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Die vorliegende Erfindung betrifft
MUC1-Peptidfragmente und betrifft Verfahren zur Herstellung solcher
Peptidfragmente. Die Erfindung betrifft weiterhin ein ex vivo-Verfahren
zur Herstellung einer Population autologer Antigen präsentierender
Zellen (APCs) und zur Herstellung gentechnisch erzeugter APCs, die
zur Induktion von effektiven Immunreaktionen gegen MUC1 in der Lage
sind. Die Erfindung betrifft weiterhin APCs, die durch diese Verfahren
gewinnbar sind, ebenso wie die Verwendung der oben erwähnten Fragmente
und APCs in einer therapeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
von Brustkrebs und anderen MUC1-positiven Karzinomen, einschließlich kolorektalem
Karzinom, Pankreas- und Magenkarzinom.
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MUC1 wird in Brustkrebs- und vielen
anderen Karzinomen überexprimiert
und es ist bekannt, dass die Tumor-assoziierte Glykoform des Mucins
innerhalb seiner Wiederholungsbzw. Repeat-Domäne vielfältige Peptidepitope exponiert.
Diese immunogenen Peptidepitope machen MUCl zu einem viel versprechenden
Tumorantigen mit einem diagnostischen wie auch therapeutischen Potential
bei der Behandlung von Krebs.
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Die Entwicklung einer wirksamen Vakzine
bzw. Impfstoffes und von Immuntherapien gegen menschliche Krebserkrankungen
und gegen infektiöse
Substanzen hängen
oftmals von der Erzeugung protektiver Immunreaktionen gegen spezifische
Domänen
von Membranproteinen ab. Die Tandem-Repeat-(TR-) Domäne des Brust-,
Pankreas- und Ovartumorantigens, des humanen Mucins MUC1 (Barrad
et al., PNAS USA, 86: 7159–7163,
1989; Jerome et al., Cancer Res., 51: 2908–2916, 1991), die neutralisierende
Hauptdomäne
(principal neutralizing domain) von HIV-1 (Javaherian et al., PNAS
USA, 86: 6768–6772,
1989; Jauaherian et al., Science, 250: 1590–1593, 1990) und die Prolin-reiche
Neutralisierungsdomäne
(= prolin rich neutralization domain) des Außenoberflächeneinheits-Proteins des felinen
Leukämievirus
(= feline leukemia virus external surface unit protein) (pg-70)
(Nunberg et al., PNAS, 81: 3675– 3679,
1984; Elder et al., J. Virol., 61: 8–15, 1987; Strouss et al.,
7. Virol., 61: 3410–3415,
1987; Nick et al., J. Gen. Virol., 71: 77–83, 1990) sind Beispiele hierfür.
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Bezüglich MUC1 wurden humorale
und zelluläre
Reaktionen bei Krebspatienten (1, 2), jedoch auch bei schwangeren
Frauen (3) und gesunden Personen (4) gezeigt. Obwohl diese natürlichen
Reaktionen üblicherweise
nicht ausreichen, um das Fortschreiten von Krebs zu bekämpfen, werden
von MUC1 stammende Peptide oder Glykopeptide gegenwärtig in
klinischen Versuchen zur Auslösung
von therapeutischen und prophylaktischen Immunreaktionen in Menschen
verwendet (5, 6).
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Es existieren zunehmende Beweise
dafür,
dass die Auslösung
von effizienten humoralen und CTL-Reaktionen auf MUCI der Aktivierung
spezifischer T-Helferzell-Klone bedarf, die durch MHC-Klasse-II-präsentierte
Antigenfragmente induziert wird. Die Erzeugung von MHC-Klasse-II-restringierten
Peptidepitopen durch Antigen-präsentierende
Zellen (APCs), wie dendritische Zellen (DCs), folgt einem mehrstufigen
Verfahren, das mit der Endozytose beginnt, gefolgt von der Prozessierung
bzw. Verarbeitung in den spät-endosomalen
Kompartimenten und die Bindung proteolytischer Peptidfragmente an
MHC-Klasse-II-Proteine und deren Transport zur Zelloberfläche zur
Folge hat. Während
viele Aspekte dieses komplexen Prozesses bereits ans Licht gebracht
wurden, existiert gegenwärtig
kaum ein Beweis für
die Prozessierung und MHC-Klasse-II-Präsentation von glykosylierten
Antigenen, insbesondere den stark O-glykosylierten Mucin-Antigenen.
Um die Entwicklung effizienter Tumorvakzinen auf Grundlage von MUC1
zu ermöglichen,
ist die Kenntnis, wie DCs oder andere APCs O-glykosylierte Peptide
behandeln, von Bedeutung. Eine besondere Frage in diesem Kontext
betrifft das Schicksal komplexer O-gebundener Glykane während der
Prozessierung, weil eine effiziente Peptidfragmentierung eine vollständige oder
teilweise Entfernung von Zuckern vor der Proteolyse mit sich bringen
kann. O-gebundene Glykane können
die Prozessierung auch bezüglich
der Zugänglichkeit
von Spaltstellen lenken und beschränken deswegen einerseits das
Muster der Peptidfragmente, während
sie andererseits das Muster der Epitope bereichern. Die Erfinder
haben kürzlich
durch immunologische Verfahren gezeigt, dass MUC1-Core- bzw. Kernglykane
während
der Prozessierung nicht entfernt werden, und dass Glykopeptide,
die von MHC-Klasse-II präsentiert
werden, zur Aktivierung von T-Zell-Hybridomen in der Lage sind (nicht
veröffentlicht).
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Obwohl mehrere Cathepsine als Bestandteile
des Prozessierungsmechanismus identifiziert wurden (8, 9), ist gegenwärtig nicht
bekannt, welches Enzym (welche Enzyme) in die Prozessierung bzw.
Verarbeitung von MUC1 involviert sind und an welchen Stellen innerhalb
der Repeat-Domäne
sie tatsächlich
das Protein spalten. Es steht zu erwarten, daß mehrere Spaltstellen existieren,
und nur Subfraktionen der erzeugten Peptidfragmente sollten die
Anforderungen zur Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle erfüllen. Es könnte somit ein wertvoller Ansatz
zur Entwicklung neuer Anti-Krebsvakzinen darin liegen, neue immunogene
MUC1-Fragmente zu
identifizieren, die zur Bindung an MHC-Klasse-II-Moleküle in der
Lage sind.
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Es ist deswegen eine Aufgabe der
vorliegenden Erfindung, neue immunogene MUC1-Peptidfragmente bereitzustellen, die
bei Menschen zur Immunisierung verwendet werden können.
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Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen MUC1-Peptids
bereitzustellen, das eine Erhaltung des ursprünglich enthaltenen Glykosylierungsmusters
während
des Produktionsverfahrens ermöglicht.
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Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der
unabhängigen
Ansprüche
gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen
sind in den abhängigen
Ansprüchen
dargelegt.
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Der Erfinder hat überraschenderweise herausgefunden,
dass Cathepsin-L oder ein eng verwandtes Enzym ein sehr beschränktes Fragmentierungsmuster
während
der humanen und murinen DC-Prozessierung mit nur zwei bevorzugten
Spaltstellen pro MUC1-Repeat zeigt. Die Spaltspezifität und die
spezifische Hemmung der Protease stimmten mit der Annahme des Erfinders überein,
dass Cathepsin-L oder ein eng verwandtes Enzym (Cathepsine B oder
S) in diese hoch spezifische Spaltung involviert waren.
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Der experimentelle Aufbau verwendete
Kügelchen
bzw. Perlen, die mit biotinylierten und nicht markierten synthetischen
Glykopeptiden beschichtet waren, die eine oder mehrere Repeat-Einheiten
von MUC1 mit einzelnen oder mehrfachen O-gebundenen Kern-Typ (coretype)
Glykanen umfassen. Exogen verabreichte lösliche oder korpuskulär gebundene
MUC1-Peptidfragmente
wurden durch humane oder murine dendritische Zellen (DCs) rasch
aufgenommen und ein großer
Anteil wurde in den „späten" endosomalen
Kompartimenten während vier
Stunden prozessiert. Vom MUC1-Repeatpeptid stammende proteolytische
Fragmente, die identifiziert und sequenziert wurden, zeigen, dass
die Glykane während
der Antigen-Prozessierung
nicht entfernt werden, und dass das Vorhandensein der Kohlenhydrate
die Spaltstellen beeinflusst, was ein unterschiedliches Repertoire
an gespaltenen Peptiden zur Folge hat.
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Überraschenderweise
legen die Proteolyseprodukte eine hochspezifische Prozessierung
des Repeatpeptides mit einer bevorzugten Spaltstelle an der Thr-Ser-Peptidbindung
nahe. Während
menschliches Cathepsin D nicht dazu in der Lage war, das MUC1-Repeatpeptid
in vitro zu spalten, hatte eine Proteolyse mit menschlichem Cathepsin-L
eine spezifische Hydrolyse der Thr-Ser-Peptidbindung zur Folge.
Weil MUC1-Sequenzen in jeder Repeat-Einheit ein VTSA-Motiv enthalten,
beginnen die erzeugten Fragmente an ihrem N-Terminus mit der Aminosäuresequenz
SAP. Es hat sieh weiterhin herausgestellt, dass Cathepsin L das MUC1-Repeatpeptid an einer
weiteren Stelle spaltet, nämlich
an His-Gly. Damit entstehen als Intermediärprodukte der Prozessierung
GVT20-Fragmente (siehe z.B. SEQ ID NO: 12), die in Abhängigkeit
von der ortsspezifischen O-Glykosylierung durch einen weiteren proteolytischen
Schnitt in SAP 17-Fragmente überführt werden.
