DE10253108B4

DE10253108B4 - Method for detecting an object with a scanning microscope and a scanning microscope for detecting an object

Info

Publication number: DE10253108B4
Application number: DE2002153108
Authority: DE
Inventors: Bernd Dipl.-Ing. Widzgowski
Original assignee: Leica Microsystems Heidelberg GmbH; Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2002-11-13
Filing date: 2002-11-13
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2022-11-14
Also published as: DE10253108A1

Abstract

Verfahren zur Detektion eines Objekts (2) mit einem Rastermikroskop (1), wobei das Objekt (2) zur Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle (3) abgerastert wird, wobei jedem Bildelement (4) eines zu generierenden Objektbilds (5) ein vom Rastervorgang abhängiges Zeitintervall entspricht, wobei die Leistung des vom Objekt (2) kommenden Lichts mit einer Detektionseinrichtung (7) detektiert wird, wobei die Detektionseinrichtung (7) ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal (8) erzeugt, wobei die Detektionseinrichtung (7) in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale (8) zu einer Auswertung weiterleitet, wobei die Detektionseinrichtung (7) in einem ersten Kanal (9) im Wesentlichen den Anteil (11) des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals (8) auswertet, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts (6) entspricht, und wobei die Detektionseinrichtung (7) in einem zweiten Kanal (10) im Wesentlichen den Anteil (12) des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals (8) auswertet, der der durch die leistungsmodulierte oder pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkten...method for detecting an object (2) with a scanning microscope (1), wherein the object (2) for object illumination with power modulated or pulsförmigem Light of a light source (3) is scanned, with each pixel (4) of an object image (5) to be generated by the screening process dependent Time interval corresponds to the power of the object (2) coming light with a detection device (7) detected is, wherein the detection device (7) one of the detected light power dependent Detection signal (8) generated, wherein the detection device (7) at least twice detection signals in each time interval (8) to an evaluation, wherein the detection device (7) in a first channel (9) substantially the portion (11) of in evaluates a detection signal (8) generated in a time interval, the the over a time interval averaged power of the detected light (6) corresponds, and wherein the detection device (7) in a second Channel (10) essentially the proportion (12) of the in a time interval evaluates generated detection signal (8), that of the power-modulated or pulsed Object lighting caused ...

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion eines Objekts mit einem Rastermikroskop, wobei das Objekt zur Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle abgerastert wird, wobei jedem Bildelement eines zu generierenden Objektbilds ein vom Rastervorgang abhängiges Zeitintervall entspricht, wobei die Leistung des vom Objekt kommenden Lichts mit einer Detektionseinrichtung detektiert wird, wobei die Detektionseinrichtung ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal erzeugt, wobei die Detektionseinrichtung in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale zu einer Auswertung weiterleitet, wobei die Detektionseinrichtung in einem ersten Kanal im Wesentlichen den Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals auswertet, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts entspricht, und wobei die Detektionseinrichtung in einem zweiten Kanal im Wesentlichen den Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals auswertet, der der durch die leistungsmodulierte oder pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkte Leistungsveränderung des detektierten Lichts entspricht, weiterleitet. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts, wobei das Objekt zur Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle abrasterbar ist, wobei jedem Bildelement eines zu generierenden Objektbilds ein vom Rastervorgang abhängiges Zeitintervall entspricht, wobei die Leistung des vom Objekt kommenden Lichts mit einer Detektionseinrichtung detektierbar ist, wobei mit der Detektionseinrichtung ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal erzeugbar ist, wobei von der Detektionseinrichtung in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale zu einer Auswertung weiterleitbar sind.The The present invention relates to a method for detecting a Object with a scanning microscope, with the object for object illumination with power modulated or pulsed light of a light source is scanned, each pixel of a to be generated Object image corresponds to a raster-dependent time interval, where the power of the light coming from the object with a detection device is detected, wherein the detection means one of the detected Light output dependent Detection signal generated, wherein the detection device in each Time interval at least twice detection signals to an evaluation forwards, wherein the detection device in a first channel essentially the proportion of the detection signal generated in a time interval evaluates the over a time interval corresponds to the mean power of the detected light, and wherein the detection means in a second channel substantially the proportion of the detection signal generated in a time interval that evaluates by the power modulated or pulsed object lighting caused performance change corresponds to the detected light, forwards. Furthermore The present invention relates to a scanning microscope for detection of an object, where the object for object lighting with power modulated or pulsed Light from a light source can be scanned, with each pixel of a the object image to be generated is a time interval dependent on the raster process corresponds, wherein the power of the light coming from the object with a Detection device is detectable, with the detection device a detection signal dependent on the detected light output can be generated is, wherein the detection device in each time interval At least twice detection signals for evaluation forwarded are.

Unter Rastermikroskopen im Sinn der vorliegenden Erfindung sind Mikroskope zu verstehen, bei denen das abzubildende Objekt mit einem Beleuchtungsmuster abgerastert wird. Dieser Rastervorgang erfolgt üblicherweise mäanderförmig, so dass das Objekt mit dem Beleuchtungsmuster in ähnlicher Weise abgerastert wird, wie beispielsweise ein Elektronenstrahl auf den Bildschirm einer Braun'schen Röhre gelenkt wird.Under Scanning microscopes in the sense of the present invention are microscopes to understand where the object to be imaged with a lighting pattern is scanned. This screening process is usually meandering, so that the object is scanned with the illumination pattern in a similar way is, such as an electron beam on the screen steered a Braun tube becomes.

Insbesondere bei biomedizinischen Anwendungen werden seit geraumer Zeit ganz besondere Rastermikroskope, nämlich konfokale Rastermikroskope, dann einge setzt, wenn – verglichen zu konventionellen Auflicht- oder Durchlichtmikroskopen – eine verbesserte Auflösung entlang der optischen Achse benötigt wird.Especially in biomedical applications have been quite for quite some time special scanning microscopes, namely confocal scanning microscopes, then used if - compared to conventional incident light or transmitted light microscopes - an improved resolution needed along the optical axis becomes.

