-
Die Erfindung betrifft ein Verfahren
zur Herstellung von immobilisierten pH-Gradienten, insbesondere zur
isoelektrischen Fokussierung, ein Verfahren zur pH-Gradienten verwendenden
isoelektrischen Fokussierung von Analyten, insbesondere Proteinen,
eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung, ein Verfahren zur
Detektion von Bestandteilen in Analyten, insbesondere von Proteinen,
sowie Verwendungen.
-
Die Verwendung von elektrophoretischen
Methoden für
präparative
Zwecke ist eine etablierte Technik, und es existieren verschiedene
Apparate für
präparative
und analytische Zwecke. Diese Apparate und ihre zugrunde liegenden
Prinzipien können
in drei Kategorien aufgeteilt werden (Andrews, 1986, Westermeier,
1977).
- a) Zonenelektrophorese
- b) Isotachophorese
- c) Isoelektrische Fokussierung
-
Zonenelektrophorese beinhaltet die
Glycin, Bicin und Tricin gepufferten Natriumdodecylsulfat -Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE) für
Proteine, die routinemäßig für die Untersuchung
von Proteinen eingesetzt wird (Wilkins et al. 1998).
-
Die Isotachophorese benutzt hydrophile
Matrixmaterialien und zeigt typischerweise eine hohe Auflösung, aber
eine geringe Beladungskapazität.
In Kombination mit Free-Flow-Elektrophorese kann diese Methode für mikropräparative
Zwecke eingesetzt werden (Weber und Bocek, 1998).
-
Die isoelektrische Fokussierung (IEF)
wird entweder in flüssigen
Dichtegradienten, in Gelgradienten (Righetti, 1990) oder in Mehrkammer-Geräten mit
Immobiline-basierenden Trenngelmedien (Righetti et al., 1997) durchgeführt.
-
Es gibt zwei etablierte IEF-Methoden
im Rahmen der Durchführung
einer zweidimensionalen Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-PAGE).
Die als erstes entwickelte Methode verwendet eine Vorfokussierung
von Trägerampholyten
(TA) an ihren isoelektrischen Punkt und eine anschließende Fokussierung
von Proteinen. Die so aufgetrennten Proteine werden dann in einer
zweiten Dimension in einer SDS-PAGE aufgetrennt (Klose, 1975; Klose
und Kobalz, 1995; O'Farrel, 1975). Dieses System besitzt eine hervorragende
Auflösung
und erreicht bei der Verwendung von 46 cm TA-IEF-Gelen eine Auftrennung
von über
10.000 Proteinspots pro 2D-PAGE Gel (Klose und Kobalz, 1995). Kürzlich wurden
auch kommerzielle Systeme mit bis zu 60 cm TA-IEF-Gelen angeboten
(www.proteomefactory.com/ct_02112.html; Stand: 28.08.2002). Dennoch
besteht bei diesem System das Problem, daß die basische Region des pH-Gradienten
aus dem Gel heraus wandert, bevor ein Gleichgewicht erreicht ist.
Diese kathodische Instabilität
wird durch Bicarbonat-Ionen verursacht, welche mit atmosphärischem
Kohlendioxid im Gleichgewicht stehen (Righetti, 1990). Um Proteine
im basischen pH- Bereich
zu untersuchen, wird ein IEF-Experiment vor dem Erreichen des Gleichgewichts
abgestoppt. Zu diesem Zeitpunkt ist die Auftrennung der Proteine
noch nicht komplett, aber die basische Region befindet sich noch
im Gel. Diese Form der IEF (non-equilibrium pH gradient gel electrophoresis,
NEPHGE) ist die einzige Möglichkeit,
basische Proteine in einem trägerampholyt-basierenden
Gelsystem zu analysieren.
