DE10249860A1

DE10249860A1 - Use of neuroglobin for producing a medicament for treating diseases of retina, or for producing a diagnostic agent for diagnosing diseases of the retina

Info

Publication number: DE10249860A1
Application number: DE2002149860
Authority: DE
Inventors: Thomas Hankeln; Thorsten Burmester
Original assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date: 2002-10-25
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2004-05-13
Also published as: AU2003296560A1; WO2004037970A2

Abstract

Use of neuroglobin for producing a medicament for treating diseases of retina, or for producing a diagnostic agent for diagnosing diseases of the retina.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Neuroglobin oder einer dafür codierende Nukleinsäure für die Herstellung eines Medikamentes.The present invention relates to the use of neuroglobin or a nucleic acid coding therefor for the production of a drug.

Neuroglobin ist ein vor kurzem entdecktes neues Hämoglobin, welches überwiegend im Gehirn exprimiert wird (Burmester, T. et al. Nature, Vol. 407, Nr. 6803, 28. September 2000, Seiten 520–523). Neuroglobin ist somit ein Mitglied der großen Familie von Proteinen, die traditionell mit der Speicherung und dem Transport von Sauerstoff in Verbindung gebracht wurden. Hämoglobine werden dabei allgemein als Proteine beschrieben, die Häm b als prosthetische Gruppe unter Verwendung einer hochkonservativen alpha-helikalen „Globin"-Faltung binden. Das Eisenatom in der prosthetischen Gruppe existiert entweder als Fe²⁺ oder Fe³⁺ und weist eine octaedrische Koordinationsgeometrie mit sechs potentiellen Bindungsstellen auf. Die beiden bekanntesten Beispiele von Hämoglobinen sind die beiden Vertebratenglobine, die beim Menschen und anderen Säugetieren gefunden werden. Dies ist zum einen das Hämoglobin, welches als Tetramer von Hämoglobin-Domänen in roten Blutkörperchen gefunden wird, wo es für den Transport von Sauerstoff von den Lungen zu anderen Geweben zuständig ist, und zum anderen Myoglobin. Menschliches Myoglobin ist im Unterschied zu Hämoglobin ein monomeres Hämoglobin, welches Sauerstoff im Muskelgewebe speichert und seine Diffusion aus den Erythrozyten zu den Mitochondrien erleichtert.Neuroglobin is a recently discovered new hemoglobin that is predominantly expressed in the brain (Burmester, T. et al. Nature, Vol. 407, No. 6803, September 28, 2000, pages 520-523). Neuroglobin is therefore a member of the large family of proteins that have traditionally been associated with the storage and transport of oxygen. Hemoglobins are generally described as proteins that bind heme b as a prosthetic group using a highly conservative alpha-helical "globin" fold. The iron atom in the prosthetic group exists either as Fe ²⁺ or Fe ³⁺ and has an octahedral coordination geometry six potential binding sites The two best known examples of hemoglobins are the two vertebrate globins found in humans and other mammals, firstly hemoglobin, which is found as a tetramer of hemoglobin domains in red blood cells, where it is used for transport of oxygen from the lungs to other tissues, and myoglobin on the other hand, unlike hemoglobin, human myoglobin is a monomeric hemoglobin that stores oxygen in muscle tissue and facilitates its diffusion from erythrocytes to mitochondria.

Neuroglobin weist weniger als 25 % Identität mit anderen Vertebratenglobinen auf und eine Identität mit dem Nervenmyoglobin der Anneliden von weniger als 30 %. Aufgrund seiner spektroskopischen und kinetischen Eigenschaften geht man davon aus, dass menschliches Neuroglobin ein sechsfach-koordiniert bindendes Hämoglobin ist und damit ähnlich zu den entsprechenden Hämoglobinen von Pflanzen und Bakterien ist. Neuroglobin ist das erste derartige bei Vertebraten aufgefundene Hämoglobin (Trent, J. T. et al. (2001), The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, Nr. 32, Ausgabe 10. August, Seiten 30106–30110). Wie in Burmester et al. (Burmester, T. et al. Nature, Vol. 407, Nr. 6803, 28. September 2000, Seiten 520-523) dargelegt, wird Neuroglobin bevorzugt im zentralen Nervensystem von Vertebraten exprimiert. Weitere Untersuchungen von Sun et al. (Sun, Y. et al., PNAS, 18. Dezember 2001, Vol. 98, Nr. 28, Seiten 15306-15311) zeigen, dass die Expression von Neuroglobin durch neuronale Hypoxie in vitro und fokale cerebrale Ischämie in vivo induziert wird. Sun et al. zeigen weiterhin, dass bei einer Inhibierung der Hämoglobin-Expression mit einem antisense-Oligodesoxynukleotid das Überleben von Neuronen nach Hypoxie verringert und entsprechend bei Überexpression von Neuroglobin verstärkt wird.Neuroglobin has less than 25 % Identity with other vertebrate globes and an identity with the Nerve myoglobin of the annelids of less than 30%. Because of his spectroscopic and kinetic properties one assumes that human neuroglobin is a six-coordinate coordinated binding hemoglobin and is similar to the corresponding hemoglobins of plants and bacteria. Neuroglobin is the first of its kind Hemoglobin found in vertebrates (Trent, J.T. et al. (2001), The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 32, August 10 edition, pages 30106-30110). As in Burmester et al. (Burmester, T. et al. Nature, Vol. 407, No. 6803, September 28, 2000, pages 520-523) is neuroglobin preferably expressed in the central nervous system of vertebrates. Further studies by Sun et al. (Sun, Y. et al., PNAS, 18. December 2001, Vol. 98, No. 28, pages 15306-15311) show that the expression of neuroglobin by neuronal hypoxia in vitro and focal cerebral ischemia is induced in vivo. Sun et al. further show that at a Inhibition of hemoglobin expression survival of neurons with an antisense oligodeoxynucleotide Hypoxia decreases and accordingly in the case of overexpression of neuroglobin reinforced becomes.

Die Feststellungen von Sun et al. bestätigen die technische Lehre der internationalen Patentanmeldung PCT/EP01/01830, die auf die Bedeutung der Sauerstoffversorgung des Nervensystems für den Fortbestand und die Funktion neuronaler Zellen abstellt. Bei einer Reihe von neuro-degenerativen Erkrankungen gilt Sauerstoffmangel und eine Störung der Energieproduktion als möglicher Risikofaktor, wie z. B. bei der Alzheimerschen Erkrankung, oder ist zumindest in das komplexe pathologische Geschehen miteinbezogen wie im Falle der Parkinsonschen Erkrankung. Eine direkte Beziehung zwischen Sauerstoff-Unterversorgung und Gehirnschädigung existiert beim Schlaganfall, wenn primär unterversorgte absterbende Zellen benachbartes Gewebe schädigen (ischämische Kaskade). Ebenfalls relevant ist die Sauerstoffversorgung beim schnellen Wachstum von Tumoren, beispielsweise im Gehirn. Infolge dieser Zusammenhänge schlägt die internationale Patentanmeldung PCT/EP01/01830 die Verwendung von Neuroglobin zur Herstellung eines Arzneimittels für die Therapie von Erkrankungen des Nervensystems, bei Schlaganfall, bei neuronaler Sauerstoff-Unterversorgung und bei Tumoren neuronaler Gewebe vor.The Sun et al. to confirm the technical teaching of the international patent application PCT / EP01 / 01830, on the importance of oxygenation to the nervous system for the Survival and the function of neuronal cells. At a A number of neuro-degenerative diseases apply to lack of oxygen and a disturbance of energy production as possible Risk factor, such as B. in Alzheimer's disease, or is at least involved in the complex pathological process like in the case of Parkinson's disease. A direct relationship between undersupply of oxygen and brain damage exists in stroke, if primary undersupplied dying cells damage neighboring tissue (ischemic cascade). The oxygen supply during rapid growth is also relevant of tumors, for example in the brain. As a result of these relationships, the international patent application fails PCT / EP01 / 01830 the use of neuroglobin for the production of a Drug for the Therapy of diseases of the nervous system, for stroke, for neuronal oxygen deficiency and in tumors of neuronal tissue.

Der vorliegenden Anmeldung liegt die Aufgabe zugrunde, weitere Verwendungen von Neuroglobin bereitzustellen.The present application lies based on the task of providing further uses of neuroglobin.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem ersten Aspekt gelöst durch die Verwendung von Neuroglobin zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen der Retina und/oder zur Herstellung eines diagnostischen Mittels für die Diagnose von Erkrankungen der Retina.The task is inventively in one first aspect solved through the use of neuroglobin to make a drug for the treatment of diseases of the retina and / or for the production a diagnostic tool for the diagnosis of diseases of the retina.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Neuroglobin eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 6, hierin auch als SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 6 bezeichnet, aufweist.In one embodiment, that the neuroglobin is an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 or SEQ ID NO. 6, also herein as SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 6, having.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem zweiten Aspekt gelöst durch die Verwendung einer für Neuroglobin codierenden Nukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen der Retina und/oder zur Herstellung eines diagnostischen Mittels für die Diagnose von Erkrankungen der Retina.The task is inventively in one second aspect solved by using one for neuroglobin coding nucleic acid for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases of the Retina and / or for the manufacture of a diagnostic agent for diagnosis of diseases of the retina.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Neuroglobin eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 6 aufweist.In one embodiment, that the neuroglobin is an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 6 has.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass dass die Nukleinsäure eine Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 7 bis SEQ ID NO. 12 ist.In another embodiment it is provided that the nucleic acid is a nucleic acid according to SEQ ID NO. 7 to SEQ ID NO. 12 is.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure mit der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 7 bis SEQ ID NO. 12 ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes hybridisieren würde.In yet another embodiment it is provided that the nucleic acid with the nucleic acid according to SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO. 12 without the degeneracy of the genetic Codes would hybridize.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung gemäß dem ersten und/oder zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist vorgesehen, dass die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, die Retinablastom, Glaukom, Retinis pigmentosa, altersabhängige Makuladegeneration und Uveitis umfasst.In one embodiment of the use according to the invention according to the first and / or second aspect of the present invention is provided, that the disease is selected is from the group that includes retinal blastoma, glaucoma, retinal pigmentosa, age-related Macular degeneration and uveitis includes.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem dritten Aspekt gelöst durch die Verfahren zum Screenen eines Mittels zur Behandlung von Erkankungen der Retina und/oder eines diagnostischen Mittels für die Diagnose von Erkrankungen der Retina, umfassend die Schritte:The task is inventively in one third aspect solved by the methods of screening an agent for treating Diseases of the retina and / or a diagnostic tool for diagnosis of diseases of the retina, comprising the steps:

a) providing a candidate connection,
b) providing a neuroglobin expression system and / or Neuroglobin activity system;
c) contacting the candidate compound with the neuroglobin expression system and / or the neuroglobin activity system;
d) Determine whether under the influence of the candidate connection the expression and / or the activity of the neuroglobin is changed.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Kandidaten-Verbindung in einer Verbindungsbibliothek enthalten ist.In one embodiment, that the candidate link contained in a link library is.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Kandidaten-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe von Verbindungsklassen, die Peptide, Proteine, Antikörper, Anticaline, funktionale Nukleinsäuren und kleine Moleküle umfasst.In another embodiment it is provided that the candidate connection is selected from the group of compound classes, the peptides, proteins, antibodies, anticalins, functional nucleic acids and small molecules includes.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die funktionalen Nukleinsäuren ausgewählt sind aus der Gruppe, die Aptamere, Aptazyme, Ribozyme, Spiegelmere, Antisense-Oligonukleotide und RNAi umfasst.In a preferred embodiment it is provided that the functional nucleic acids are selected from the group consisting of Aptamers, aptazymes, ribozymes, Spiegelmers, antisense oligonucleotides and RNAi.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem vierten Aspekt gelöst durch die Verwendung von Neuroglobin und/oder einer dafür codierenden Nukleinsäure und/oder eines insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartners von Neuroglobin und/oder einer dafür codierenden Nukleinsäure als Zielmolekül für die Entwicklung und/oder Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Erkrankungen der Retina, und/oder für die Entwicklung und/oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen der Retina.The task is inventively in one fourth aspect solved through the use of neuroglobin and / or a coding for it nucleic acid and / or a particularly natural one Interaction partner of neuroglobin and / or a coding for it nucleic acid as a target for the Development and / or production of a diagnostic agent for Diagnosis of diseases of the retina, and / or for development and / or Manufacture of a medication for the prevention and / or treatment of Diseases of the retina.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Medikament oder das diagnostische Mittel ein Agens umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antikörper, Peptide, Anticaline, kleine Moleküle, Antisense-Moleküle, Aptamere, Spiegelmere und RNAi-Moleküle umfasst.In one embodiment, that the drug or diagnostic agent comprises an agent that selected is from the group, the antibodies, Peptides, anticalins, small molecules, antisense molecules, aptamers, Spiegelmers and RNAi molecules includes.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Agens mit Neuroglobin oder einem insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin in Wechselwirkung tritt.In a preferred embodiment it is provided that the agent with neuroglobin or a particular natural Interaction partner of neuroglobin interacts.