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Informationen über die Struktur prozessierter
MUC1-Glykopeptide sind für
die Entwicklung von Tumorvakzinen von äußerster Wichtigkeit. Eine intakte
O-Glykosylierung auf einem prozessierten MUC1-Repeatpeptid trägt zu einer
größeren Vielfalt
der MHC-Klasse-IIrestringierten T-Helferzelt-Reaktionen bei, wodurch
eine allumfassende Antitumorreaktion gefördert wird.
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Erfindungsgemäß wird ein MUC1-Peptidfragment
der Tandem-Repeat-Domäne
von humanem MUC1 bereitgestellt, das mit der Aminosäuresequenz
SAP beginnt und zumindest neun Aminosäuren aufweist. Die Aminosäuresequenz
von humanem MUC1 ist bereits bekannt und ist beispielsweise in der
SWISS PROT-Datenbank zu finden. Das MUC1-Protein enthält wechselnde
Anzahlen von Aminosäuren,
was auf einen Längen-Polymorphismus
zurückzuführen ist,
der sich aus individuell variablen Repeat-Anzahlen ergibt, und es sind
im Augenblick zumindest neun Isoformen bekannt (1/A, 2B, 3/C, 4/D,
5/SEC, 6/X, 7/Y, 8/Z und 9/S, die durch alternatives Spleißen erzeugt
werden).
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In dieser Erfindung werden spezielle
MUC1-Fragmente betrachtet, die aus einer synthetischen oder natürlichen
MUC1-Sequenz stammen, und die enzymatisch am VTSA-Motiv gespalten
wurden, das in allen MUC1-Sequenzen enthalten ist (oder im Falle
von synthetischen Fragmenten chemisch synthetisiert wurde). Die
Fragmente der vorliegenden Erfindung können somit durch Spaltung der
MUC1-Sequenzen mit Cathepsin-L gewonnen werden. Ungeachtet der Start-Aminosäureposition
in der Repeat-Sequenz (TAP, AHG, GST) und der Länge der Peptide (20mer, 21mer,
25mer, 100mer) spaltet Cathepsin-L im VTSA-Motiv des Repeat-Peptids
spezifisch zwischen Thr-Ser und ergibt dadurch die erfindungsgemäßen Peptidfragmente.
Es ist ein essentielles Merkmal der vorliegenden Erfindung, dass
alle Fragmente an ihrem N-Terminus mit der Aminosäuresequenz
SAP beginnen.
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Wie oben erwähnt, ist das MUC1-Peptidfragment
der vorliegenden Erfindung nicht in seiner Länge beschränkt und kann beispielsweise
bis zu 100 Aminosäuren
oder sogar mehr umfassen. Jedoch werden Aminosäuren bevorzugt, bei denen sich
das MUC1-Fragment im Bereich von 10–25, beispielsweise 20, Aminosäuren bewegt.
Da Cathepsin-L – wie
oben angesprochen – weiterhin
zu einer Proteolyse an His-Gly in der Lage ist, werden erfindungsgemäß insbesondere
Peptidfragmente mit 17 Aminosäuren
gebildet (d.h., das MUC1-Repeat-Peptid wird in einer Repeat-Einheit
an 2 Stellen gespalten (nämlich
Thr-Ser und His-Gly), wodurch sich ein Fragment aus 17 Aminosäuren ergibt,
siehe auch 5).
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Der Abbau bis auf das Niveau des
SAP17 wird jedoch durch O-Glykosylierung an Thr oder Ser innerhalb
des VTSA-Motivs inhibiert, so daß entsprechend glykosylierte
GVT20-Fragmente
als Endprodukte entstehen.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung spezielle MUC1-Peptidfragmente bereit, die die Aminosäuren von
SEQ ID NO: 1-4 oder 11 oder Varianten hiervon umfassen, wobei die Varianten
ein oder mehrere Insertionen, Substitutionen und/oder Deletionen
im Vergleich zur Sequenz von SEQ ID NO: 1-4 oder 11 umfassen, und
wobei die biologische Aktivität
der Varianten im Wesentlichen der Aktivität des Peptids gleich ist, das
die nicht-modifizierte Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 1-4 oder 11 umfasst, und vorausgesetzt, dass die
Varianten mit der Aminosäuresequenz
SAP beginnen und zumindest neun Aminosäuren umfassen.
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In diesem Kontext stellt die vorliegende
Erfindung die nachfolgenden Peptide bereit:
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Der Pfeil weist darauf hin, dass
die vorliegende Erfindung auch Varianten der oben erwähnten Aminosäuresequenzen
einschließt,
die um ein oder mehrere Aminosäuren,
ausgehend vom C-Terminus, reduziert sind, unter dem Vorbehalt, dass
die Varianten zumindest die neun N-terminalen Aminosäuren der
oben angezeigten Sequenzen umfassen (fett gedruckt).
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Der Begriff "biologische Aktivität", wie
hierin verwendet, betrifft die immunogene Funktion der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen.
Wie oben erwähnt,
wird MUC1 natürlich
in verschiedenen Krebsarten, wie Brustkrebs oder Adenokarzinomen, überexprimiert
und ist deswegen ein bedeutendes Target bzw. Ziel für die Immun-basierte
anti-Krebstherapie. Somit werden die wie hierin vorstehend offenbarten
MUC1-Fragmente in einem solchem Umfang betrachtet, in dem sie zur
Induktion einer Immunreaktion in Säugetieren, vorzugsweise Menschen,
in der Lage sind, um einen Angriff des Patienten-eigenen Immunsystems
gegen den jeweiligen Krebs zu initüeren/zu fördern.
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Die Aminosäuresequenzen der vorliegenden
Erfindung umfassen ebenfalls alle Sequenzen, die sich von den hierin
offenbarten Sequenzen durch Aminosäureinsertionen, -deletionen
und -substitutionen unterscheiden.
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Aminosäure- „Substitutionen" sind vorzugsweise
das Ergebnis des Ersetzens einer Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit ähnlichen
strukturellen und/oder chemischen Eigenschaften, das heißt konservative
Aminosäure-Ersetzungen.
Aminosäure-Substitutionen
können
auf der Grundlage einer Ähnlichkeit
in der Polarität,
Ladung, Löslichkeit,
Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphipatischen Natur der einbezogenen Reste
vorgenommen werden. Beispielsweise schließen unpolare (hydrophobe) Aminosäuren Alanin,
Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin
ein; polare neutrale Aminosäuren
schließen Glycin,
Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein; positiv
geladene (basische) Aminosäuren
schließen
Arginin, Lysin und Histidin ein; und negativ geladene (saure) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und
Glutaminsäure
ein.
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"Insertionen" oder "Deletionen" bewegen
sich typischerweise im Bereich von 1–3 Aminosäuren. Die erlaubte Variation
kann experimentell bestimmt werden, indem systematisch Insertionen,
Deletionen oder Substitutionen von Aminosäuren in einem Polypeptidmolekül unter
Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken vorgenommen und die sich
ergebenden rekombinanten Varianten bezüglich ihrer Aktivität untersucht
werden. Dazu ist für
den Fachmann nicht mehr als die Durchführung von Routineexperimenten
erforderlich. Im Falle der MUC1-Repeats sind drei Positionen bekannt,
die einen Sequenzpolymorphismus in der Population zeigen (Engelmann
et al., 2001, J. Biol. Chem. 276: 27764–27769; PCT Patentanmeldung
PCT/DE00/00440, deren Offenbarung durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit
in diese Anmeldung mit aufgenommen ist).
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Die vorliegende Erfindung betrifft
weiterhin eine Nukleinsäure,
die eine der oben erwähnten MUC1-Peptidfragmente
kodiert.
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Der Begriff "Nukleinsäuresequenz"
betrifft ein Heteropolymer aus Nukleotiden oder die Sequenz dieser
Nukleotide. Die Begriffe "Nukleinsäure" und "Polynukleotid" werden
hierin austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Heteropolymer
von Nukleotiden.
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Die Polynukleotide der vorliegenden
Erfindung schließen
ebenfalls ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, ein Polynukleotid,
das an das Komplement der offenbarten Nukleotidsequenzen unter moderat
stringenten oder stringenten Bedingungen hybridisiert; ein Polynukleotid,
das eine Allel-Variante irgendeines oben beschriebenen Polynukleotids
ist; ein Polynukleotid, das ein Spezies-Homolog irgendwelcher der
hierin offenbarten Proteine kodiert; oder ein Polynukleotid, das
ein Polypeptid kodiert, das eine zusätzliche spezifische Domäne oder
eine Trunkierung bzw. Verkürzung
der offenbarten Proteine aufweist.
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Die Stringenz der Hybridisierung,
wie hierin verwendet, betrifft Bedingungen, unter denen Polynukleotid-Doppelstränge stabil
sind. Wie dem Fachmann bekannt ist, ist die Stabilität eines
Doppelstranges eine Funktion der Natriumionenkonzentration und der
Temperatur (siehe beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual 2nd Ed. (Cold Spring
Harbor Laboratory, (1989)). Die Stringenzniveaus, die zur Hybridisierung
verwendet werden, können
vom Fachmann leicht abgewandelt werden.