-
Ein später entwickeltes System zur
isoelektrischen Fokussierung verwendet acrylamid-ähnliche
Acrylamido-Puffer Monomere (Immobiline), die eine funktionelle Puffergruppe
tragen. Ein pH-Gradient wird durch die Bildung eines Konzentrationsgradienten
von Gellösungen
mit verschiedenen pH-Werten geformt. Nach der Bildung des Gradienten
polymerisieren die Acrylamido-Puffer-Monomere zusammen mit der Arcylamid-Matrix und
werden somit immobilisiert (Görg
et al., 2000; Görg
et al. 1988; Righetti, 1990). Diese immobilisierten pH-Gradienten
(IPG) – Gele
werden gegossen, in dem man einen Dichtegradienten mit Glycerol
zwischen den zwei Lösungen
unterschiedlicher pH-Werte aufbaut. Da dieser Vorgang diffusionslimitiert
ist, sind die hergestellten Immobilingradienten typischerweise weniger
als 30 cm lang, um einen korrekten Dichtegradienten zu gewährleisten.
Daher wurden bisher noch keine immobilisierten pH-Gradienten über 30 cm
Länge berichtet. Die
längsten
kommerziell erhältlichen
IPGs sind 24 cm lang und werden von Amersham Biosciences angeboten.
-
Das der Erfindung zugrunde liegende
Problem ist es, die oben genannten Nachteile zumindest teilweise
zu lösen.
-
Dieses Problem wird durch ein Verfahren
nach Anspruch 1, ein Verfahren nach Anspruch 12, eine Vorrichtung
nach Anspruch 20, ein Verfahren nach Anspruch 24, ein Verfahren
nach Anspruch 30, Verwendungen nach den Ansprüchen 37 bis 39 sowie eine Vorrichtung
nach den An sprüchen
40 bis 48 gelöst.
Der Wortlaut sämtlicher
Ansprüche
wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.
-
Es ist erfindungswesentlich, daß die pH-Gradienten
mindestens eine Länge
von 30 cm, insbesondere 40 cm, insbesondere 50 und insbesondere
90 cm, aufweisen. Zu Herstellung dieser Längen ist es von Vorteil, wenn
während
des Gießvorgangs über noch
auszupolymerisierende Gele derart kontinuierlich Polymerisationsinitiatoren
gegeben werden, daß die
pH-Gradienten die gewünschte
Mindestlänge
aufweisen. Dies wird in vorteilhafter Weise bei der Zugabe der Polymerisationsinitiatoren
durch die Verwendung computergesteuerter Applikatoren, insbesondere
Büretten
oder ähnliche
Pumpen, bewerkstelligt.
-
Dies gilt insbesondere dann, wenn
während
des Gießvorgangs über noch
auszupolymerisierende Gele zu applizierende Lösungen (unter Lösungen sind
insbesondere Acrylamidopuffer enthaltende Lösungen zu verstehen) und die
Gele derart gekühlt
werden und anschließend
die Temperatur zum Starten der Polymerisationsreaktion derart kontrolliert
erhöht
wird und/oder nach Mischung des Gradienten aktivierbare Polymerisationsinitiatoren
verwendet werden, daß die
pH-Gradienten die gewünschte
Länge aufweisen.
-
Die Erfindung bezieht sich auf Methoden
zur Durchführung
von isoelektrischen Fokussierungen (IEF) von Analyten, wie z. B.
Proteinen, in einem extrem langen immobilisierten pH-Gradienten,
der durch die Copolymerisation eines vorgeformten pH-Gradienten
in eine Matrix wie z. B. Polyacrylamid oder einer Polymermatrix
mit ähnlicher
Polymersiationschemie von Monomeren, ähnlich zu Acrylamid und Bisacrylamid,
gebildet wird.
-
Wir stellen extrem lange IPGs her.
Eine charakteristische Eigenschaft unserer Erfindung besteht darin, daß die von
uns produzierten immobili sierten pH-Gradienten über 30 cm lang sind, vorzugsweise
bis ca. 100 cm oder mehr. Die Herstellung dieser langer Gradienten
ist nicht offensichtlich. Um einen gleichmäßigen langen Gradienten zu
erstellen, ist eine langsame, pulsationsfreie Flußrate der
einzelnen, mindestens zwei, Pufferkomponenten beim Gießvorgang
zu gewährleisten.