Bei konfokalen Rastermikroskopen wird ein Objekt mit einem fokussierten Lichtstrahl abgerastert, was im Allgemeinen durch Verkippen zweier im Strahlengang des konfokalen Rastermikroskops angeordneter Spiegel realisiert wird. Hierdurch wird der Fokus des Lichtstrahls in der Fokalebene eines Mikroskopobjektivs bewegt, wobei die Ablenkrichtungen des Lichtstrahls meist senkrecht zueinander angeordnet sind, so dass beispielsweise ein Spiegel den Strahl in x- ein anderer Spiegel den Strahl in y-Richtung ablenkt. Die Bewegung bzw. Verkippung der Spiegel wird üblicherweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Der fokussierte Lichtstrahl weist in der Fokalebene eines Mikroskopobjektivs ein nahezu punktförmiges Beleuchtungsmuster auf, was einer konfokalen Beleuchtung entspricht. In einer zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs korrespondierenden Ebene ist eine Detektionslochblende derart angeordnet, dass lediglich das vom Objekt kommende Licht aus dem Beleuchtungsfokusbereich die Detektionslochblende zu einem dahinter angeordneten Detektor passieren kann.at confocal scanning microscopes will be an object with a focused Scanned light beam, which is generally by tilting two arranged in the beam path of the confocal scanning microscope mirror is realized. As a result, the focus of the light beam in the Focal plane of a microscope objective moves, the deflection directions of the light beam are usually arranged perpendicular to each other, so for example, one mirror is the beam in x- another mirror deflects the beam in the y direction. The movement or tilt of the Mirrors become common accomplished with the help of galvanometer actuators. The focused beam of light has in the focal plane of a microscope objective, a nearly punctiform illumination pattern on what corresponds to a confocal illumination. In one to the focal plane of the microscope objective corresponding plane is a detection pinhole arranged such that only the light coming from the object from the illumination focus area, the detection pinhole to a behind arranged detector can happen.

Das vom Objekt kommende Licht wird mit einer Detektionseinrichtung detektiert, die ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal erzeugt. Aus diesem Detektionssignal kann zusammen mit der dazugehörigen Rasterposition des Beleuchtungslichtstrahls eindeutig ein zweidimensionales Bild zusammengesetzt und abgespeichert bzw. auf einem Monitor angezeigt werden. Üblicherweise werden hierfür die Zustandsdaten der Verstellelemente der Spiegel – d.h. der Galvanometer-Stellelemente – laufend mitgemessen. Das zusammengesetzte Bild ist in einzelne Bildelemente – Pixel – unterteilt und jedem Bildelement entspricht ein Zeitintervall des Rastervorgangs, dessen Dauer von der Geschwindigkeit abhängt, mit der der Rastervorgang erfolgt.The light coming from the object is detected by a detection device, which generates a detection signal dependent on the detected light output. From this detection signal can together with the associated grid position of the illumination light beam clearly a two-dimensional image composed and stored or displayed on a monitor become. Usually therefor the state data of the adjustment elements of the mirrors - i. of the Galvanometer control elements - running also measured. The composite image is divided into individual pixels - pixels and each pixel corresponds to a time interval of the screening process, whose duration depends on the speed with which the raster process he follows.

Falls das Objekt mit Licht einer Lichtquelle beleuchtet wird, das einen kontinuierlichen Leistungsverlauf aufweist, wird im Rahmen einer üblichen Auswertungsmethode jedem Bildelement ein Helligkeitswert zugewiesen, der der über das Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts entspricht. In diesem Fall gibt die Detektionseinrichtung am Ende eines jeden Zeitintervalls das entsprechende Detektionssignal zu einer Auswertung weiter.If the object is illuminated with light from a light source, the one continuous performance has, as part of a conventional Evaluation method assigns a brightness value to each picture element, the over the time interval corresponds to the average power of the detected light. In this case, the detection device gives at the end of each Time interval, the corresponding detection signal to an evaluation further.

Falls nun das Objekt zur Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle beleuchtet wird, ist üblicherweise die Pulsfolgedauer der Lichtpulse bzw. die Periodendauer der Leistungsmodulation wesentlich höher als ein Zeitintervall eines Bildelements. So ist auch unter diesen Beleuchtungsverhältnissen grundsätzlich eine Auswertung des Detektionssignals möglich, bei der die über das jeweiligen Zeitintervall gemittelte Leistung des detektierten Lichts berücksichtigt wird. Bei speziellen Applikationen, wie beispielsweise bei Fluoreszenzlebensdauermessungen, kann jedoch auch eine andere Auswertemethode angewandt werden. Hierbei gibt die Detektionseinrichtung in jedem Zeitintervall mehrmals Detektionssignale zu einer Auswertung weiter, so dass auch Leistungsveränderungen des detektierten Lichts unterhalb des Zeitintervalls der Bildelementdauer berücksichtigt werden können.If the object for illuminating the object is then illuminated with power-modulated or pulsed light from a light source, the pulse duration of the light pulses or the period of the power modulation is usually much higher than a time interval of a picture element. Thus, even under these lighting conditions, an evaluation of the detection signal is basically possible, in which the power of the detected light averaged over the respective time interval is taken into account. For special applications, such as Fluorescence lifetime measurements, but also a different evaluation method can be applied. In this case, the detection device repeatedly sends detection signals to an evaluation in each time interval, so that changes in the power of the detected light below the time interval of the picture element duration can also be taken into account.

Bislang können mit herkömmlichen Rastermikroskopen lediglich eine der beiden unterschiedlichen Auswertemethoden angewandt werden. Detektionssignale bzw. diesbezügliche Informationen zu der anderen Auswertemethode können nicht genutzt werden und gehen daher verloren. So sind mindestens zwei Objektdetektionen erforderlich, nämlich für jede Auswertungsmethode eine, um Informationen zu beiden Auswertungsmethoden zu erhalten.So far can with conventional Scanning microscopes only one of the two different evaluation methods be applied. Detection signals or related information to the other evaluation method can not be used and are therefore lost. So are at least two object detections are required, namely one for each evaluation method, to get information about both evaluation methods.