In einer alternativen Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Agens mit einer für Neuroglobin codierenden Nukleinsäure und/oder mit einer für einen insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin codierenden Nukleinsäure, insbesondere mit mRNA, genomischer Nukleinsäure oder cDNA für Neuroglobin in Wechselwirkung tritt.In an alternative embodiment it is provided that the agent with a nucleic acid coding for neuroglobin and / or with one for a particularly natural one Interaction partners of nucleic acid encoding neuroglobin, in particular with mRNA, genomic nucleic acid or cDNA for neuroglobin interacts.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem fünften Aspekt gelöst durch die Verwendung eines mit Neuroglobin oder mit einem insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin in Wechselwirkung tretenden Polypeptids zur Entwicklung oder Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Erkrankungen der Retina, und/oder zur Entwicklung oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen der Retina.The task is inventively in one fifth Aspect solved through the use of one with neuroglobin or with one in particular natural Interaction partner of neuroglobin interacting Polypeptide for the development or manufacture of a diagnostic For the diagnosis of diseases of the retina, and / or for development or manufacture of a medicament for prevention and / or treatment of diseases of the retina.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, die Antikörper gegen Neuroglobin und Neuroglobin-bindende Polypeptide umfasst.In one embodiment, that the polypeptide is selected is from the group called antibodies against neuroglobin and neuroglobin binding polypeptides.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem sechsten Aspekt gelöst durch die Verwendung einer mit Neuroglobin oder mit einem insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin in Wechselwirkung tretenden Nukleinsäure zur Entwicklung oder Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Erkrankungen der Retina, und/oder zur Entwicklung oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen der Retina.The task is inventively in one sixth aspect solved by using one with neuroglobin or with one in particular natural Interaction partner of neuroglobin interacting nucleic acid for the development or manufacture of a diagnostic agent for Diagnosis of diseases of the retina, and / or for development or Manufacture of a medication for prevention and / or treatment of diseases of the retina.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Nukleinsäure ausgewählt ist aus der Gruppe, die Aptamere und Spiegelmere umfasst.In one embodiment, that the nucleic acid selected is from the group that includes aptamers and Spiegelmers.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem siebten Aspekt gelöst durch die Verwendung einer mit für Neuroglobin oder für einen insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin codierenden Nukleinsäure in Wechselwirkung tretenden Nukleinsäure zur Entwicklung oder Herstellung eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Erkrankungen der Retina, und/oder zur Entwicklung oder Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen der Retina.According to the invention, the object is achieved in a seventh aspect by using a nucleic acid which interacts with nucleic acid coding for neuroglobin or for a particularly natural interaction partner of neuroglobin for developing or producing a diagnosis means for the diagnosis of diseases of the retina, and / or for the development or manufacture of a medicament for the prevention and / or treatment of diseases of the retina.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die in Wechselwirkung tretende Nukleinsäure ein Antisense-Oligonukleotid, ein Ribozym und/oder RNAi ist.In one embodiment, that the interacting nucleic acid is an antisense oligonucleotide, is a ribozyme and / or RNAi.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die für Neuroglobin oder für einen insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin codierende Nukleinsäure die jeweilige cDNA oder mRNA ist.In another embodiment it is envisaged that for Neuroglobin or for a particularly natural one Interaction partner of nucleic acid encoding neuroglobin respective cDNA or mRNA.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem achten Aspekt gelöst durch eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend mindestens ein Agens, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die mit Neuroglobin, mit einer dafür codierender Nukleinsäure, mit einem insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin und/oder mit einer dafür codierenden Nukleinsäure in Wechselwirkung tretende Polypeptide, mit Neuroglobin oder einem insbesondere natürlichem Wechselwirkungspartner von Neuroglobin in Wechselwirkung tretende Nukleinsäuren und mit für Neuroglobin oder für einen insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin codierende Nukleinsäure(n) in Wechselwirkung tretende Nukleinsäuren umfasst, und mindestens einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, insbesondere zur Prävention und/oder Behandlung von Erkrankungen der Retina.The task is inventively in one eighth aspect solved by a pharmaceutical composition comprising at least an agent that selected is from the group with neuroglobin, with a coding for it Nucleic acid, with a particularly natural one Interaction partner of neuroglobin and / or with a coding for it nucleic acid interacting polypeptides, with neuroglobin or a especially natural Interaction partner of neuroglobin interacting nucleic acids and with for Neuroglobin or for a particularly natural one Interaction partner of nucleic acid (s) encoding neuroglobin in Interacting nucleic acids comprises, and at least one pharmaceutically acceptable carrier, in particular for prevention and / or treatment of diseases of the retina.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem neunten Aspekt gelöst durch einen Kit für die Charakterisierung des Zustandes der Retina, umfassend ein mit Neuroglobin, mit einer dafür codierenden Nukleinsäure, mit einem insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin oder mit einer dafür codierenden Nukleinsäure in Wechselwirkung tretendes Polypeptid, eine mit Neuroglobin, mit einer dafür codierenden Nukleinsäure, mit einem insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin oder einer dafür codierenden Nukleinsäure in Wechselwirkung tretende Nukleinsäure und/oder eine mit für Neuroglobin codierende und/oder für einen insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin codierende Nukleinsäure in Wechselwirkung tretende Nukleinsäure.The task is inventively in one ninth aspect solved through a kit for the characterization of the state of the retina, comprising a with Neuroglobin, with one for it coding nucleic acid, with a particularly natural one Interaction partner of neuroglobin or with a coding for it nucleic acid interacting polypeptide, one with neuroglobin, with one for that coding nucleic acid, with a particularly natural one Interaction partner of neuroglobin or a coding for it nucleic acid interacting nucleic acid and / or one for neuroglobin coding and / or for a particularly natural one Interaction partner of nucleic acid encoding neuroglobin in interaction stepping nucleic acid.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Kit und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung mindestens einen hierin offenbarten Antikörper umfasstIn one embodiment, that the kit and / or the pharmaceutical composition at least an antibody disclosed herein includes

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem zehnten Aspekt gelöst durch die Antikörper, insbesondere monoklonaler Antikörper, gerichtet gegen Neuroglobin.The task is inventively in one solved tenth aspect through the antibodies, especially monoclonal antibodies, directed against neuroglobin.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß in einem elften Aspekt gelöst durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Antikörpers, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen der Retina und/oder zur Herstellung eines diagnostischen Mittels für die Diagnose von Erkrankungen der Retina.The task is inventively in one eleventh aspect solved by using an antibody according to the invention for the production of a Medicament for the treatment of diseases of the retina and / or for the production of a diagnostic agent for the diagnosis of diseases the retina.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass das Neuroglobin in der Retina in außerordentlich hohen Konzentrationen vorhanden ist. Dabei wird eine bevorzugte Expression in den Innensegmenten der Photorezeptorzellen und den retikulären (plexiformen) Schichten beobachtet. Damit wird Neuroglobin nicht nur wie im Stand der Technik bekannt in Geweben des zentralen Nervensystems, sondern auch in der Retina bzw. in den diese aufbauenden Zellen selbst exprimiert. Dabei ist für die sich daraus ergebenden Anwendungsmöglichkeiten von Neuroglobin oder von die Expression oder Aktivität von Neuroglobin beeinflussenden Verbindungen besonders beachtlich, dass die Expression bevorzugt und in besonders starkem Maße in den Bereichen erfolgt, die nach dem Stand der heutigen Forschung den höchsten Sauerstoffbedarf in der Retina besitzen (vergl. Cringle, S.J. and Yu, D.Y., Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol., Mai 2002, Vol. 132, 61-66). Sowohl das Innensegment der Photorezeptorzellen als auch die plexiformen Schichten enthalten eine großen Anzahl von Mitochondrien, die unter Sauerstoffverbrauch die Energie für die Generierung und synaptische Weiterleitung von Nervenimpulsen bereitstellen.The present invention lies the surprising Underlying knowledge that the neuroglobin in the retina is extraordinary high concentrations is present. A preferred one Expression in the inner segments of the photoreceptor cells and reticular (plexiform) layers observed. This doesn't make neuroglobin only as known in the prior art in tissues of the central nervous system, but also in the retina or in the cells that build it self-expressed. Here is for the resulting applications of neuroglobin or affecting the expression or activity of neuroglobin Compounds particularly notable that expression preferred and to a particularly great extent is done in areas that are based on current research the highest Have oxygen needs in the retina (see Cringle, S.J. and Yu, D.Y., Comp. Biochem. Physiol. A Mol. Integr. Physiol., May 2002, Vol. 132, 61-66). Both the inner segment of the photoreceptor cells as well as the plexiform layers contain a large number of mitochondria that use oxygen to generate energy and provide synaptic transmission of nerve impulses.

Ohne im Folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, ergeben sich aus dieser Erkenntnis zwei grundsätzliche mögliche Wirkmechanismen, die die Anwendung von Neuroglobin im Zusammenhang mit der Beeinflussung des Geschehens in der Retina eröffnen und wesentlich bestimmen. In einem Aspekt wird dabei auf die Fähigkeit von Neuroglobin abgestellt, Sauerstoff zu speichern. Mit Blick darauf, dass die Retina eines der metabolisch aktivsten neuronalen Gewebe darstellt, führt eine geeignete Überexpression von Neuroglobin dazu, die Sauerstoffversorgung der Retina zu verbessern bzw. aufrechtzuerhalten und damit Erkrankungen oder Zustände zu therapieren bzw. deren Entstehen zu verhindern, bei denen die Sauerstoffversorgung der Retina, insbesondere infolge eines Mangels oder einer gegenüber den bestehenden Erfordernissen verringerte Expression oder Aktivität von Neuroglobin, verringert ist. In diesem Kontext können auch diagnostische Mittel ansetzen mit dem Ziel zu bestimmen, inwieweit die Expression oder Aktivität von Neuroglobin in der Retina und insbesondere den Zapfen und/oder Stäbchen bzw. allgemein den Photorezeptorzellen, in ausreichendem Maße erfolgt bzw. vorhanden ist.Without being bound to it below Two basic principles arise from this knowledge possible Mechanisms of action related to the use of neuroglobin with the influence of what is happening in the retina and determine significantly. One aspect is ability turned off by neuroglobin to store oxygen. With a view that the retina is one of the most metabolically active neuronal tissues represents leads a suitable overexpression of neuroglobin to improve the oxygenation of the retina or to maintain and thereby treat diseases or conditions or to prevent their occurrence, in which the oxygen supply the retina, particularly as a result of a deficiency or compared to the existing needs reduced expression or activity of neuroglobin, is reduced. Diagnostic agents can also be used in this context start with the aim of determining to what extent the expression or activity of neuroglobin in the retina and especially the cones and / or rod or generally the photoreceptor cells, takes place to a sufficient extent or is present.

