DE10253108B4

DE10253108B4 - Verfahren zur Detektion eines Objekts mit einem Rastermikroskop und Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts

Info

Publication number: DE10253108B4
Application number: DE2002153108
Authority: DE
Inventors: Bernd Dipl.-Ing. Widzgowski
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2002-11-13
Filing date: 2002-11-13
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2022-11-14
Also published as: DE10253108A1

Abstract

Verfahren zur Detektion eines Objekts (2) mit einem Rastermikroskop (1), wobei das Objekt (2) zur Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle (3) abgerastert wird, wobei jedem Bildelement (4) eines zu generierenden Objektbilds (5) ein vom Rastervorgang abhängiges Zeitintervall entspricht, wobei die Leistung des vom Objekt (2) kommenden Lichts mit einer Detektionseinrichtung (7) detektiert wird, wobei die Detektionseinrichtung (7) ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal (8) erzeugt, wobei die Detektionseinrichtung (7) in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale (8) zu einer Auswertung weiterleitet, wobei die Detektionseinrichtung (7) in einem ersten Kanal (9) im Wesentlichen den Anteil (11) des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals (8) auswertet, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts (6) entspricht, und wobei die Detektionseinrichtung (7) in einem zweiten Kanal (10) im Wesentlichen den Anteil (12) des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals (8) auswertet, der der durch die leistungsmodulierte oder pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkten...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion eines Objekts mit einem Rastermikroskop, wobei das Objekt zur Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle abgerastert wird, wobei jedem Bildelement eines zu generierenden Objektbilds ein vom Rastervorgang abhängiges Zeitintervall entspricht, wobei die Leistung des vom Objekt kommenden Lichts mit einer Detektionseinrichtung detektiert wird, wobei die Detektionseinrichtung ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal erzeugt, wobei die Detektionseinrichtung in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale zu einer Auswertung weiterleitet, wobei die Detektionseinrichtung in einem ersten Kanal im Wesentlichen den Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals auswertet, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts entspricht, und wobei die Detektionseinrichtung in einem zweiten Kanal im Wesentlichen den Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals auswertet, der der durch die leistungsmodulierte oder pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkte Leistungsveränderung des detektierten Lichts entspricht, weiterleitet. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts, wobei das Objekt zur Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle abrasterbar ist, wobei jedem Bildelement eines zu generierenden Objektbilds ein vom Rastervorgang abhängiges Zeitintervall entspricht, wobei die Leistung des vom Objekt kommenden Lichts mit einer Detektionseinrichtung detektierbar ist, wobei mit der Detektionseinrichtung ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal erzeugbar ist, wobei von der Detektionseinrichtung in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale zu einer Auswertung weiterleitbar sind.
Unter Rastermikroskopen im Sinn der vorliegenden Erfindung sind Mikroskope zu verstehen, bei denen das abzubildende Objekt mit einem Beleuchtungsmuster abgerastert wird. Dieser Rastervorgang erfolgt üblicherweise mäanderförmig, so dass das Objekt mit dem Beleuchtungsmuster in ähnlicher Weise abgerastert wird, wie beispielsweise ein Elektronenstrahl auf den Bildschirm einer Braun'schen Röhre gelenkt wird.
Insbesondere bei biomedizinischen Anwendungen werden seit geraumer Zeit ganz besondere Rastermikroskope, nämlich konfokale Rastermikroskope, dann einge setzt, wenn – verglichen zu konventionellen Auflicht- oder Durchlichtmikroskopen – eine verbesserte Auflösung entlang der optischen Achse benötigt wird.
Bei konfokalen Rastermikroskopen wird ein Objekt mit einem fokussierten Lichtstrahl abgerastert, was im Allgemeinen durch Verkippen zweier im Strahlengang des konfokalen Rastermikroskops angeordneter Spiegel realisiert wird. Hierdurch wird der Fokus des Lichtstrahls in der Fokalebene eines Mikroskopobjektivs bewegt, wobei die Ablenkrichtungen des Lichtstrahls meist senkrecht zueinander angeordnet sind, so dass beispielsweise ein Spiegel den Strahl in x- ein anderer Spiegel den Strahl in y-Richtung ablenkt. Die Bewegung bzw. Verkippung der Spiegel wird üblicherweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Der fokussierte Lichtstrahl weist in der Fokalebene eines Mikroskopobjektivs ein nahezu punktförmiges Beleuchtungsmuster auf, was einer konfokalen Beleuchtung entspricht. In einer zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs korrespondierenden Ebene ist eine Detektionslochblende derart angeordnet, dass lediglich das vom Objekt kommende Licht aus dem Beleuchtungsfokusbereich die Detektionslochblende zu einem dahinter angeordneten Detektor passieren kann.
Das vom Objekt kommende Licht wird mit einer Detektionseinrichtung detektiert, die ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal erzeugt. Aus diesem Detektionssignal kann zusammen mit der dazugehörigen Rasterposition des Beleuchtungslichtstrahls eindeutig ein zweidimensionales Bild zusammengesetzt und abgespeichert bzw. auf einem Monitor angezeigt werden. Üblicherweise werden hierfür die Zustandsdaten der Verstellelemente der Spiegel – d.h. der Galvanometer-Stellelemente – laufend mitgemessen. Das zusammengesetzte Bild ist in einzelne Bildelemente – Pixel – unterteilt und jedem Bildelement entspricht ein Zeitintervall des Rastervorgangs, dessen Dauer von der Geschwindigkeit abhängt, mit der der Rastervorgang erfolgt.
Falls das Objekt mit Licht einer Lichtquelle beleuchtet wird, das einen kontinuierlichen Leistungsverlauf aufweist, wird im Rahmen einer üblichen Auswertungsmethode jedem Bildelement ein Helligkeitswert zugewiesen, der der über das Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts entspricht. In diesem Fall gibt die Detektionseinrichtung am Ende eines jeden Zeitintervalls das entsprechende Detektionssignal zu einer Auswertung weiter.
Falls nun das Objekt zur Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle beleuchtet wird, ist üblicherweise die Pulsfolgedauer der Lichtpulse bzw. die Periodendauer der Leistungsmodulation wesentlich höher als ein Zeitintervall eines Bildelements. So ist auch unter diesen Beleuchtungsverhältnissen grundsätzlich eine Auswertung des Detektionssignals möglich, bei der die über das jeweiligen Zeitintervall gemittelte Leistung des detektierten Lichts berücksichtigt wird. Bei speziellen Applikationen, wie beispielsweise bei Fluoreszenzlebensdauermessungen, kann jedoch auch eine andere Auswertemethode angewandt werden. Hierbei gibt die Detektionseinrichtung in jedem Zeitintervall mehrmals Detektionssignale zu einer Auswertung weiter, so dass auch Leistungsveränderungen des detektierten Lichts unterhalb des Zeitintervalls der Bildelementdauer berücksichtigt werden können.
Bislang können mit herkömmlichen Rastermikroskopen lediglich eine der beiden unterschiedlichen Auswertemethoden angewandt werden. Detektionssignale bzw. diesbezügliche Informationen zu der anderen Auswertemethode können nicht genutzt werden und gehen daher verloren. So sind mindestens zwei Objektdetektionen erforderlich, nämlich für jede Auswertungsmethode eine, um Informationen zu beiden Auswertungsmethoden zu erhalten.