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Der Begriff schwach stringente Hybridisierung
bezeichnet Bedingungen, die einer Hybridisierung in 10% Formamid,
5 × Denharts
Lösung,
6 × SSPE,
0,2% SDS bei 42°C,
gefolgt von Waschen in 1 × SSPE,
0,2% SDS bei 50°C äquivalent
sind. Denhart's Lösung
und SSPE sind dem Fachmann genauso wie andere geeignete Hybridisierungspuffer
wohl bekannt.
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Eine moderat stringente Hybridisierung
bedeutet Bedingungen, die es der DNA erlauben, an eine komplementäre Nukleinsäure zu binden,
die ungefähr
60% Identität,
vorzugsweise ungefähr
75% Identität,
besonders bevorzugt ungefähr
85% Identität
zu dieser DNA aufweist; wobei eine Identität von mehr als ungefähr 90% zu
dieser DNA besonders bevorzugt wird. Moderat stringente Bedingungen
sind vorzugsweise Bedingungen, die eine Hybridisierung in 50% Formamid,
5 × Denharts
Lösung,
5 × SSPE,
0,2% SDS bei 42°C
gefolgt von Waschen in 0,2 × SSPE,
0,2% SDS bei 65°C äquivalent
sind.
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Hochstringente Hybridisierung bedeutet
Bedingungen, die die Hybridisierung nur von solchen Nukleinsäuresequenzen
ermöglichen,
die in 0,018 M NaCl bei 65°C
stabile Doppelstränge
bilden (d.h., wenn ein Doppelstrang in 0,018 M NaCl bei 65°C nicht stabil
ist, ist er unter den hierin betrachteten hochstringenten Bedingungen
nicht stabil).
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Weiterhin können Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken
verwendet werden, um eine Nukleinsäure zu identifizieren und zu
gewinnen, die im Umfang der vorliegenden Erfindung liegt. Kurz gesagt
kann jede Nukleinsäure
mit einer gewissen Homologie zu einer in dieser Erfindung dargelegten
Sequenz oder einem Fragment hiervon, als Sonde zur Identifizierung
einer ähnlichen
Nukleinsäure
durch Hybridisierung unter moderat stringenten bis hochstringenten
Bedingungen verwendet werden. Solche ähnlichen Nukleinsäuren können dann
isoliert, sequenziert und analysiert werden, um zu bestimmen, ob
sie im Umfang der wie hierin beschriebenen Erfindung liegen.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
sind die MUC1-Peptidfragmente der vorliegenden Erfindung an einem
oder mehreren der Threonine oder Serine, die in der Sequenz enthalten
sind, O-glykosyliert. Vorzugsweise sind die MUC1-Peptidfragmente
einer der SEQ ID NO: 1–4
oder 11 an Thr 5 und/oder 12 glykosyliert. Jedoch können auch
alle anderen Serine oder Threonine in den jeweiligen Sequenzen glykosyliert
sein. Ein bevorzugtes Glykan, das hierin verwendet wird, ist GalNAc
oder weitere komplexe Glykane, die davon abgeleitet sind.
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Gemäß eines weiteren Aspektes stellt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen MUC1-Peptidfragmente
bereit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
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- a) Bereitstellen eines Peptids, das die Tandem-Repeat-Domäne von MUC1
oder einen Teil hiervon umfasst, wobei der Teil zumindest eine Repeating-Unit
bzw. Wiederholungseinheit der Tandem-Repeat-Domäne von MUC1 enthält,
- b) In-Berührung-Bringen
des Peptids aus a) mit einer wirksamen Menge Cathepsin-L, wodurch
das Peptid gespalten wird, und
- c) Isolieren der in b) erzeugten Fragmente.
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Das in a) bereitgestellte Peptid
ist vorzugsweise ein MUC1-Protein, das ein natürliches Glykosylierungsmuster
aufweist. Wie oben erwähnt,
wurde durch den Erfinder überraschenderweise
herausgefunden, dass eine wie in Schritt b) durchgeführte Cathepsin-L-Spaltung
das Glykosylierungsmuster des in a) bereitgestellten MUC1-Proteins
unversehrt bzw. intakt lässt.
Eine intakte O-Glykosylierung auf prozessierten MUC1-Repeat-Peptiden
wiederum trägt
zu einer größeren Vielzahl
der MHC-Klasse-II-restringierten T-Helferzell-Reaktionen bei, wodurch
die Gesamt-Antitumorreaktionen der Patienten erhöht wird. Somit führt das
erfindungsgemäße Verfahren
zu einem MUC1-Peptidfragment, das leicht durch die APCs des Patienten,
beispielsweise durch dendritische Zellen, auf dem MHC-Klasse-II-Weg
prozessiert werden kann und mit einem intakten Glykosylierungsmuster
präsentiert
wird, was zu einer erhöhten
Immunreaktion von T-Helferzellen führt. Es sollte in diesem Kontext
erwähnt
werden, dass bezüglich
des Glykosylierungsmusters keine Einschränkung besteht, jedoch führt ein
Threonin, das an der Spaltstelle glykosyliert ist, zu einer Thr-Ser-Bindung, die
gegenüber
einer Cathepsin-L-Proteolyse stabil ist. Glykosylierungen an anderen
Stellen stören
die erfindungsgemäße Spaltung
durch Cathepsin-L nicht, jedoch kann eine vielfache Gal-GalNAc-Substitution sowie eine
Substitution mit komplexen Glykanen eine Fragmentierung an His-Gly erschweren oder
sogar verhindern.
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Selbstverständlich ist das oben erwähnte Verfahren
nicht das einzige Verfahren, das zu den erfindungsgemäßen Peptidfragmenten
führt,
gleichgültig,
ob sie glykosyliert sind oder nicht. Es ist ebenfalls möglich, diese
Fragmente chemisch zu synthetisieren, indem beispielsweise ein erwünschtes
Glykosylierungsmuster bereitgestellt wird. Zur Synthese von Glykopeptiden
sind Glykosylaminosäure-Bausteine
erforderlich, die bereits die Oligosaccharid-Kette und Threonin
oder Serin enthalten. Die Synthese dieser Bausteine wurde bereits
beschrieben (Mathieux, N., Pauken, H., Meldal, M., Bock, K., J.
Chem. Soc., Perkin Trans. 1: 2359– 2368, 1997). Die Mehrfachsäulen-Festphasensynthese
kann in einem halbmanuellen 20-Säulen-Mehrfachsynthesegerät durchgeführt werden
und ein Wang-Harz kann als Trägermaterial
ausgewählt
werden. Das Wang-Harz (2,5 g) kann beispielsweise in einem Glasreaktor
angeordnet, in Dichlormethan (15 cm3, 10
Min.) gequollen und gewaschen werden. Ein Gemisch von Fmoc-Ala-OH
(3,40 mmol), 1-(Mesitylensulfonyl)-3-nitro-1,2,4-triazol (3,40 mmol)
und Methylimidazol (3,40 mmol) in Dichlormethan (15 cm3)
wurde zugesetzt. Nach 2 Stunden wurde das Harz gewaschen und die
unveränderten
Aminogruppen können
mit Ac2O/DMF (1:1; 15 cm3)
acetyliert werden. Das derivatisierte Harz wird dann für die Glykopeptidsynthese
in die 20 Säulen
des Synthesegerätes
gepackt. Das Reaktions- und Waschlösungsmittel kann DMF sein und
die Beseitigung des Fmoc-Schutzes wurde durch Behandlung mit Piperidin
(20 %) in DMF (20 Min.) durchgeführt.
Die Aminosäuren
werden a1s Fmoc-Aminosäure-Pfp-Ester
mit Dhbt-OH (3 Moläquiv.)
gebunden. Die Gal (1→3)
GalNAcenthaltenden Bausteine werden mit TBTU und N-Ethyldiisopropylamin
(1,5 Moläquiv.)
gebunden. Nach 20 Stunden Umsetzungszeit wird der Synthesezyklus
wiederholt, um den Aufbau jedes Glykopeptids abzuschließen. Nach
Entfernung der letzten Fmoc-Gruppen werden die Harze gewaschen,
getrocknet, mit 95 % wässrigem
TFA (2 cm3, 2 Stunden) behandelt und abfiltriert.
Darauf werden die Verbindungen mit katalytischen Mengen 1 % CH3ONa in Methanol bei pH 8,5 behandelt, um
die Acetylgruppen des Saccharid-Anteils zu entfernen und werden
durch eine präparative
RP-HPLC gereinigt. Die reinen O-Glykopeptide werden nach Lyophilisation
in Ausbeuten von 16-57 % gewonnen.
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Es werden vorzugsweise Glykopeptide
gebildet, die an einem oder mehreren der Threonin- oder Serinreste
O-gebundenes GalNAc oder längere
komplexe Glykane enthalten.
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Das in Schritt a) bereitgestellte
Peptid wird vorzugsweise durch natürliches MUC1 repräsentiert,
das aus humanen Milchfettmembranen (s. Müller et al., 1997, J. Biol.,
Chem. 272: 24780–24793),
aus Tumor-Aszites (Beatty et al., 2001, Clin. Cancer Res. 7, 781–787) oder
aus humanen Brustkarzinom-Zelllinien (Müller et al., 2002 J. Biol.
Chem. 277: 26103–26112)
gewonnen wird oder wird durch SEQ ID NO: 5, 6, 9 oder 10 oder 12
dargestellt.
