DE10325639A1

DE10325639A1 - Determining particular conditions or alterations in the uterine mucosa, useful e.g. for assessing receptivity for implantation, by measuring concentration of specific forms of human chorionogonadotrophin

Info

Publication number: DE10325639A1
Application number: DE2003125639
Authority: DE
Inventors: Henry Prof. Dr. Alexander; Gerolf Dr. Zimmermann
Original assignee: Universitaet Leipzig
Current assignee: Universitaet Leipzig
Priority date: 2003-06-06
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2004-12-23

Abstract

Method for determining particular conditions or alterations in the uterine mucosa, or in the epithelium of other organs, by specific measurement of the concentration of human endometrial chorionogonadotrophin (ebeta hCG/ehCG) and/or non-trophoblastic hCG (hCG type I; beta 6, beta 7) in a body fluid sample, tissue sample and/or cells. Independent claims are also included for the following: (1) similar method that comprises determining the concentration of total hCG, or its beta -subunit, in a sample of menstrual blood; (2) antibodies (Ab1) that recognize specifically ebeta hCG/ehCG and non-trophoblastic hCG; (3) antibodies (Ab2) that recognize specifically trophoblastic hCG (type II/tbeta hCG) but not ebeta hCG/ehCG; (4) test kit for the new method that contains Ab1 or Ab2, also other antibodies and standards; (5) the endometrial beta -subunit of hCG having a 165 amino acid sequence (10), defined in the specification; (6) the beta e6 gene sequence, encoding ebeta hCG of (5), having a 861 bp sequence (7), defined in the specification; and (7) four new ebeta hCG peptides of sequences (1), (3), (12) and (14). Thr-Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Ala-(Ser) 4-Lys-Ala (1); Ser-Arg-Glu-Met-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro-Ile-Asn-Ala-Thr (3); Cys-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Ala-Ser-Ser (12); Ser-Arg-Glu-Met-Leu-Arg-Pro-Arg-Cys-Arg-Pro (14).

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Feststellen optimaler Implantationsbedingungen durch die Bestimmung von humanem endometrialen hCG und/oder βhCG im Serum, Plasma und im Peripherblut der Lutealphase (prospektiv) sowie im Menstrualblut (retrospektiv). Die Freisetzung des endometrialem hCG ist Ausdruck ungestörter sekretorischer Transformation des Endometriums.The The invention relates to a method for determining optimal implantation conditions by determining human endometrial hCG and / or βhCG in serum, Plasma and in the peripheral blood of the luteal phase (prospective) as well as in Menstrual blood (retrospective). The release of the endometrial hCG is an expression of undisturbed secretory transformation of the endometrium.

Die Erfindung betrifft ferner einen Testkit zur Durchführung des Verfahrens.The The invention further relates to a test kit for performing the Process.

