and also the MTN derivatives is broad. Particularly resistant to proliferation the compounds act on L5178y cells. Comparative inhibition experiments show that MTN and DMTN compared to unsubstituted 1,4-naphthoquinone a much higher one inhibitory activity having. Similar Results were obtained using the derivatives of claims 4 and 5th

Beispiel 3: Biologische Aktivität: Anti-angiogenetische WirkungExample 3: Biological Activity: Anti-angiogenic effect

Testansatz:Test Batch:

Die hier angewandte Methode, der Chorioallantois-Membran (CAM)-Test, basiert auf einem publizierten Verfahren (Crum R, Sazbo S, Fokeman J: A new class of steroids inhibit angiogenesis in presence of heparin and heparin fragments. Science 231:1375–1378, 1985). Die Testsubstanz MTN wurde in mindestens vier verschiedenen Dosen von 0,25 ng bis 1 ng in Agarblöckchen mit einem Durchmesser von 4 mm eingebracht. Die Agarkonzentration lag bei 2,5%. Nachdem die Substanz in den Agar eingedrungen war, wurde das Blöckchen auf die Chorioallantoismembran aufgetragen. Befruchtete 5 Tage alte Eier wurden mit 70%igem Alkohol äußerlich sterilisiert. Nach Lokalisierung der CAM wurde ein 1 mm × 1 mm großes Fenster in der Schale eröffnet. Das Agarblöckchen wurde 2–3 mm vom zentralen Blutgefäß entfernt auf die Region mit den proliferierenden Kapillaren aufgesetzt. Anschließend wurde das Schalenfenster mit Parafilm wieder verschlossen und die Eier bei 38°C für weitere 48 Stunden inkubiert. Anschließend wurde der potentielle antiangiogenetische Effekt bestimmt. Als Positiv-Kontrolle wurde Hydrocortison (60 μg/Disk) zusammen mit Heparin (100 μg/Disk) angewandt. Pro Testsubstanz wurden mindestens 15 befruchtete Eier eingesetzt.The method used here, the chorioallantoic membrane (CAM) test, is based on a published method (Crum R, Sazbo S, Fokeman J: A new class of steroid inhibition angiogenesis in presence of heparin and heparin fragments. Science 231: 1375-1378, 1985). The test substance MTN was up in at least four different doses from 0.25 ng up 1 ng in agar blocks introduced with a diameter of 4 mm. The agar concentration was 2.5%. After the substance had penetrated into the agar, became the little block applied to the chorioallantoic membrane. Fertilized 5 days old Eggs became external with 70% alcohol sterilized. After localization of the CAM became a 1 mm × 1 mm large window opened in the shell. The agar block was 2-3 mm away from the central blood vessel placed on the region with the proliferating capillaries. Subsequently was the shell window with parafilm closed again and the eggs at 38 ° C for further Incubated for 48 hours. Subsequently the potential antiangiogenic effect was determined. As a positive control was hydrocortisone (60 μg / disk) together with heparin (100 μg / disc) applied. At least 15 fertilized eggs per test substance used.

Ergebnis:Result:

Der Chorioallantois-Membran (CAM)-Test gilt als sehr zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung potentiell anti-angiogenetischer Wirkungen von Substanzen (siehe: Auerbach R, Lewis R, Shinners B, Kuba, L, Akhtar N: Angiogenesis assays: a critical overview. Clinical Chem 49:32–40, 2003).Of the Chorioallantoic membrane (CAM) test is considered a very reliable procedure for the determination of potentially anti-angiogenic effects of substances (see: Auerbach R, Lewis R, Shinners B, Cuba, L, Akhtar N: Angiogenesis assays: a critical overview. Clinical Chem 49: 32-40, 2003).

Abbildung (siehe auch 4) Wirkung von MTN auf die Vaskularisierung in Hühnchenembryonen im CAM-Assay. 4A zeigt das Kapillarmuster von Embryonen, die mit einem Agarblöckchen, das keine Testsubstanz enthielt, über 48 Stunden inkubiert wurden. 4B zeigt das Kapillarmuster nach Behandlung mit 0,25 ng MTN pro Disk und 4C einen entsprechenden Ansatz mit 1 ng MTN pro Disk. Eine sehr stark ausgeprägte Störung der Kapillarorganisation sieht man dort, wo die mit MTN getränkten Agar-Disks (Pfeilspitzen und mit "d" markiert) aufgebracht waren. Vergrößerung: × 10.Illustration (see also 4 ) Effect of MTN on vascularization in chicken embryos in the CAM assay. 4A shows the capillary pattern of embryos incubated with an agar block containing no test substance for 48 hours. 4B shows the capillary pattern after treatment with 0.25 ng MTN per disc and 4C a corresponding approach with 1 ng MTN per disc. A very pronounced disorder of the capillary organization can be seen where the agar discs soaked with MTN (arrowheads and marked with "d") were applied. Magnification: × 10.