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Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Aminosäuren des
in Schritt a) bereitgestellten Peptids des oben erwähnten Verfahrens
zur Herstellung der erfindungsgemäßen MUC1-Peptidfragmente O-glykosyliert, jedoch
vorausgesetzt, dass das Peptid nicht an der Spaltstelle von Cathepsin-L
glykosyliert ist. Vorzugsweise sind ein oder mehrere Threonine oder
Serine des erfindungsgemäßen Peptidfragmentes,
das in c) isoliert wird, O-glykosyliert.
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Gemäß eines weiteren Aspektes wird
ein MUC1-Peptidfragment bereitgestellt, das durch die oben erwähnten Verfahren
gewinnbar ist.
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Die Erfindung ist weiterhin auf ein
ex vivo-Verfahren zur Herstellung einer Population autologer Antigen
präsentierender
Zellen (APCs) gerichtet, die zur Induktion einer wirksamen Immunreaktion
gegen MUC1 in der Lage ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte
umfasst:
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- a) In-Berührung-Bringen
der autologen APCs von Tumorpatienten mit einer wirksamen Menge
eines erfindungsgemäßen MUC1-Peptidfragmentes
unter Bedingungen, die eine Endozytose, Prozessierung und MHC-Klasse-II-Präsentation
der Peptidfragmente durch die APCs ermöglichen, und
- b) Isolieren der MUC1-Peptid-präsentierenden APCs zum Zweck
einer immuntherapeutischen Anwendung in Patienten.
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Vorzugsweise werden die MUC1-Peptidfragmente
in a) an beschichtete Eisenoxid-Kügelchen gebunden. Es sei jedoch
erwähnt,
dass alle anderen bekannten Kügelchen
bzw. Beads im oben erwähnten
Verfahren zu diesem Zweck verwendet werden können. Im Allgemeinen können alle
Kügelchen
verwendet werden, die nicht größer als
ungefähr
1–2 μm sind und
eine kovalente Bindung von Antikörpern
und Lektinen erlauben.
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Darüber hinaus wird ein ex vivo-Verfahren
zur Herstellung gentechnisch erzeugter APCs bereitgestellt, die
zum Induzieren einer wirksamen Immunreaktion gegen MUC1 in der Lage
sind, und das die nachfolgenden Schritte umfasst:
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- a) Bereitstellen einer Nukleinsäure, die
für eines
der erfindungsgemäßen MUC1-Peptidfragmente kodiert;
- b) Transfizieren der APCs mit dieser Nukleinsäure, und
- c) Auswählen
von APCs, die die MUC1-Peptidfragmente in einer MHC-II-restringierten
Weise präsentieren.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
wird die Nukleinsäure
in Schritt a) in einem Expressionsvektor bereitgestellt. Dieser
Expressionsvektor umfasst vorzugsweise ein oder mehrere Regulationssequenzen.
Der Begriff "Expressionsvektor" betrifft im Allgemeinen ein Plasmid
oder einen Phagen oder ein Virus oder einen Vektor zum Exprimieren
eines Polypeptids aus einer DNA (RNA) Sequenz. Ein Expressionsvektor
kann eine Transkriptionseinheitumfassen, die eine Anordnung des
Folgenden aufweist: (1) ein genetisches Element oder Elemente mit
einer regulatorischen Rolle in der Genexpression, beispielsweise
Promotoren oder Enhancer, (2) eine Struktursequenz oder kodierende
Sequenz, die in mRNA transkribiert und in ein Protein translatiert wird
und (3) geeignete Transkriptionsstart- und – terminationssequenzen. Struktureinheiten,
die zur Verwendung in Hefen oder eukaryontischen Expressionssystemen
vorgesehen sind, schließen
vorzugsweise eine Leadersequenz ein, die die extrazelluläre Sekretion
eines translatierten Proteins durch einen Wirt ermöglicht. Es
kann alternativ, wenn ein rekombinantes Protein ohne eine Leader-
oder Transportsequenz exprimiert wird, einen N-terminalen Methionin-Rest
einschließen.
Dieser Rest kann oder kann nicht anschließend von dem exprimierten rekombinanten
Protein abgespalten werden, um das Endprodukt bereitzustellen.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
Erfindung wird eine APC bereitgestellt, die durch eines der vorher erwähnten Verfahren
gewinnbar ist. Vorzugsweise ist diese APC eine dendritische Zelle
oder eine B-Zelle.
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Die vorliegende Erfindung stellt
weiterhin eine therapeutische Zusammensetzung bereit, die das erfindungsgemäße MUC1-Peptidfragment
oder die erfindungsgemäßen APCs
und einen pharmazeutisch verträglichen
Träger
umfasst. Eine solche Zusammensetzung kann weiterhin (zusätzlich zum
Inhaltsstoff und dem Träger)
Verdünnungsmittel,
Füllmittel,
Salze, Puffer, Stabilisatoren, Lösungsvermittler
und andere Materialien enthalten, die in der Technik wohl bekannt
sind. Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" bedeutet ein untoxisches
Material, das die Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven
Inhaltsstoff (der aktiven Inhaltsstoffe) nicht stört. Die
Eigenschaften des Trägers
hängen
vom Verabreichungsweg ab. Die therapeutische Zusammensetzung kann
weiterhin weitere Mittel bzw. Wirkstoffe enthalten, die die Aktivität bzw. Wirksamkeit
oder Anwendung bei Behandlung verbessern bzw. erleichtern. Solche
zusätzlichen
Faktoren und/oder Mittel können in
der therapeutischen Zusammensetzung enthalten sein, um eine synergistische
Wirkung zu erzeugen oder um Nebenwirkungen zu minimieren.
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Techniken zur Formulierung bzw. Zubereitung
und Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind
in "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton,
PA, neueste Ausgabe, zu finden.
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Die Zusammensetzungen enthalten eine
therapeutisch wirksame Dosis des jeweiligen Inhaltsstoffes. Eine
therapeutisch wirksame Dosis betrifft diejenige Menge der Verbindung,
die ausreicht, um eine Linderung der Symptome, beispielsweise eine
Behandlung, Heilung, Prävention
oder Linderung derartiger Zustände,
insbesondere die Induktion einer Immunreaktion in einem Patienten
zu ergeben. Geeignete Verabreichungswege schließen beispielsweise eine parenterale
Verabreichung, einschließlich
intramuskulärer
und subkutaner Injektionen, ebenso wie intrathekaler, direkt intraventrikulärer, intravenöser, intraperitonealer
Injektionen ein. Die intravenöse
Verabreichung an den Patienten wird bevorzugt.
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Eine typische Zusammensetzung für eine intravenöse Infusion
kann so hergestellt werden, dass sie bis zu 250 ml sterile Ringer'sche
Lösung
und 10 mg Inhaltsstoff enthält.
Siehe Remington's Pharmaceutical Science (15. Ausgabe, Mack Publishing
Company, Easton, Ps., 1980). Die therapeutische Zusammensetzung der
vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise eine Vakzine.
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Wie oben erwähnt, findet diese Vakzine Anwendung
zur Verwendung in der Behandlung von Brustkrebs und anderen MUC1-positiven
Karzinomen, einschließlich
kolorektalen Karzinomen, Pankreas- und Magenkarzinomen.
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Soweit keine anderen Definitionen
angegeben sind, weisen alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe,
die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung auf, wie sie üblicherweise
vom Fachmann auf dem Gebiet, an den sich diese Erfindung wendet,
verstanden werden. Alle Veröffentlichungen,
Patentanmeldungen, Patente und anderen hierin erwähnten Referenzen
sind durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit mit aufgenommen. Im Falle
eines Konfliktes wird jedoch die vorliegende Beschreibung einschließlich der
Definitionen entscheiden. Zusätzlich
sind die Materialien, Methoden und Beispiele lediglich veranschaulichend
und sollen nicht als einschränkend
aufgefasst werden.
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Die Erfindung wird nunmehr durch
die begleitenden Zeichnungen veranschaulicht, die das Folgende darstellen:
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1 MUC1-Glykopeptid-Prozessierung
durch murine dendritische Zellen
-
Ein Gemisch aus biotinylierten Glykopeptiden
H1 bis H3 (AHGVTSAPDTRPAPGSTAPPA; SEQ ID NO: 5) und H4 bis H6 (AHGVTSAPESRPAPGSTAPAA;
SEQ ID NO: 6), die einer Teilsequenz von MUC1-Tandem-Repeats entsprachen
und die an ThrS (H1, H4), Thr10/Ser10 (H2, H5) oder Thr17 (H3, H6)
mit Ga1NAc glykosyliert waren, wurden zum Pulsen von murinen dendritischen
Zellen D2.4 verwendet. Die Prozessierungsprodukte wurden aus Zellfraktionen
Affinitäts-isoliert
oder aus Kulturüberständen isoliert,
mit Dithiotreitol reduziert, so dass die Markierung abgespalten
wurde und wurde durch Reflectron-MALDI-Massen-Spektrometrie im positiven Ionen-Modus
(positive ion mofle) analysiert.
A, zentrifugierte Zellfraktion;
B,
magnetisch getrennte Zellfraktion;
C, Kulturüberstand
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Die Hauptsignale bei m/z 2249,0 (H1
bis H3) und 2223,0 (H4 bis H6) entsprechen den Vorläufer-Glykopeptiden,
die Signale bei m/z 1695,7 (P1) und 1669,7 (P2) entsprechen den
SAP 16-Fragmenten (P 1 abgeleitet von H1 bis H3; P2 von H4 bis H6).