Dieser Vorgang wird bevorzugterweise mit Hilfe von z. B. computergesteuerten
"Kolbenbüretten"
oder ähnlichen
Pumpen ermöglicht.
Um die langsamen Flußraten zu
gewährleisten,
ist eine Kontrolle der Polymerisationsgeschwindigkeit unerläßlich. Diese
wird vorteilhafterweise gewährleistet
durch die kontinuierliche computergesteuerte Zugabe von Polymerisationsinitiatoren
(wie z. B. Ammoniumperoxosulfat) während des Gießvorgangs
oder durch eine Kühlung
der Pufferlösungen
und des gegossenen Gradienten und eine anschließende kontrollierte Temperaturerhöhung zum
Starten der Polymerisation oder durch die Verwendung von nach der
Mischung des Gradienten aktivierbaren Polymerisationsinitiatoren
(z. B. UV-Licht induzierbar wie z. B. Riboflavin oder Methylenblau,
Rabilloud et al., 1996b und darin enthaltene Referenzen) oder durch
eine Kombination der vorher genannten Methoden. Für die Generation
eines Dichtegradienten zur Herstellung von langen Gelen eignen sich
bevorzugt schwere Pufferlösungen
mit einer Dichte größer als
1,1. Die Dichtedifferenz zum Aufbau eines Dichtegradienten aus verwendeten
mindestens zwei Pufferlösungen
beträgt
vorzugsweise 0,1 g/cm3, insbesondere 0,2
g/cm3 oder größer als 0,2 g/cm3. Zur
Generation dieser Dichten eignen sich beispielsweise besonders folgende
Komponenten oder Gemische der Komponenten: Glycerin, Cäsiumchlorid,
Cäsiumsulfat,
Cäsiumbromid,
Natriumbromid, Kaliumbromid, Saccharose.
-
Beim erfindungsgemäßen Verfahren
zur pH-Gradienten verwendenden isoelektrischen Fokussierung von
Analyten, insbesondere Proteinen, weisen die pN-Gradienten mindestens
eine Länge
von 30 cm, insbesondere 40 cm, insbesondere 50 cm und insbesondere
90 cm, auf.
-
In einer bevorzugten Variante der
Erfindung wird die IEF unter hohen Voltzahlen, mindestens 10.000 V,
bevorzugt mindestens 20.000 V und weiterhin bevorzugt mindestens
30.000 V, durchgeführt.
Derart hohe Voltzahlen wurden bisher von Experten vermieden, weil
man befürchtete,
daß die
Entstehung von Entladungsfunken und die Hitzeentwicklung den isoelektrischen
Fokussiervorgang stören
könnte
und wegen der potentiellen Gefahr für Mitarbeiter. Hieraus folgte
aber, daß die
Fokussierzeit für
z. B. 54 cm IPG-Streifen pH 4-8 bei 10.000 V 75 Stunden dauert;
in Gegensatz zu weniger als 37 Stunden bei einer Voltzahl von 20.000
V, und 25 Stunden bei einer Voltzahl von 30.000 V. Daher stellt
die Anwendung von hohen Voltzahlen während der IEF von langen IPGs
eine erfinderische Leistung dar, die den Durchsatz stark erhöht und darüber hinaus
die Spotgröße der an
ihrem isoelektrischen Punkt (pI) fokussierten Proteine verkleinert.
Die hohen Voltzahlen werden durch die erfinderische Verwendung eines
elektrisch isolierenden Mediums, insbesondere eines Öls, ermöglicht,
das die Elektroden und die IPG-Streifen während der IEF umgibt.
-
Eine geeignete Substanz ist das Dimethylpolysiloxanöl AK10 der
Firma Wacker-Chemie GmbH, 84489 Burghausen, Deutschland, das Isolationseigenschaften
von besser als 1014 Ohm cm aufweist.