Aus W. Becker, K. Benndorf, A. Bergmann, C. Biskup, K. Koenig, U. Tirlapur, and T. Zimmer: „FRET measurements by TCSPC laser scanning microscopy", Photon Migration, Optical Coherence Tomography, and Microscopy, Munich, 2001, Proc. of SPIE, vol. 4431, pp. 94-98 ist ein Verfahren zur Detektion eines Objekts unter Nutzung eines Rastermikroskops bekannt. Das Objekt wird mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Laserlichtquelle, vorzugsweise mit einem punktförmigen Beleuchtungsmuster, abgerastert. Jedes Bildelement bzw. Pixel eines zu generierenden Objektbildes entspricht einem vom Rastervorgang abhängigen Zeitintervall, wobei die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes mit einer Detektionseinrichtung detektiert wird. Die Detektionseinrichtung erzeugt ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal und leitet in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale zu einer Auswerteeinrichtung. Des Weiteren wertet die Detektionseinrichtung in einem ersten Kanal im Wesentlichen den Anteil des in dem einen Zeitintervall erzeugten Detektionssignals aus, wobei dieser Anteil der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts entspricht. In einem zweiten Kanal wertet die Detektionseinrichtung im Wesentlichen den Anteil des in einem zweiten Zeitintervall erzeugten Detektionssignals aus, wobei dieser Anteil der durch die leistungsmodulierte oder pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkten Leistungsveränderung des detektierten Lichts entspricht. Ebenso ist es möglich, die über Zeitintervalle gemittelte Leistung zu detektieren, nämlich durch die PMTs 1 bis 3 im Scanning-Head des Mikroskops. So wird das Objekt lediglich einmal abgerastert und es erfolgt eine parallele Auswertung mit den beiden Kanälen, wobei beide Auswertungsmodi durchführbar sind. Die Verteilung der Detektionssignale auf die beiden Kanäle ist jedoch stets problematisch, da mit einem ganz erheblichen Aufwand verbunden.

Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, sowohl ein gattungsbildendes Verfahren als auch ein gattungsbildendes Rastermikroskop anzugeben, bei dem mit einfachen Mitteln eine reproduzierbare Aufteilung der Detektionssignale auf die beiden Kanäle, möglich ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion eines Objekts mit einem Rastermikroskop löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist ein solches Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionssignale mittels Hochpassfilter und/oder Tiefpassfilter auf die zwei Kanäle verteilt werden, und dass im zweiten Kanal mit einem Pulsformer Pulse erzeugt werden, die zur weiteren Auswertung dienen.

Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass sich die Detektionssignale auf einfache Weise mittels Hochpassfilter und/oder Tiefpassfilter auf die beiden Kanäle verteilen lassen. Falls ein Hochpassfilter und ein Tiefpassfilter vorgesehen sind, liegen die von der Detektionseinrichtung zunächst erzeugten Detektionssignale an beiden Filtern an. Der Tiefpassfilter ist dabei derart konfiguriert, dass er den Anteil des Detektionssignals selektiert, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts entspricht. Somit ist der Tiefpassfilter eine Art „Eingangsschleuse" des ersten Kanals. Da das Zeitintervall eines jeden Bildelements vom Rastervorgang des Rastermikroskops abhängt, ist der Tiefpassfilter vorzugsweise hinsichtlich seiner Selektionsfrequenz einstellbar, um nämlich den entsprechenden Anteil des Detektionssignals für den ersten Kanal zu selektieren. In gleicher Weise selektiert der Hochpassfilter den mit dem zweiten Kanal der Detektionseinrichtung auszuwertenden Anteil des Detektionslichts, nämlich den Anteil, der üblicherweise eine höhere Frequenz als diejenige Frequenz aufweist, die einem vom Rastervorgang anhängigen Zeitintervall entspricht. Auch der Hochpassfilter ist vorzugsweise konfigurierbar ausgeführt, um nämlich bei unterschiedlichen Rastergeschwindigkeiten den über den zweiten Kanal bestimmten Anteil des Detektionssignals zu selektieren.

Des Weiteren ist wesentlich, dass die Verfahrensschritte zur Auswertung der Detektionssignale im ersten Kanal der Detektionseinrichtung im Wesentlichen denjenigen Verfahrensschritten entsprechen, die bei konventionellen konfokalen Rastermikroskopen üblich sind. Folglich stellen diese Verfahrensschritte eine Art Leistungsrepräsentation des vom Objekt kommenden Lichts dar.