Aus W. Becker, K. Benndorf, A. Bergmann, C. Biskup, K. Koenig, U. Tirlapur, and T. Zimmer: „FRET measurements by TCSPC laser scanning microscopy", Photon Migration, Optical Coherence Tomography, and Microscopy, Munich, 2001, Proc. of SPIE, vol. 4431, pp. 94-98 ist ein Verfahren zur Detektion eines Objekts unter Nutzung eines Rastermikroskops bekannt. Das Objekt wird mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Laserlichtquelle, vorzugsweise mit einem punktförmigen Beleuchtungsmuster, abgerastert. Jedes Bildelement bzw. Pixel eines zu generierenden Objektbildes entspricht einem vom Rastervorgang abhängigen Zeitintervall, wobei die Leistung des vom Objekt kommenden Lichtes mit einer Detektionseinrichtung detektiert wird. Die Detektionseinrichtung erzeugt ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal und leitet in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale zu einer Auswerteeinrichtung. Des Weiteren wertet die Detektionseinrichtung in einem ersten Kanal im Wesentlichen den Anteil des in dem einen Zeitintervall erzeugten Detektionssignals aus, wobei dieser Anteil der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts entspricht. In einem zweiten Kanal wertet die Detektionseinrichtung im Wesentlichen den Anteil des in einem zweiten Zeitintervall erzeugten Detektionssignals aus, wobei dieser Anteil der durch die leistungsmodulierte oder pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkten Leistungsveränderung des detektierten Lichts entspricht. Ebenso ist es möglich, die über Zeitintervalle gemittelte Leistung zu detektieren, nämlich durch die PMTs 1 bis 3 im Scanning-Head des Mikroskops. So wird das Objekt lediglich einmal abgerastert und es erfolgt eine parallele Auswertung mit den beiden Kanälen, wobei beide Auswertungsmodi durchführbar sind. Die Verteilung der Detektionssignale auf die beiden Kanäle ist jedoch stets problematisch, da mit einem ganz erheblichen Aufwand verbunden.Out W. Becker, K. Benndorf, A. Bergmann, C. Biskup, K. Koenig, U. Tirlapur, and T. Zimmer: "FRET measurements by TCSPC laser scanning microscopy ", Photon Migration, Optical Coherence Tomography, and Microscopy, Munich, 2001, Proc. of SPIE, vol. 4431, pp. 94-98 is a method of detecting an object under use a raster microscope known. The object is using power modulated or pulsed Light from a laser light source, preferably with a point-like illumination pattern, scanned. Each picture element or pixel of one to be generated Object image corresponds to a raster process-dependent time interval, where the power of the light coming from the object with a detection device is detected. The detection device generates one of the detected Light output dependent Detection signal and conducts at least twice detection signals in each time interval to an evaluation device. Furthermore, the detection device evaluates in a first channel essentially the proportion of in the one Time interval generated detection signal, this proportion the over a time interval corresponds to the average power of the detected light. In a second channel, the detection device substantially evaluates the proportion of the detection signal generated in a second time interval this proportion being due to the power modulated or pulsed object illumination caused performance change corresponds to the detected light. It is also possible to use the time intervals detected average power, namely by the PMTs 1 to 3 in the scanning head of the microscope. So the object is just once scanned and there is a parallel evaluation with the two channels, where both evaluation modes feasible are. However, the distribution of the detection signals on the two channels is always problematic, as associated with a very considerable effort.

Der vorliegenden Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, sowohl ein gattungsbildendes Verfahren als auch ein gattungsbildendes Rastermikroskop anzugeben, bei dem mit einfachen Mitteln eine reproduzierbare Aufteilung der Detektionssignale auf die beiden Kanäle, möglich ist.Of the present invention is based on the object, both a generic method as well as a generic type scanning microscope specify, by simple means, a reproducible distribution the detection signals on the two channels, is possible.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Detektion eines Objekts mit einem Rastermikroskop löst die voranstehende Aufgabe durch die Merkmale des Patentanspruchs 1. Danach ist ein solches Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionssignale mittels Hochpassfilter und/oder Tiefpassfilter auf die zwei Kanäle verteilt werden, und dass im zweiten Kanal mit einem Pulsformer Pulse erzeugt werden, die zur weiteren Auswertung dienen.The inventive method for detecting an object with a scanning microscope solves the above Task by the features of claim 1. Thereafter is a Such method characterized in that the detection signals by means of High-pass filter and / or low-pass filter distributed over the two channels and that generates pulses in the second channel with a pulse shaper will be used for further evaluation.

Erfindungsgemäß ist erkannt worden, dass sich die Detektionssignale auf einfache Weise mittels Hochpassfilter und/oder Tiefpassfilter auf die beiden Kanäle verteilen lassen. Falls ein Hochpassfilter und ein Tiefpassfilter vorgesehen sind, liegen die von der Detektionseinrichtung zunächst erzeugten Detektionssignale an beiden Filtern an. Der Tiefpassfilter ist dabei derart konfiguriert, dass er den Anteil des Detektionssignals selektiert, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts entspricht. Somit ist der Tiefpassfilter eine Art „Eingangsschleuse" des ersten Kanals. Da das Zeitintervall eines jeden Bildelements vom Rastervorgang des Rastermikroskops abhängt, ist der Tiefpassfilter vorzugsweise hinsichtlich seiner Selektionsfrequenz einstellbar, um nämlich den entsprechenden Anteil des Detektionssignals für den ersten Kanal zu selektieren. In gleicher Weise selektiert der Hochpassfilter den mit dem zweiten Kanal der Detektionseinrichtung auszuwertenden Anteil des Detektionslichts, nämlich den Anteil, der üblicherweise eine höhere Frequenz als diejenige Frequenz aufweist, die einem vom Rastervorgang anhängigen Zeitintervall entspricht. Auch der Hochpassfilter ist vorzugsweise konfigurierbar ausgeführt, um nämlich bei unterschiedlichen Rastergeschwindigkeiten den über den zweiten Kanal bestimmten Anteil des Detektionssignals zu selektieren.According to the invention is recognized have been that the detection signals in a simple way by means of high-pass filter and / or low-pass filter to the two channels. If a high pass filter and a low pass filter are provided the detection signals initially generated by the detection device on both filters. The low-pass filter is configured in this way that he selects the proportion of the detection signal, the one about Time interval averaged power of the detected light corresponds. Thus, the low-pass filter is a kind of "entrance lock" of the first channel. Since the time interval of each pixel from the rasterization of the Grid microscope depends, the low-pass filter is preferably adjustable in terms of its selection frequency, namely the corresponding portion of the detection signal for the first Select channel. In the same way, the high-pass filter selects with the second channel of the detection device to be evaluated share the detection light, namely the Share, usually a higher one Frequency than that frequency, one of the screening process pending Time interval corresponds. The high-pass filter is also preferred configurable, namely at different screen speeds over the second channel to select certain proportion of the detection signal.