In der durchgeführten In-vivo-Untersuchungsreihe wurde festgestellt, dass MTN einen sehr wirksamen angiogenetischen Inhibitor darstellt. Bei einer Dosis von 1 ng/Disk wird eine 100%ige Eliminierung der Kapillaren gemessen. Wie in der 4 (Teilbild C) gezeigt, kommt es in der Region, in der das Agarblöckchen aufgebracht wurde, zu einer kompletten Unterdrückung der Kapillarbildung. Im Vergleich dazu ist das physiologische Muster der Kapillarbildung in Teilbild A gezeigt. Bei der niedrigeren Dosis von 0,25 ng pro Disk ist ebenfalls noch eine Fehlorganisation der Kapillarmusters zu sehen (Teilbild B). Eine quantitative Analyse ergab, dass bei der Dosis von 0,25 ng pro Disk bei 20% der Embryonen ein signifikant anti-angiogenitischer Effekt nachzuweisen ist (Anzahl der untersuchten Embryonen: n = 20), während bei einer etwas höher gewählten Dosis zwischen 0,50 ng und 1 ng (pro Disk) MTN einen 100% anti-angiogenischen Effekt erzeugt.In the in vivo study series, MTN was found to be very effective represents angiogenic inhibitor. At a dose of 1 ng / disk, 100% elimination of the capillaries is measured. Like in the 4 (Panel C), complete capillary suppression occurs in the region where the agar block was applied. In comparison, the physiological pattern of capillary formation is shown in Panel A. At the lower dose of 0.25ng per disc there is also a misorganization of the capillary patterns (panel B). A quantitative analysis showed that at the dose of 0.25 ng per disc in 20% of the embryos a significant anti-angiogenic effect can be detected (number of embryos examined: n = 20), while with a slightly higher dose between 0, 50 ng and 1 ng (per disc) MTN produced a 100% anti-angiogenic effect.

Umsetzbare Schlussfolgerung:Conclusive conclusion:

Die hier dargelegten Ergebnisse zeigen, dass MTN bei den sehr niedrigen Dosen von 0,25 ng bis 1 ng pro Disk einen ausgeprägten anti-angiogenetischen Effekt zeigt. Es ist deshalb zu erwarten, dass MTN bei vergleichbar niedrigen Dosen diesen Effekt auf die Vaskularisierung nicht nur bei Hühnchenembryonen, sondern auch in anderen Vertebraten und in menschlichen Tumoren zeigt. Ähnliche Ergebnisse ergaben sich auch für DMTN sowie die Derivate der Ansprüche 4 und 5.The Here presented results show that MTN at the very low Doses of 0.25 ng to 1 ng per disc have a pronounced anti-angiogenic Effect shows. It is therefore to be expected that MTN at comparable low doses not only this effect on vascularization in chicken embryos, but also in other vertebrates and in human tumors shows. Similar Results were also obtained for DMTN and the derivatives of the claims 4 and 5.

Beispiel 4: Biologische Aktivität: Antibakterielle WirkungExample 4: Biological Activity: Antibacterial effect

Zur Testung auf antibakterielle Aktivität wurden die folgenden beiden Bakterienstämme eingesetzt: Escherichia coli (DHSalpha), ein gram-negatives Bakterium, und Bacillus subtilis (168), ein gram-positives Bakterium. Die Untersuchungen wurden sowohl mit MTN als auch mit DMTN und Naphthochinon durchgeführt.to Testing for antibacterial activity were the following two bacterial strains used: Escherichia coli (DHSalpha), a Gram-negative bacterium, and Bacillus subtilis (168), a gram-positive bacterium. The investigations were performed with both MTN and DMTN and naphthoquinone.

Figure 00180001
Figure 00180001

Testansatz:Test Batch:

Ein Bakterienrasen wurde nach Übernachtkultur und anschließendem Ausstreichen auf solidem Agar angezüchtet. Als Kulturmedium wurde LB-Agar (10 g Peptone, 5 g Hefe-Extrakt, 5 g NaCl und 15 g Agar ad 1 Liter) eingesetzt.One Bacterial lawn was after overnight culture and then Spread on solid agar. As a culture medium was LB agar (10 g peptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl and 15 g agar 1 liter).