-
Es hat sich in der Praxis als vorteilhaft
herausgestellt, wenn die immobilisierten pH-Gradienten unter ein Öl- oder ähnlichen
organischen Schicht fokussiert werden, da die immobilisierten pH-Gradientengele
ansonsten über
die Zeit langsam durch Wasserverlust an die Atmosphäre austrocknen
würden.
-
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur isoelektrischen
Fokussierung, insbesondere von pN-Gradienten verwendenden isoelektrischen
Fokussierung von Analyten, insbesondere Proteinen, insbesondere
zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens,
weist eine Stromversor gung und eine IEF-Kammer (Kammer, in der die
isoelektrische Fokussierung durchgeführt wird) auf, wobei die Stromkabel
zwischen Stromversorgung und IEF-Kammer während der IEF fest installiert,
also nicht entfernbar, sind. Die IPGs sind vorteilhafterweise von
einem elektrisch isolierenden Material umgeben, das fest oder flüssig sein
kann.
-
Bei einer Variante ist der Stromversorger
vorzugsweise vollständig
in die IEF-Apparatur integriert und mit einem Mechanismus versehen,
der den Stromversorger abschaltet, sobald die Kammer geöffnet wird
und somit sicherstellt, daß kein
Benutzer der Apparatur durch den an die Apparatur angelegten Strom
gefährdet wird.
Vorzugsweise kann die Apparatur für eine derartige Zeit, in der
Regel vorzugsweise mindestens zwei Minuten, nach Unterbrechung des
Stromkreises nicht geöffnet
werden, um sicherzustellen, daß sich
die verbleibende Hochspannung abbauen kann.
-
Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren
ist es sehr vorteilhaft, wenn Kabel der Art verwendet werden, daß diese
10.000 Volt, insbesondere 20.000 Volt, besonders insbesondere 30.000
Volt, spannungsisolierend sind, so daß bei der Bedienung keine gefährlichen
Spannungsüberschläge auftreten.
In einer bevorzugten Variante ist der stromleitende Teil der Kabel
vollständig
von der Umgebungsluft isoliert.
-
Beim weiteren erfindungsgemäßen Verfahren
zur Detektion von Bestandteilen in Analyten, insbesondere von Proteinen,
wird das erfindungsgemäße Verfahren
zur isoelektrischen Fokussierung (als Teil des Verfahrens) und/oder
eine erfindungsgemäße Vorrichtung
angewendet.
-
Die Auflösungskapazität von dem
derzeitigen Stand der Technik entsprechenden IPG-Streifen und die resultierenden
2D-PAGE Gele limitieren die Anzahl der Proteine, die detektiert
werden können.
Aufgrund dieser geringen Auflösung
können
mit wenig sensitiven Detektionsmethoden (z. B. Silberfärbung oder
Fluoreszenzfärbung)
oder mit hoch sensitiven Detektionsmethoden (z .B. Radio-Imaging)
nur eine ähnliche
Anzahl an Proteinen detektiert werden. Wenn jedoch die Auflösungskapazität der 2D-PAGE
Gele erhöht
wird, erzielt man bei der Verwendung von hochsensitiven Radio-Imaging
basierenden, fluoreszenz-basierenden oder massenspektroskopie-basierenden
Detektionsverfahren im Vergleich zu anderen Methoden eine signifikante
Steigerung der Detektionsrate. In diesem Zusammenhang ist es vorteilhaft,
wenn mindestens zwei verschiedene Proben mit unterschiedlichen Radioisotopen
und/ oder verschiedenen Gemischen von Radioisotopen und/oder mindestens
zwei Proben mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und/ oder
verschiedener Gemische von Fluoreszenzfarbstoffen und/oder mindestens
zwei verschiedene Proben mit unterschiedlichen stabilen Isotopen
und/oder verschiedenen Gemischen von stabilen Isotopen und/ oder
mindestens zwei verschiedene Proben mit unterschiedlichen massendifferenten
Reagenzien markiert werden.