Dabei kann bei der Verwendung von Neuroglobin bzw. der für sie codierenden Nukleinsäuren vorgesehen sein, dass die Aktivität bzw. der Umfang der Expression von Neuroglobin verringert wird und die dafür codierende Nukleinsäure entsprechend inhibiert, degradiert oder in ihrem Expressionsumfang verringert wird. Eine derartige Verringerung der Aktivität bzw. Expression von Neuroglobin und der dafür codierenden Nukleinsäure(n) wird im Falle der Behandlung oder Diagnose von Erkrankungen und allgemein Zuständen von Vorteil sein, bei denen die Funktion des Neuroglobins als Sauerstofftransportmolekül und Sauerstoffspeichermolekül bzw. die Wirkung des Neuroglobins als Schutzprotein (engt. 'scavenger') verringert werden soll. Derartige Zustände sind dabei u. a. Tumore des Auges, insbesondere der Retina und bevorzugter Weise der diese ausbildenden Zellen oder Zellarten. Ein Beispie für eine derartigen Tumor stellt das Retinoblastom dar. Dieser Anwendung liegt dabei die Überlegung zugrunde, dass Tumoren, die in der Regel ein starkes Wachstum zeigen, einen vergleichsweise hohen Sauerstoffbedarf aufweisen. Indem Neuroglobin im weitesten Sinne nicht mehr oder nur mehr im verringerten Umfang präsent ist, um die Sauerstoffversorgung, insbesondere den Übergang von dem die Retina mit Sauerstoff versorgenden Blutgefäßen zu den eigentlichen Zellen bzw. innerhalb der Zellen zu gewährleisten oder zu vermitteln, wird das weitere Wachstum des Tumors dadurch verringert bzw. unterdrückt werden. Gegebenenfalls bildet sich der Tumor unter diesen Umständen auch wieder zurück bzw. kann gegebenenfalls auch vollständig abgebaut werden. Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff des Tumors dabei sowohl benigne als auch maligne Tumoren und tumorartige Erkrankungen.When using neuroglobin or the nucleic acids coding for it, it can be provided that the activity or the level of expression of neuroglobin is reduced and the nucleic acid coding for it is correspondingly inhibited, degraded or reduced in its level of expression. Such a reduction in the activity or expression of neuroglobin and the nucleic acid (s) coding for it will be advantageous in the case of treatment or diagnosis of diseases and general conditions in which the function of the neuroglobin as an oxygen transport molecule and oxygen storage molecule or the action of the neuroglobin as a protective protein (narrowly 'scavenger') should be reduced. Such conditions include tumors of the eye, in particular the retina, and preferably the cells or cell types that form them. An example of such a tumor is the retinoblastoma. This application is based on the consideration that tumors, which generally show strong growth, have a comparatively high oxygen requirement. In the broadest sense, neuroglobin is no longer or only present to a reduced extent in order to guarantee or mediate the oxygen supply, in particular the transition from the blood vessels supplying the retina with the actual cells or within the cells, the further growth of the tumor are thereby reduced or suppressed. The tumor may also regress under these circumstances or may even be completely broken down. As used herein, the term tumor refers to both benign and malignant tumors and tumor-like diseases.

Der zweite Aspekt der erfindungsgemäßen Verwendung von Neuroglobin gründet sich auf der Überlegung, dass im Bereich der metabolisch aktiven Retinazellen, in denen durch die Lichteinwirkung Sauerstoffradikale bzw. Sauerstoffperoxide gebildet werden, die bekanntermaßen auf biologische Systeme eine in der Regel schädigende Wirkung entfalten, durch Neuroglobin als Schutzprotein die lichtinduzierte Schadwirkung, insbesondere durch Sauerstoffradikale bzw. Sauerstoffperoxide auf die Zellen der Retina begrenzt werden kann. Unter diesem Aspekt kann Neuroglobin, oder die verschiedenen, die Expression beeinflussenden, insbesondere die Expression von Neuroglobin verstärkenden Mittel dazu verwendet werden, die Wirkung der Sauerstoffradikale bzw. Sauerstoffperoxide in der Retina und gegebenenfalls den sie weiter umgebenden Geweben bzw. Zellen einzudämmen oder zu verhindern. Auch im Rahmen dieses Aspekts besteht die Möglichkeit durch Verwendung geeigneter diagnostischer Mittel im Vorfeld zu überprüfen, inwieweit eine Retina und damit eine Person oder auch ein Tier vorteilhafterweise in der Weise behandelt werden soll, um die Schutzwirkung des Neuroglobins zu erhöhen bzw. zu begründen oder die Wirkung der Sauerstoffradikale bzw. Sauerstoffperoxide in den besagten Zellen bzw. Geweben zu verringern. Im Stand der Technik ist beispielsweise bekannt, dass unter dem Einfluß von Sauerstoffradikalen langfristig Krankheitsbilder wie Uveitis begründet werden können, so dass die Expression von Neuroglobin, wie hierin beschrieben, ein geeignetes Mittel darstellt, um Uveitis zu verhindern, zu behandeln, zu diagnostizieren oder Vorstufen bzw. Veranlagungen einer Person oder eines Tieres dazu festzustellen.The second aspect of the use according to the invention of neuroglobin on the consideration that in the area of metabolically active retina cells in which by the exposure to light forms oxygen radicals or oxygen peroxides are known to be usually have a damaging effect on biological systems, due to neuroglobin as protective protein, the light-induced harmful effect, in particular due to oxygen radicals or oxygen peroxides on the cells the retina can be limited. With this in mind, neuroglobin, or the different ones that influence expression, in particular used the expression of neuroglobin enhancing agents the effect of oxygen radicals or oxygen peroxides in the retina and, if applicable, the tissues surrounding it or contain cells or prevent. There is also the possibility within the scope of this aspect Use appropriate diagnostic tools to check in advance to what extent a retina and thus a person or an animal advantageously in the way to be treated to protect the neuroglobin to increase or justify or the effect of oxygen radicals or oxygen peroxides to decrease in said cells or tissues. In the state of Technology is known, for example, that under the influence of oxygen radicals long-term clinical pictures like uveitis can be justified, so that expression of neuroglobin as described herein is a suitable means to prevent and treat uveitis, diagnose or preliminary stages or predispositions of a person or an animal.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist es dabei grundsätzlich möglich, sowohl Neuroglobin als auch die Expression und/oder Aktivität von Neuroglobin beeinflussenden Verbindungen im Sinne der vorliegenden Endung zu verwenden. Dabei ist das Neuroglobin insbesondere dasjenige, welches eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 6 aufweist. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Neuroglobin eine von der in SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 6 dargestellten Sequenz abweichende Aminosäuresequenz aufweist. Eine solchermaßen abweichende Aminosäuresequenz wird solange als Neuroglobin bezeichnet, wie es in einem geeigneten Testsystem die für Neuroglobin typischen Eigenschaften aufweist. Eine derartige Eigenschaft ist die Fähigkeit, Sauerstoff zu speichern. Dabei eignen sich als Testsysteme solche Systeme, die sich die Änderung der Absorptionseigenschaften des Neuroglobins bei Sauerstoffbindung zu Nutze machen, um den Sauerstoffgehalt einer Zelle zu bestimmen. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Neuroglobin eine oder mehrere zusätzliche Aminosäure(n) oder auch eine oder mehrere Deletionen einer oder mehrerer Aminosäuren, insbesondere relativ zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 6, bevorzugter Weise am N-Terminus oder C-Terminus aufweist. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass dem Neuroglobin eine oder mehrere Signal- oder Transportsequenzen hinzugefügt werden, die einen Zellimport bzw -export, oder eine spezifischen Lokalisation in der Zelle hervorrufen (vergl. Nakai, K. and Horton, P., PSORT: a program for detecting the sorting signals of proteins and predicting their subcellular localization, Trends Biochem. Sci, (1999) Vol. 24(1) Seiten 34-35). Weiterhin ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Neuroglobin durch chemische, enzymatische oder andere Methoden durch Phosphorylierung, Sulfatierung, PEGylierung oder Glykosilierung verändert wird. Derartige Neuroglobine werden hierin auch als Neuroglobin-Derivate bezeichnet. Sofern nichts Gegenteiliges angegeben ist, gelten die hierin zu Neuroglobin gemachten Aussagen auch für ein jegliches Neuroglobin-Derivat.Within the scope of the present invention it is fundamental possible, both neuroglobin and the expression and / or activity of neuroglobin influencing compounds in the sense of the present ending use. The neuroglobin is in particular the one that an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 6 has. It is also within the scope of the present Invention that the neuroglobin is one of those in SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 6 sequence shown differing amino acid sequence having. Such a way different amino acid sequence is called neuroglobin as long as it is in a suitable one Test system the for Neuroglobin has typical properties. Such a property is the ability To store oxygen. Such are suitable as test systems Systems that are changing the absorption properties of neuroglobin when oxygen is bound Use to determine the oxygen content of a cell. It is within the scope of the present invention that the neuroglobin one or more additional Amino acids) or also one or more deletions of one or more amino acids, in particular relative to the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 6, preferably at the N-terminus or C-terminus having. It is also within the scope of the present invention that the neuroglobin has one or more signal or transport sequences added be a cell import or export, or a specific Cause localization in the cell (see Nakai, K. and Horton, P., PSORT: a program for detecting the sorting signals of proteins and predicting their subcellular localization, Trends Biochem. Sci, (1999) Vol. 24 (1) pages 34-35). It is also part of the present invention that the neuroglobin by chemical, enzymatic or other methods by phosphorylation, sulfation, PEGylation or glycosylation is changed. Such neuroglobins are also referred to herein as neuroglobin derivatives designated. Unless otherwise stated, the Statements made here regarding neuroglobin also apply to any neuroglobin derivative.

Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine für Neuroglobin oder für ein Neuroglobin-Derivat, wie vorstehend definiert, codierende Nukleinsäure erfindungsgemäß verwendet wird. Dabei handelt es sich typischerweise um eine Nukleinsäure, die die in SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 6 angegebenen Aminosäuresequenzen codiert. Bevorzugter Weise handelt es sich bei der Nukleinsäure um die Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 7 bis 12. Es ist dabei auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass grundsätzlich eine jede mögliche Nukleinsäure verwendet wird, die für die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 bis SEQ ID NO. 6 codiert. Dabei kann der Fachmann im Rahmen seiner Kenntnisse unter Zugrundelegung des genetischen Codes die Aminosäuresequenz in die geeigneten Triplets rückübersetzen. Bevorzugter Weise werden dabei jene Triplets verwendet, die in dem jeweils betrachteten Expressionssystem, bevorzugter Weise einer Zelle, und bevorzugterer Weise einer menschlichen Zelle und bevorzugtester Weise einer menschlichen Retina-Zelle, verwendet werden (engt. 'codon usage'). Eine geeignete Nukleinsäure im Sinne der vorstehenden Erfindung ist dabei auch eine solche Nukleinsäure, die mit der vorstehend beschriebenen Nukleinsäure und insbesondere der Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO. 7 bis SEQ ID NO. 12 hybridisiert. Die Hybridisierungsbedingungen sind dabei solche, die eine spezifische Hybridisierung mit Blick auf die gegebene Länge der jeweiligen Nukleinsäure wie beispielsweise derjenigen gemäß SEQ ID NO. 7 bis SEQ ID NO. 12 gewährleisten und beispielsweise beschrieben sind in Sambrook et al. (Joseph Sambrook, David W. Russell, Joe Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2000). Unter spezifischen Hybridisierungsbedingungen werden dabei insbesondere die folgenden verstanden: Hybridierung 3 × SSC 60°, Waschen 2 × SSC 60°. Schließlich ist eine erfindungsgemäß zu verwendende Nukleinsäure auch eine solche, die ohne die Degeneriertheit des genetischen Codes für eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder für eine Aminosäuresequenz entsprechend dem Neuroglobin oder dem Neuroglobin-Derivat codiert. Bei den erfindungsgemäß verwendeten Neuroglobinen handelt es sich auch um solche, die eine Ähnlichkeit, ausgedrückt in Prozent der in den zu vergleichenden Aminosäuresequenzen identischen Aminosäuren, von mindestens 50%, bevorzugterweise mindestens 70% und bevorzugtererweise mindestens 90% aufweisen. Ganz besonders bevorzugt sind dabei 95%, 96%, 97%, 98% und 99%.It is also within the scope of the present invention that a nucleic acid coding for neuroglobin or for a neuroglobin derivative as defined above is used according to the invention. This is typically a nucleic acid that the in SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 6 given amino acid sequences coded. The nucleic acid is preferably the nucleic acid according to SEQ ID NO. 7 to 12. It is also within the scope of the present invention that basically every possible nucleic acid is used which is suitable for the amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 6 coded. The specialist can use his knowledge on the basis of the genetic codes translate the amino acid sequence back into the appropriate triplets. Those triplets are preferably used which are used in the expression system under consideration, preferably a cell, and more preferably a human cell and most preferably a human retina cell (narrowly 'codon usage'). A suitable nucleic acid in the sense of the above invention is also such a nucleic acid that is compatible with the nucleic acid described above and in particular the nucleic acid according to SEQ ID NO. 7 to SEQ ID NO. 12 hybridizes. The hybridization conditions are those which have a specific hybridization with a view to the given length of the respective nucleic acid, such as, for example, that according to SEQ ID NO. 7 to SEQ ID NO. 12 ensure and are described for example in Sambrook et al. (Joseph Sambrook, David W. Russell, Joe Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2000). Specific hybridization conditions mean in particular the following: hybridization 3 × SSC 60 °, washing 2 × SSC 60 °. Finally, a nucleic acid to be used according to the invention is also one which, without the degeneracy of the genetic code for an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 2 or encoded for an amino acid sequence corresponding to the neuroglobin or the neuroglobin derivative. The neuroglobins used according to the invention are also those which have a similarity, expressed as a percentage of the amino acids identical in the amino acid sequences to be compared, of at least 50%, preferably at least 70% and preferably at least 90%. 95%, 96%, 97%, 98% and 99% are very particularly preferred.