Entsprechend den etablierten Methoden wurde der antibakterielle Test durchgeführt. Seriell verdünnte Konzentrationen von MTN wurden auf Papierdisks (Durchmesser 6 mm) aufgetragen. Nach Verdunstung des Lösungsmittels wurden die Disks auf die Bakterienrasen aufgelegt und die Kulturen 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde der Durchmesser derjenigen Zone bestimmt, bei der keine Bakterien zu erkennen waren (Hemmhof).Corresponding In the established methods the antibacterial test was carried out. Serial diluted concentrations of MTN were applied to paper discs (diameter 6 mm). To Evaporation of the solvent The discs were placed on the bacterial lawn and the cultures Incubated for 24 hours at 30 ° C. Subsequently the diameter of that zone was determined at which no bacteria were recognizable (Hemmhof).

Ergebnis:Result:

Die Untersuchungen ergaben, dass Naphthochinon und dessen Derivate bei einer Dosis von 10 μg pro Disk eine meßbare antibakterielle Wirkung bei Bacillus subtilis (gram-positiv) erzeugen; die getesteten Derivate sind entsprechend aktiv. Die Wirkung auf das gram-negative Bakterium Escherichia coli ist gering.The Investigations showed that naphthoquinone and its derivatives in a dose of 10 μg one measurable per disc produce antibacterial activity in Bacillus subtilis (gram-positive); the tested derivatives are active accordingly. The effect on the gram-negative bacterium Escherichia coli is low.

Figure 00190001
Figure 00190001

Die Aktivität ist angegeben mit: schwach < 2 mm Hemmhof; stark > 2 mm Hemmhof.The activity is indicated with: weak <2 mm Hemmhof; strong> 2 mm Hemmhof.

Umsetzbare Schlussfolgerung:Conclusive conclusion:

Es wird deutlich, dass die Naphthochinon-Derivate auf gram-positive Bakterien, hier das Bakterium Bacillus subtilis, eine anti-bakterielle Wirkung zeigen.It it becomes clear that the naphthoquinone derivatives on Gram-positive Bacteria, here the bacterium Bacillus subtilis, an anti-bacterial Show effects.

Beispiel 5: Biologische Aktivität: Fungizide WirkungExample 5: Biological Activity: Fungicidal action

Zur Austestung der potentiell fungiziden Wirkung der zur Anmeldung kommenden Substanzen (MTN, DMTN und Naphthochinon sowie Derivate davon) wurde Saccharomyces cerevisiae ausgewählt.to Testing the potentially fungicidal effect of the registration Substances (MTN, DMTN and naphthoquinone and derivatives thereof) became Saccharomyces cerevisiae selected.

Testansatz:Test Batch:

Der Hefestamm wurde nach Übernachtkultur als Rasen auf YPD-Agar (20 g Peptone, 10 g Hefe-Extrakt, 20 g Glucose, 15 g Agar ad 1 Liter) ausgesät.Of the Yeast strain was after overnight culture as a lawn on YPD agar (20 g peptone, 10 g yeast extract, 20 g glucose, 15 g agar ad 1 liter).

Seriell verdünnte Konzentrationen von MTN bzw. dessen Derivaten wurden auf Papierdisks (Durchmesser 6 mm) aufgetragen. Nach Verdunstung des Lösungsmittels wurden diese Disks auf den Hefe-Rasen aufgelegt und die Kulturen 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Anschließend wurde der Durchmesser derjenigen Zone bestimmt, bei der keine Hefe zu erkennen war (Hemmhof).Serial diluted Concentrations of MTN or its derivatives were on paper disks (Diameter 6 mm) applied. After evaporation of the solvent These discs were put on the yeast turf and cultures 24 hours at 30 ° C incubated. Subsequently the diameter of that zone was determined at which no yeast was recognizable (Hemmhof).

Ergebnis:Result:

Die Untersuchungen ergaben, dass Naphthochinon bei einer Dosis von 10 μg pro Disk keine starke antifungische Wirkung erzeugt. Der Hemmhof ist < 2 mm.The Investigations revealed that naphthoquinone at a dose of 10 μg per disc does not produce a strong antifungal effect. The Hemmhof is <2 mm.