-
In diesen bevorzugten Darstellungen
der Erfindung sind die zu untersuchenden Moleküle (z. B. Proteine), insbesondere
mit Radioisotopen, stabilen Isotopen, Fluoreszenzfarbstoffen oder
massendifferenten Reagenzien, markiert, durch 2D-PAGE aufgetrennt
und mit einem geeigneten Detektor detektiert. In dieser besonders
bevorzugten Variante der Erfindung werden zwei oder mehr Proben
mit unterschiedlichen Radio-Isotopen oder verschiedenen Gemischen
von Radio-Isotopen, oder verschiedenen stabilen Isotopen oder Fluoreszenzfarbstoffen
oder massendifferenten Reagenzien markiert und in einem 2D-PAGE
Gel zusammen aufgetrennt und anschließend separat mit geeigneten
Detektoren detektiert. Dieses ermöglicht die Erstellung von Gelbildern,
der einzelnen ursprünglichen
markierten Proben. Für
diese besondere Art der Analyse wird ein Detektor benötigt, der
auf der Basis von physikalischen Eigenschaften und Halbwertszeiten
der verwendeten Markierungsreagenzien zwischen den unterschiedlich
markierten Proben unterscheiden kann.
-
In einer bevorzugten Variante der
Erfindung wird die Probe in die IPG-Streifen mittels aktiver Rehydratation
beladen. In diesem Prozeß werden
die Proteine aktiv, während
der Rehydratation der trockenen (PG-Streifen in einer Rehydratationskammer,
bei geringer Voltzahl, typischerweise weniger als 1250 V, eingebracht.
Der IPG-Streifen wird dann häufig
in eine zweite Kammer transferiert, die weite Elektroden enthält. Der Kontakt
zu den Elektroden wird über
leitende Elemente (Medien) (z. B. mit wäßrigen, Chemikalien enthaltende Lösungen getränkte Filterpapierstreifen)
an beiden Enden der IPG-Streifen hergestellt. Die bevorzugten Filterpapierstreifen
werden in zeitlichen Intervallen während der IEF mindestens einmal
ausgetauscht, um im Filterpapier akkumulierende Ionen zu entfernen.
Die Entfernung dieser im Filterpapier akkumulierenden Ionen ist für hochwertige
Resultate unerläßlich. Die
Kombination von aktiver Rehydratisierung und austauschbaren Filterpapieren,
vorzugsweise in einer separaten zweiten Kammer, wurde bisher nicht
eingesetzt und ist hiermit für
isoelektrische Fokussierungen mit IPG-Streifen von über 30 cm
offengelegt.
-
Schließlich ist von Vorteil, wenn
die Temperatur während
der isoelektrischen Fokussierung nahezu konstant gehalten wird,
um die Reproduzierbarkeit der IEF zu verbessern. Im Erfindungskontext
wird hierunter eine maximale Temperaturschwankung von +/– 5 °C, insbesondere
von +/– 2 °C, verstanden.
-
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur isoelektrischen
Fokussierung nach Anspruch 40 weist eine Stromversorgung auf, die
eine maximale Fokussierungsspannung von mindestens 10 kV, insbesondere
mindestens 15 kV, liefert. Dies ermöglicht die Verwendung langer
Fokussierungsmedien, insbesondere mit Längen von mehr als 30 cm, wodurch
sich die erzielbare Auflösung
stark verbessert.
-
Vorteilhafte Weiterbildungen sind
Gegenstand der Unteransprüche
41 bis 48.
-
Das nachfolgende Beispiel dient zur
näheren
Erläuterung
der Erfindung.
-
BEISPIEL
-
Menschliches Prostatakrebsgewebe
wurde extrahiert und für
die IEF vorbereitet nach Vuong et al. (2000) mit der Modifikation,
daß die
Proteine nicht jodiert wurden.