Neben der direkten Verwendung von Neuroglobin oder einer dafür codierenden Nukleinsäure ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Behandlungen oder Diagnose von Erkrankungen der Retina durch ein Mittel erfolgt, welches geeignet ist, die Expression und/oder Aktivität von Neuroglobin oder einer dafür codierenden Nukleinsäure zu modulieren. In Abhängigkeit von den verschiedenen hierin diskutierten Aspekten kann es dabei von Vorteil sein, die Expression und/oder Aktivität des Neuroglobins oder einer dafür codierenden Nukleinsäure zu erhöhen, wie beispielsweise im Zusammenhang mit der Sauerstofftransport- und Sauerstoffspeicherfähigkeit von Neuroglobin, oder auch im Zusammenhang mit der Funktion von Neuroglobin als Schutzprotein (engl. "scavenger") für Sauerstoffradikale bzw. Sauerstoffperoxide diskutiert. In diesen beiden Fällen ist eine Hochregulierung der Expression und/oder Aktivität von Neuroglobin besonders vorteilhaft.In addition to the direct use of Neuroglobin or one for it coding nucleic acid It is also within the scope of the present invention that the treatments or diagnosis of diseases of the retina is made by a means, which is suitable for the expression and / or activity of neuroglobin or one for it coding nucleic acid to modulate. Dependent on from the various aspects discussed herein, it can be advantageous, the expression and / or activity of neuroglobin or one for it coding nucleic acid to increase such as in connection with the oxygen transport and oxygen storage ability of neuroglobin, or in connection with the function of neuroglobin as a protective protein ("scavenger") for oxygen radicals or oxygen peroxides discussed. In both of these cases upregulating the expression and / or activity of neuroglobin particularly advantageous.

Umgekehrt kann, wie hierin bereits dargelegt, auch die Verringerung der Expression und/oder Aktivität von Neuroglobin oder einer dafür codierenden Nukleinsäure möglich und mit Vorteilen verbunden sein, insbesondere bei Erkrankungen, bei denen die Aktivität oder Expression, bevorzugter Weise die gesteigerte Aktivität oder gesteigerte Expression von Neuroglobin oder einer dafür codierenden Nukleinsäure nicht erwünscht ist. Ein derartiger Zustand oder eine derartige Erkrankung kann dabei ein Tumor im Bereich des Auges, insbesondere ein Tumor der Retina sein. Die Wirkung der erfindungsgemäßen Verwendung von Neuroglobin bzw. der dafür codierenden Nukleinsäure beruht dabei auf der Überlegung, dass durch eine Unterdrückung der Sauerstoffversorgung eines schnell wachsenden Tumors dieser in seinem weiteren Wachstum und gegebenenfalls auch in seinem weiteren Existieren gehemmt werden kann. Insoweit kann die Sauerstoffversorgung des Tumors beeinflusst und somit eine Behandlung des Tumors bewirkt werden. Dabei kann die Bestimmung der Aktivität oder der Expression von Neuroglobin oder einer dafür codierenden Nukleinsäure auch als diagnostischer Marker der Erkrankung und zum Darstellen des Fortschritts des Krankheitsverlaufes bzw. Verlauf der Therapie herangezogen werden.Conversely, as already herein also demonstrated the reduction in expression and / or activity of neuroglobin or one for it coding nucleic acid possible and be associated with advantages, especially in the case of diseases, where the activity or expression, preferably the increased activity or increased Expression of neuroglobin or a nucleic acid coding therefor not he wishes is. Such a condition or disease can a tumor in the area of the eye, in particular a tumor of Be retina. The effect of the use of neuroglobin according to the invention or the one for it coding nucleic acid is based on the consideration that through oppression the oxygenation of a rapidly growing tumor in its further growth and possibly also in its further Existing can be inhibited. To this extent, the oxygen supply of the tumor and thus causes treatment of the tumor become. It can determine the activity or expression of neuroglobin or one for it coding nucleic acid also as a diagnostic marker of the disease and for presentation the progress of the course of the disease or course of therapy become.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass neben Neuroglobin oder der dafür codierenden Nukleinsäure, wie hierin beschrieben, auch andere Mittel verwendet werden können, um die von Neuroglobin oder der dafür codierenden Nukleinsäure ausgehenden Wirkungen zu erzeugen oder auch zu unterdrücken. Derartige Mittel können im Rahmen eines sogenannten Screening-Verfahrens ermittelt werden. Dabei wird in einem ersten Schritt eine oder mehrere sogenannte Kandidatenverbindungen bereitgestellt. Kandidatenverbindungen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind dabei solche Verbindungen, deren Eignung in einem Testsystem festgestellt werden soll, Erkrankungen der Retina zu behandeln bzw. als diagnostisches Mittel für die Diagnose von Erkrankungen der Retina herangezogen zu werden. Zeigt die Kandidatenverbindung in dem beschriebenen Testsystem eine entsprechende Wirkung, stellt sie ein entsprechendes, d. h. prinzipiell geeignetes Mittel zur Behandlung von Erkrankungen der Retina oder ein prinzipiell geeignetes diagnostisches Mittel für die Diagnose von Erkrankungen der Retina dar. In einem zweiten Schritt wird sodann die Kandidatenverbindung mit einem Neuroglobin-Expressionssystem oder mit einem Neuroglobin-Aktivitätssystem in Kontakt gebracht. Ein Neuroglobin-Expressionssystem ist dabei ein Expressionssystem, welches die Expression von Neuroglobin zeigt, wobei der Umfang der Expression grundsätzlich veränderbar ist. Ein Neuroglobin-Aktivierungssystem ist dabei im Wesentlichen ein Expressionssystem, wobei hier weniger auf die Expression des Neuroglobins als vielmehr auf dessen Aktivität bzw. dessen Aktivierungszustand abgestellt wird. Konkret wird in diesem Falle festgestellt, ob sich unter dem Einfluss einer Kandidatenverbindung die Aktivität des Neuroglobins oder der für sie codierenden Nukleinsäure verändert. Dabei kann unabhängig vom Vorliegen des jeweiligen konkreten Expressionssystems oder Aktivitätssystem grundsätzlich sowohl eine Verringerung der Expression bzw. Aktivität als auch eine Erhöhung der Expression bzw. Aktivität erfolgen. Typischerweise handelt es sich bei dem Expressionssystem und/oder dem Neuroglobin-Aktivitätssystem um einen in vitro-Ansatz, wie beispielsweise einen Zellextrakt oder ein Fragment eines Zellextraktes wie beispielweise einen Zellkernextrakt. Ein Neuroglobin-Expressionssystem im Sinne der vorliegenden Erfindung kann jedoch auch eine Zelle sein, bevorzugter Weise eine Zelle der Retina und bevorzugterer Weise eine menschliche Retina-Zelle.It is within the scope of the present invention that, in addition to neuroglobin or the nucleic acid coding therefor, as described herein, other means can also be used to produce or suppress the effects emanating from neuroglobin or the nucleic acid coding therefor. Such means can be determined in the context of a so-called screening method. In a first step, one or more so-called candidate connections are made available. In the context of the present invention, candidate compounds are those compounds whose suitability is to be determined in a test system for treating diseases of the retina or to be used as a diagnostic agent for the diagnosis of diseases of the retina. If the candidate compound shows a corresponding effect in the test system described, it represents a corresponding, ie principally suitable agent for the treatment of diseases of the retina or a principally suitable diagnostic agent for the diagnosis of diseases of the retina. In a second step the candidate compound is then used brought into contact with a neuroglobin expression system or with a neuroglobin activity system. A neuroglobin expression system is an expression system which shows the expression of neuroglobin, the extent of the expression being fundamentally changeable. A neuroglobin activation system is essentially an expression system, the focus here being less on the expression of the neuroglobin than on its activity or its activation state. In this case, it is specifically determined whether the activity of the neuroglobin or the nucleic acid coding for it changes under the influence of a candidate compound. Regardless of the presence of the respective specific expression system or activity system, both a reduction in the Ex pression or activity as well as an increase in expression or activity. The expression system and / or the neuroglobin activity system is typically an in vitro approach, such as, for example, a cell extract or a fragment of a cell extract, such as, for example, a cell nucleus extract. However, a neuroglobin expression system in the sense of the present invention can also be a cell, preferably a cell of the retina and more preferably a human retina cell.