Des Weiteren ist wesentlich, dass die Verfahrensschritte zur Auswertung der Detektionssignale im ersten Kanal der Detektionseinrichtung im Wesentlichen denjenigen Verfahrensschritten entsprechen, die bei konventionellen konfokalen Rastermikroskopen üblich sind. Folglich stellen diese Verfahrensschritte eine Art Leistungsrepräsentation des vom Objekt kommenden Lichts dar.Of Furthermore, it is essential that the method steps for evaluation the detection signals in the first channel of the detection device essentially correspond to those procedural steps that are common in conventional confocal scanning microscopes. Consequently, these process steps provide a kind of performance representation of the light coming from the object.

Des Weiteren ist in erfindungsgemäßer Weise erkannt worden, dass zur Auswertung der Detektionssignale im zweiten Kanal in idealer Weise mit einem Pulsformer Pulse erzeugt werden. Entsprechend erfolgt die weitere Auswertung im zweiten Kanal im Wesentlichen pulsbasiert, so dass das ursprünglich am Eingang des zweiten Kanals anliegende Detektionssignal zur weiteren Auswertung nicht berücksichtigt werden muss. Insoweit kann in vorteilhafter Weise auf auf dem Markt befindliche pulsbasierte Elektronikbausteine zurückgegriffen werden, wodurch die Materialkosten für das Vorsehen eines zweiten Kanals der Detektionseinrichtung gering zu halten sind.Furthermore, it has been recognized in accordance with the invention that for the evaluation of the detection signals in the second channel in an ideal manner with egg nem pulse shaper pulses are generated. Accordingly, the further evaluation in the second channel is essentially pulse-based, so that the detection signal initially present at the input of the second channel need not be taken into account for further evaluation. In that regard, can be used in an advantageous manner on the market located pulse-based electronic components, whereby the material costs for the provision of a second channel of the detection device are to be kept low.

Somit ist auf einfache Weise eine saubere Trennung der Detektionssignale in die beiden Kanäle möglich.Consequently is simply a clean separation of the detection signals possible in the two channels.

Falls das Rastermikroskop in Form eines konfokalen Rastermikroskops bzw. konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops ausgeführt ist, liefert die in dem ersten Kanal vorgesehene Auswertung des Detektionssignals ein Bild des Objekts, das von der Leistung des vom Objekt kommenden Lichts abhängig ist und dem Objektbild entsprechen würde, das mit einem konventionellen Mikroskop generiert werden kann. Die in dem zweiten Kanal vorgenommene Auswertung der Detektionssignale liefert ein Bild, das einer zeitlichen Auflösung der leistungsmodulierten oder pulsförmigen Objektbeleuchtung Rechnung trägt, nämlich die durch die Objektbeleuchtung bewirkte Leistungsveränderung des detektierten Lichts ist somit auflösbar bzw. nachweisbar. Hierdurch können Bilder erzeugt werden, die beispielsweise Fluoreszenzlebensdauermessungen, Photonenzählen und/oder Zeitkorrelationen zwischen unterschiedlichen Ereignissen ermöglichen.If the scanning microscope in the form of a confocal scanning microscope or Confocal Laser Scanning Microscope is designed to deliver in the first channel provided evaluation of the detection signal an image of the object that depends on the power of the light coming from the object dependent and would match the object image with a conventional one Microscope can be generated. The evaluation made in the second channel the detection signals provides an image that is a temporal resolution of the power modulated or pulsed Object lighting takes account, namely the power variation caused by the object illumination the detected light is thus resolvable or detectable. hereby can Images, such as fluorescence lifetime measurements, Photon counting and / or Allow time correlations between different events.

Insoweit ist die Auswertung der von der Detektionseinrichtung erzeugten Detektionssignale mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ganz besonders vorteilhaft, da das Objekt lediglich einmal abgerastert werden muss und dennoch – aufgrund der parallelen Auswertung mit den zwei Kanälen – beide Auswertungsmodi durchführbar sind.in this respect is the evaluation of the detection signals generated by the detection device with the method according to the invention very particularly advantageous because the object are scanned only once must and still - due the parallel evaluation with the two channels - both evaluation modes are feasible.

Nun ist es grundsätzlich möglich, die Auswertung der Detektionssignale mit den zwei Kanälen zeitversetzt durchzuführen, beispielsweise durch das Vorsehen einer Verzögerungsschaltung in einem der beiden Kanäle. Hierdurch könnte die Auswerteauslastung der Detektionseinrichtung an die jeweilige Detektionssituation bzw. an das aktuelle Datenaufkommen angepasst werden.Now it is basically possible, the evaluation of the detection signals with the two channels with a time delay perform, for example, by providing a delay circuit in one of the two Channels. This could the evaluation utilization of the detection device to the respective detection situation or adapted to the current data volume.

Ganz besonders bevorzugt werden jedoch die Detektionssignale mit den zwei Kanälen im Wesentlichen simultan ausgewertet. Eine nahezu gleichzeitige Verfügbarkeit der Auswerteergebnisse ist hierdurch möglich, so dass beispielsweise einem Bediener des Rastermikroskops trotz Vorliegen der Ergebnisse der zwei unterschiedlichen Auswertungsmethoden lediglich ein Ergebnisbild dargestellt wird, wobei das Ergebnisbild – in Abhängigkeit der jeweiligen Applikation – lediglich die Bereiche des detektierten Objekts darstellt, die einer logischen UND-Verknüpfung entsprechen und gewissen Selektions- bzw. Segmentierungskriterien entsprechen. So könnten beispielsweise in dem Ergebnisbild lediglich die Objektbereiche gezeigt werden, deren Fluoreszenzfarbstoff eine in einem vorgebbaren Bereich liegende Fluoreszenzlebensdauer aufweist, wobei diese Objektbereiche nach der Auswertungsmethode angezeigt werden, der das Ergebnis der Auswertung des ersten Kanals ist.All However, the detection signals are particularly preferred with the two channels evaluated essentially simultaneously. An almost simultaneous Availability the evaluation results is possible, so that, for example an operator of the scanning microscope despite the results the two different evaluation methods only a result image is shown, the result image - depending on the application - only represents the areas of the detected object that are logical AND operation correspond and certain selection or segmentation criteria correspond. So could For example, only the object areas in the result image are shown, the fluorescent dye one in a predeterminable Has area lying fluorescence lifetime, these object areas displayed according to the evaluation method, which is the result of Evaluation of the first channel is.