Beispiel 6: Biologische Aktivität: Wirkung in vivoExample 6: Biological Activity: Effect in vivo

Zur Bestimmung der Toxizität wurde die Testsubstanz MTN an Mäusen getestet. Sowohl die Überlebensrate als auch die Änderung des Gewichts der Tiere wurde als Parameter für einen potentiell toxischen Effekt herangezogen. Für diese Untersuchungen wurden männliche (outbred) NMRI-Mäuse (32–36 g; Alter: 8–9 Monate) eingesetzt.to Determination of toxicity became the test substance MTN in mice tested. Both the survival rate as well as the change The weight of the animals was used as a parameter for a potentially toxic Effect used. For these investigations were male (outbred) NMRI mice (32-36 G; Age: 8-9 months) used.

Testansatz:Test Batch:

Die Testsubstanz MTN wurde in Methylzellulose gelöst und den Tieren i.p. injiziert. Fünf Tage lang wurde den Tieren eine Dosis von 30 mg/kg (pro Tag) bzw. 3 mg/kg (pro Tag) verabreicht. Täglich wurde das Gewicht der Tiere bestimmt. Pro Kollektiv wurden 5 Tiere behandelt. Die Überlebensrate als auch das mittlere Gewicht des Kollektives wurde nach 5 und nach 11 Tagen bestimmt.The Test substance MTN was dissolved in methyl cellulose and injected i.p. injected. Five days For a long time, the animals were given a dose of 30 mg / kg (per day) or 3 mg / kg (per day). Every day the weight of the animals was determined. Five animals per collective treated. The survival rate as well as the average weight of the collective became after 5 and after Determined 11 days.

Ergebnis:Result:

Während dieser Zeit veränderte sich das Gewicht der MTN-behandelten Tiere bei einer Dosis von 3 mg/kg gegenüber dem der Kontrollen nicht signifikant. Jedoch kam es bei den Tieren, die mit 30 mg/kg behandelt wurden, zu einer starken Gewichtsabnahme; auch starben bei den mit 30 mg/kg MTN-behandelten Tieren insgesamt zwei Tiere nach dem 3. und 4. Tag. In der Kontrollgruppe oder in der mit 3 mg/kg MTN-behandelten Tiergruppe starb keines der Versuchstiere.During this time, the weight of the MTN-treated animals at a dose of 3 mg / kg did not change significantly from that of the controls. However, the animals treated with 30 mg / kg deltas, leading to severe weight loss; In the two animals treated with 30 mg / kg MTN, two animals died after the third and fourth day. None of the experimental animals died in the control group or in the 3 mg / kg MTN treated group.

Figure 00210001
Figure 00210001

8.3. Umsetzbare Schlussfolgerung:8.3. Conclusive conclusion:

Ergebnis: Aus diesen Daten wird geschlossen, dass die subakute Toxizität von MTN bei einer fünftägigen i.p.-Behandlung >> 3 mg/kg beträgt.Result: From these data it is concluded that the subacute toxicity of MTN for a five-day i.p. treatment is >> 3 mg / kg.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.The in the foregoing description, claims and drawings disclosed features of the invention can both individually and also in any combination for the realization of the invention in its various embodiments be essential.

Claims (22)