Es ist bereits bekannt, das trophoblastäre Gesamtmolekül hCG (Total-hCG) allein oder in der Summe mit den freien Untereinheiten zu bestimmen. Dafür sind unterschiedliche Testkits vorgeschlagen worden, die mit unterschiedlicher Spezifität arbeiten (1) und die Bestimmung von holo-hCG (Total-hCG), βhCG und aCG ermöglichen (2). Die Heterogenität des hCG im biologischen Material (intaktes α,β-Heterodimer, freies aCG, freies βhCG, βhCG core-Fragment, nicked hCG, nicked βhCG), bezogen auf die Bindung an den jeweilig verwendeten Antikörper, erschweren die genaue Bestimmung und die Standardisierung eines Nachweisverfahrens für das endometriale hCG (3–5). Eine zusätzliche Heterogenität der hCG-Bestimmung in der späten Lutealphase und frühen Schwangerschaft kann im geringen Grad auch zwischen den vier nativen, hyperglykosylierten oder desialylierten Kohlenhydratseitenketten des C-terminalen Endes (CTP) von βhCG (Aminosäure 113–145), wie sie different zwischen früher und mittlerer Schwangerschaft und bei Chorioncarcinom im trophoblastären βhCG beobachtet worden sind, auftreten (4, 6–10). Weiterhin kann die Variation des Alanin, A (Endometrium) und Aspartat, D (Trophoblast) in der Aminosäureposition 117 des C-terminalen Endes von βhCG (βCG-CTP) bei endometrialem, blastozytärem und trophoblastärem βhCG für die Epitop-Spezifität des verwendeten Antikörpers von Bedeutung sein (11). Neben der bekannten Änderung der Aminosäuresequenz in Position 117 des CTP vom Exon 3 des βhCG für nicht-trophoblastäres hCG haben wir eine weitere Differenz der Aminosäure bei Position 4 im Exon 2 zwischen Trophoblast und Endometrium finden können (Pro-Met, P-M).It is already known, the trophoblastic total molecule hCG (total hCG) to be determined alone or in total with the free subunits. For that are Different test kits have been proposed, with different ones specificity work (1) and enable the determination of holo-hCG (total hCG), βhCG and aCG (2). The heterogeneity of the hCG in the biological material (intact α, β-heterodimer, free aCG, free βhCG, βhCG core fragment, nicked hCG, nicked βhCG), based on the binding to the antibody used, complicate the exact determination and standardization of a detection procedure for the endometrial hCG (3-5). An additional heterogeneity the hCG determination in the late Luteal phase and early Pregnancy can, to a small degree, also be between the four native, hyperglycosylated or desialylated carbohydrate side chains of the C-terminal end (CTP) of βhCG (Amino acid 113-145), such as they differ between earlier and middle pregnancy and in chorionic carcinoma in the trophoblastic βhCG have occurred (4, 6-10). Furthermore, the variation of alanine, A (endometrium) and aspartate, D (trophoblast) in the amino acid position 117 of the C-terminal end of βhCG (βCG-CTP) at endometrial, blastocytic and trophoblastic βhCG for the epitope specificity of the used antibody be of importance (11). In addition to the known change in the amino acid sequence at position 117 of the CTP from exon 3 of the βhCG for non-trophoblastic hCG we have another amino acid difference at position 4 in the exon 2 between trophoblast and endometrium (Pro-Met, P-M).

Die bisher etablierten Verfahren haben den Nachteil, keine ausreichende Aussage über die Differenziertheit der exprimierten hCG-Gene treffen zu können. Das hat seine Ursache darin, daß die Verfahren die Heterogenität der vorliegenden βhCG-Epitope aus jeweils endometrialem, trophoblastärem, leukozytärem oder chorioncarcinomähnlichen Ursprung nicht erfassen.The Processes established so far have the disadvantage that they are not sufficient Statement about to be able to differentiate the expressed hCG genes. The is due to the fact that the Procedure the heterogeneity of the present βhCG epitopes from endometrial, trophoblastic, leukocytic or chorioncarcinomähnlichen Do not record origin.

Die Erfindung hat das Ziel, ein Verfahren zur Bestimmung von humanem endometrialen hCG und/oder βhCG anzugeben, das unter Einsatz eines leicht handhabbaren Testkits die zuverlässige Aussage einer vorausgegangenen optimalen oder minderwertigen sekretorischen Transformation des Endometriums bzw. einer bestehenden optionalen Implantationsvoraussetzung für einen Embryo oder für die frühzeitige Diagnose einer erfolgten Schwangerschaft ermöglicht.The Invention aims to provide a method for the determination of human endometrial hCG and / or βhCG specify that using an easy-to-use test kit the reliable Statement of a previous optimal or inferior secretory Transformation of the endometrium or an existing optional one Implantation requirement for an embryo or for the early Diagnosis of a successful pregnancy enables.