Zur Auswertung der Detektionssignale im zweiten Kanal werden mit einem Pulsformer Pulse erzeugt. Vorzugsweise hängen die vom Pulsformer erzeugten Pulse bezüglich ihrer Pulsamplitude, Pulsdauer und/oder Pulsfolgefrequenz von dem im zweiten Kanal verarbeiteten Detektionssignal ab. Die weitere Auswertung im zweiten Kanal erfolgt demgemäß im Wesentlichen pulsbasiert, das ursprünglich am Eingang des zweiten Kanals anliegende Detektionssignal muss zur weiteren Auswertung nicht berücksichtigt werden. Insoweit kann in vorteilhafter Weise auf auf dem Markt befindliche pulsbasierte Elektronikbausteine zurückgegriffen werden, so dass die Materialkosten für das Vorsehen eines zweiten Kanals der Detektionseinrichtung gering gehalten werden können.to Evaluation of the detection signals in the second channel are provided with a Pulse shaper generates pulses. Preferably, those generated by the pulse shaper hang Pulse relative their pulse amplitude, pulse duration and / or pulse repetition frequency of the in the second channel processed detection signal. The others Evaluation in the second channel is thus essentially pulse-based, originally at the entrance the second channel adjacent detection signal must to further Evaluation not considered become. In that regard, can be located on the market in an advantageous manner Pulse-based electronic components are used so that the material costs for the provision of a second channel of the detection device low can be kept.

Im zweiten Kanal ist zur weiteren pulsbasierten Auswertung ein Pulszähler vorgesehen, der die Anzahl der vom Pulsformer erzeugten Pulse zählt. Die Ausgabe des Pulszählers kann beispielsweise zur Auswertung nach einem Photonenzählverfahren bzw. Photon-Counting-Verfahren herangezogen werden, wie es z.B. bei der Fluoreszenzmikroskopie angewandt wird.in the second channel, a pulse counter is provided for further pulse-based evaluation, which counts the number of pulses generated by the pulse shaper. The Output of the pulse counter For example, for evaluation according to a Photonenzählverfahren or Photon counting methods, e.g. in the Fluorescence microscopy is applied.

Im zweiten Kanal könnte weiterhin eine Zeitmesseinrichtung vorgesehen sein, die die Zeitdifferenz jeweils zwei aufeinander folgender Pulse ermittelt und entsprechend ausgibt. In gleicher Weise könnte eine ebenfalls im zweiten Kanal vorgesehene zweite Zeitmesseinrichtung vorgesehen sein, die die Zeitdifferenz der vom Pulsformer erzeugten Pulse zu jeweils den Pulsen eines externen Pulsfolgesignals ermittelt. Die Ergebnisse beider Zeitmesseinrichtungen können beispielsweise bei Fluoreszenzlebensdauermessungen oder bei Messungen angewandt werden, bei denen das Objekt auf äußere Einflüsse, beispielsweise auf einzelne Lichtpulse der Lichtquelle reagiert. So ist das an der zweiten Zeitmesseinrichtung anliegende externe Pulsfolgesignal beispielsweise ein Signal, das von der zur Objektbeleuchtung dienenden gepulsten Lichtquelle anhängt. Im Fall einer gepulsten Laserlichtquelle könnte das externe Pulsfolgesignal das von der Laserlichtquelle ausgegebene Triggersignal sein.in the second channel could Furthermore, a time measuring device can be provided which determines the time difference each two consecutive pulses determined and accordingly outputs. In the same way could a likewise provided in the second channel second time measuring device be provided that the time difference generated by the pulse shaper Pulse to each of the pulses of an external pulse train signal determined. The results of both time measuring devices can, for example, in fluorescence lifetime measurements or be applied to measurements in which the object on external influences, for example responds to individual light pulses of the light source. That's the way it is the second time measuring device applied external pulse train signal For example, a signal that is used by the object lighting depends on pulsed light source. In the case of a pulsed laser light source, the external pulse train signal could be the output from the laser light source trigger signal.

Falls die zur Objektbeleuchtung dienenden Lichtquelle Licht emittiert, das einen im Wesentlichen konstanten Leistungsverlauf aufweist, könnte eine Leistungsmodulation dieses Lichts mit Hilfe eines AOTF (Acousto-Optical-Tunable-Filter) erfolgen. In diesem Fall könnte das Ansteuersignal des AOTF gleichzeitig als externes Pulsfolgesignal genutzt werden und der zweiten Zeitmesseinrichtung zugeführt werden. Insoweit hängt im ersten Fall das externe Pulsfolgesignal von der zeitlichen Abfolge der Lichtpulse der Lichtquelle ab. Im zweiten Fall hängt das externe Pulsfolgesignal von der zeitlichen Abfolge der Leistungsmodulation des Lichts der Lichtquelle ab.If the light source used for object lighting emits light, which has a substantially constant power curve, could a power modulation of this light using an AOTF (acousto-optical tunable filter) done. In this case could the drive signal of the AOTF simultaneously as an external pulse train signal be used and the second time measuring device are supplied. As far as that depends in the first case, the external pulse train signal of the time sequence the light pulses from the light source. In the second case, the external one hangs Pulse train signal from the time sequence of the power modulation from the light of the light source.