Verbindung der allgemeinen Formel 2:
Figure 00220001
wobei R1 entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes C1-C18-Alkyl wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, ein monosubstituiertes oder polysubstituiertes, gerades, verzweigtes oder cyclisches C1-C18-Alkenyl oder eine Acylgruppe wie z.B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl, verzweigte oder Heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppen sein kann, und R2 bis R6 unabhängig voneinander entweder H, ein unsubstituiertes, monosubstituiertes oder polysubstituiertes C1-C18-Alkyl, wobei das Alkyl gerade, verzweigt oder cyclisch sein kann, Alkenyl, ein unsubstituierter, monosubstituierter oder polysubstituierter Aryl- oder He teroarylrest, eine unsubstituierte, monosubstituierte oder polysubstituierte Benzylgruppe, eine Acylgruppe, wie z.B. Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, Fumaryl, Maleyl, Succinyl, Benzoyl oder eine verzweigte oder Heteroatom- oder arylsubstituierte Acylgruppe, ein Alkoxysubstituent, wie z.B. -OMe, -OEt, -OnPr, -iPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu, dessen Alkylgruppe verzweigt, unverzweigt oder cyclisch ist, eine über ein Schwefelatom gebundene Alkylgruppe, wie z.B. -SMe, -SEt, oder eine Sulfonylgruppe, wie z. B. -SO3H, -SO2Me, -SO2CF3, SO2C6H4CH3 oder SO2C6H4CH2Br, oder ein Stickstoffsubstituent, wie z.B. -NH2, -NHR, -NRR' (mit R, R' = Alkyl, Aryl, Heteroaryl, Alkenyl), -NC oder -NO2, oder Fluor, Chlor Brom, Iod, -CN oder ein Heterosubstituent sind, und pharmazeutisch annehmbare Salze oder Solvate der Verbindung.Compound of general formula 2:
Figure 00220001
wherein R 1 is either H, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted C 1 -C 18 alkyl wherein the alkyl may be straight, branched or cyclic, a monosubstituted or polysubstituted, straight, branched or cyclic C 1 -C 18 alkenyl or an acyl group such as formyl, acetyl, trichloroacetyl, fumaryl, maleyl, succinyl, benzoyl, branched or heteroatom- or aryl-substituted acyl groups, and R 2 to R 6 are independently H, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted C 1 -C 18 alkyl where the alkyl may be straight, branched or cyclic, alkenyl, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted aryl or heteroaryl radical, an unsubstituted, monosubstituted or polysubstituted benzyl group, an acyl group such as formyl, acetyl, trichloroacetyl, fumaryl, maleyl, succinyl , Benzoyl or a branched or heteroatom- or aryl-substituted acyl group, an alkoxy substituent, such as for example, -OMe, -OEt, -OnPr, -iPr, -OnBu, -OiBu, -OsecBu, -OtBu, whose alkyl group is branched, unbranched or cyclic, an alkyl group bonded via a sulfur atom, such as -SMe, -SSE, or a sulfonyl group, such as. B. -SO 3 H, -SO 2 Me, -SO 2 CF 3 , SO 2 C 6 H 4 CH 3 or SO 2 C 6 H 4 CH 2 Br, or a nitrogen substituent such as -NH 2 , -NHR, -NRR '(with R, R' = alkyl, aryl, heteroaryl, alkenyl), -NC or -NO 2 , or fluorine, chlorine, bromine, iodine, -CN or hetero substituent, and pharmaceutically acceptable salts or solvates of the compound. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 = CH3 und R2-R6 = H.Compound according to Claim 1, characterized in that R 1 = CH 3 and R 2 -R 6 = H. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 = CH3, R2 = SCH3 und R3-R6 = H.A compound according to claim 1, characterized in that R 1 = CH 3 , R 2 = SCH 3 and R 3 -R 6 = H. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 = -CH2-CH(CH3)2 und R2-R6 = H.A compound according to claim 1, characterized in that R 1 = -CH 2 -CH (CH 3 ) 2 and R 2 -R 6 = H. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R1 = -C(CH3)3 und R2-R6 = H.Compound according to Claim 1, characterized in that R 1 = -C (CH 3 ) 3 and R 2 -R 6 = H. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5, umfassend das Züchten eines Bakteriums in Kulturmedium, wobei besagtes Bakterium mit dem alpha-Proteobakterium MBIC3368 verwandt ist, 99% Sequenzidentität hinsichtlich der rDNA zu dem alpha-Proteobakterium MBIC3368 aufweist und mit dem marinen Schwamm Dysidea avara assoziiert vorkommt, und Isolieren mindestens einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-3 aus dem Kulturmedium und/oder der Bakterienbiomasse, wobei das Isolieren mindestens einen der folgenden Schritte umfaßt: a) Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, bevorzugt einem C1-C6-Alkohol, bevorzugter n-Butanol, b) Gelfitration.A method of producing a compound according to any one of claims 1-5 comprising culturing a bacterium in culture medium, said bacterium being related to the alpha proteobacterium MBIC3368, having 99% sequence identity with respect to the rDNA to the alpha proteobacterium MBIC3368 and with the marine Sponge Dysidea avara, and isolating at least one compound according to any one of claims 1-3 from the culture medium and / or the bacterial biomass, the isolating comprising at least one of the following steps: a) extraction with an organic solvent, preferably a C 1 - C 6 -alcohol, more preferably n-butanol, b) gel filtration. Verfahren nach Anspruch 6, weiterhin umfassend eine anschließende synthetische Derivatisierung der isolierten Verbindung.The method of claim 6, further comprising subsequent synthetic derivatization of the isolated compound. Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 zur Verwendung als Medikament.A compound according to any one of claims 1-5 for use as Drug. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 zusammen mit geeigneten Zusatz- oder Hilfsstoffen.A pharmaceutical composition comprising a compound according to one of the claims 1-5 together with suitable additives or auxiliaries. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz vorliegt.Pharmaceutical composition according to claim 9, characterized in that the compound in the form of a depot substance or as a precursor together with a suitable, pharmaceutically acceptable Dilution solution or vehicle is present. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung in Form einer Dosierungseinheit vorliegt, wobei eine Dosierungseinheit die Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 in einer Menge enthält, die im Bereich von 5 μg bis 50 μg, bevorzugt von 10 μg bis 40 μg, bevorzugter von 15 μg bis 30 μg, am bevorzugtesten bei ungefähr 20 μg liegt.Pharmaceutical composition according to claim 9 or 10, characterized in that the composition in the form a dosage unit is present, wherein a dosage unit the A compound according to any one of the claims Contains 1-5 in an amount in the range of 5 μg up to 50 μg, preferably of 10 μg up to 40 μg, more preferably 15 μg up to 30 μg, most preferably at about 20 μg. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9-11, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in der Zusammensetzung in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um bei Verabreichung an einen Säuger eine Blutkonzentration zu erzielen, die im Bereich 0,3 bis 3,0 μg/ml liegt.Pharmaceutical composition according to any one of claims 9-11, characterized in that the compound is in the composition in an amount sufficient to be administered a mammal to achieve a blood concentration that is in the range 0.3 to 3.0 μg / ml. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie weitere Chemotherapeutika enthält.A pharmaceutical composition according to any one of claims 9 to 12, characterized in that it contains further chemotherapeutic agents. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 13 in Form von Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropflösungen, Suppositorien, Injektions- oder Infusionszubereitungen zur peroralen, rektalen oder parenteralen Verwendung.A pharmaceutical composition according to any one of claims 9 to 13 in the form of tablets, dragees, capsules, drop solutions, Suppositories, injectables or infusion preparations for oral, rectal or parenteral use. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumorerkrankungen oder Infektionen durch gram-negative Bakterien.Use of a compound according to any one of claims 1-5 for the manufacture of a medicament for the treatment of tumor diseases or infections by gram-negative Bacteria. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Hemmung von Angiogenese.Use of a compound according to any one of claims 1-5 for the manufacture of a medicament for prevention or inhibition of angiogenesis. Verwendung nach Anspruch 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Hemmung der Angiogenese bei Tumorerkrankungen.Use according to claim 16 for the preparation of a Medicament for preventing or inhibiting angiogenesis in tumor diseases. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1-5 zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Hemmung der neointimalen Proliferation.Use of a compound according to any one of claims 1-5 for the manufacture of a medicament for prevention or inhibition neointimal proliferation. Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Verbindung auf einen Stent aufgebracht wird, bevorzugt als Beschichtung.Use according to claim 18, wherein the compound is applied to a stent, preferably as a coating. Verwendung nach einem der Ansprüche 15-18, wobei die Verbindung in Form einer Depotsubstanz oder als Vorläufer vorliegt, zusammen mit einer geeigneten, pharmazeutisch verträglichen Verdünnungslösung oder Trägersubstanz.Use according to any one of claims 15-18, wherein the compound in the form of a depot substance or as a precursor, together with a suitable, pharmaceutically acceptable dilution solution or Carrier. Verwendung nach einem der Ansprüche 15-18 und 20, wobei die Verbindung in einer Menge eingesetzt wird, die im Bereich von 5 μg bis 50 μg, bevorzugt von 10 μg bis 40 μg, bevorzugt von 15 μg bis 30 μg, am bevorzugtesten bei ungefähr 20 μg liegt.Use according to any one of claims 15-18 and 20, wherein the Compound is used in an amount ranging from 5 micrograms to 50 micrograms, preferably of 10 μg up to 40 μg, preferably 15 μg up to 30 μg, most preferably at about 20 μg. Verwendung nach einem der Ansprüche 15-18 und 20, wobei die Verbindung in einer Menge eingesetzt wird, die ausreicht, um bei Verabreichung an einen Säuger eine Blutkonzentration zu erzielen, die im Bereich von 0,3 bis 3,0 μg/ml liegt.Use according to any one of claims 15-18 and 20, wherein the Compound is used in an amount that is sufficient to Administration to a mammal to achieve a blood concentration that is in the range of 0.3 to 3.0 μg / ml.
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