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2 Peptid-Sequenzierung
der Prozessierungsprodukte P1 und P2 durch LC-MS/MS-Analyse auf einem
Qtof2-Elektrospray-Massenspektrometer
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(Glyko)peptide wurden durch eine
Nanoflow-Flüssigchromatographie
auf einer Umkehrphasen-Mikrokapillarsäule aufgetrennt und online
durch Elektrospray-Massen-Spektrometrie im positiven Ionen-Modus
untersucht. B-Ion- und Y-Ion-Fragmentreihen aus den N-terminalen
und C-terminalen Sequenzen der Hauptpeptidprodukte (A, P1 bei m/z
1695; B, P2 bei m/z 1669) wurden dazu verwendet, die Sequenz der
SAP16-Peptide zu bestätigen
(Bezugnahme auf C).
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3 In
vitro-Proteolyse von MUC1-Glykopeptiden durch humanes Cathepsin-L
-
MUC1-Glykopeptide (10 μg) wurden
3 Stunden mit 2-5 munits Cathepsin-L in 0,1 M Natriumacetat, pH 5,5
behandelt, das 1 mM EDTA und 1 mM DTT enthielt. Reflectron-MALDI-Massenspektren wurden
im positiven Ionen-Modus unter Verwendung von α-Cyano-4-hydroxy-cinnamonsäure als Matrix aufgezeichnet.
A,
Biotinyliertes A3-Glykopeptid (m/z 2784,7), A3-Glykopeptid nach
reduktiver Spaltung der Markierung (m/z 2412,6), SAP16-Fragment
(m/z 1858, 3).
B, Produkte des nicht-markierten A3-Glykopeptids:
SAP16-Fragment (m/z 1858,0), APD15 (m/z 1771,0), TSA17 (m/z 1959,0).
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4 Cathepsin-L-artige
Aktivität
in Endosomen niederer Dichte aus murinen dendridschen Zellen spaltet
MUC1-Repeats bei Thr-Ser
-
Endosomen mit niederer Dichte (low-density
endosomes) in murinen dendritischen Zellen wurden aus Lysosomen
und Plasmamembranen durch Dichte-Gradienten-Zentrifugation in Percoll/Saccharose
(30 ml) aufgetrennt. Fraktionen (1 ml) wurden auf das Vorhandensein
von Markerproteinen/-enzymen (β-Hexosaminidase,
H2-Antigen) und bezüglich
ihrer proteolytischen Aktivität
getestet. Das TAP25-Peptid wurde als Substrat verwendet (20 Stunden,
37 °C, pH
5,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
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5 Cathepsin
L-vermittelte Proteolyse von MUC1-Repeatpepdden
-
In der Figur bezeichnet ⤋ eine
Spaltstelle von Cathepsin-L. ⟡ bedeutet eine Glykosylierungsstelle.
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Materialien
und Methoden
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Isolierung und
Kultivierung dendritischer Zellen
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Immortalisierte dendritische Zellen
(Klon D2.4) von C57BL/6-Mäusen
wurden bei 37 °C
und 5 % CO2 in DMEM gezüchtet, ergänzt mit 10 % FCS, L-Glutamin,
0,1 % 2-Mercaptoethanol und Antibiotika (9).
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Erzeugung synthetischer
(biotinylierter) MUC1-Glykopeptide und deren Bindung an magnetische
Eisenoxidkügelchen
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Die Glykopeptide H1 bis H6, die den
MUC1-Tandem-Repeat-Peptiden auf Grundlage der AHG21-Sequenzen AHGVTSAPDTRPAPGSTAPPA
(H1 bis H3) und AHGVTSAPESR-PAPGSTAPAA
(H4 bis H6) entsprachen und die GalNAc an Thr5, Thr10 oder Thr17
trugen, wurden gemäß früher veröffentlichter
Vorschriften (10) chemisch synthetisiert und schrittweise auf präparativen
und analytischen Umkehrphasensäulen
an einem HPLC-Arbeitsplatz (System Gold, Beckman, München, Deutschland)
isoliert. Dasselbe betrifft die Glykopeptid-Reihen H11 bis H13 (GaINAc-substituier)
und A3 (substituiert mit Galß1-3GalNAc
an Thr17), die auf derselben Peptidsequenz wie H1 bis H3 basieren.
Das 100mer-Peptid, das fünf
Repeats der MUC1-Domäne entspricht
und das mit dem HGV-Motiv beginnt, wurde durch eine lokale Einrichtung
(University of Pittsburgh) synthetisiert und in vitro mit GalNAc
unter Verwendung von gereinigtem Polypeptid-GalNAc-Transferasen-T1 und
-T2 (freundlicherweise von Herrn Dr. Hendrik Clausen, School of
Dentistry, University of Copenhagen, Dänemark, zur Verfügung gestellt)
unter den früher
beschriebenen Bedingungen (11, 12) glykosyliert.
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Die Glykopeptide H1 bis H6 (jeweils
100 μg)
wurden mit [2-(Biotinamido)ethylamido]-3,3'dithiopropionsäure-N-hydroxysuccinimidester
(100 mM in DMSO, 100 μl)
bei 50 °C über eine
Zeitspanne von 48 Stunden biotinyliert. Nach Abdampfen des Lösungsmittels
durch Vakuumzentrifugation wurden die biotinylierten Produkte von
nicht markierten Glykopeptiden und von überschüssigem Reagenz durch Umkehrphasen-Chromatographie
auf einer PLRP-S-Säule abgetrennt.
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Anti-MUC1-Dynabeads wurden durch
kovalente Bindung von 50 μg
monoklonalem B27.29-Antikörper an
tosylierte M-280-Kügelchen
(Dynal, Hamburg, Deutschland) in 0,1 M Boratpuffer, pH 9,5 (200 μl) 48 Stunden
lang bei Umgebungstemperatur hergestellt. Lektinbeschichtete Dynabeads
wurden in ähnlicher
Weise durch Bindung von 50 μg
Helix pomatia Agglutinin an M-280-Kügelchen hergestellt. Antikörper- und
Lektin-beschichtete Kügelchen
(108) wurden mit (biotinylierten) Glykopeptiden
(50 μg)
durch Inkubation in 250 μ1 AIMV-Medium unter Rollen
für 2 Stunden
bei Umgebungstemperatur komplexiert.
-
Antigen-Puls dendritischer Zellen
und Isolierung von Peptidfragmenten Murine dendritische D2.4 Zellen
(107 Zellen/ml) wurden in ein 15 ml Falcon-Röhrchen übertragen,
in AIMV-Medium suspendiert und 1 Stunde bei 37 °C (5 % CO2)
vorinkubiert. Antigene wurden als Gemisch biotinylierter Glykopeptide
H1 bis H6 (50 μg)
nach Bindung bzw. Konjugation an anti-MUC1-Antikörper- und Lektin-(HPA-)beschichtete
Dynabeads (jeweils zu 5 x l07 Kügelchen/ml
Endkonzentration) zugesetzt. Die 1 ml-Suspension wurde unter gelegentlichem Schütteln bei
37 °C (5
% CO2) für
eine Gesamtzeitspanne von 4 Stunden inkubiert. Nach Pulsen wurden
die Zellen aus dem Medium auf zwei Wegen abgetrennt: eine orthogonale
magnetische Trennung von Kügelchen-beladenen
Zellen und freien Dynabeads und eine Zentrifugation der verbleibenden
Zellen (180 g, 5 Min.), die im ersten Schritt aufgrund einer geringeren
Antigen/Kügelchen-Beladung
nicht entfernt wurden. Beide Zeltfraktionen wurden mehrmals in Phosphat
(4 mM), NaCl (153 mM), pH 7,2 gewaschen, während der zellfreie Überstand
bei 3000 g (5 Min., 4 °C)
zentrifugiert wurde. Die Zellfraktionen wurden auf Eis 15 Minuten
lang mit 100 μl
1% NP40, 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0, enthaltend ein Gemisch
von Protease-Inhibitoren (Sigma P8340, München, Deutschland), gefolgt
von Ultrabeschallung für
2 Minuten behandelt.
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In Experimenten, in denen biotinylierte
Antigene verwendet wurden, wurden die Zeltextrakte zweifach mit
PBS verdünnt
und mit 2 x 108 Streptavidin-beschichteten
Dynabeads M-270 für
30 Minuten bei 37 °C
und für
eine weitere 30-minütige
Zeitspanne unter Rollen bei Umgebungstemperatur inkubiert. Nach
magnetischer Trennung und dreimaligem Waschen der Kügelchen
wurden die biotinylierten Glykopeptide durch Reduktion mit 10 mM
Dithiotreitol bei 56 °C
(30 Minuten) abgespalten, durch Vakuumzentrifugation getrocknet
und in 0,1 % wässrige
Trifluoressigsäure
aufgenommen. Weil beide Zellfraktionen beträchtliche Anteile Antikörper- und Lektin-beschichteter
Perlen enthielten, wurden auch nicht markierte Peptid- und Glykopeptid-Fragmente
während
dieses Trennschrittes isoliert. Es zeigte sich, dass beträchtliche
Mengen des nicht markierten MUC1-Glykopeptids an Streptavidin-beschichtete
Dynabeads über
undefinierte Mechanismen banden, und dass sie während Erhitzen bzw. Erwärmen unter
reduzierenden Bedingungen eluieren. Peptide und Glykopeptide, die im
zellfreien Überstand
enthalten waren, wurden durch Verwendung von Gemischen von Streptavidin-,
anti-MUC1-Antikörper- und
Lektin-beschichteten Kügelchen
oder durch Anwendung einer Umkehrphasen-Chromatographie auf 50-μl-Säulen Poros
C18 isoliert. Nach Zuführung
von 500 μ1 Überstand
an die Umkehrphasensäule
wurde die Probe entsalzt, indem sie mit 0,1 % wäss riger Trifluoressigsäure gewaschen
und mit 80 % Acetonitril in 0,1 % wässriger Trifluoressigsäure eluiert
wurde.