Eine Feststellung darüber, inwieweit eine Erhöhung oder Verringerung des Expressionssystems erfolgt, kann dabei auf einer jeden Ebene der Expression festgestellt werden, d. h. beispielsweise durch Zunahme oder Abnahme der Menge der für Neuroglobin codierenden Nukleinsäure, insbesondere der mRNA, oder aber auch des im Expressionssystem unter dem Einfluss der Kandidatenverbindung hergestellten Neuroglobins, d. h. des Neuroglobin-Proteins. Die hierfür erforderlichen Techniken wie beispielsweise ein Verfahren zur Quantifizierung von mRNA sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt und beispielsweise beschrieben in Sambrook et al. (Joseph Sambrook, David W. Russell, Joe Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2000) oder Freeman et al. (Freeman, W.M., Walker, S.J., and Vrana, K.E. Biotechniques Vol. 26, 1999, Seiten 112-122 beschrieben. Des Weiteren sind dem Fachmann auch Verfahren bekannt zur Bestimmung des Gehaltes der Menge von Neuroglobin-Protein, beispielsweise durch Verwendung geeigneter Antikörper. Antikörper können nach den allgemein bekannten und beispielsweise in "Current Protocols in Protein Science" (edited by Coligan, J.E., Dunn, B.M., Ploegh, H.L., Speicher, D.W., and Wingfield, P.T., John Wiley & Sons, Inc., 1995, New York) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Weiterhin ist es möglich, dass im Rahmen des Expressionssystems das hergestellte Neuroglobin eine Markierung trägt, wobei die Markierung beispielsweise ein His₆-Tag (Hochuli, E., Bannwarth, W., Dobeli, H., Gentz, R., and Stuber, D. Bio/Technology Vol. 6, 1988, Seiten 1321-1325), ein Biotin-Tag (Pound, J.D. (ed.) Immunochemical Protocols, Second Edition. Methods in Molecular Biology, Vol 80. Humana Press Inc. Totowa, N.J. 1998, Kapitel 17), ein Digoxigenin-Tag (McCreery, T., Mol Biotechnol. April 1997, Vol. 7, Nummer 2, Seiten 121-124) oder ein Fluoreszenzfarbstoff (Hardy, R.R., In: Handbook of Experimental Immunology, 4th edition (D.M. Weir, L.A. Herzenberg, C. Blackwell, and L.A. Herzenberg, editors) Blackwell Scientific Publications, Boston, 1986, Kapitel 31) sein kann. Der Nachweis einer Aktivitätssteigerung des Neuroglobins erfolgt je nach System entsprechend über die Verwendung spezifischer Antikörper bzw. über den verstärkte Fluoreszenz.A determination of the extent to which the expression system is increased or decreased can be determined at each level of expression, that is to say, for example, by increasing or decreasing the amount of the nucleic acid coding for neuroglobin, in particular the mRNA, or else that in the expression system under the Influence of the candidate compound produced neuroglobin, ie the neuroglobin protein. The techniques required for this, such as a method for quantifying mRNA, are known to the person skilled in the art and are described, for example, in Sambrook et al. (Joseph Sambrook, David W. Russell, Joe Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2000) or Freeman et al. (Freeman, WM, Walker, SJ, and Vrana, KE Biotechniques Vol. 26, 1999, pages 112-122. Furthermore, methods are known to the person skilled in the art for determining the content of the amount of neuroglobin protein, for example by using suitable antibodies Antibodies can be obtained according to the generally known and, for example, "Current Protocols in Protein Science" (edited by Coligan, JE, Dunn, BM, Ploegh, HL, Speicher, DW, and Wingfield, PT, John Wiley & Sons, Inc., 1995 , New York) It is also possible for the neuroglobin produced to bear a label in the context of the expression system, the label being, for example, a His ₆ tag (Hochuli, E., Bannwarth, W., Dobeli, H. , Gentz, R., and Stuber, D. Bio / Technology Vol. 6, 1988, pages 1321-1325), a biotin tag (Pound, JD (ed.) Immunochemical Protocols, Second Edition. Methods in Molecular Biology, Vol 80. Humana Press Inc. Totowa, NJ 1998, Chapter 17), a digoxige nin-day (McCreery, T., Mol Biotechnol. April 1997, vol. 7, number 2, pages 121-124) or a fluorescent dye (Hardy, RR, In: Handbook of Experimental Immunology, 4th edition (DM Weir, LA Herzenberg, C. Blackwell, and LA Herzenberg, editors) Blackwell Scientific Publications, Boston, 1986, Chapter 31). Depending on the system, an increase in the activity of the neuroglobin can be demonstrated by using specific antibodies or by increasing fluorescence.

Im Falle des Neuroglobin-Aktivitätssystems wird dabei die Erhöhung der Aktivität oder Verringerung der Aktivtät von Neuroglobin typischerweise in einem funktionalen Assay getestet oder in anderen geeigneten Testsystemen, beispielsweise durch Messen des Sauerstoffpartialdruckes im Außenmedium.In the case of the neuroglobin activity system is the increase of activity or decrease in activity of neuroglobin typically tested in a functional assay or in other suitable test systems, for example by measuring the oxygen partial pressure in the external medium.

Das in Kontakt bringen von Kandidatenverbindungen und Neuroglobin-Expressionssystem oder -Aktivitätssystem erfolgt dabei in der Regel durch Zugeben einer bevorzugter Weise wässrigen Lösung der Kandidatenverbindung zu dem entsprechenden Reaktionssystem, d. h. dem Expressionssystem oder dem Aktivitätssystem, die hierin auch allgemein als Testsysteme bezeichnet werden. Die wässrige Lösung kann dabei bevorzugter Weise eine Pufferlösung sein.Contacting candidate associations and neuroglobin expression system or activity system takes place in the Usually by adding a preferred aqueous solution of the candidate compound to the corresponding reaction system, d. H. the expression system or the activity system, which are also generally referred to herein as test systems. The aqueous solution can preferably be a buffer solution.

Die Verwendung von Kandidatenverbindungen erfolgt dabei in der Regel in der Form, dass in einem Test jeweils nur eine einzelne Kandidatenverbindung in dem entsprechenden Testsystem erfolgen. Dabei ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass entsprechende Tests parallel und in einem Hochdurchsatzverfahren (engt. high through-put system) durchgeführt werden. In dem letzten Schritt des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens, bestehend in dem Bestimmen, ob unter dem Einfluss der Kandidatenverbindung die Expression bzw. Aktivität des Neuroglobins oder einer codierenden Nukleinsäure verändert wird, erfolgt in der Regel durch Vergleich des Verhaltens des Testsystems ohne Zusatz der Kandidatenverbindung. Bevorzugter Weise wird die Kandidatenverbindung in einer Verbindungsbibliothek enthalten sein. Als Verbindungsbibliothek ist dabei grundsätzlich eine jede Verbindungsbibliothek unabhängig von der Verbindungsklasse denkbar. Geeignete Verbindungsbibliotheken sind beispielsweise Bibliotheken kleiner Moleküle. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass andere Verbindungsklassen als kleine Moleküle verwendet werden, wie beispielsweise Peptide, Proteine, Antikörper, Anticaline und funktionale Nukleinsäuren.The use of candidate connections usually takes the form of one test at a time only a single candidate compound in the corresponding test system respectively. It is also within the scope of the present invention that corresponding tests in parallel and in a high-throughput process (narrow.high through-put system). In the last one Step of the screening method according to the invention, consisting in determining whether, under the influence of the candidate association Expression or activity the neuroglobin or a coding nucleic acid is changed in the Usually by comparing the behavior of the test system without addition the candidate association. The candidate connection is preferred be included in a compound library. As a connection library is fundamental each connection library regardless of the connection class conceivable. Suitable connection libraries are, for example, libraries small molecules. However, it is also within the scope of the present invention that others Classes of compounds can be used as small molecules, such as Peptides, proteins, antibodies, Anticalins and functional nucleic acids.

Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass Neuroglobin bzw. die dafür codierende Nukleinsäure als Zielmolekül (engl. ,target') für die Erzeugung der vorstehend genannten Verbindungsklassen wie insbesondere Peptide, Proteine, Antikörper, Anticaline und funktionale Nukleinsäuren verwendet werden. Die entsprechenden Verbindungen, d. h. Peptide, Proteine, Antikörper, Anticaline und funktionale Nukleinsäuren können sodann in dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren verwendet werden.It is within the scope of the present Invention that neuroglobin or the nucleic acid coding therefor as target molecule (English, target ') for the Generation of the above-mentioned connection classes, such as in particular Peptides, proteins, antibodies, Anticalins and functional nucleic acids can be used. The corresponding Connections, d. H. Peptides, proteins, antibodies, anticalins and functional Nucleic acids can then in the screening method according to the invention be used.

Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass jene Verbindungen, d. h. Peptide, Proteine, Antikörper, Anticaline und funktionale Nukleinsäuren, die gegen Neuroglobin bzw. die dafür codierende Nukleinsäure(n) erzeugt werden, als Mittel im Sinne der vorliegenden Erfindung verwendet werden, d. h. als Mittel für die Therapie bzw. Herstellung einer Therapeutikums für die Behandlung von Erkrankungen der Retina bzw. als entsprechende diagnostische Mittel.It is still within the scope of the present Invention that those compounds, i.e. H. Peptides, proteins, antibodies, anticalins and functional nucleic acids, which generates against neuroglobin or the nucleic acid (s) coding for it are used as agents in the sense of the present invention become, d. H. as a means for the therapy or production of a therapeutic agent for the treatment of diseases of the retina or as corresponding diagnostic Medium.

Peptide im Sinne der vorliegenden Erfindung sind dabei bevorzugter Weise solche Proteine und Peptide, die an Neuroglobin oder die Wechselwirkungspartner, insbesondere die natürlichen Wechselwirkungspartner, von Neuroglobin, bevorzugter Weise in biologischen Systemen, insbesondere in der Retina und der sie aufbauenden Zellen, binden. Gleiches gilt auch für die hierin im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen Verwendung beschriebenen Antikörper, Antikaline, funktionale Nukleinsäuren und kleine Moleküle. Grundsätzlich kann ein jedes Mitglied der vorstehend genannten Verbindungsklassen bevorzugter Weise mit dem Neuroglobin oder einer dafür codierenden Nukleinsäure in Wechselwirkung treten und somit die entsprechende Aktivität des Neuroglobin oder der dazu codierenden Nukleinsäure beeinflussen.Peptides within the meaning of the present invention are preferably those proteins and peptides which are linked to neuroglobin or the interaction partners, in particular the natural interaction partners, of neuroglobin, preferably in biological systems, in particular in the retina and binding cells. The same also applies to the antibodies, anticalins, functional nucleic acids and small molecules described herein in connection with the use according to the invention. In principle, each member of the abovementioned classes of compounds can preferably interact with the neuroglobin or a nucleic acid coding therefor and thus influence the corresponding activity of the neuroglobin or the nucleic acid coding therefor.

Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Endung, derartige Mitglieder zu erzeugen bzw. zu verwenden bzw. einem entsprechenden Screening-Verfahren zu unterziehen, die mit dem Wechselwirkungspartner, insbesondere dem natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin, oder einer dafür codierenden Nukleinsäure, in Wechselwirkung treten und die Expression bzw. Aktivität des Wechselwirkungspartners oder der dafür codierenden Nukleinsäure beeinflussen. Auch hier bezeichnet der Begriff „beeinflussen" entweder Erhöhung oder Verringerung der Expression, des Expressionsumfangs oder der Aktivität, wie hierin allgemein offenbart. Infolge der Wechselwirkung der besagten Mitglieder mit den Wechselwirkungspartnern von Neuroglobin bzw. der dafür codierenden Nukleinsäure wird somit die an Neuroglobin gekoppelte Kaskade unterbrochen, so dass die natürlicherweise beobachtete Wirkung von Neuroglobin bzw. der von ihr codierten Nukleinsäure unterbrochen wird, was im Rahmen der hierin offenbarten Therapie bzw. Diagnose von Erkrankungen der Retina verwendet werden kann. Wird beispielsweise ein Wechselwirkungspartner von Neuroglobin blockiert, kann dies zu einer Verringerung der Sauerstoffzufuhr in einem Tumorgewebe der Retina führen und insoweit ein geeignetes Mittel für die Behandlung dieser Tumore darstellen.However, it is also part of the present extension to create or use such members or to undergo a corresponding screening process, the with the interaction partner, especially the natural one Interaction partner of neuroglobin, or a nucleic acid coding therefor, in Interaction occur and the expression or activity of the interaction partner or the one for it coding nucleic acid influence. Here too, the term "influence" denotes either increase or Decrease expression, level of expression, or activity as herein generally disclosed. As a result of the interaction of said members with the interaction partners of neuroglobin or the coding for it nucleic acid the cascade coupled to neuroglobin is thus interrupted, so that the naturally observed effect of neuroglobin or the nucleic acid encoded by it interrupted becomes what is within the scope of the therapy or diagnosis disclosed herein of diseases of the retina can be used. For example an interaction partner blocking neuroglobin can do this to a decrease in the oxygen supply in a tumor tissue the retina and in so far a suitable agent for the treatment of these tumors represent.