Die Erfindung hat folgende Aufgabe zu lösen:

– Aussagen zur sekretorischen Transformation des Endometriums im normalen, gestörten und hormonstimulierten Zyklus,
– frühzeitige Diagnostik eines implantationsfähigen Endometriums,
– frühzeitige Diagnostik einer Schwangerschaft in Kombination von endometrialem und trophoblastärem hCG,
- Differenzierung eines early pregnancy loss,
- Differenzierung zwischen Extrauteringravidität und intrauteriner Schwangerschaft,
– Differenzierung falsch positiver hCG-Werte (zum Beispiel der hCG-Titer bei Patientinnen nach IUD-Einlage).

The invention has the following object:

Statements about the secretory transformation of the endometrium in the normal, disturbed and hormone-stimulated cycle,
- early diagnosis of an implantable endometrium,
- early diagnosis of pregnancy in combination of endometrial and trophoblastic hCG,
- differentiation of an early pregnancy loss,
- differentiation between ectopic pregnancy and intrauterine pregnancy,
- Differentiation of false positive hCG values (for example the hCG titer in patients after IUD insertion).

Das Verfahren richtet sich auf die Angabe einer Schrittfolge zur Bestimmung von endometrialem hCG und/oder βhCG (eβhCG), womit die angegebene Zielfunktion erreicht werden kann.The The procedure is aimed at specifying a sequence of steps for determination of endometrial hCG and / or βhCG (EβhCG) with which the specified objective function can be achieved.

Der Erfindung liegt die wissenschaftlichen Erkenntnisse zugrunde, daß im sekretorischen Endometrium gesunder nichtschwangerer Frauen epitheliales hCG und/oder βhCG gebildet wird (12–15). Auch in der Dezidua wird bei Patientinnen mit Extrauteringravidität hCG und/oder βhCG im Drüsenepithel nachgewiesen (16). Der Nachweis erfolgt durch Immunhistochemie, in situ-Hybridisierung, Western Blot und RT-PCR. Nach Sequenzierung wurde von uns nachgewiesen, daß die β-Untereinheit des endometrialen hCG (eβhCG) different zum herkömmlichen trophoblastären hCG (tβhCG) ist, vor allem im Promotorgen des Exon 1 und auch im Exon 3. Das zeigt, daß eβhCG vom Gen 7 und 6 translatiert wird, während trophoblastäres βhCG vorwiegend vom Gen 5 und auch Gen 8 und 3 gebildet wird.The invention is based on the scientific knowledge that epithelial hCG and / or βhCG is formed in the secretory endometrium of healthy, non-pregnant women (12-15). Also in the decidua, hCG and / or βhCG is detected in the glandular epithelium in patients with ectopic pregnancy (16). The detection is carried out by immunohistochemistry, in situ hybridization, Western blot and RT-PCR. To Sequencing has shown that the β-subunit of the endometrial hCG (eβhCG) is different from the conventional trophoblastic hCG (tβhCG), especially in the promoter gene of exon 1 and also in exon 3. This shows that eβhCG from genes 7 and 6 is translated, while trophoblastic βhCG is predominantly formed by gene 5 and also genes 8 and 3.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß das erste in der Frühschwangerschaft nachgewiesene βhCG entgegen der allgemeinen Auffassung nicht tβhCG ist, sondern eβhCG. Die Aminosäure- und Nukleotidsequenz des endometrialen βhCG wird hier erstmals in SEQ ID No 5 und SEQ ID No 7 dargestellt (Endo). Da die Aminosäure- und Nukleotidsequenz des endometrialen hCG in SEQ ID No 5 und No 7 nicht ausschließlich hCG β7 oder hCG β6 ist, bezeichnen wir die endometriale Gensequenz als Gen β6e.The Invention is based on the knowledge that the first in early pregnancy detected βhCG contrary to popular belief, it is not tβhCG, but eβhCG. The Amino acid- and nucleotide sequence of the endometrial βhCG is shown here for the first time in SEQ ID No 5 and SEQ ID No 7 shown (Endo). Because the amino acid and Nucleotide sequence of the endometrial hCG in SEQ ID No 5 and No 7 not exclusively hCG β7 or hCG is β6, we refer to the endometrial gene sequence as gene β6e.