-
Herstellung von 54 cm
langen IPG-Gelen
-
Die Gele wurden in einer Gießkammer
(12 cm × 54
cm × 0,5
mm) bestehend aus zwei Glasplatten und einem U-förmigen Abstandhalter und einer
Trägerfolie
(Gel-Fix Folie, Serva, Heidelberg) gegossen. Die Glasplatten und
Spacer werden hierzu sorgfältig
gereinigt. Die Glasplatte mit Spacer wird anschließend mehrfach mit
Repel-Silane (Amersham Biosciences, Freiburg) behandelt. Die Gel-Fixfolie
wird auf die gereinigte und mit Wasser bedeckte Deckglasplatte gelegt,
mit Papier bedeckt und mit einer Gummiwalze das Wasser luftblasenfrei
entfernt. Anschließend
wird die Platte mit dem Abstandhalter aufgesetzt und die Kammer
mit Klemmen versehen. Die Gelkammer wird dann auf 4 °C gekühlt. Zur
Vorbereitung der Gellösungen
werden gemäß Kammervolumen
die saure und basische Lösung
bestehend aus Acrylamido-puffern, Acrylamid, PDA (Piperazin-diacrylamid),
KBr und TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin) vorbereitet.
APS (Ammoniumpersulfat) wird später
während
der Gradientenherstellung kontrolliert zugesetzt. Das Gießen der
Gele und die computergestützte
Berechnung der Mischungsverhältnisse
der Acrylamidopuffer (Immobiline) zur Herstellung des pN-Gradienten erfolgt
nach der Methode von Altland und Altland (1984). Für die Herstellung
eines linearen pH 4-8 Gradienten wurden folgende Immobilin-Verhältnisse
in einem Endvolumen von 10 ml verwendet.
-
-
Der Gradient wird mit computergesteuerten
Büretten
(Desaga) gegossen, wobei Bürette
1 die saure Lösung,
Bürette
2 die basische Lösung
und Bürette
3 die 2,5 % (w/v) (Gewicht/Volumen) Ammoniumpersulfatlösung enthält. Die
Gele werden nach dem Gießen
für 10
min stehen gelassen und dann 1 h bei 50 °C auspolymerisiert. Anschließend wird
das Gel mit der Trägerfolie
4 mal 15 Minuten in 1,5 % Glycerol gewaschen und getrocknet. Die
Gelobertläche
wird mit einer Folie abgedeckt und das basische und saure Ende markiert.
Anschließend
wird das Gel in 4 mm breite Streifen geschnitten und bis zur Verwendung
bei –20 °C gelagert.
-
Isoelektrische
Fokussierung
-
150 μg Protein in 1200 μl Rehydratisierungspuffer
(8M Harnstoff, 2 % Chaps, 0,5 % (v/v) IPG Puffer, 20 mM DTT (Dithiothreitol),
etwas Bromphenolblau) werden zur Rehydratation der IPG-Streifen
verwendet. Die Rehydratation erfolgte über 15 h bei 100 V in einer
speziellen Rehydratationskammer unter DryStrip Cover Fluid (Amersham
Biosciences, Freiburg). Anschließend wurden die Streifen in
eine zweite Kammerüberführt. Hier wurde
der Kontakt zwischen den Enden der IPG-Streifen und der Elektroden
mittels 8M Harnstoff, 2 % Chaps (3-((3-Cholamidopropyl)dimethylammonium)-1-propansulfonat)
getränkten
Filterpapierstreifen (8M Harnstoff, 2 % Chaps) hergestellt.
-
Zur Fokussierung der Proben wurde
folgendes Programm verwendet:
| 500
V | 1 Stunde |
| 1250
V | 1 Stunde |
| 2500V | 30 Minuten |
| 20.000V | bis 125.000 Voltstunden |
-
Diese Filterpapierstreifen wurden
dann nach den ersten drei Fokussierungsschritten gewechselt. Die Ströme wurden
limitiert auf 60 Mikroampere je IPG-Streifen. Bei anderen Versuchen
wurden Spannungen bis zu 35.000 Volt unter ähnlichen Bedingungen angewendet.
-
Nach der Fokussierung wurden die
54 cm Streifen in 3 × 18
cm Streifen zerschnitten und in der zweiten Dimension (2D-SDS-PAGE)
aufgetrennt, wie bei Vuong et al. (2000) beschrieben. Die Färbung der
Gele mittels Silber erfolgte nach Heukeshoven und Dernick (1988).