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Massenspektrometrische
Analysen
-
MALDI-Massenspektrometrie: Die Peptid-
und Glykopeptid-Proben (20 μ]),
die in 0,1 % wässriger Trifluoressigsäure oder
in Gemischen mit Acetonitril enthalten waren, wurden auf einen Probenteller
aus rostfreiem Stahl durch Mischen einer 1 μl-Teilmenge mit demselben Volumen
an Matrix (gesättigte
Lösung
von α-Cyano-4-hydroxy-cinnamonsäure in Acetonitril/0,1
% TFA, 2:1) aufgebracht. Eine massenspektrometrische Untersuchung
wurde auf einem Broker-Reflex IV Gerät (Broker-Daltonic, Bremen,
Deutschland) durch positiven Ionen-Nachweis im Reflectron-Modus
durchgeführt.
Eine Ionisierung der kokristallisierten Analyten wurde mit einem
gepulsten Stickstoff-Laserstrahl (337 nm) induziert und die Ionen
wurden in einem Feld von 20 kV beschleunigt und reflektierten bei
23 kV (12, 13).
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Nanoflow-Flüssigkeitschromatographie mit
online ESI-Massenspektrometrie: LC/MS-Daten wurden auf einem Q-Tof
II Quadrupole-Time of Flight-Massenspektrometer (Micromass, Manchester,
UK) gewonnen, das mit einer Z-Spray-Quelle ausgestattet war. Die
Proben wurden unter Verwendung des Ultimate-nano-LC-Systems (LC
Packings, Amsterdam, Niederlande) eingebracht, das mit dem Famos-Autosampler
und dem Switchos-Säulenumschaltmodul
(column switching module) ausgerüstet
war. Der Säulenaufbau
umfasste eine 0,3 mm × 1
mm Trap-Säule
und eine 0,075 × 150
mm Analysesäule,
beide mit 3 μm
PepMap C18 (LC Packings, Amsterdam, Niederlande) bepackt. Die Proben
wurden 1:10 in 0,1 % TFA verdünnt.
10 μl wurden auf
die Trap-Säule
injiziert und 3 Minuten unter Verwendung von 0,1 % TFA und einer
Durchflussgeschwindigkeit von 30 μl/Min.
entsalzt. Das Eingangsventil 10 schaltete die Trap-Säule zum
analytischen Durchflussweg um und die Peptide wurden auf der Analysesäule unter
Verwendung eines Gradienten aus 5 % ACN in 0,1 % Ameisensäure zu 40
% ACN in Ameisensäure über 20 Minuten
und einer Säulendurchflussgeschwindigkeit von
ungefähr
200 nl/min. eluiert, was eine 1:1000-Aufteilung des 200 μl/min.-Durchflusses
ergab, der durch die Pumpe erbracht wurde. Das ESI-Interface umfasste
einen Metall-beschichteten PicoTip-Sprayemitter (New Objective,
MA), befestigt an der PicoTip-Halteranordnung (New Objective). Stabiles
Nanospray wurde durch Aufbringung von 2,5–3,0 kV auf das distale Ende
des PicoTips und durch eine Stickstoff- Gegenstromgeschwindigkeit von ungefähr 40 l/min.
aufgebaut. Die Daten-abhängige
Erfassung der MS- und MS/MS-Spektren wurde durch die Masslynx-Software
kontrolliert. Überwachungs-Scans
von einer Sekunde deckten den Bereich von m/z 400 bis m/z 1200 ab.
Doppelt und dreifach geladene Ionen, die eine vorgegebene Schwelle überschritten,
wurden für
MS/MS-Experimente ausgewählt.
Im MS/MS-Modus wurde der Massenbereich von m/z 40 bis m/z 1400 in
einer Sekunde gescannt und 10 Scans ergaben sich für jedes
Experiment. Micromassen-formatierte Peak-Listen wurden aus den Rohdaten
unter Verwendung des Proteinlynx-Softwaremoduls erzeugt.
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Konfokale Lasermikroskopie
und Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren
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Die Antigen-Aufnahme wurde durch
durchflusszytometrische Analysen unter Verwendung eines Becton Dickinson
FACScalibur gemäß einer
kürzlich
veröffentlichten
Vorschrift (14) mengenmäßig erfasst.
Vor der mikroskopischen Inspektion wurden die DCs mit 2 % Formaldehyd
fixiert und mit 0,1 % Saponin permeabilisiert. Im Anschluss an eine
Färbung
mit anti-MUC1-Antikörpern (B27.29,
Biomira, Edmonton, Kanada), biotinyliertem sekundärem anti-Maus-Ig (Dako, Hamburg,
Deutschland) und FITC-markiertem Streptavidin (Sigma), wurden die
Zellen ein zweites Mal mit 1 % Paraformaldehyd fixiert, die Kammern
der Objektträger
entfernt und die Objektträger
zur Untersuchung durch konfokale Lasermikroskopie auf einer Leica
DM IRE2 (14) befestigt.
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In vitro-Proteolyse von
MUC1 (Glyko)peptiden mit menschlichen Cathepsinen und endosomalen
Fraktionen mit niederer Dichte aus murinen dendritischen Zellen
-
Humanes Cathepsin-L und -D wurden
von Sigma (München,
Deutschland) bezogen und in 0,1 M Natriumacetatpuffer, pH 5,5 solubilisiert,
der 1 mM EDTA (Cathepsin-D) und 1 mM Dithiothritol (Cathepsin-L)
enthielt. 2–5
munits (mUnits) Enzym wurden zu 10 μg (Glyko)peptidsubstraten (entsprechend
ungefähr
5 nmol Repeat-Einheiten) in einem Gesamtvolumen von 20 μl Digestionspuffer
(s. o.) zugesetzt. Die Reaktionsgemische wurden bei 37 °C inkubiert
und 2 μl
wurden nach 3 oder 24 Stunden abgezogen und 10 bis 20-fach in 0,1 %iger
wässriger
TFA vor der MALDI-Massenspektrometrie verdünnt.
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Murine dendritische Zellen (108) wurden durch Feinnadelaspiration auf Eis
unter Verwendung von 1 ml von 0,3 M Saccharose, 0,01 M Hepes als
Puffer (ohne Protease-Inhibitoren) homogenisiert. Nach Verdünnung auf
7 ml und Zentrifugation bei 850 g für 10 Minuten zur Entfernung
intakter Zellen und Kerne wurden 6 ml des Überstandes über 24 ml 35 % Percoll mit
0,3 M Saccharose, 0,01 M Hepes für
105 Minuten bei 20.000 UpM in einer Zentrifuge (Modell J2-21 M/E,
Rotor: JA-20, Beckman Instruments, München, Deutschland) (15) zentrifugiert.
Der Gradient wurde durch einen Schwerkraftsiphon (30 × 1 ml)
fraktioniert und jede Fraktion wurde nach Beschallung durch Enzymimmunassay
mit einem anti-H2-Antikörper
auf Gegenwart von MHC-Klasse-II-Moleküle und auf β-Hexosaminidase-Aktivität (15) und
Cathepsin-L-bezogene proteolytische Aktivität unter Verwendung von TAP25-Peptid
als Substrat (5 μg),
untersucht. Die Proben wurden 24 Stunden bei 37 °C inkubiert, 20-fach in wässriger
TFA verdünnt
und durch MALDI-Massenspektrometrie untersucht. Zur spezifischen
Hemmung der Cathepsin-L=Aktivität
wurden die entsprechenden Fraktionen mit 1 μm Z-Leu-Leu-Leu-fluormethylketon
(Sigma) vermischt.
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Prozessierung von MUC1-Glykopeptiden
durch murine dendritische Zellen
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In einer Reihe von Experimenten wurde
eine Vielzahl von Anwendungsarten für das Pulsen von dendritischen
Zellen mit Antigenen durch Anwendung konfokaler Lasermikroskopie
und Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortieren in der kinetischen Analyse
von Cy3-markiertem MUC1-Peptid (100mer) getestet. Gemäß den nuantitativen
FACScan-Daten nahm der Anteil der Fluoreszenz-markierten Zellen
mit der Zeit bis zu 2 Stunden zu, jedoch noch mehr mit der Art der
Antigen-Aufbringung als freies Peptid, als Peptid-Antikörperkomplex
oder als Konjugate an paramagnetischen Eisenoxid-Kügelchen.
Die letzteren wurden von den Zellen am effektivsten unabhängig von
der Größe der Kügelchen
(50 nm oder 1 μm
Durchmesser) und unabhängig
von der Art der Peptid-Bindung an die Kügelchen über immobilisiertes Streptavidin,
anti-MUC1-Antikörper
(C595, B27.29) oder Helix pomatia Agglutinin (im Falle von GalNAc-substituierten
Glykopeptiden) eingebaut. Während
nach einer zweistündigen
Inkubationszeit mehr als 80 % der Maus-DCs mit Antigen-beschichteten
Kügelchen
(1 μm) beladen
waren, wurde bei Peptid-Antikörperkomplexen
ein Anteil von nur 15-20 % und bei freiem Peptid-Antigen von unter
5 % erreicht. Demgemäß waren
alle Versuche, Peptid-Prozessierungsprodukte
nach Pulsen mit freiem Antigen oder Antigen-Antikörperkomplexen
zu identifizieren, nicht erfolgreich.