Des Weiteren ist in erfindungsgemäßer Weise erkannt worden, dass zur Auswertung der Detektionssignale im zweiten Kanal in idealer Weise mit einem Pulsformer Pulse erzeugt werden. Entsprechend erfolgt die weitere Auswertung im zweiten Kanal im Wesentlichen pulsbasiert, so dass das ursprünglich am Eingang des zweiten Kanals anliegende Detektionssignal zur weiteren Auswertung nicht berücksichtigt werden muss. Insoweit kann in vorteilhafter Weise auf auf dem Markt befindliche pulsbasierte Elektronikbausteine zurückgegriffen werden, wodurch die Materialkosten für das Vorsehen eines zweiten Kanals der Detektionseinrichtung gering zu halten sind.

Somit ist auf einfache Weise eine saubere Trennung der Detektionssignale in die beiden Kanäle möglich.

Falls das Rastermikroskop in Form eines konfokalen Rastermikroskops bzw. konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops ausgeführt ist, liefert die in dem ersten Kanal vorgesehene Auswertung des Detektionssignals ein Bild des Objekts, das von der Leistung des vom Objekt kommenden Lichts abhängig ist und dem Objektbild entsprechen würde, das mit einem konventionellen Mikroskop generiert werden kann. Die in dem zweiten Kanal vorgenommene Auswertung der Detektionssignale liefert ein Bild, das einer zeitlichen Auflösung der leistungsmodulierten oder pulsförmigen Objektbeleuchtung Rechnung trägt, nämlich die durch die Objektbeleuchtung bewirkte Leistungsveränderung des detektierten Lichts ist somit auflösbar bzw. nachweisbar. Hierdurch können Bilder erzeugt werden, die beispielsweise Fluoreszenzlebensdauermessungen, Photonenzählen und/oder Zeitkorrelationen zwischen unterschiedlichen Ereignissen ermöglichen.

Insoweit ist die Auswertung der von der Detektionseinrichtung erzeugten Detektionssignale mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ganz besonders vorteilhaft, da das Objekt lediglich einmal abgerastert werden muss und dennoch – aufgrund der parallelen Auswertung mit den zwei Kanälen – beide Auswertungsmodi durchführbar sind.

Nun ist es grundsätzlich möglich, die Auswertung der Detektionssignale mit den zwei Kanälen zeitversetzt durchzuführen, beispielsweise durch das Vorsehen einer Verzögerungsschaltung in einem der beiden Kanäle. Hierdurch könnte die Auswerteauslastung der Detektionseinrichtung an die jeweilige Detektionssituation bzw. an das aktuelle Datenaufkommen angepasst werden.

Ganz besonders bevorzugt werden jedoch die Detektionssignale mit den zwei Kanälen im Wesentlichen simultan ausgewertet. Eine nahezu gleichzeitige Verfügbarkeit der Auswerteergebnisse ist hierdurch möglich, so dass beispielsweise einem Bediener des Rastermikroskops trotz Vorliegen der Ergebnisse der zwei unterschiedlichen Auswertungsmethoden lediglich ein Ergebnisbild dargestellt wird, wobei das Ergebnisbild – in Abhängigkeit der jeweiligen Applikation – lediglich die Bereiche des detektierten Objekts darstellt, die einer logischen UND-Verknüpfung entsprechen und gewissen Selektions- bzw. Segmentierungskriterien entsprechen. So könnten beispielsweise in dem Ergebnisbild lediglich die Objektbereiche gezeigt werden, deren Fluoreszenzfarbstoff eine in einem vorgebbaren Bereich liegende Fluoreszenzlebensdauer aufweist, wobei diese Objektbereiche nach der Auswertungsmethode angezeigt werden, der das Ergebnis der Auswertung des ersten Kanals ist.