Die Erfindung vermeidet die Nachteile bisher bekannter Methoden und der zu der Durchführung entwickelten Testkits der Total-hCG/βhCG-Bestimmung durch den Einsatz des endometrium- und deziduaepithel-spezifischen eβhCG-Antikörpers im Verfahren des Testansatzes.The Invention avoids the disadvantages of previously known methods and the one to carry out developed test kits for total hCG / βhCG determination through use of the endometrium and decidua epithelium-specific eβhCG antibody in the Test Approach Procedure.

Dafür werden spezifische Antikörper mit veränderter Aminosäuresequenz im Exon 2 (Position +4) und Exon 3 (Position +117) entwickelt und eingesetzt, die nur den endometrialen hCG- und/oder βhCG-Anteil im Serum, Plasma und Peripherblut sowie im Menstrualblut erfassen.For that be specific antibodies with changed amino acid sequence developed in exon 2 (position +4) and exon 3 (position +117) and used only the endometrial hCG and / or βhCG portion in serum, plasma and peripheral blood as well as in menstrual blood.

Der endometriale hCG- und/oder βhCG-Anteil kann aber auch mit dem in der Erfindung angegebenen Verfahren der Quotientenbildung von hCG- und/oder βhCG-Meßwerten als Wert Menstrualblut durch Wert Serum mit den herkömmlichen Total-hCG/βhCG-Immunoassays erfaßt werden.The endometrial hCG and / or βhCG portion can also with the method specified in the invention Quotient formation of hCG and / or βhCG measured values as a menstrual blood value by value serum with the conventional Total hCG / βhCG immunoassays can be detected.

Die Erfindung wird nachstehend an Ausführungsbeispielen näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.The Invention is explained in more detail below using exemplary embodiments, without limited to this too his.

Ausführungsbeispiel 1:Example 1:

Der Patientin wird zur Diagnostik Peripherblut der mittleren bis späten Sekretionsphase entnommen (Heparinblut, Blut). Das Plasma oder Serum wird bis zur Messung bei –20° C gelagert.The The patient is diagnosed with peripheral blood in the middle to late secretion phase taken (heparin blood, blood). The plasma or serum is up to Measurement stored at –20 ° C.

Als Antigenmaterial für die Antikörpergewinnung des endometrialen hCG und/oder βhCG werden zum einen je ein synthetisches Peptid der Aminosäuresequenz 109–118 oder 109–122 oder sequenzversetzt für das hCG β7, β6 und hCG β5, β8, β3 des C-terminalen Endes (CTP) im Exon 3 eingesetzt:

und weiterhin eine Zell-Linie humaner endometrialer Drüsenepithel-Zellen wie RL 95-2 oder eine andere Zell-Linie (humane uterine epitheliale Zell-Linie RL 95-2).As antigen material for the antibody production of the endometrial hCG and / or βhCG, a synthetic peptide of the amino acid sequence 109-118 or 109-122 or sequence-shifted for the hCG β7, β6 and hCG β5, β8, β3 of the C-terminal end (CTP ) used in exon 3:

and further a cell line of human endometrial glandular epithelial cells such as RL 95-2 or another cell line (human uterine epithelial cell line RL 95-2).

Vor dem Einsatz der endometrialen Epithelzellen wird die mRNA-Expression des hCG β7, β6, β6e im Promotorgen Exon 1 und im Exon 3 (CTP) in den nativen Zellen und nach Kultur mit RT-PCR geprüft und durch Sequenzanalyse bestätigt.In front The use of endometrial epithelial cells is the expression of mRNA of the hCG β7, β6, β6e in the promoter gene Exon 1 and exon 3 (CTP) in native cells and after culture checked with RT-PCR and confirmed by sequence analysis.