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Maus-DCs wurden an AIMV-Medium angepasst
und 4 Stunden mit einem Gemisch aus biotinylierten Glykopeptiden
(H1 bis H6) gepulst, die an Antikörper- und Lectin-beschichtete
Kügelchen
gebunden waren. Drei Fraktionen, nämlich das magnetisch getrennte
Zell-Pellet, das zentrifugierte Zell-Pellet und der Überstand wurden
auf das Vorhandensein proteolytischer Fragmente untersucht, die
von den 21mer GaINAc-Peptiden abgeleitet waren (
1). Eine Peptid-Isolierung wurde durch
magnetische Trennung auf Streptavidin-beschichteten Kügelchen
nach Inkubation mit Zellextrakten oder Überstand oder durch Urrikehrphasen-Festphasenextraktion
auf Poros C 18 durchgeführt.
Die Fraktionen wurden durch MAL-DI(tof)-Massenspektrometrie, um
das Massenmuster der Peptidprodukte zu gewinnen und durch Nanoflow-LC-ESI-Massenspektrometrie
im MS/MS-Modus analysiert, um die Sequenzinformation zu gewinnen.
Die in
1 dargestellten
Ergebnisse zeigen eine umfassende Fragmentierung der Glykopeptide
an, wobei der Überstand überwiegend
prozessierte Produkte enthielt, wohingegen die Zellfraktionen ebenfalls
beträchtliche
Anteile an restlichen 21mer-Glykopeptiden enthielten. Die AHG21-Glykopeptide
AHGVT-SAPD(E)T(S)RPAPGS
TAPP(A)A (substituiert mit einem GalNAc-Rest) wurden jeweils bei
m/z 2249,0 und 2223,0 identifiziert, entsprechend den Massen von
N-thiopropionyliertem H1 bis H3 (m/z 2249,0) und H4 bis H6 (m/z
2223,0). Die einzigen identifizierten Produkte wurden jeweils bei
m/z 1695.7 (P1) und bei m/z 1669,7 (P2) registriert, entsprechend
den GalNAc-enthaltenden Peptidfragmenten SAP16. Die Sequenz der
beiden Peptidprodukte (P1, P2) wurde durch MS/MS auf einem Qtof2-Gerät bestätigt und
umfasste 16 Aminosäure
lange C-terminale Anteile der AHG21-Glykopeptide (
2),
die beide GalNAc an Thr/Ser10
oder Thr17 (Nummerierung gemäß der AHG21-Sequenz)
enthielten. Keine SAP16-Peptide ohne GaINAc wurden jeweils bei m/z
1492 und 1466 registriert, was darauf hinweist, dass die Proteolyse
von AHG21 mit GaINAc an ThrS, das neben der Spaltstelle vorlag,
nicht eintrat. Eine Sequenzierung der verbleibenden AHG21-Glykopeptide durch
MS/MS-Analyse zeigte, dass sich das GalNAc vorzugsweise an ThrS
befand, was mit der Annahme übereinstimmt,
dass unverdaute Protease-resistente AHG21- Glykopeptide mit H1 bzw. H4 identisch
waren (
2). Das 5 Aminosäure lange
N-terminale proteolytische Fragment AHGVT (N-thiopropionyliert)
wurde in keinem der Spektren nachgewiesen. Kontrollexperimente mit
DC-geprimten AIMV-Medien ohne Antigen (4 Stunden) zeigten an, dass
keine proteolytische Aktivität
in das Medium sezerniert wurde, was eine nachweisbare Endopeptidase-Spaltung
des TAP25-Peptids nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C zur Folge
hatte. Jedoch wurde nach Einstellung des Überstands auf Bedingungen,
die für
Cysteinproteasen optimal waren (pH 5,5, 1 mM Dithiotreitol) eine
geringere Exopeptidase-Spaltung
des Peptids im Massenspektrum (Daten nicht dargestellt) registriert.
Daher können
die SAP 16-Fragmente, die in den Überständen von Antigen-gepulsten
Zellen nachgewiesen wurden, als zelluläre Produkte und nicht als extrazelluläre Produkte
sezernierter Proteasen angesehen werden.
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In-vitro-Proteolyse von
MLTC1-Glykopeptiden mit humanem Cathepsin-L
-
Um die Prozessierungsdaten zu verifizieren,
die mit Maus-DCs gewonnen wurden, und um die vorgeschlagene Identität der vorzugsweise
involvierten Protease(n) zu bestätigen,
führten
wir eine Reihe von in vitro-Digestionen mit Cathepsin-L und ausgewählten Peptidsubstraten
(Tabelle 1, 3) durch.
Unter Anwendung von Standardbedingungen für Cysteinproteasen und Inkubationszeiten
von 3 Stunden war das Enzym dazu in der Lage, alle nichtglykosylierten
MUC1-Repeatpeptide quantitativ zu spalten, außer der Variante GST20-AES-Peptid (80 % Spaltung).
Ungeachtet der Startaminosäure-Position
in der Repeat-Sequenz (TAP, AHG, GST) und der Länge der Peptide (20mer, 21mer,
25mer, 100mer) spaltete Cathepsin-L im VTSA-Motiv des Repeatpeptids
spezifisch zwischen Thr-Ser. Außer
dieser bevorzugten Spaltstelle, die in Übereinstimmung mit den in vivo-Daten
steht, stellte sich heraus, dass geringere Aktivitäten der
Enzymzubereitung auf die angrenzenden Positionen Val-Thi(TSA17 bei
m/z 1959) und Ser-Ala (APD15 bei m/z 1771) gerichtet waren. Um die
Möglichkeit
auszuschließen,
dass Aminopeptidasen für
die Erzeugung dieser kleineren Produkte verantwortlich sein könnten, wurde
ein geschütztes
Substrat, das am Amino-Terminus eine Biotin-Markierung trug, als
Substrat verwendet (3A). Ebenso in Übereinstimmung
mit der DC-vermittelten Prozessierung war die Erkenntnis, dass O-glykosylierte
Peptide, die Ga1NAc oder Galβ 1-3
Ga1NAc trugen, effektiv digeriert wurden (Tabelle 1, 3B). Darüber hinaus stellte sich heraus,
dass die Position der Glykan-Bindung an eines der drei Threonine
(Thr5, Thr10, Thr17) in der AHG21-Sequenz entscheidend ist, wie
es durch die in vivo-Daten nahegelegt ist. Während GalNAc oder Galaβ 1-3 GalNAc
in von der Spaltstelle entfernteren Positionen (Thr10, Thrl7) keinen
Einfluss auf die Spaltung durch Cathepsin-L aufwiesen, waren die
Glykopeptide H1 und H4, die beide an der Spaltstelle (Thr5) glykosyliert
waren, gegenüber
einer Proteolyse stabil. Eine geringere Exopeptidase-Aktivität war (im
Falle dieser Glykopeptide) in der Cathepsin-L-Zubereitung aus menschlicher Leber
nachweisbar. Als Kontrolle wurde menschliches Cathepsin-D mit einer
Auswahl an MUC1-Repeatpeptiden und Glykopeptiden getestet, und es
stellte sich heraus, dass es nicht dazu in der Lage war, irgendeines von
diesen sogar dann, wenn Inkubationszeiten von bis zu 24 Stunden
ausgewählt
wurden, als Substrat zu verwenden. Es kann gefolgert werden, dass
die proteolytische Aktivität
in der menschlichen Cathepsin-L-Zubereitung alle Hauptaspekte der
MUC1-Glykopeptid-Prozessierung
in vivo durch Maus-DCs zusammenfasste.
-
In-vitro-Proteolyse von
MUC1-Glykopeptiden mit Enzymen in endosomalen Fraktionen mit niederer
Dichte aus murinen dendritischen Zellen
-
Murine dendritische Zellen wurden
in Abwesenheit von Protease-Inhibitoren aufgebrochen und der Überstand
nach Entfernung der Kerne in einem Percoll-Gradienten zentrifugiert.
Die Gradientenfraktionen wurden auf ihre proteolytische Aktivität unter
Verwendung von TAP25 als Substrat getestet und unter Verwendung von
Inkubationsbedingungen, die für
Cysteinproteasen optimiert waren (4).
Endosomen mit niederer Dichte wurden aus Lysosomen gemäß der Registrierung
von Marker-Proteinen (a-Hexosaminidase) abgetrennt und es wurde
gezeigt, dass sie eine Cysteinprotease enthielten, die mit Z-Leu-Leu-Leufluormethylketon
nicht hemmbar war und mit einer Ortsspezifität, die mit humanem Cathepsin-L
in Beziehung stand. Nur Enzyme in Fraktionen mit einer Dichte um
1,037 g/ml spalteten das TAP25-Peptid und H3/H6 Glykopeptide an
Thr-Ser, wodurch SAP16 gewonnen wurde, während alle Fraktionen, insbesondere
diejenigen mit Dichten von über 1,054
g/ml, beträchtliche
Aktivitäten
von Carboxypeptidase(n) enthielten (4).
