-
Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zum Feststellen optimaler Implantationsbedingungen
durch die Bestimmung von humanem endometrialen hCG und/oder βhCG im Serum,
Plasma und im Peripherblut der Lutealphase (prospektiv) sowie im
Menstrualblut (retrospektiv). Die Freisetzung des endometrialem
hCG ist Ausdruck ungestörter
sekretorischer Transformation des Endometriums.
-
Die
Erfindung betrifft ferner einen Testkit zur Durchführung des
Verfahrens.
-
Es
ist bereits bekannt, das trophoblastäre Gesamtmolekül hCG (Total-hCG)
allein oder in der Summe mit den freien Untereinheiten zu bestimmen.
Dafür sind
unterschiedliche Testkits vorgeschlagen worden, die mit unterschiedlicher
Spezifität
arbeiten (1) und die Bestimmung von holo-hCG (Total-hCG), βhCG und aCG ermöglichen
(2). Die Heterogenität
des hCG im biologischen Material (intaktes α,β-Heterodimer, freies aCG, freies βhCG, βhCG core-Fragment,
nicked hCG, nicked βhCG),
bezogen auf die Bindung an den jeweilig verwendeten Antikörper, erschweren
die genaue Bestimmung und die Standardisierung eines Nachweisverfahrens
für das
endometriale hCG (3–5).
Eine zusätzliche
Heterogenität
der hCG-Bestimmung in der späten
Lutealphase und frühen
Schwangerschaft kann im geringen Grad auch zwischen den vier nativen,
hyperglykosylierten oder desialylierten Kohlenhydratseitenketten
des C-terminalen Endes (CTP) von βhCG
(Aminosäure 113–145), wie
sie different zwischen früher
und mittlerer Schwangerschaft und bei Chorioncarcinom im trophoblastären βhCG beobachtet
worden sind, auftreten (4, 6–10).
Weiterhin kann die Variation des Alanin, A (Endometrium) und Aspartat,
D (Trophoblast) in der Aminosäureposition
117 des C-terminalen Endes von βhCG (βCG-CTP) bei
endometrialem, blastozytärem
und trophoblastärem βhCG für die Epitop-Spezifität des verwendeten
Antikörpers
von Bedeutung sein (11). Neben der bekannten Änderung der Aminosäuresequenz
in Position 117 des CTP vom Exon 3 des βhCG für nicht-trophoblastäres hCG
haben wir eine weitere Differenz der Aminosäure bei Position 4 im Exon
2 zwischen Trophoblast und Endometrium finden können (Pro-Met, P-M).
-
Die
bisher etablierten Verfahren haben den Nachteil, keine ausreichende
Aussage über
die Differenziertheit der exprimierten hCG-Gene treffen zu können. Das
hat seine Ursache darin, daß die
Verfahren die Heterogenität
der vorliegenden βhCG-Epitope
aus jeweils endometrialem, trophoblastärem, leukozytärem oder
chorioncarcinomähnlichen
Ursprung nicht erfassen.
-
Die
Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Bestimmung von humanem
endometrialen hCG und/oder βhCG
anzugeben, das unter Einsatz eines leicht handhabbaren Testkits
die zuverlässige
Aussage einer vorausgegangenen optimalen oder minderwertigen sekretorischen
Transformation des Endometriums bzw. einer bestehenden optionalen
Implantationsvoraussetzung für
einen Embryo oder für
die frühzeitige
Diagnose einer erfolgten Schwangerschaft ermöglicht.
-
Die
Erfindung hat folgende Aufgabe zu lösen:
- – Aussagen
zur sekretorischen Transformation des Endometriums im normalen,
gestörten
und hormonstimulierten Zyklus,
- – frühzeitige
Diagnostik eines implantationsfähigen
Endometriums,
- – frühzeitige
Diagnostik einer Schwangerschaft in Kombination von endometrialem
und trophoblastärem hCG,
- - Differenzierung eines early pregnancy loss,
- - Differenzierung zwischen Extrauteringravidität und intrauteriner
Schwangerschaft,
- – Differenzierung
falsch positiver hCG-Werte (zum Beispiel der hCG-Titer bei Patientinnen
nach IUD-Einlage).
-
Das
Verfahren richtet sich auf die Angabe einer Schrittfolge zur Bestimmung
von endometrialem hCG und/oder βhCG
(eβhCG),
womit die angegebene Zielfunktion erreicht werden kann.
-
Der
Erfindung liegt die wissenschaftlichen Erkenntnisse zugrunde, daß im sekretorischen
Endometrium gesunder nichtschwangerer Frauen epitheliales hCG und/oder βhCG gebildet
wird (12–15).