Die in den zwei Kanälen anliegenden Detektionssignale und/oder die ermittelten Auswerteergebnisse werden in einer Konkreten Ausführungsform digitalisiert, um nämlich beispielsweise mit einem Steuerrechner erfasst und einem Rastermikroskopbediener auf einem Monitor des Steuerrechners ausgegeben zu werden. Insbesondere werden neben den Detektionssignalen die ermittelten Zählergebnisse des Pulszählers und/oder die ermittelten Zeitdifferenzen der ersten und/oder der zweiten Zeitmesseinrichtung digitalisiert. Insoweit ist hierdurch in vorteilhafter Weise auch eine der Objektbilddetektion nachgeschaltete Auswertung möglich, die beispielsweise mit Methoden der digitalen Bildverarbeitung durchgeführt werden kann.The in the two channels applied detection signals and / or the determined evaluation results are in a specific embodiment digitized, namely for example, recorded with a control computer and a raster microscope operator to be spent on a monitor of the control computer. Especially In addition to the detection signals, the determined counting results of the pulse counter and / or the determined time differences of the first and / or the digitized second time measuring device. In that regard, this is by this in an advantageous manner, one of the object image detection downstream Evaluation possible, which are performed, for example, with methods of digital image processing can.

Neben einer Objektbeleuchtung mit leistungsmoduliertem oder pulsförmigem Licht einer Lichtquelle ist weiterhin auch eine Objektbeleuchtung mit einer Lichtquelle vorgesehen, deren Licht einen im Wesentlichen konstanten Leistungsverlauf aufweist. Insoweit könnte beispielsweise bei einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einer zur Zwei-Photonen-Fluoreszenzanregung dienenden pulsförmigen Lichtquelle Fluoreszenzlebensdauermessungen eines Fluoreszenzfarbstoffs durchgeführt werden. Der Fluoreszenzfarbstoff wird hierbei von dem Licht der pulsförmigen Lichtquelle angeregt, mit dem Fluoreszenzfarbstoff sind spezifisch bestimmte Objektbereiche markiert. Zusätzlich könnte mit der einen im Wesentlichen konstanten Leistungsverlauf aufweisenden Lichtquelle ein anderer Fluoreszenzfarbstoff angeregt werden, der spezifisch andere Objektbereiche des zu detektierenden Objekts sichtbar macht. Insoweit könnten beide Lichtquellen simultan zur Objektbeleuchtung eingesetzt und das von den verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen emittierte Fluoreszenzlicht gleichzeitig mit mehreren Detektoren der Detektionseinrichtung detektiert werden. Jedem Detektor ist dann allerdings jeweils ein erster und ein zweiter Kanal nachgeordnet, der eine erfindungsgemäße Auswertung beider Auswertemodi für jeden Detektor ermöglicht.Next object lighting with power modulated or pulsed light a light source is also an object lighting with a light source provided, the light of a substantially has constant power curve. In that regard, for example, at a confocal laser scanning microscope with a pulsed light source for two-photon fluorescence excitation Fluorescence lifetime measurements of a fluorescent dye can be performed. The fluorescent dye is in this case of the light of the pulsed light source stimulated with the fluorescent dye are specific Object areas marked. additionally could with the one having a substantially constant performance curve Light source can be excited by another fluorescent dye, the specifically different object areas of the object to be detected visible power. In that regard, could both light sources used simultaneously for object lighting and the fluorescent light emitted by the different fluorescent dyes detected simultaneously with a plurality of detectors of the detection device become. However, each detector is then a first and a second channel downstream, the an inventive evaluation both evaluation modes for each Detector allows.

Die bezüglich eines Rastermikroskops zur Detektion eines Objekts eingangs genannte Aufgabe wird durch die Merkmale des Patentanspruchs 12 gelöst. Danach ist ein solches Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts dadurch gekennzeichnet, dass mit einem ersten Kanal der Detektionseinrichtung im Wesentlichen der Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals auswertbar ist, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts entspricht, und dass mit einem zweiten Kanal der Detektionseinrichtung im Wesentlichen der Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals auswertbar ist, der der durch die leistungsmodulierte oder pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkte Leistungsveränderung des detektierten Lichts entspricht.The in terms of a scanning microscope for detecting an object mentioned above The object is solved by the features of claim 12. After that is such a scanning microscope for detecting an object thereby characterized in that with a first channel of the detection device essentially the proportion of generated in a time interval Detection signal is evaluated, the averaged over a time interval Power of the detected light corresponds, and that with a second channel of the detection device substantially the proportion of the detection signal generated in a time interval evaluable that caused by the power modulated or pulsed object lighting performance change corresponds to the detected light.

Insbesondere dient das erfindungsgemäße Rastermikroskop zur Detektion eines Objekts zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 11, so dass zur Vermeidung von Wiederholungen auf den vorangegangenen Teil der Beschreibung verwiesen wird.Especially serves the scanning microscope according to the invention for detecting an object for performing the method according to a the claims 1 to 11, so as to avoid repetition on the previous Part of the description is referenced.

In einer konkreten Ausführungsform weist die Detektionseinrichtung des Rastermikroskops einen lichtempfindlichen Detektor auf. Dieser Detektor könnte beispielsweise in Form eines Photomultipliers ausgeführt sein, mit dem auch vom Objekt kommendes Licht geringer Leistung – beispielsweise Fluoreszenzlicht – nachweisbar ist. Insbesondere konfokale Rastermikroskope weisen derzeit mehrere lichtempfindliche Detektoren auf, so dass eine simultane Detektion mehrerer Fluoreszenzfarbstoffe mit zwei Auswertekanälen pro Detektor in erfindungsgemäßer Weise möglich ist.In a concrete embodiment the scanning device of the scanning microscope has a photosensitive Detector on. This detector could be executed for example in the form of a photomultiplier, with the coming of the object light low power - for example Fluorescent light - detectable is. In particular, confocal scanning microscopes currently have several light-sensitive detectors on, allowing simultaneous detection several fluorescent dyes with two evaluation channels per Detector in accordance with the invention possible is.