Diese Peptide, im folgenden hierin auch als bindende Peptide oder Proteine bezeichnet, können mit im Stand der Technik bekannten Verfahren, wie beispielsweise phage-display gescreent bzw. hergestellt werden. Die Techniken sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Dabei wird bei der Erzeugung derartiger Peptide typischerweise so vorgegangen, dass eine Peptid-Bibliothek angelegt wird, beispielsweise in Form von Phagen, und diese Bibliothek in Kontakt gebracht wird mit einem Zielmolekül, im vorliegenden Falle beispielsweise mit dem Neuroglobin oder dem natürlichen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin. Die bindenden Peptide werden sodann typischerweise als Komplex zusammen mit dem Zielmolekül von den nicht bindenden Mitgliedern der Bibliothek entfernt. Es ist dabei im Rahmen der Kenntnisse der Fachleute auf diesem Gebiet, dass die Bindungseigenschaften zumindest bis zu einem bestimmten Umfang von den jeweils konkret vorliegenden Versuchsbedingungen, wie beispielsweise Salzgehalt und dergleichen, abhängen. Nach Abtrennen der mit einer höheren oder stärkeren Affinität an das Zielmolekül bindenden Peptide von den nicht-bindenden Mitgliedern der Bibliothek bzw. vom Zielmolekül, im vorliegenden Fall vom Neuroglobin, können diese sodann charakterisiert werden. Ggf. ist vor der Charakterisierung ein Amplifikationsschritt, beispielsweise durch Vermehrung der entsprechenden, das Peptid bzw. die Peptide oder Proteine) codierenden Phagen erforderlich. Die Charakterisierung umfasst bevorzugter Weise die Sequenzierung der an Neuroglobin oder seinen natürlichen Wechselwirkungspartner, je nachdem, welches der beiden Moleküle als Zielmolekül in dem phage-display Screening-Verfahren eingesetzt wurde, bindenden Peptide. Die Peptide sind dabei hinsichtlich ihrer Länge grundsätzlich nicht beschränkt. Typischerweise werden in derartigen Verfahren jedoch Peptide mit einer Länge von 8 – 20 Aminosäuren erhalten bzw. verwendet. Die Größe der Bibliotheken beträgt 10² – 10¹⁸, bevorzugter Weise 10⁸ – 10¹⁵ verschiedene Peptide. Eine spezielle Form von an Zielmolekülen bindenden Polypeptiden stellen die Anticaline dar, wie sie beispielsweise in der deutschen Patentanmeldung DE 197 42 706 beschrieben sind.These peptides, hereinafter also referred to as binding peptides or proteins, can be screened or produced using methods known in the art, such as phage display. The techniques are known to those skilled in the art. The process for generating such peptides is typically such that a peptide library is created, for example in the form of phages, and this library is brought into contact with a target molecule, in the present case for example with the neuroglobin or the natural interaction partner of neuroglobin. The binding peptides are then typically removed as a complex together with the target molecule from the non-binding members of the library. It is within the knowledge of the experts in this field that the binding properties depend at least to a certain extent on the specific test conditions, such as salinity and the like. After the peptides binding to the target molecule with a higher or stronger affinity have been separated from the non-binding members of the library or from the target molecule, in the present case from the neuroglobin, these can then be characterized. Possibly. an amplification step is required before the characterization, for example by increasing the corresponding phages encoding the peptide or peptides or proteins). The characterization preferably comprises the sequencing of the peptides binding to neuroglobin or its natural interaction partner, depending on which of the two molecules was used as the target molecule in the phage display screening method. The length of the peptides is basically not limited. Typically, however, peptides with a length of 8-20 amino acids are obtained or used in such methods. The size of the libraries is 10 ² - 10 ¹⁸ , preferably 10 ⁸ - 10 ¹⁵ different peptides. A special form of polypeptides that bind to target molecules are the anticalins, as described, for example, in the German patent application DE 197 42 706 are described.

Bei der Verwendung von Neuroglobin, der dafür codierenden Nukleinsäure, des oder der Neuroglobin-Wechselwirkungspartner, insbesondere der natürlichen Wechselwirkungspartner, und/oder der für diese codierende(n) Nukleinsäure(n) als Zielmolekül für die Herstellung bzw. Entwicklung eines Medikaments für die Behandlung von Erkrankungen der Retina, ebenso wie bei der Herstellung und/oder der Entwicklung von Mitteln für die Diagnose von Erkrankungen der Retina, können auch Bibliotheken kleiner Moleküle verwendet werden. Auch dabei wird das Zielmolekül mit einer Bibliothek in Kontakt gebracht und jene Mitglieder der Bibliothek, die daran binden, ermittelt, ggf. von den anderen Mitgliedern der Bibliothek bzw. vom Target abgetrennt und optional weiter charakterisiert. Auch hier wird die Charakterisierung des kleinen Moleküls nach den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannten Verfahrensweisen erfolgen, so z. B. die Verbindung identifiziert und die Molekularstruktur bestimmt werden. Diese Bibliotheken umfassen dabei so wenig wie zwei und soviel wie bis zu mehreren hunderttausend Mitglieder.When using neuroglobin, the one for it coding nucleic acid, the neuroglobin interaction partner (s), in particular the natural Interaction partner, and / or the nucleic acid (s) coding for them as target molecule for the Manufacture or development of a medication for the treatment of diseases the retina, as well as in the manufacture and / or development of funds for the diagnosis of diseases of the retina, libraries can also be smaller molecules be used. The target molecule also comes into contact with a library brought and identified those members of the library who bind to it, possibly from the other members of the library or from the target separated and optionally further characterized. Here, too Characterization of the small molecule according to the experts Known procedures take place in this area, such. B. the Compound identified and the molecular structure determined. These libraries include as little as two and as much as up to several hundred thousand members.

Eine weitere Verbindungsklasse, die im Rahmen des erfindungsgemäßen Screening-Verfahrens ebenso wie bei der Herstellung von Medikamenten verwendet werden können, sind funktionale Nukleinsäuren. Unter funktionalen Nukleinsäuren sollen hierin insbesondere Aptamere, Aptazyme, Ribozyme, Spiegelmere, Antisense-Oligonukleotide und RNAi verstanden werden.Another class of compound, the likewise in the context of the screening method according to the invention as can be used in the manufacture of medicines functional nucleic acids. Under functional nucleic acids In particular, aptamers, aptazymes, ribozymes, Spiegelmers, antisense oligonucleotides and RNAi can be understood.

Aptamere sind D-Nukleinsäuren, entweder einzelsträngig oder doppelsträngig, auf RNA- oder DNA-Basis, die spezifisch an ein Zielmolekül binden. Die Herstellung von Aptameren ist bspw. beschrieben im Europäischen Patent EP 0 533 838 . Dabei wird wie folgt vorgegangen:
Eine Mischung aus Nukleinsäuren, d. h. potentiellen Aptameren, wird bereitgestellt, wobei eine jede Nukleinsäure aus einem Segment aus wenigstens acht aufeinanderfolgenden, randomisierten Nukleotiden besteht und diese Mischung mit dem Target, im vorliegenden Falle somit mit Neuropeptid, dafür codierender/codierenden Nukleinsäure(n), Neuroglobin-Wechselwirkungspartnern, insbesondere den natürlichen Wechselwirkungspartnern, und/oder für sie codierender) Nukleinsäure(n) in Kontakt gebracht wird, wobei Nukleinsäuren, die an das Target binden, ggf. auf der Grundlage einer erhöhten Affinität, verglichen mit der Affinität der Kandidatenmischung, vom Rest der Kandidatenmischung abgetrennt werden und die solchermaßen erhaltenen an das Target bindenden Nukleinsäuren amplifiziert werden. Diese Schritte werden mehrfach wiederholt, so dass am Ende des Verfahrens spezifisch an das jeweilige Target oder Zielmolekül bindende Nukleinsäuren, eben die sogenannten Aptamere, erhalten werden. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass diese Aptamere stabilisiert werden können, bspw. durch Einführung bestimmter chemischer Gruppen, wie den Fachleuten auf dem Gebiet der Aptamer-Entwicklung bekannt. Aptamere werden derzeit bereits therapeutisch eingesetzt. Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die solchermaßen hergestellten Aptamere für die Targetvalidierung und als Leitsubstanzen für die Entwicklung von Medikamenten, insbesondere von kleinen Molekülen, verwendet werden.Aptamers are D-nucleic acids, either single-stranded or double-stranded, based on RNA or DNA that specifically bind to a target molecule. The production of aptamers is described, for example, in the European patent EP 0 533 838 , The procedure is as follows:
A mixture of nucleic acids, ie potential aptamers, is provided, each nucleic acid consisting of a segment of at least eight consecutive, randomized nucleotides and this mixture is brought into contact with the target, in the present case thus with neuropeptide, nucleic acid (s) coding / coding therefor, neuroglobin interaction partners, in particular the natural interaction partners, and / or nucleic acid (s) coding for them, nucleic acids which bind to the target, if necessary on the basis of an increased affinity compared to the affinity of the candidate mixture, are separated from the rest of the candidate mixture and the nucleic acids obtained in this way which bind to the target are amplified. These steps are repeated several times, so that at the end of the method, nucleic acids specifically binding to the respective target or target molecule, namely the so-called aptamers, are obtained. It is within the scope of the present invention that these aptamers can be stabilized, for example by introducing certain chemical groups, as is known to those skilled in the field of aptamer development. Aptamers are currently used therapeutically. It is also within the scope of the present invention that the aptamers thus produced are used for target validation and as lead substances for the development of medicaments, in particular of small molecules.

Auf einem grundsätzlich ähnlichen Prinzip beruht die Herstellung oder Erzeugung von Spiegelmeren, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung auf der Grundlage des Neuroglobin-Proteins, der dafür codierenden Nukleinsäure(n), der Neuroglobin-Wechselwirkungspartner, insbesondere der natürlichen Wechselwirkungspartner, und/oder der für sie codierenden Nukleinsäure(n) als Zielmolekül entwickelt werden können. Die Herstellung von Spiegelmeren ist bspw. beschrieben in der internationalen Patentanmeldung WO 98/08856. Spiegelmere sind L-Nukleinsäuren, d.h. bestehen aus L-Nukleotiden, und zeichnen sich im wesentlichen dadurch aus, dass sie in biologischen Systemen eine sehr hohe Stabilität aufweisen und gleichzeitig, vergleichbar den Aptameren, mit einem Zielmolekül spezifisch wechselwirken bzw. an dieses binden können. Bei der Herstellung der Spiegelmere wird dabei so vorgegangen, dass eine heterogene Population aus D-Nukleinsäuren erzeugt wird, die Population mit dem optischen Antipoden des Zielmoleküls in Kontakt gebracht wird, im vorliegenden Falle somit beispielsweise mit dem D-Enantiomer des natürlicher Weise auftretenden L-Enantiomers von Neuroglobin, sodann jene D-Nukleinsäuren abgetrennt werden, die nicht mit dem optischen Antipode des Zielmoleküls in Wechselwirkung getreten sind, die D-Nukleinsäuren, die mit der optischen Antipode des Zielmoleküls in Wechselwirkung getreten sind, bestimmt, ggf. abgetrennt und sequenziert werden und anschließend L-Nukleinsäuren synthetisiert werden, die in ihrer Sequenz mit derjenigen zuvor für die D-Nukleinsäuren ermittelten Sequenzen identisch sind. Ähnlich dem Verfahren zur Herstellung von Aptameren ist es auch hier möglich, durch mehrfaches Wiederholen der Schritte geeignete Nukleinsäuren, d.h. Spiegelmere anzureichern bzw. zu erzeugen, die das Neuroglobin-Protein, einen oder mehreren seiner insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner, je nachdem, welche der vorstehend genannten Verbindungen als Zielmolekül eingesetzt wird, oder einer dafür codierenden Nukleinsäure binden.The is based on a fundamentally similar principle Manufacture or production of Spiegelmeren within the scope of the present Invention based on the neuroglobin protein, the coding for it Nucleic acid (s), the neuroglobin interaction partner, especially natural ones Interaction partner, and / or the nucleic acid (s) coding for them as target molecule can be developed. The production of Spiegelmeren is described, for example, in the international Patent application WO 98/08856. Spiegelmers are L-nucleic acids, i.e. consist of L-nucleotides, and are essentially characterized by it that they have a very high stability in biological systems and at the same time, comparable to the aptamers, specific to a target molecule interact or bind to it. When producing the Spiegelmere is used in such a way that a heterogeneous population from D-nucleic acids is generated, the population is in contact with the optical antipode of the target molecule brought in the present case, for example with the D enantiomer of the natural Wise occurring L-enantiomer of neuroglobin, then those D-nucleic acids separated that do not interact with the optical antipode of the target molecule the D nucleic acids, which interact with the optical antipode of the target molecule are determined, optionally separated and sequenced and then synthesized L-nucleic acids be determined in their sequence with that previously for the D-nucleic acids Sequences are identical. Similar The process for the production of aptamers is also possible here repeating the steps of suitable nucleic acids several times, i.e. Enrich or generate Spiegelmers that contain the neuroglobin protein, one or more of its particularly natural interaction partners, depending on which of the above compounds is used as the target molecule or one for it coding nucleic acid tie.