Auch in der Dezidua wird bei Patientinnen mit Extrauteringravidität hCG und/oder βhCG im Drüsenepithel
nachgewiesen (16). Der Nachweis erfolgt durch Immunhistochemie,
in situ-Hybridisierung, Western Blot und RT-PCR. Nach Sequenzierung
wurde von uns nachgewiesen, daß die β-Untereinheit
des endometrialen hCG (eβhCG)
different zum herkömmlichen
trophoblastären
hCG (tβhCG)
ist, vor allem im Promotorgen des Exon 1 und auch im Exon 3. Das
zeigt, daß eβhCG vom Gen
7 und 6 translatiert wird, während
trophoblastäres βhCG vorwiegend vom
Gen 5 und auch Gen 8 und 3 gebildet wird.
-
Die
Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß das erste in der Frühschwangerschaft
nachgewiesene βhCG
entgegen der allgemeinen Auffassung nicht tβhCG ist, sondern eβhCG. Die
Aminosäure-
und Nukleotidsequenz des endometrialen βhCG wird hier erstmals in SEQ
ID No 5 und SEQ ID No 7 dargestellt (Endo). Da die Aminosäure- und
Nukleotidsequenz des endometrialen hCG in SEQ ID No 5 und No 7 nicht
ausschließlich
hCG β7 oder
hCG β6 ist,
bezeichnen wir die endometriale Gensequenz als Gen β6e.
-
Die
Erfindung vermeidet die Nachteile bisher bekannter Methoden und
der zu der Durchführung
entwickelten Testkits der Total-hCG/βhCG-Bestimmung durch den Einsatz
des endometrium- und deziduaepithel-spezifischen eβhCG-Antikörpers im
Verfahren des Testansatzes.
-
Dafür werden
spezifische Antikörper
mit veränderter
Aminosäuresequenz
im Exon 2 (Position +4) und Exon 3 (Position +117) entwickelt und
eingesetzt, die nur den endometrialen hCG- und/oder βhCG-Anteil
im Serum, Plasma und Peripherblut sowie im Menstrualblut erfassen.
-
Der
endometriale hCG- und/oder βhCG-Anteil
kann aber auch mit dem in der Erfindung angegebenen Verfahren der
Quotientenbildung von hCG- und/oder βhCG-Meßwerten als Wert Menstrualblut
durch Wert Serum mit den herkömmlichen
Total-hCG/βhCG-Immunoassays erfaßt werden.
-
Die
Erfindung wird nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne
auf diese beschränkt zu
sein.
-
Ausführungsbeispiel 1:
-
Der
Patientin wird zur Diagnostik Peripherblut der mittleren bis späten Sekretionsphase
entnommen (Heparinblut, Blut). Das Plasma oder Serum wird bis zur
Messung bei –20° C gelagert.
-
Als
Antigenmaterial für
die Antikörpergewinnung
des endometrialen hCG und/oder βhCG
werden zum einen je ein synthetisches Peptid der Aminosäuresequenz
109–118
oder 109–122
oder sequenzversetzt für das
hCG β7, β6 und hCG β5, β8, β3 des C-terminalen
Endes (CTP) im Exon 3 eingesetzt:
und weiterhin
eine Zell-Linie humaner endometrialer Drüsenepithel-Zellen wie RL 95-2
oder eine andere Zell-Linie (humane uterine epitheliale Zell-Linie
RL 95-2).
-
Vor
dem Einsatz der endometrialen Epithelzellen wird die mRNA-Expression
des hCG β7, β6, β6e im Promotorgen
Exon 1 und im Exon 3 (CTP) in den nativen Zellen und nach Kultur
mit RT-PCR geprüft
und durch Sequenzanalyse bestätigt.
-
Die
monoklonalen Antikörper
der CTP-Peptide und der Endometrium-Epithel-Zell-Linie gegen hCG β7, β6 werden
nach Immunisierung, Isolierung, Hybridisierung und Fein reinigung
in vorgegebener Vorschrift hergestellt und bei –20° C gelagert. Dazu werden zunächst sechs
bis acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse mit einer Endometrium-Epithel-Zell-Linie
immunisiert. Aus den Milzen derart immunisierter Mäuse werden
die Zellen isoliert und mit Mausmyelomzellen fusioniert. Die geeigneten
Myelomzellen P3-X63-Ag8.653 (17) werden in RPMI-1640 mit 10 % fetalem
Kälberserum
gezüchtet.
In einem Kulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin
enthält
(18), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten
Myelomzellen abgetrennt und Zellklone selektiert, welche Antikörper der
gewünschten
Spezifität
sezernieren.
-
Die
Selektierung der Hybridome erfolgt in an sich bekannter Weise, ein
besonders produktives Hybridom wird ausgewählt Die Herstellung von Hybridomen,
welche Antikörper
der gewünschten
Spezifität
sezerniere, ist zuverlässig
wiederholbar. Eine Hinterlegung ist deshalb nicht erforderlich.