Zur Auswertung der Detektionssignale im zweiten Kanal werden mit einem Pulsformer Pulse erzeugt. Vorzugsweise hängen die vom Pulsformer erzeugten Pulse bezüglich ihrer Pulsamplitude, Pulsdauer und/oder Pulsfolgefrequenz von dem im zweiten Kanal verarbeiteten Detektionssignal ab. Die weitere Auswertung im zweiten Kanal erfolgt demgemäß im Wesentlichen pulsbasiert, das ursprünglich am Eingang des zweiten Kanals anliegende Detektionssignal muss zur weiteren Auswertung nicht berücksichtigt werden. Insoweit kann in vorteilhafter Weise auf auf dem Markt befindliche pulsbasierte Elektronikbausteine zurückgegriffen werden, so dass die Materialkosten für das Vorsehen eines zweiten Kanals der Detektionseinrichtung gering gehalten werden können.

Im zweiten Kanal ist zur weiteren pulsbasierten Auswertung ein Pulszähler vorgesehen, der die Anzahl der vom Pulsformer erzeugten Pulse zählt. Die Ausgabe des Pulszählers kann beispielsweise zur Auswertung nach einem Photonenzählverfahren bzw. Photon-Counting-Verfahren herangezogen werden, wie es z.B. bei der Fluoreszenzmikroskopie angewandt wird.

Im zweiten Kanal könnte weiterhin eine Zeitmesseinrichtung vorgesehen sein, die die Zeitdifferenz jeweils zwei aufeinander folgender Pulse ermittelt und entsprechend ausgibt. In gleicher Weise könnte eine ebenfalls im zweiten Kanal vorgesehene zweite Zeitmesseinrichtung vorgesehen sein, die die Zeitdifferenz der vom Pulsformer erzeugten Pulse zu jeweils den Pulsen eines externen Pulsfolgesignals ermittelt. Die Ergebnisse beider Zeitmesseinrichtungen können beispielsweise bei Fluoreszenzlebensdauermessungen oder bei Messungen angewandt werden, bei denen das Objekt auf äußere Einflüsse, beispielsweise auf einzelne Lichtpulse der Lichtquelle reagiert. So ist das an der zweiten Zeitmesseinrichtung anliegende externe Pulsfolgesignal beispielsweise ein Signal, das von der zur Objektbeleuchtung dienenden gepulsten Lichtquelle anhängt. Im Fall einer gepulsten Laserlichtquelle könnte das externe Pulsfolgesignal das von der Laserlichtquelle ausgegebene Triggersignal sein.

Falls die zur Objektbeleuchtung dienenden Lichtquelle Licht emittiert, das einen im Wesentlichen konstanten Leistungsverlauf aufweist, könnte eine Leistungsmodulation dieses Lichts mit Hilfe eines AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) erfolgen. In diesem Fall könnte das Ansteuersignal des AOTF gleichzeitig als externes Pulsfolgesignal genutzt werden und der zweiten Zeitmesseinrichtung zugeführt werden. Insoweit hängt im ersten Fall das externe Pulsfolgesignal von der zeitlichen Abfolge der Lichtpulse der Lichtquelle ab. Im zweiten Fall hängt das externe Pulsfolgesignal von der zeitlichen Abfolge der Leistungsmodulation des Lichts der Lichtquelle ab.

Die in den zwei Kanälen anliegenden Detektionssignale und/oder die ermittelten Auswerteergebnisse werden in einer Konkreten Ausführungsform digitalisiert, um nämlich beispielsweise mit einem Steuerrechner erfasst und einem Rastermikroskopbediener auf einem Monitor des Steuerrechners ausgegeben zu werden. Insbesondere werden neben den Detektionssignalen die ermittelten Zählergebnisse des Pulszählers und/oder die ermittelten Zeitdifferenzen der ersten und/oder der zweiten Zeitmesseinrichtung digitalisiert. Insoweit ist hierdurch in vorteilhafter Weise auch eine der Objektbilddetektion nachgeschaltete Auswertung möglich, die beispielsweise mit Methoden der digitalen Bildverarbeitung durchgeführt werden kann.