In einer ganz besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Rastermikroskop in Form eines konfokalen Rastermikroskops ausgeführt. Mit anderen Worten ist der optische Strahlengang derart ausgeführt, dass in der Fokalebene des Mikroskopobjektivs eine konfokale Objektbeleuchtung vorliegt, im Idealfall also eine beugungsbegrenzte punktförmige Objektbeleuchtung vorliegt. Weiterhin ist der optische Strahlengang des konfokalen Rastermikroskops derart ausgebildet, dass in einer zur Fokalebene des Mikroskopobjektivs korrespondierenden Ebene eine Detektionslochblende derart angeordnet ist, dass lediglich Licht aus dem Beleuchtungsfokusbereich die Detektionslochblende zu einem dahinter angeordneten Detektor passieren kann.In a most preferred embodiment is the scanning microscope executed in the form of a confocal scanning microscope. In other words the optical beam path designed such that in the focal plane there is a confocal object illumination of the microscope objective, Ideally, there is a diffraction-limited point-like object illumination. Furthermore, the optical beam path of the confocal scanning microscope formed such that in one to the focal plane of the microscope objective Corresponding level arranged a detection pinhole such is that only light from the illumination focus area the detection pinhole can pass to a detector arranged behind it.

Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung an hand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert.There are now various possibilities for designing and developing the teaching of the present invention in an advantageous manner. For this purpose, on the one hand to the claims subordinate to claim 1 and on the other hand to the following explanation of the preferred Ausfüh Examples of the invention with reference to the drawing reference. In conjunction with the explanation of the preferred embodiments of the invention with reference to the drawings, also generally preferred embodiments and developments of the teaching are explained.

In der Zeichnung zeigenIn show the drawing

1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Rastermikroskops zur Detektion eines Objekts zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und 1 a schematic representation of a first embodiment of a scanning microscope according to the invention for the detection of an object for performing the method according to the invention and

2 eine schematische Darstellung eines Teils der Detektionseinrichtung des Rastermikroskops aus 1. 2 a schematic representation of a portion of the detection device of the scanning microscope 1 ,

1 zeigt in einer schematischen Darstellung ein konfokales Rastermikroskop 1 zur Detektion eines Objekts 2. Zur Objektbeleuchtung wird das Objekt 2 mit pulsförmigem Licht einer Laserlichtquelle 3 mit einem punktförmigem Beleuchtungsmuster abgerastert. Jedem Pixel bzw. Bildelement 4 eines zu generierenden Objektbilds 5 entspricht ein vom Rastervorgang abhängiges Zeitintervall. 1 shows a schematic representation of a confocal scanning microscope 1 for the detection of an object 2 , The object becomes the object illumination 2 with pulsed light of a laser light source 3 scanned with a punctiform illumination pattern. Every pixel or picture element 4 an object picture to be generated 5 corresponds to a time interval dependent on the screening process.

Die Leistung des vom Objekt 2 kommenden Lichts 6 ist mit einer Detektionseinrichtung 7 detektierbar, wobei die Detektionseinrichtung 7 ein von der detektierten Lichtleistung abhängiges Detektionssignal 8 erzeugt.The performance of the object 2 coming light 6 is with a detection device 7 detectable, wherein the detection device 7 a detection signal dependent on the detected light output 8th generated.

Zur Auswertung werden von der Detektionseinrichtung 7 in jedem Zeitintervall mindestens zweimal Detektionssignale 8 weitergeleitet.For evaluation by the detection device 7 at least twice detection signals in each time interval 8th forwarded.

Mit einem ersten Kanal 9 der Detektionseinrichtung 7 ist im Wesentlichen der Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals 11 auswertbar, der der über ein Zeitintervall gemittelten Leistung des detektierten Lichts 6 entspricht. In einem zweiten Kanal 10 der Detektionseinrichtung 7 ist im Wesentlichen der Anteil des in einem Zeitintervall erzeugten Detektionssignals 12 auswertbar, der durch die pulsförmige Objektbeleuchtung bewirkten Leistungsveränderung des detektierten Lichts 6 entspricht.With a first channel 9 the detection device 7 is essentially the proportion of the detection signal generated in a time interval 11 evaluable, the averaged over a time interval power of the detected light 6 equivalent. In a second channel 10 the detection device 7 is essentially the proportion of the detection signal generated in a time interval 12 evaluable, which caused by the pulsed object illumination power change of the detected light 6 equivalent.

Das von dem Detektor 13 der Detektionseinrichtung 7 erzeugte Detektionssignal 8 wird mittels Tiefpassfilter 14 und Hochpassfilter 15 auf die zwei Kanäle 9 und 10 verteilt. Mit dem im zweiten Kanal 10 angeordneten Pulsformer 16 werden in Abhängigkeit des Detektionssignals 12 bzw. 8 Pulse 17 erzeugt, die zur weiteren Auswertung dienen. Im zweiten Kanal 10 ist ein Pulszähler 18 vorgesehen, der die Anzahl der vom Pulsformer 16 erzeugten Pulse 17 zählt. Dementsprechend gibt Pulszähler 18 als Ergebnis die Anzahl 19 der vom Pulszähler 18 erzeugten Pulse 17 aus.That of the detector 13 the detection device 7 generated detection signal 8th becomes by means of low pass filter 14 and high pass filter 15 on the two channels 9 and 10 distributed. With the second channel 10 arranged pulse shaper 16 become dependent on the detection signal 12 respectively. 8th Pulse 17 generated, which serve for further evaluation. In the second channel 10 is a pulse counter 18 provided that the number of the pulse shaper 16 generated pulses 17 counts. Accordingly, there are pulse counters 18 as a result the number 19 that of the pulse counter 18 generated pulses 17 out.

Im zweiten Kanal 10 ist eine erste Zeitmesseinrichtung 20 vorgesehen, die die Zeitdifferenz jeweils zwei aufeinander folgender Pulse 17 in Form einer Signalfolge 21 ausgibt, die von der Zeitdifferenz jeweils zwei aufeinander folgender Pulse 17 abhängt.In the second channel 10 is a first time measuring device 20 provided the time difference of two consecutive pulses 17 in the form of a signal sequence 21 outputs the time difference of two successive pulses 17 depends.