-
Sandwich-ELISA:
Die gereinigten monoklonalen Antikörper (Mab) werden an ELISA-ptates (96 wells) adsorbiert
(8 μg/ml
in PBS, 1 Stunde, 37° C)
mit anschließendem
Blocken und Waschen; Antigeninkubation (100 μl, 1 Stunde, 37° C) mit hCG
und/oder βhCG
oder dem synthetischen Peptid hCG β7, β6, β6e als Standardreihe und dem
Heparinplasma in Blocking-Puffer; Bestimmung des Sandwich-Mab, gekoppelt
an HRP type IV (Sigma) zu 100 μl
für 1 Stunde,
37° C nach
der Methode von Wilson und Nakane (19).
-
Menstrualblut:
Kann wie Peripherblut nach Zentrifugation zur Abtrennung von Zellen
und Stroma für den
direkten hCG β7, β6-CTP (AS
109–118;
109–122)-ELISA
und dem hCG β7, β6 (AS –5 bis +5)
eingesetzt werden.
-
Perfusat
nach Corpusabrasio: Einsatz nach Zentrifugation für die beiden
beschriebenen ELISA-Tests.
-
Ausführungsbeispiel 2:
-
Neben
der bekannten Änderung
der Aminosäuresequenz
in Position 117 des CTP vom Exon 3 des βhCG für nicht-trophoblastäres hCG
haben wir eine weitere Differenz der Aminosäure bei Position 4 im Exon 2
zwischen Trophoblast und Endometrium finden können (Pro-Met).
-
Alternativ
zum Ausführungsbeispiel
1 wird als Antigenmaterial für
die Antikörpergewinnung
des endometrialen hCG und/oder βhCG
zum einen je ein synthetisches Peptid der Aminosäuresequenz –5 bis + 5 oder sequenzversetzt
oder erweitert für
das endometriale oder trophoblastäre βhCG neben einer humanen uterinen epithelialen
Zell-Linie wie RL 95-2 eingesetzt:
-
Vor
dem Einsatz der endometrialen Epithelzellen wird die mRNA-Expression
des hCG β7, β6 im Promotorgen
Exon 1 und im Exon 2 bei Aminosäureposition
+4 in den nativen Zellen und nach Kultur mit RT-PCR geprüft und durch
Sequenzanalyse bestätigt.
-
Die
monoklonalen Antikörper
werden weiter wie in Ausführungsbeispiel
1 beschrieben hergestellt und in den beschriebenen ELISA-Test-Anordnungen
eingesetzt. Außerdem
besteht die Option in Kombination von Ausführungsbeispiel 1 und Ausführungsbeispiel
2 die gesamte Aminosäuresequenz
von –4
bis +122 oder eine Ligation mit beiden angegebenen Aminosäuresequenzen
als Antigen für
die Antikörpergewinnung
zu benutzen (sowohl für
Aminosäuresequenz
ehCG β7, β6 als auch
thCG β5, β8, β3).
-
Ausführungsbeispiel 3:
-
Gewinnung
von Menstrualblut nach normalem Zyklus, nach Hormontherapie, nach
IVF und ET ohne erfolgreiche Implantation sowie bei vorgesehener
Diagnostik des Zyklus bei Kinderwunschpatientinnen und bei IUD-Patientinnen.
-
Parallele
Gewinnung von Peripherblut zum selben Zeitpunkt als Heparinblut
oder Serum zum Ausschluss eines erhöhten unspezifischen Serum-hCG-Wertes
ist unbedingt erforderlich.
-
Vergleich
der hCG- und/oder βhCG-Konzentration
im biologischen Material der Desquamation des endometrialen Gewebes
nach Separation der epithelialen und Stromazellen, der peripheren
mononukleären
Blutzellen, der mononukleären
Immunzellen des endometrialen Epithels oder des Stromas für die hCG-
und/oder βhCG-Bestimmung.
-
Bei
einer definierten Differenz hohen Anteils von hCG und/oder βhCG im Menstrualblut
zu niedrigem Anteil im Peripherblut kann von lokaler endometrialer
Bildung ausgegangen werden. Für
das Peripherblut kann allein der übliche trophoblastäre hCG β5, β8, β3-Hormontest
(ELISA, MEIA u. a.) verwendet werden.
-
Der
auszuwertende Meßwert
berechnet sich aus der Quotientenbildung der Konzentration vom Total-hCG/βhCG-Meβwert im Menstrualblut
durch den Meßwert
im Plasma oder Serum.
-
Es
folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform
des DPMA heruntergeladen werden.