Neben einer Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle ist weiterhin auch eine Objektbeleuchtung mit einer Lichtquelle vorgesehen, deren Licht einen im Wesentlichen konstanten Leistungsverlauf aufweist. Insoweit könnte beispielsweise bei einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einer zur Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung dienenden pulsförmigen Lichtquelle Fluoreszenzlebensdauermessungen eines Fluoreszenzfarbstoffs durchgeführt werden. Der Fluoreszenzfarbstoff wird hierbei von dem Licht der pulsförmigen Lichtquelle angeregt, mit dem Fluoreszenzfarbstoff sind spezifisch bestimmte Objektbereiche markiert. Zusätzlich könnte mit der einen im Wesentlichen konstanten Leistungsverlauf aufweisenden Lichtquelle ein anderer Fluoreszenzfarbstoff angeregt werden, der spezifisch andere Objektbereiche des zu detektierenden Objekts sichtbar macht. Insoweit könnten beide Lichtquellen simultan zur Objektbeleuchtung eingesetzt und das von den verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Fluoreszenzlicht gleichzeitig mit mehreren Detektoren der Detektionseinrichtung detektiert werden. Jedem Detektor ist dann allerdings jeweils ein erster und ein zweiter Kanal nachgeordnet, der eine erfindungsgemäße Auswertung beider Auswertemodi für jeden Detektor ermöglicht.

Die bezüglich eines Rastermikroskops zur Detektion eines Objekts eingangs genannte Aufgabe wird durch die Merkmale des Patentanspruchs 12 gelöst. Danach ist ein solches Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts dadurch gekennzeichnet, dass mit einem ersten Kanal der Detektionseinrichtung im Wesentlichen der Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals auswertbar ist, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts entspricht, und dass mit einem zweiten Kanal der Detektionseinrichtung im Wesentlichen der Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals auswertbar ist, der der durch die leistungsmodulierte oder pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkte Leistungsveränderung des detektierten Lichts entspricht.

Insbesondere dient das erfindungsgemäße Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf den vorangegangenen Teil der Beschreibung verwiesen wird.