-
ABBILDUNGEN
-
-
2D-Gel von 150 μg Proteinextrakt aus menschlichem
Prostatakrebsgewebe fokussiert auf einem 54 cm langen IPG-Streifen
pH 4-8.
-
ZITATE:
-
Altland, K und Altand, A. (1984).
Pouring reproducible gradients in gels under computer control: new devices
for simultaneous delivery of two independent gradients, for more
felxible slope and pH range of immobilized pH gradients. Clinical
Chemistry 30, 2098–2103
Andrews,
A. T. (1986). Electrophoresis: Theory, Techniques, and Biochemical
and Clinical Applications, 2nd Ed. (Dec 1986) Edition: Oxford University
Press).
Gorg, A., Obermaier, C., Boguth, G., Harder, A., Scheibe,
B., Wildgruber, R., and Weiss, W. (2000). The current state of two-dimensional
electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 21,
1037–53.
Görg, A.,
Postel, W., and Günther,
S. (1988). The current state of two dimensional electrophoresis
with immobilised pH gradients. Electrophoresis 9, 531–546.
Hansen,
J. N. (1976). Electrophoresis of ribonucleic acid on a polyacrylamide
gel which contains disulfide cross-linkages. Anal Biochem 76, 37–44.
Heukeshoven,
J., and Dernick, R. (1988). Improved silver staining procedure for
fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium
dodecyl sulfate gels. Electrophoresis 9, 28–32.
Klose, J. (1975).
Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis
of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point
mutations in mammals. Humangenetik 26, 231–43.
Klose, J., and Kobalz,
U. (1995). Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated
protocol and implications for a functional analysis of the genome.
Electrophoresis 16, 1034–1059.
Lyubimova,
T., Caglio, S., Gelfi, C., Righetti, P. G., and Rabilloud, T. (1993).
Photopolymerization of polyacrylamide gels with methylene blue.
Electrophoresis 14, 40–50.
O'Farrell,
P. H. (1975). High resolution two-dimensional electrophoresis of
proteins. J Biol Chem 250, 4007–21.
Rabilloud,
T. (1996). Solubilization of proteins for electrophoretic analyses.
Electrophoresis 17, 813–29.
Rabilloud,
T., Valerie G, Lawrence J. J. (1996b). One- and twodimensional histone
separations in acidic gels: Usefulness of methylene blue-driven
photopolymerization. Electrophoresis 17, 67–73.
Righetti, P. G. (1990).
Immobilised pH gradients: theon and methodology. In Laboratory techniques
in biochemistry and molecular biology, R. H. Burdon and P. H. Knippenberg,
eds. (Amsterdam: Elsevier), pp. 397.
Righetti, P. G., Bossi,
A., Wenisch, E., and Orsini, G. (1997). Protein purification in
multicompartment electrolyzers with isoelectric membranes. J Chromatogr
B Biomed Sci Appl 699, 105–15.
Righetti,
P. G., and Gelfi, C. (1996). Electrophoresis gel media: the state
of the art. J. Chromatog. B 699, 63–75.
Vuong GL, Weiss SM,
Kammer W, Priemer M, Vingron M, Nordheim A, Cahill MA. (2000). Improved
sensitivity proteomics by postharvest alkylation and radioactive
labelling of proteins. Electrophoresis. 21, 2594–605.
Weber, G., and Bocek,
P. (1998). Stability of continuous flow electrophoresis [In Process
Citation]. Electrophoresis 19, 3094–5.
Westermeier, R. (1977).
Electrophoresis in Practice : A Guide to Methods and Applications
of DNA and Protein Separations, 2n Edition (Weinhem: John Wiley
and Sons).
Wilkins, M. R., Gasteiger, E., Sanchez, J. C., Bairoch,
A., and Hochstrasser, D. F. (1998). Two-dimensional gel electrophoresis
for proteome projects: the effects of protein hydrophobicity and
copy number. Electrophoresis 19, 1501–5.