Die monoklonalen Antikörper der CTP-Peptide und der Endometrium-Epithel-Zell-Linie gegen hCG β7, β6 werden nach Immunisierung, Isolierung, Hybridisierung und Fein reinigung in vorgegebener Vorschrift hergestellt und bei –20° C gelagert. Dazu werden zunächst sechs bis acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse mit einer Endometrium-Epithel-Zell-Linie immunisiert. Aus den Milzen derart immunisierter Mäuse werden die Zellen isoliert und mit Mausmyelomzellen fusioniert. Die geeigneten Myelomzellen P3-X63-Ag8.653 (17) werden in RPMI-1640 mit 10 % fetalem Kälberserum gezüchtet. In einem Kulturmedium, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält (18), werden die gebildeten Hybridzellen von den nicht fusionierten Myelomzellen abgetrennt und Zellklone selektiert, welche Antikörper der gewünschten Spezifität sezernieren.The monoclonal antibodies of the CTP peptides and the endometrial epithelial cell line against hCG β7, β6 are prepared after immunization, isolation, hybridization and fine cleaning in a prescribed manner placed and stored at -20 ° C. For this purpose, six to eight week old female BALB / c mice are immunized with an endometrial epithelial cell line. The cells are isolated from the spleens of such immunized mice and fused with mouse myeloma cells. The appropriate myeloma cells P3-X63-Ag8.653 (17) are grown in RPMI-1640 with 10% fetal calf serum. In a culture medium containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine (18), the hybrid cells formed are separated from the unfused myeloma cells and cell clones are selected which secrete antibodies of the desired specificity.

Die Selektierung der Hybridome erfolgt in an sich bekannter Weise, ein besonders produktives Hybridom wird ausgewählt Die Herstellung von Hybridomen, welche Antikörper der gewünschten Spezifität sezerniere, ist zuverlässig wiederholbar. Eine Hinterlegung ist deshalb nicht erforderlich.The The hybridomas are selected in a manner known per se particularly productive hybridoma is selected The production of hybridomas, what antibodies the desired one specificity secrete is reliable repeatable. A deposit is therefore not necessary.

Sandwich-ELISA: Die gereinigten monoklonalen Antikörper (Mab) werden an ELISA-ptates (96 wells) adsorbiert (8 μg/ml in PBS, 1 Stunde, 37° C) mit anschließendem Blocken und Waschen; Antigeninkubation (100 μl, 1 Stunde, 37° C) mit hCG und/oder βhCG oder dem synthetischen Peptid hCG β7, β6, β6e als Standardreihe und dem Heparinplasma in Blocking-Puffer; Bestimmung des Sandwich-Mab, gekoppelt an HRP type IV (Sigma) zu 100 μl für 1 Stunde, 37° C nach der Methode von Wilson und Nakane (19).Sandwich ELISA: The purified monoclonal antibodies (Mab) are adsorbed on ELISA ptates (96 wells) (8 μg / ml in PBS, 1 hour, 37 ° C) with subsequent Blocking and washing; Antigen incubation (100 ul, 1 hour, 37 ° C) with hCG and / or βhCG or the synthetic peptide hCG β7, β6, β6e as a standard series and the Heparin plasma in blocking buffer; Determination of the sandwich mab, coupled on HRP type IV (Sigma) at 100 μl for 1 hour, 37 ° C after the method of Wilson and Nakane (19).

Menstrualblut: Kann wie Peripherblut nach Zentrifugation zur Abtrennung von Zellen und Stroma für den direkten hCG β7, β6-CTP (AS 109–118; 109–122)-ELISA und dem hCG β7, β6 (AS –5 bis +5) eingesetzt werden.menstrual blood: Can be used as peripheral blood after centrifugation to separate cells and stroma for the direct hCG β7, β6-CTP (AS 109-118; 109-122) ELISA and the hCG β7, β6 (AS -5 to +5) be used.