Im zweiten Kanal 10 ist weiterhin eine zweite Zeitmesseinrichtung 22 vorgesehen, die die Zeitdifferenz der vom Pulsformer 16 erzeugten Pulse 17 zu jeweils den Pulsen eines externen Pulsfolgesignals 23 ermittelt. Das externe Pulsfolgesignal 23 hängt hierbei von der zeitlichen Abfolge der Lichtpulse der Laserlichtquelle 3 ab. Hierbei handelt es sich im Konkreten um das von der Laserlichtquelle 3 ausgegebene Puls-Triggersignal. Die zweite Zeitmesseinrichtung 22 gibt eines Signalfolge 24 aus, die von der Zeitdifferenz der vom Pulsformer 16 erzeugten Pulse 17 zu den jeweiligen Pulsen des externen Pulsfolgesignals 23 abhängt.In the second channel 10 is still a second time measuring device 22 provided that the time difference of the pulse shaper 16 generated pulses 17 in each case to the pulses of an external pulse train signal 23 determined. The external pulse train signal 23 depends on the time sequence of the light pulses of the laser light source 3 from. In concrete terms, this is that of the laser light source 3 output pulse trigger signal. The second time measuring device 22 gives a signal sequence 24 from that of the time difference of the pulse shaper 16 generated pulses 17 to the respective pulses of the external pulse train signal 23 depends.

In dem ersten Kanal 9 ist ein Analog-Digital-Wandler 25 vorgesehen, der das analoge Signal 11 in ein digitales Signal 26 umwandelt.In the first channel 9 is an analog-to-digital converter 25 provided that the analog signal 11 into a digital signal 26 transforms.

Der Detektor 13 der Detektionseinrichtung 7 ist als Photomultiplier ausgeführt.The detector 13 the detection device 7 is designed as a photomultiplier.

Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken.In conclusion, be particularly noted that the above discussed embodiments merely to describe the claimed teaching, this but not on the embodiments limit.

Claims

Method for detecting an object ( 2 ) with a scanning microscope ( 1 ), where the object ( 2 ) for object illumination with power modulated or pulsed light from a light source ( 3 ) is scanned, each picture element ( 4 ) of an object image to be generated ( 5 ) corresponds to a time interval dependent on the raster operation, the power of the object ( 2 ) coming light with a detection device ( 7 ) is detected, wherein the detection device ( 7 ) a detection signal dependent on the detected light output ( 8th ), wherein the detection device ( 7 ) in each time interval at least twice detection signals ( 8th ) to an evaluation, wherein the detection device ( 7 ) in a first channel ( 9 ) essentially the proportion ( 11 ) of the detection signal generated in a time interval ( 8th ), which determines the power of the detected light averaged over a time interval ( 6 ), and wherein the detection device ( 7 ) in a second channel ( 10 ) essentially the proportion ( 12 ) of the detection signal generated in a time interval ( 8th ), that of the power-modulated or pulse-shaped Object lighting caused power change of the detected light ( 6 ), characterized in that the detection signals ( 11 . 12 ) by means of high-pass filter ( 15 ) and / or low-pass filter ( 14 ) on the two channels ( 9 . 10 ) and that in the second channel ( 10 ) with a pulse shaper ( 16 ) Pulses ( 17 ) are generated, which are used for further evaluation.

Method according to Claim 1, characterized in that the evaluation of the detection signals ( 11 . 12 ) with the two channels ( 9 . 10 ) takes place substantially simultaneously.

Method according to claim 1 or 2, characterized in that the pulse generator ( 16 ) generated pulses ( 17 ) with respect to its pulse amplitude, pulse duration and / or pulse repetition frequency from the detection signal ( 12 ) depend.

Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that a in the second channel ( 10 ) provided pulse counter ( 18 ) the number ( 19 ) of the pulse shaper ( 16 ) generated pulses ( 17 ) counts.

Method according to one of claims 1 to 4, characterized in that one in the second channel ( 10 ) provided time measuring device ( 20 ) the time difference ( 21 ) each two consecutive pulses ( 17 ).

Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that one in the second channel ( 10 ) provided second time measuring device ( 22 ) the time difference ( 24 ) of the pulse shaper ( 16 ) generated pulses ( 17 ) to the pulses of an external pulse train signal ( 23 ).

Method according to Claim 6, characterized in that the external pulse train signal ( 23 ) of the temporal sequence of the light pulses of the light source ( 3 ) depends.

Method according to Claim 6, characterized in that the external pulse train signal ( 23 ) depends on the time sequence of the power modulation of the light of the light source.

Method according to one of claims 1 to 8, characterized in that in the two channels ( 9 . 10 ) a digitization of the detection signals ( 8th . 11 . 12 ) and / or the determined counting results ( 19 ) and / or the determined time differences ( 21 . 24 ), preferably by means of an analog-to-digital converter ( 25 ).

Method according to one of claims 1 to 9, characterized that also a light source serves for object illumination, the light substantially constant power emitted.

Method according to one of claims 1 to 10, characterized that the object is punctiform Is scanned lighting pattern.

Scanning microscope for the detection of an object ( 2 ), where the object ( 2 ) for object illumination with power modulated or pulsed light from a light source ( 3 ) is rasterable, each picture element ( 4 ) of an object image to be generated ( 5 ) corresponds to a time interval dependent on the raster operation, the power of the object ( 2 ) coming light with a detection device ( 7 ) is detectable, wherein with the detection device ( 7 ) a detection signal dependent on the detected light output ( 8th ) is producible, wherein with the detection device ( 7 ) in each time interval at least twice detection signals ( 8th ) can be forwarded to an evaluation, wherein with the detection device ( 7 ) in a first channel ( 9 ) essentially the proportion ( 11 ) of the detection signal generated in a time interval ( 8th ), the power of the detected signal averaged over a time interval ( 6 ) and wherein with the detection device ( 7 ) in a second channel ( 10 ) essentially the proportion ( 12 ) of the detection signal generated in a time interval ( 8th ) which can be evaluated as the change in the power of the detected light caused by the power-modulated or pulsed object illumination ( 6 ), characterized in that the detection signals ( 11 . 12 ) by means of high-pass filter ( 15 ) and / or low-pass filter ( 14 ) on the two channels ( 9 . 10 ) and that in the second channel ( 10 ) with a pulse shaper ( 16 ) Pulses ( 17 ) are generated, which serve for further evaluation.

Scanning microscope according to claim 12, characterized in that the detection device ( 7 ) a photosensitive detector ( 13 ), preferably a photomultiplier.

Scanning microscope according to claim 12 or 13, characterized by a confocal object illumination and a confocal object detection.

Scanning microscope according to one of claims 12 to 14, characterized in that the object with a punctiform illumination pattern is rasterable.