In einer konkreten Ausführungsform weist die Detektionseinrichtung des Rastermikroskops einen lichtempfindlichen Detektor auf. Dieser Detektor könnte beispielsweise in Form eines Photomultipliers ausgeführt sein, mit dem auch vom Objekt kommendes Licht geringer Leistung – beispielsweise Fluoreszenzlicht – nachweisbar ist. Insbesondere konfokale Rastermikroskope weisen derzeit mehrere lichtempfindliche Detektoren auf, so dass eine simultane Detektion mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe mit zwei Auswertekanälen pro Detektor in erfindungsgemäßer Weise möglich ist.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Rastermikroskop in Form eines konfokalen Rastermikroskops ausgeführt. Mit anderen Worten ist der optische Strahlengang derart ausgeführt, dass in der Fokalebene des Mikroskopobjektivs eine konfokale Objektbeleuchtung vorliegt, im Idealfall also eine beugungsbegrenzte punktförmige Objektbeleuchtung vorliegt. Weiterhin ist der optische Strahlengang des konfokalen Rastermikroskops derart ausgebildet, dass in einer zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs korrespondierenden Ebene eine Detektionslochblende derart angeordnet ist, dass lediglich Licht aus dem Beleuchtungsfokusbereich die Detektionslochblende zu einem dahinter angeordneten Detektor passieren kann.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung an hand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert.
In der Zeichnung zeigen
1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops zur Detektion eines Objekts zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und
2 eine schematische Darstellung eines Teils der Detektionseinrichtung des Rastermikroskops aus 1.
1 zeigt in einer schematischen Darstellung ein konfokales Rastermikroskop 1 zur Detektion eines Objekts 2. Zur Objektbeleuchtung wird das Objekt 2 mit pulsförmigem Licht einer Laserlichtquelle 3 mit einem punktförmigem Beleuchtungsmuster abgerastert. Jedem Pixel bzw. Bildelement 4 eines zu generierenden Objektbilds 5 entspricht ein vom Rastervorgang abhängiges Zeitintervall.
Die Leistung des vom Objekt 2 kommenden Lichts 6 ist mit einer Detektionseinrichtung 7 detektierbar, wobei die Detektionseinrichtung 7 ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal 8 erzeugt.
Zur Auswertung werden von der Detektionseinrichtung 7 in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale 8 weitergeleitet.
Mit einem ersten Kanal 9 der Detektionseinrichtung 7 ist im Wesentlichen der Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals 11 auswertbar, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts 6 entspricht. In einem zweiten Kanal 10 der Detektionseinrichtung 7 ist im Wesentlichen der Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals 12 auswertbar, der durch die pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkten Leistungsveränderung des detektierten Lichts 6 entspricht.
Das von dem Detektor 13 der Detektionseinrichtung 7 erzeugte Detektionssignal 8 wird mittels Tiefpassfilter 14 und Hochpassfilter 15 auf die zwei Kanäle 9 und 10 verteilt. Mit dem im zweiten Kanal 10 angeordneten Pulsformer 16 werden in Abhängigkeit des Detektionssignals 12 bzw. 8 Pulse 17 erzeugt, die zur weiteren Auswertung dienen. Im zweiten Kanal 10 ist ein Pulszähler 18 vorgesehen, der die Anzahl der vom Pulsformer 16 erzeugten Pulse 17 zählt. Dementsprechend gibt Pulszähler 18 als Ergebnis die Anzahl 19 der vom Pulszähler 18 erzeugten Pulse 17 aus.
Im zweiten Kanal 10 ist eine erste Zeitmesseinrichtung 20 vorgesehen, die die Zeitdifferenz jeweils zwei aufeinander folgender Pulse 17 in Form einer Signalfolge 21 ausgibt, die von der Zeitdifferenz jeweils zwei aufeinander folgender Pulse 17 abhängt.
Im zweiten Kanal 10 ist weiterhin eine zweite Zeitmesseinrichtung 22 vorgesehen, die die Zeitdifferenz der vom Pulsformer 16 erzeugten Pulse 17 zu jeweils den Pulsen eines externen Pulsfolgesignals 23 ermittelt. Das externe Pulsfolgesignal 23 hängt hierbei von der zeitlichen Abfolge der Lichtpulse der Laserlichtquelle 3 ab. Hierbei handelt es sich im Konkreten um das von der Laserlichtquelle 3 ausgegebene Puls-Triggersignal. Die zweite Zeitmesseinrichtung 22 gibt eines Signalfolge 24 aus, die von der Zeitdifferenz der vom Pulsformer 16 erzeugten Pulse 17 zu den jeweiligen Pulsen des externen Pulsfolgesignals 23 abhängt.
In dem ersten Kanal 9 ist ein Analog-Digital-Wandler 25 vorgesehen, der das analoge Signal 11 in ein digitales Signal 26 umwandelt.
Der Detektor 13 der Detektionseinrichtung 7 ist als Photomultiplier ausgeführt.
Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.