Perfusat nach Corpusabrasio: Einsatz nach Zentrifugation für die beiden beschriebenen ELISA-Tests.perfusate after corpus abrasion: use after centrifugation for the two described ELISA tests.

Ausführungsbeispiel 2:Example 2:

Neben der bekannten Änderung der Aminosäuresequenz in Position 117 des CTP vom Exon 3 des βhCG für nicht-trophoblastäres hCG haben wir eine weitere Differenz der Aminosäure bei Position 4 im Exon 2 zwischen Trophoblast und Endometrium finden können (Pro-Met).Next the known change the amino acid sequence at position 117 of the CTP from exon 3 of the βhCG for non-trophoblastic hCG we have another amino acid difference at position 4 in exon 2 between trophoblast and endometrium (Pro-Met).

Alternativ zum Ausführungsbeispiel 1 wird als Antigenmaterial für die Antikörpergewinnung des endometrialen hCG und/oder βhCG zum einen je ein synthetisches Peptid der Aminosäuresequenz –5 bis + 5 oder sequenzversetzt oder erweitert für das endometriale oder trophoblastäre βhCG neben einer humanen uterinen epithelialen Zell-Linie wie RL 95-2 eingesetzt:

As an alternative to embodiment 1, a synthetic peptide of the amino acid sequence -5 to +5 or sequence shifted or expanded for the endometrial or trophoblastic βhCG in addition to a human uterine epithelial cell line such as RL is used as the antigen material for the antibody production of the endometrial hCG and / or βhCG 95-2 used:

Vor dem Einsatz der endometrialen Epithelzellen wird die mRNA-Expression des hCG β7, β6 im Promotorgen Exon 1 und im Exon 2 bei Aminosäureposition +4 in den nativen Zellen und nach Kultur mit RT-PCR geprüft und durch Sequenzanalyse bestätigt.In front The use of endometrial epithelial cells is the expression of mRNA of the hCG β7, β6 in the promoter gene Exon 1 and in exon 2 at amino acid position +4 in the native cells and after culture with RT-PCR checked and by Sequence analysis confirmed.

Die monoklonalen Antikörper werden weiter wie in Ausführungsbeispiel 1 beschrieben hergestellt und in den beschriebenen ELISA-Test-Anordnungen eingesetzt. Außerdem besteht die Option in Kombination von Ausführungsbeispiel 1 und Ausführungsbeispiel 2 die gesamte Aminosäuresequenz von –4 bis +122 oder eine Ligation mit beiden angegebenen Aminosäuresequenzen als Antigen für die Antikörpergewinnung zu benutzen (sowohl für Aminosäuresequenz ehCG β7, β6 als auch thCG β5, β8, β3).The monoclonal antibodies will continue as in embodiment 1 and produced in the described ELISA test arrangements used. Moreover there is the option in combination of embodiment 1 and embodiment 2 the entire amino acid sequence from –4 to +122 or a ligation with both specified amino acid sequences as an antigen for antibody production to use (both for amino acid sequence ehCG β7, β6 as well thCG β5, β8, β3).

Ausführungsbeispiel 3:Example 3:

Gewinnung von Menstrualblut nach normalem Zyklus, nach Hormontherapie, nach IVF und ET ohne erfolgreiche Implantation sowie bei vorgesehener Diagnostik des Zyklus bei Kinderwunschpatientinnen und bei IUD-Patientinnen.recovery of menstrual blood after normal cycle, after hormone therapy, after IVF and ET without successful implantation and with planned Diagnostics of the cycle in fertility patients and IUD patients.

Parallele Gewinnung von Peripherblut zum selben Zeitpunkt als Heparinblut oder Serum zum Ausschluss eines erhöhten unspezifischen Serum-hCG-Wertes ist unbedingt erforderlich.parallel Collection of peripheral blood at the same time as heparin blood or serum to exclude an increased non-specific serum hCG value is absolutely necessary.