Eine weitere Form der funktionalen Nukleinsäure, die erfindungsgemäß verwendet werden können, sind sogenannte Aptazmye. Aptazyme sind beispielsweise beschrieben von Piganeau, N. et al. (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, Nr. 29, Seiten 4369-4373. Dabei handelt es sich um eine spezifische Form von Aptameren, die sich dadurch auszeichnen, dass sie neben dem Aptameranteil, der spezifisch an das Zielmolekül, im vorliegenden Falle das Neuroglobin oder einen Wechselwirkungspartner davon, bindet, kann noch einen Ribozymanteil enthalten mit der Folge, dass nach Bindung des Zielmoleküls des Aptameranteils des Aptazyms der Ribozymanteil aktiviert wird und es infolge dessen zu einer Spaltung einer als Substrat des Ribozymanteils des Aptazyms fungierenden Nukleinsäure kommt. Bei entsprechender Gestaltung des Ribozymsubstrates kann dabei beispielsweise eine Änderung der Fluoreszenz infolge einer Änderung der räumlichen Anordnung eines Fluoreszenzdonors relativ zu einem Fluoreszenzakzeptor auf dem Ribozymsubstrat beobachtet werden. Aptazyme eignen sich insoweit insbesondere für die Anwendung im Rahmen einer Targetvalidierung betreffend Neuroglobin und seiner Wechselwirkungspartner sowie als diagnostisches Mittel im Sinne der vorliegenden Erfindung.Another form of functional Nucleic acid, which used according to the invention can be so-called Aptazmye. Aptazyme are described for example by Piganeau, N. et al. (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, No. 29, pages 4369 to 4373. It is a specific form of aptamers that are characterized by the fact that in addition to the aptamer fraction, the specific to the target molecule, in the present case the neuroglobin or an interaction partner of which, binds, may still contain a ribozyme component, with the result that that after binding the target molecule of the aptamer portion of the aptazyme the ribozyme portion is activated and as a result, cleavage as a substrate of the ribozyme portion of the aptazyme acting nucleic acid comes. With appropriate The design of the ribozyme substrate can be a change, for example the fluorescence due to a change the spatial Arrangement of a fluorescence donor relative to a fluorescence acceptor can be observed on the ribozyme substrate. Aptazyme are suitable to that extent in particular for the application in the context of a target validation regarding neuroglobin and its interaction partners as well as a diagnostic tool in the sense of the present invention.

Den vorstehend genannten Verbindungsklassen ist dabei gemein, dass sie im Wesentlichen an das jeweilige Protein, d. h. das Neuroglobin oder den Wechselwirkungspartner davon binden, es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die diese Verbindungsklassen und insbesondere die funktionalen Nukleinsäuren als Targetmolekül die für die vorstehend genannten Proteine codierenden Nukleinsäuren zum Gegenstand haben.The connection classes mentioned above what is common is that they essentially depend on the respective protein, d. H. bind the neuroglobin or its interaction partner, however, it is also within the scope of the present invention that the these classes of compounds and in particular the functional nucleic acids as target molecule the for the above-mentioned proteins encoding nucleic acids for Have subject.

Eine weitere Klasse von Verbindungen, die unter Verwendung von Neuroglobin und/oder eines Wechselwirkungspartners davon bzw. der für diese codierenden Nukleinsäuren hergestellt bzw. entwickelt werden können, sind Ribozyme, Antisense-Oligonukleotide und RNAi.Another class of connections, that using neuroglobin and / or an interaction partner of which or for these coding nucleic acids Ribozymes, antisense oligonucleotides can be produced or developed and RNAi.

All diesen Klassen ist dabei gemein, dass sie nicht auf der Ebene des Translationsproduktes, d.h. auf der Ebene der Proteine (Neuroglobin-Proteine und Wechselwirkungspartner davon) ihre Wirkung entfalten, sondern auf der Ebene der für das jeweilige Protein codierenden Nukleinsäure(n), insbesondere der für Neuroglobin codierenden mRNA bzw. der mRNA, die für einen Wechselwirkungspartner von Neuroglobin codiert.All these classes have in common that they are not at the level of the translation product, i.e. on the Level of proteins (neuroglobin proteins and interaction partners of which) develop their effect, but at the level of that for the respective Protein encoding nucleic acid (s), especially for Neuroglobin encoding mRNA or the mRNA that is responsible for a Interaction partner encoded by neuroglobin.

Bei Ribozymen handelt es sich um katalytisch aktive Nukleinsäuren, die bevorzugter Weise aus RNA aufgebaut sind und aus zwei Teilbereichen bestehen. Der erste Teilbereich ist für eine katalytische Aktivität verantwortlich, wohingegen der zweite Teil für eine spezifische Wechselwirkung mit einer Ziel-Nukleinsäure verantwortlich ist. Kommt es zur Ausbildung einer Wechselwirkung zwischen der Ziel-Nukleinsäure und dem zweiten Teil des Ribozyms, typischer Weise durch Hybridisierung von zueinander im wesentlichen komplementären Basenbereichen, kann der katalytische Teil des Ribozyms entweder intramolekular oder intermolekular, wobei letzteres bevorzugt ist, die Ziel-Nukleinsäure hydrolysieren für den Fall, dass die katalytische Wirkung des Ribozyms eine Phosphodiesterase-Aktivität ist. In der Folge kommt es zu einem – ggf. weiteren – Abbau der codierenden Nukleinsäure, wobei der Titer des Zielmoleküls sowohl auf der Nukleinsäure- als auch der Proteinebene sowohl intrazellulär als auch extrazellulär verringert werden kann und somit eine therapeutischer Ansatz bei den Erkrankungen der Retina bereitgestellt wird. Ribozyme, deren Verwendung sowie Konstruktionsprinzipien sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und bspw. beschrieben in Doherty und Doudna (Ribozyme structures and mechanisms. Annu Rev Biophys Biomol Struct 2001; 30:457-75) und Lewin und Hauswirth (Ribozyme gene therapy: applications for molecular medicine. Trends Mol Med 2001, 7:221-8).Ribozymes are catalytically active nucleic acids, which are preferably made up of RNA and consist of two parts. The first section is for catalytic activity responsible, whereas the second part is responsible for a specific interaction with a target nucleic acid. If there is an interaction between the target nucleic acid and the second part of the ribozyme, typically by hybridization of base regions that are essentially complementary to one another, the catalytic part of the ribozyme can hydrolyze the target nucleic acid either intramolecularly or intermolecularly, the latter being preferred in the event that the catalytic action of the ribozyme is a phosphodiesterase activity. As a result, the coding nucleic acid is degraded, if necessary further, the titer of the target molecule being able to be reduced both intracellularly and extracellularly both at the nucleic acid and the protein level, thus providing a therapeutic approach for the diseases of the retina becomes. Ribozymes, their use and construction principles are known to those skilled in the art and are described, for example, in Doherty and Doudna (Ribozyme structures and mechanisms. Annu Rev Biophys Biomol Struct 2001; 30: 457-75) and Lewin and Hauswirth (Ribozyme gene therapy: applications for molecular medicine. Trends Mol Med 2001, 7: 221-8).

Auf einem grundsätzlich ähnlichen Wirkmechanismus beruht die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden zur Herstellung eines Medikamentes bzw. diagnostischen Mittels im Sinne der vorliegenden Erfindung. Antisense-Oligonukleotide hybridisieren infolge Basenkomplementarität typischerweise mit einer Ziel-RNA, normaler Weise mit mRNA und aktivieren dadurch RNAaseH. RNAaseH wird sowohl durch Phosphodiester als auch Phosphorothioat-gekoppelte DNA aktiviert. Phosphodieester-gekoppelte DNA wird jedoch schnell durch zelluläre Nukleasen mit Ausnahme von Phosphorothioat-gekoppelter DNA abgebaut. Diese resistenten, nicht-natürlicher Weise auftretende DNA-Derivate inhibieren RNAaseH nicht, wenn sie mit RNA hybridisiert sind. Mit anderen Worten, Antisense-Polynukleotide sind nur als DNA-RNA-Hybridkomplex wirksam. Beispiele für derartige Antisense-Oligonukleotide finden sich, u.a. in US-Patent US 5,849,902 oder US 5,989,912 . Prinzipiell besteht das wesentliche Konzept der Antisense-Oligonukleotide darin, gegen bestimmte RNA eine komplementäre Nukleinsäure bereitzustellen. Mit anderen Worten, ausgehend von der Kenntnis der Nukleinsäuresequenz des Neuroglobin-Proteins bzw. seines oder seiner Wechselwirkungspartner, insbesondere der jeweiligen mRNA, können durch Basenkomplementarität geeignete Antisense-Oligonukleotide hergestellt werden, die zu einem Abbau der codierenden Nukleinsäure, insbesondere der mRNA, führen. Dieser Abbau kann sodann in einem Expressions- oder Aktivitässystem qualitativ oder quantitativ erfasst werden.The use of antisense oligonucleotides for the production of a medicament or diagnostic agent in the sense of the present invention is based on a basically similar mechanism of action. Antisense oligonucleotides typically hybridize to a target RNA, usually mRNA, due to base complementarity, thereby activating RNAaseH. RNAaseH is activated by both phosphodiester and phosphorothioate-coupled DNA. However, phosphodieester-linked DNA is rapidly degraded by cellular nucleases with the exception of phosphorothioate-linked DNA. These resistant, non-naturally occurring DNA derivatives do not inhibit RNAaseH when hybridized to RNA. In other words, antisense polynucleotides are only effective as a DNA-RNA hybrid complex. Examples of such antisense oligonucleotides can be found, inter alia, in US patent US 5,849,902 or US 5,989,912 , In principle, the essential concept of the antisense oligonucleotides is to provide a complementary nucleic acid against certain RNA. In other words, based on the knowledge of the nucleic acid sequence of the neuroglobin protein or its or its interaction partners, in particular the respective mRNA, suitable antisense oligonucleotides can be produced by base complementarity, which lead to a degradation of the coding nucleic acid, in particular the mRNA. This degradation can then be recorded qualitatively or quantitatively in an expression or activity system.

Eine weitere Klasse von Verbindungen, die als Medikament bzw. diagnostisches Mittel im Sinne der vorliegenden Endung verwendet, identifiziert oder hergestellt werden kann, ist die sogenannte RNAi. RNAi ist eine doppelsträngige RNA, die RNA-Interferenz vermittelt und typischerweise eine Länge von etwa 21 bis 23 Nukleotiden aufweist. Dabei entspricht einer der beiden Stränge der RNA einer Sequenz eines abzubauenden Gens. Mit anderen Worten, ausgehend von der Kenntnis der für Neuroglobin und/oder dessen Wechselwirkungspartner codierenden Nukleinsäure(n), insbesondere der mRNA, kann eine doppelsträngige RNA hergestellt werden, wobei einer der beiden RNA-Stränge komplementär zu der besagten, für Neuroglobin und/oder dessen Wechselwirkungspartner codierenden Nukleinsäure(n) ist, bevorzugter Weise zur mRNA, und diese dann zum Abbau der entsprechenden codierenden Nukleinsäure führt und damit einhergehend zu einer Verringerung des Titers der jeweiligen Translationsprodukte, d. h. der Proteine. Die Erzeugung und Verwendung von RNAi als Medikament bzw. diagnostisches Mittel ist bspw. beschrieben in den Internationalen Patentanmeldungen WO 00/44895 und WO 01/75164.Another class of connections, as a medicament or diagnostic agent in the sense of the present Ending can be used, identified or manufactured the so-called RNAi. RNAi is a double-stranded RNA, the RNA interference mediates and typically a length of about 21 to 23 nucleotides having. One of the two strands of RNA corresponds to a sequence of one gene to be mined. In other words, based on knowledge the for Neuroglobin and / or its interaction partner encoding nucleic acid (s), especially the mRNA, a double-stranded RNA can be produced, being one of the two RNA strands complementary to said, for Neuroglobin and / or its interaction partner encoding nucleic acid (s), preferably to the mRNA, and then to break down the corresponding coding nucleic acid leads and associated with a reduction in the titer of each Translation products, d. H. of the proteins. The generation and use of RNAi as a medicament or diagnostic agent is described, for example in international patent applications WO 00/44895 and WO 01/75164.