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Die hier vorliegende Arbeit zeigt
zum ersten Mal eine Einsicht in die Prozessierung des humanen Glykoprotein-Tumorantigens
MUC1 durch DCs. Unter Verwendung von Methodologien aus dem Stand
der Technik zur Strukturcharakterisierung von Peptiden/Glykopeptiden war
diese Studie dazu in der Lage, vier bedeutende Fragen betreffend
der MUC1-Proteolyse durch APCs im MHC-Klasse-II-Weg zu beantworten:
1) Welche sind die Spaltstellen im MUCI-Repeat-Peptid? 2) Auf welchem
Wege beeinflussen O-gebundene Glykane die proteolytische Spaltung?
3) Werden Kerntyp-Glykane vor der proteolytischen Prozessierung
entfernt? 4) Welche der in den Prozessierungsmechanismus involvierten
Enzyme sind für
die proteolytische Spaltung von MUC1-Repeat-Peptiden verantwoitlich?
Unsere Ergebnisse zeigen, dass MUC 1-Repeats an zwei Stellen, nämlich zwischen
Thr-Ser im VTSA-Motiv und zwischen His-Gly gespalten werden. Während der
in vivo-Prozessierung wurden die Coretype-Glykane GalNAc und Galß 1-3 GalNAc
nicht entfernt, hemmten jedoch die Spaltung, wenn sie sich neben
der Spaltstelle befanden. Die obigen Aspekte, insbesondere die Ortsspezifität der Spaltung
und die ortsabhängigen
Wirkungen der Kohlenhydrate wurden unter Verwendung von menschlichem
Cathepsin-L in vitro Perfekt simuliert. Weil dieses Enzym zur Cystein-Protease-Familie
gehört,
die mit Papain verwandt ist und von der beansprucht wird, dass sie
in die Antigen-Prozessierung involviert ist (7, 8), bestätigten wir
weiter die Einbeziehung von Cathepsin-L (oder einer eng verwandten
Enzymspezies) in die MUC1-Repeat-Proteolyse
durch spezifische Hemmung. Es kann angenommen werden, dass die Antigen-Prozessierung
in späten
Endosomen durch eine Familie von Proteasen mit teilweise überlappenden,
jedoch noch verschiedenen Spezifitäten vermittelt wird. Daher
schließen
die in vitro-Daten über
die Cathepsin-L-Spaltung von MUC1, die in diesem Dokument präsentiert
wird, nicht die mögliche
Einbeziehung anderer, Cathepsin-L-verwandter Enzyme in den Prozessierungsmechanismus
und in die spezifische Spaltung von MUC1 ein.
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Das Peptid SAP 17 oder die glykosylierten
Derivate, die O-gebundene Glykane an den mehr C-terminalen Thr-
und Ser-Positionen tragen, können
die bevorzugten, wenn nicht exklusiven Prozessierungsprodukte von
MUC1-Repeats in DCs darstellen. Die strukturellen Merkmale dieser
Produkte stimmen mit Erkenntnissen aus einer immunologischen Studie überein,
die parallel durchgeführt
wurden. Gemäß dieser
Arbeit bleiben Glykane während
der Prozessierung von MUC1-Glykopeμtiden durch DCs intakt, beeinflussen
jedoch die Aktivierung von T-Zell-Hybridom-Klonen in einer ortsspezifischen
Weise. Klon VFS, der mit einem Peptidepitop reaktiv ist, das das
DTR-Motiv aufweist, wurde durch humane DCs, gepulst mit AHG21-Glykopeptiden,
aktiviert, die Glykane an Ser16 oder Thr 17 trugen. Keine Zunahme
der IL-2-Produktion durch diesen Klon war jedoch messbar, wenn die
Glykane am vorge schlagenen Epitop oder an den Thr-Ser-Positionen
neben der Spaltstelle angeordnet waren, die in der vorliegenden
Studie definiert wurden (ThrS, Ser6). Daher können die Ogebundenen Glykane
die ortsspezifische proteolytische Prozessierung oder Präsentation
der MHC-Klasse-II-restringierten Glykopeptide verändern. Dass
Glykane die Präsentation
von Glykopeptiden auf MHC-Klasse-II negativ beeinflussen, kann nicht
verallgemeinert werden, weil eine effektive MHC-Klasse-II-Präsentation von
Glykopeptiden und eine Aktivierung von 7-Zellen (16) gezeigt wurde.
Es existieren Belege dafür,
dass Glykane nicht nur negative Auswirkungen auf die DC-vermittelte
Prozessierung und 7-Zell-Aktivierung aufweisen. Wir haben damit
in Übereinstimmung
ein 7-Zell-Hybridom VF9 erzeugt und charakterisiert, das mit MHC-Klasse-II-präsentierten
MUC1-Glykopeptiden reaktiv ist, die an Thr5 in der AHG21-Sequenz
Galβ 1-3
GalNAc trageni. Das spezifische Epitop dieses T-Zell-Hybridom-Klons FV9 unterstellt,
dass ein 21mer Glykopeptid den Prozessierungsmechanismus ungespalten
durchläuft
und als solches, auf MHC-Klasse-II-Proteinen präsentiert wird. Somit überleben
O-gebundene Glykane nicht nur den Prozessierungsmechanismus auf
APCs und werden auf MHC-Klasse-II-Proteinen präsentiert, sie können auch
in die Epitop-Struktur involviert sein, die von T-Zell-Rezeptoren
erkannt werden. Auf dieser Grundlage kann hypothetisch verallgemeinert
werden, dass Glykane auf diese Weise zu einer größeren Diversifikation der Immunreaktion
gegenüber
dem redundanten Proteinkern von MUC1 beitragen können.
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Es wurde beansprucht, dass Tumor-assoziiertes
MUC1, insbesondere die Glykoformen von Brustkrebszellen, unterglykosylierte
Proteinkerne zeigen (17), was sich auf beides bezieht, sowohl auf
verkürzte Kettenlängen als
auch auf eine reduzieite Anzahl von glykosylierten Stellen pro Repeatpeptid.
Wir konnten kürzlich
zeigen, dass diese Annahme nur teilweise korrekt ist, weil die Strukturanalyse
von MUC1-Proben, die in vier unterschiedlichen Brustkrebs-Zelllinien
rekombinant exprimiert wurden, erhöhte O-Glykosylierungsdichten
(18) zeigten. Darüber
hinaus unterschieden sich die Muster der O-gebundenen Ketten zwischen
individuellen Zelllinen stark, was darauf hinweist, dass kein gemeinsames
Brustkrebsassoziiertes Profil existiert. Letztendlich wurde die
vorgeschlagene Verschiebung von Core-2-basierten Glykanen zu Core-1 nicht verifiziert, ganz
im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Core-2 die vorherrschende strukturelle
Grundlage der Krebs-assoziierten Glykane bildete. Ein durchschnittliches
Profil der O-gebundenen Glykane, das für MUC1 aus gepoolten Ascites-Proben von Brust-
und Pankreaskrebspatienten ermittelt wurde, stimmte ebenfalls mit
einer komplexeren, Core-2-basierten Glykosylierung überein (19).
Interessanterweise repräsentiert
diese Glykoform des Mucins ein schwaches Immunogen im MHC-Klasse-I-Weg
(20) und ist im MHC-Klasse-Π-Weg
nicht immunogen (14). Das letztere Phänomen wurde einem „Festhalten"
des Antigens in frühen
Endosomen von DCs zugeschrieben, das durch eine multivalente, hoch-avide
Wechselwirkung mit dem Mannose-Rezeptor (14) vermittelt wurde. Es
kann demgemäß geschlossen
werden, dass die O-Glykosylierung von MUC1 in erster Linie das „Trafficking"
von endozytiertem Mucin stört.
Später,
wenn die spät-endosomalen
Kompartimente für
das Antigen zugänglich
sind, können
auch andere Störarten,
die durch Ogebundene Glykane vermittelt werden, zum Zuge kommen,
wie eine sterische Hemmung der Proteolyse. Die Existenz derartiger
Einschränkungen, die
durch eine ortsspezifische O-Glykosylierung
eingeführt
wurden, werden in der vorliegenden Studie offensichtlich, weil an
Thr-Ser im VTSA-Motiv von MUC1-Repeats gebundene Glykane die Prozessierung
der Glykopeptide verhinderten. Die spezifische Proteolyse des MUC1-Peptids
durch Cathepsin-L würde
ebenfalls die Beobachtung erklären,
dass ein Tn-100mer-Peptid mit insgesamt 15 Gal-NAc-Resten, gebunden an jedes Thr5,
Ser16 und Thr17 (Nummerierung gemäß der AHG20-Sequenz) nicht dazu in der Lage war,
Th-Zell-Klone zu aktivierenl. Daher muss die ortsspezifische Glykan-Substitution,
nicht notwendigerweise die Glykan-Struktur, bei der Entwicklung
von Krebsvakzinen beachtet werden. Weil nicht alle glykosylierten
Epitope für
die MHC-Klasse-II-Präsentation
verfügbar
waren, präsentieren
SAP17 und dessen glykosylierte Derivate eine "vorprozessierte" Form,
die zur internen oder externen Beladung auf MHC-KIasse-II-Moleküle in immuntherapeutischen
Ansätzen
geeignet ist. Bei Beladungsexperimenten mit SAP17 können die
Glykosylierungs-abhängigen
Wirkungen auf die Bindung an MHC-Klasse-II-Proteine
und an die T-Zell-Rezeptoren durch systematische Variation der Substitutionsorte
und Strukturen der Glykane untersucht werden.
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