Claims

Verfahren zur Detektion eines Objekts (2) mit einem Rastermikroskop (1), wobei das Objekt (2) zur Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle (3) abgerastert wird, wobei jedem Bildelement (4) eines zu generierenden Objektbilds (5) ein vom Rastervorgang abhängiges Zeitintervall entspricht, wobei die Leistung des vom Objekt (2) kommenden Lichts mit einer Detektionseinrichtung (7) detektiert wird, wobei die Detektionseinrichtung (7) ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal (8) erzeugt, wobei die Detektionseinrichtung (7) in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale (8) zu einer Auswertung weiterleitet, wobei die Detektionseinrichtung (7) in einem ersten Kanal (9) im Wesentlichen den Anteil (11) des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals (8) auswertet, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts (6) entspricht, und wobei die Detektionseinrichtung (7) in einem zweiten Kanal (10) im Wesentlichen den Anteil (12) des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals (8) auswertet, der der durch die leistungsmodulierte oder pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkten Leistungsveränderung des detektierten Lichts (6) entspricht, dadurch gekennzeichnet , dass die Detektionssignale (11, 12) mittels Hochpassfilter (15) und/oder Tiefpassfilter (14) auf die zwei Kanäle (9, 10) verteilt werden, und dass im zweiten Kanal (10) mit einem Pulsformer (16) Pulse (17) erzeugt werden, die zur weiteren Auswertung dienen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auswertung der Detektionssignale (11, 12) mit den zwei Kanälen (9, 10) im Wesentlichen simultan erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die vom Pulsformer (16) erzeugten Pulse (17) bezüglich ihrer Pulsamplitude, Pulsdauer und/oder Pulsfolgefrequenz vom Detektionssignal (12) abhängen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein im zweiten Kanal (10) vorgesehener Pulszähler (18) die Anzahl (19) der vom Pulsformer (16) erzeugten Pulse (17) zählt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass eine im zweiten Kanal (10) vorgesehene Zeitmesseinrichtung (20) die Zeitdifferenz (21) jeweils zwei aufeinander folgender Pulse (17) ermittelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine im zweiten Kanal (10) vorgesehene zweite Zeitmesseinrichtung (22) die Zeitdifferenz (24) der vom Pulsformer (16) erzeugten Pulse (17) zu jeweils den Pulsen eines externen Pulsfolgesignals (23) ermittelt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das externe Pulsfolgesignal (23) von der zeitlichen Abfolge der Lichtpulse der Lichtquelle (3) abhängt.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das externe Pulsfolgesignal (23) von der zeitlichen Abfolge der Leistungsmodulation des Lichts der Lichtquelle abhängt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass in den beiden Kanälen (9, 10) eine Digitalisierung der Detektionssignale (8, 11, 12) und/oder der ermittelten Zählergebnisse (19) und/oder der ermittelten Zeitdifferenzen (21, 24) erfolgt, vorzugsweise mittels eines Analog-Digital-Wandlers (25).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass auch eine Lichtquelle zur Objektbeleuchtung dient, die Licht im Wesentlichen konstanter Leistung emittiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt mit einem punktförmigen Beleuchtungsmuster abgerastert wird.
Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts (2), wobei das Objekt (2) zur Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle (3) rasterbar ist, wobei jedem Bildelement (4) eines zu generierenden Objektbilds (5) ein vom Rastervorgang abhängiges Zeitintervall entspricht, wobei die Leistung des vom Objekt (2) kommenden Lichts mit einer Detektionseinrichtung (7) detektierbar ist, wobei mit der Detektionseinrichtung (7) ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal (8) erzeugbar ist, wobei mit der Detektionseinrichtung (7) in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale (8) zu einer Auswertung weiterleitbar sind, wobei mit der Detektionseinrichtung (7) in einem ersten Kanal (9) im Wesentlichen der Anteil (11) des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals (8) auswertbar ist, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Signals (6) entspricht und wobei mit der Detektionseinrichtung (7) in einem zweiten Kanal (10) im Wesentlichen der Anteil (12) des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals (8) auswertbar ist, der der durch die leistungsmodulierte oder pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkten Leistungsveränderung des detektierten Lichts (6) entspricht, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionssignale (11, 12) mittels Hochpassfilter (15) und/oder Tiefpassfilter (14) auf die zwei Kanäle (9, 10) verteilbar sind und dass im zweiten Kanal (10) mit einem Pulsformer (16) Pulse (17) erzeugbar sind, die zur weiteren Auswertung dienen.
Rastermikroskop nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung (7) einen lichtempfindlichen Detektor (13) aufweist, vorzugsweise einen Photomultiplier.
Rastermikroskop nach Anspruch 12 oder 13, gekennzeichnet durch eine konfokale Objektbeleuchtung und eine konfokale Objektdetektion.
Rastermikroskop nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Objekt mit einem punktförmigen Beleuchtungsmuster abrasterbar ist.