Vergleich der hCG- und/oder βhCG-Konzentration im biologischen Material der Desquamation des endometrialen Gewebes nach Separation der epithelialen und Stromazellen, der peripheren mononukleären Blutzellen, der mononukleären Immunzellen des endometrialen Epithels oder des Stromas für die hCG- und/oder βhCG-Bestimmung.comparison the hCG and / or βhCG concentration in the biological material of desquamation of the endometrial tissue after separation of the epithelial and stromal cells, the peripheral mononuclear Blood cells, the mononuclear Immune cells of the endometrial epithelium or stroma for the hCG- and / or βhCG determination.

Bei einer definierten Differenz hohen Anteils von hCG und/oder βhCG im Menstrualblut zu niedrigem Anteil im Peripherblut kann von lokaler endometrialer Bildung ausgegangen werden. Für das Peripherblut kann allein der übliche trophoblastäre hCG β5, β8, β3-Hormontest (ELISA, MEIA u. a.) verwendet werden.at a defined difference in the high proportion of hCG and / or βhCG in the menstrual blood too low a percentage in peripheral blood can be of local endometrial Education be run out. For the peripheral blood can only do the usual trophoblastic hCG β5, β8, β3 hormone test (ELISA, MEIA and others) can be used.

Der auszuwertende Meßwert berechnet sich aus der Quotientenbildung der Konzentration vom Total-hCG/βhCG-Meβwert im Menstrualblut durch den Meßwert im Plasma oder Serum.The Measured value to be evaluated is calculated from the quotient formation of the concentration of the total hCG / βhCG measured value in the menstrual blood by the measured value in plasma or serum.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.It follows a sequence listing according to WIPO St. 25. This can be from the official publication platform of the DPMA can be downloaded.

Claims

Procedure for determining optimal implantation conditions in the current or subsequent cycle by determining human hCG, thereby characterized in that the Peripheral blood in the middle to late secretion phase or menstrual blood is taken, a hCG determination known per se with a commercial Test kit is made and the concentration of the hCG is absolute or relative to the measured value in a second test for hCG is determined.

Procedure for determining optimal implantation conditions in the current or subsequent cycle by determining human endometrial hCG, characterized in that the Peripheral blood in the middle to late secretion phase or menstrual blood is taken from an ELISA test using an endometrial epithelial cell line and a myeloma cell line P3X63-Ag8.653 obtained hybridoma produced monoclonal antibody and the concentration of the endometrial hCG is absolute or relative to the measured value in a second ELISA test for usual trophoblastic hCG is determined.

Procedure for determining optimal implantation conditions by determining human endometrial hCG, characterized in that ever an ELISA test with synthetic peptides from exon 3 with AS 109 to 122, from exon 2 with AS –6 to +6 or synthetic peptides with portions inside the amino acid sequence –6 to +122, in all cases also sequence-shifted, shown and for measuring the endometrial hCG is used.

Test kit for recognizing optimal implantation conditions, consisting of an enzyme immunoassay for the determination of human endometrial hCG in serum / plasma or menstrual blood and a monoclonal antibody from a hybridoma coming from an endometrial epithelial cell line I and the myelam cell line P3X63-Ag8.653 is obtained.

Test kit for determining physiological implantation conditions, consisting of an enzyme immunoassay for the determination of human endometrial hCG in serum / plasma and a monoclonal antibody produced by an Hybridoma that is made by immunization from six to eight week old female BALB / c mice with an endometrial epithelial cell line, isolation the corresponding cells from the spleens of the mice and the fusion with a mouse myeloma cell line, cloning and subcloning of the hybridomas and use of a productive clone which converts the monoclonal antibodies into produced in vivo or in vitro.

amino acid sequence hCG β6e according to SEQ ID No 5 and gene sequence hCG β6e according to SEQ ID No 7.