Mit Blick auf die Wirkmechanismen der vorstehend beschriebenen Klassen von Verbindungen, Ribozymen, Antisense-Oligonukleotiden sowie RNAi, ist es somit im Rahmen der vorliegenden Erfindung, neben dem Neuroglobin-Protein und dessen insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartner(n) auch die dafür codierende(n) Nukleinsäure(n), insbesondere die entsprechende mRNA, cDNA oder DNA, zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Erkrankungen der Retina bzw. für die Herstellung eines diagnostischen Mittels für die Diagnose von Erkrankungen der Retina und für das Überwachen des Verlaufes der Erkrankung bzw. der angesetzten Therapie, entweder direkt oder als Zielmolekül, zu verwenden.With a view to the mechanisms of action the classes of compounds, ribozymes, Antisense oligonucleotides as well as RNAi, it is therefore within the scope of present invention, in addition to the neuroglobin protein and its especially natural Interaction partner (s) also the nucleic acid (s) coding for it, in particular the corresponding mRNA, cDNA or DNA, for the manufacture of a medicament for the Treatment of diseases of the retina or for the production of a diagnostic agent for the Diagnosis of diseases of the retina and for monitoring the course of the Disease or the therapy applied, either directly or as Target molecule, to use.

Es ist weiter im Rahmen der vorliegenden Endung, dass die vorstehend genannten Klassen von Verbindungen, d.h. Antikörper, Peptide, Proteine, Anticaline, kleine Moleküle, Aptamere, Spiegelmere, Ribozyme, Aptazyme, Antisense-Oligonukleotide sowie RNAi, für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Erkrankungen der Retina und/oder als diagnostisches Mittel für die Diagnose von Erkrankungen der Retina verwendet werden können. Die solchermaßen hergestellten bzw. identifizierten Verbindungen der verschiedenen Klassen können nach deren Herstellung auch in dem erfindungsgemäßen Verfahren nochmals gescreent werden. Ein derartiges Screenen wird Aufschluss darüber geben, inwieweit eine oder mehrere dieser Verbindungen geeignet sind, erfindungsgemäß verwendet zu werden. Wie auf der Grundlage der hierin gemachten Offenbarung belegt, können die Vertreter der verschiedenen Verbindungsklassen als solches geeignet sein zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Erkrankungen der Retina oder eines diagnostischen Mittels zur Diagnose von Erkrankungen der Retina verwendet zu werden. Darüber hinaus können die solchermaßen herstellten Verbindungen der verschiedenen Klassen auch Gegenstand einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines diagnostischen Mittels, insbesondere eines Kits, bevorzugt eines diagnostischen Kits sein, welche zu dem erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden können.It is further within the scope of the present Ending that the above classes of connections, i.e. Antibody, Peptides, proteins, anticalins, small molecules, aptamers, Spiegelmers, Ribozymes, aptazymes, antisense oligonucleotides and RNAi, for the production a medicament for the treatment of diseases of the retina and / or as a diagnostic tool for the diagnosis of diseases of the retina can be used. The thus established or identified connections of the different Classes can after their production also screened again in the process according to the invention become. Such screening will shed light on the extent to which one or more of these compounds are suitable is used according to the invention to become. As based on the disclosure made herein occupied, can the representatives of the various classes of compounds are suitable as such be for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases the retina or a diagnostic tool for diagnosing diseases the retina to be used. In addition, the thus established connections of the different classes also subject a pharmaceutical composition or a diagnostic By means of, in particular a kit, preferably a diagnostic Be kits which are used for the purpose according to the invention can.

Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung umfasst in einer Ausführungsform neben einer oder mehreren der vorstehend genannten bzw., wie hierin offenbart, zu erzeugenden Verbindungen noch andere pharmazeutisch wirksame Verbindungen sowie einen pharmazeutisch akzeptablen Träger. Derartige Träger können bspw. flüssig oder fest sein, bspw. eine Lösung, ein Puffer, eine alkoholische Lösung und dergleichen. Als geeignete feste Träger kommen bspw. Stärke und dergleichen in Betracht. Es ist den Fachleuten auf dem Gebiet der pharmazeutischen Darreichungsformen bekannt, wie die entsprechenden Verbindungen der verschiedenen Klassen formuliert werden müssen, um auf dem jeweils angestrebten Darreichungsweg, bspw. oral, parenteral, subcutan, intravenös und dergleichen mehr, verabreicht werden zu können.The pharmaceutical composition according to the invention comprises in one embodiment in addition to one or more of the above or as herein discloses compounds to be produced still other pharmaceutically active compounds and a pharmaceutically acceptable carrier. Such carriers can, for example. liquid or be solid, e.g. a solution, a buffer, an alcoholic solution and the same. For example, starch and the like into consideration. It is the specialist in the field of pharmaceutical dosage forms known as the corresponding Connections of different classes have to be formulated in order on the desired route of administration, e.g. oral, parenteral, subcutaneously, intravenously and the like, to be administered.

Die verschiedenen Verbindungen der verschiedenen Klassen können neben Neuroglobin, einem Wechselwirkungspartner davon oder einer jeweils dafür codierenden Nukleinsäure auch einzeln oder gemeinsam Gegenstand eines Kits sein, wobei der Kit die Verbindung und ggf. noch ein oder mehrere weitere Elemente umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die Puffer, Negativ-Kontrollen, Positiv-Kontrollen und Benutzungsanweisungen umfasst. Typischerweise sind die einzelnen Verbindungen in trockener oder flüssiger Form, bevorzugter Weise für den einzelnen Anwendungsfall portioniert, in dem Kit enthalten. Der Kit kann dabei bevorzugter Weise verwendet werden zur Bestimmung des Zustandes der Retina aufgrund der hierin offenbarten Korrelation zwischen Erkrankungen der Retina und der Expression bzw. Verfügbarkeit oder Aktivität von Neuroglobin. Ein weiterer Aspekt, der für eine jegliche hierin beschriebene Verwendung der verschiedenen Moleküle und Verbindungen gilt, betrifft die Darstellung bzw. Überwachung der Sauerstoffversorgung bzw. Sauerstoffversorgungszustandes der Retina, insbesondere der Photorezeptorzellen wie der Stäbchen und Zäpfchen.The different connections of the different classes can in addition to neuroglobin, an interaction partner thereof or one each for that coding nucleic acid can also be the subject of a kit individually or together, the Kit the connection and possibly one or more other elements which are selected from the group consisting of buffers, negative controls, Includes positive controls and instructions for use. typically, are the individual compounds in dry or liquid form, preferred way for portioned into the individual application, included in the kit. The kit can preferably be used for the determination the state of the retina based on the correlation disclosed herein between diseases of the retina and expression or availability or activity of Neuroglobin. Another aspect for any described herein Use of different molecules and compounds applies to concerns the presentation or monitoring the oxygen supply or oxygen supply state of the Retina, especially the photoreceptor cells like the rods and suppositories.

Im Zusammenhang mit den verschiedenen hierin offenbarten Klassen von Verbindungen, die als therapeutisches Mittel oder diagnostisches Mittel erfindungsgemäß verwendet werden können, ist dabei ein Aspekt der, dass bestimmte Klassen direkt mit dem Neuroglobin oder seinem Wechselwirkungspartner in Wechselwirkung treten. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die besagten Verbindungen der verschiedenen Klassen, insbesondere wenn es sich dabei um Peptide, Antikörper, Anticaline, Aptamere und Spiegelmere handelt, den Wechselwirkungspartner des Neuroglobins durch eine mehr oder weniger spezifische Wechselwirkung für das Neuroglobin blockieren. Insoweit ist der Begriff der Verwendung von Neuroglobin hierin auch dahingehend zu verstehen, dass er die Verwendung eines oder mehrerer des/der Neuroglobin-Wechselwirkungspartner(s), wie bspw. Rezeptoren davon, umfasst. Die hierin beschriebenen Verfahren sind dann insoweit zu modifizieren, als dass anstelle des Neuroglobin-Proteins bzw. der für sie codierenden Nukleinsäure, ein Wechselwirkungspartner davon in den verschiedenen Selektionsverfahren, Assays, Screening-Verfahren oder Herstellungsverfahren eingesetzt wird.In connection with the various Classes of compounds disclosed herein as therapeutic Agents or diagnostic agents can be used according to the invention doing an aspect of that certain classes directly with the neuroglobin or interact with its interaction partner. It is however also within the scope of the present invention that said Connections of different classes, especially if it is peptides, antibodies, Anticaline, Aptamere and Spiegelmere acts as the interaction partner of neuroglobin through a more or less specific interaction for the Block neuroglobin. To that extent, the concept of use of neuroglobin herein to be understood to mean that it is the Use of one or more of the neuroglobin interaction partner (s), such as receptors thereof. The methods described herein are then modify to the extent that instead of the neuroglobin protein or the for nucleic acid encoding them, an interaction partner thereof in the various selection processes, Assays, screening procedures or manufacturing processes used becomes.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Wechselwirkungspartnern von Neuroglobin, insbesondere natürlichen Wechselwirkungspartnern, solche Moleküle und Strukturen bezeichnet, mit denen dieses in Wechselwirkung tritt. Dabei sind insbesondere jene Moleküle und Strukturen umfasst, mit denen das Protein im biologischen System unter normalen und/oder auch unter pathologischen Bedingungen in Wechselwirkung tritt. Dazu gehören unter anderem Rezeptoren und jene Moleküle und Strukturen, die an der Ausbildung von Komplexen von Neuroglobin bei der Übertragung von Sauerstoff beteiligt oder mit diesem in Kontakt treten.Within the scope of the present invention are among interaction partners of neuroglobin, in particular natural Interaction partners, such molecules and structures, with which this interacts. In particular, those are molecules and includes structures with which the protein in the biological system under normal and / or also under pathological conditions in Interaction occurs. This includes among other things receptors and those molecules and structures involved in the Formation of complexes of neuroglobin during transmission involved in or in contact with oxygen.

Beispiele für Erkrankungen oder pathologische Zustände, insbesondere der Retina, im Rahmen derer das Neuroglobin, die dafür codierende Nukleinsäure oder die damit in Wechselwirkung tretenden verschiedenen Verbindungsklassen, wie hierin offenbart, verwendet werden können, sei es zum Screenen eines geeigneten Mittels oder dahingehend, dass diese selbst als entsprechendes Mittel für die Behandlung oder Diagnose verwendet werden können, ist das Glaukom (grüner Star), Retinis pigmentosa oder auch die altersabhängige Makuladegeneration (AMD))Examples of diseases or pathological Conditions, especially the retina, in the context of which the neuroglobin, the coding for it nucleic acid or the different classes of compounds interacting with it, as disclosed herein may be used to screen one suitable means or to the extent that this itself as a corresponding Funds for the treatment or diagnosis can be used is glaucoma (glaucoma), Retinis pigmentosa or age-related macular degeneration (AMD))

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Figuren, Beispiele und des Sequenzprotokolls erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der Endung ergeben. Dabei zeigt:The invention is now based on the following figures, examples and the sequence listing explained which are other features, embodiments and advantages of Result. It shows:

1 einen Western Blot zum Nachweis von Neuroglobin in der Retina der Maus; 1 a Western blot for the detection of neuroglobin in the mouse retina;

2 eine Phasenkontrastaufnahme eines Querschnittes durch eine Retina; 2 a phase contrast image of a cross section through a retina;

3 eine Immunfluoreszenz-Darstellung des in 2 dargestellten Querschnitts durch eine Retina; und 3 an immunofluorescence representation of the in 2 cross-section shown through a retina; and

4 eine schematische Darstellung eines Querschnitts durch die Retina. 4 is a schematic representation of a cross section through the retina.

Beispiel 1: Nachweis von Neuroglobin in der RetinaExample 1: Detection of Neuroglobin in the retina

Acht bis 10 Retinae wurden aus Mausaugen präpariert und in 100 μl Probenpuffer homogenisiert. Zum Nachweis von Neuroglobin in der Retina von Maus wurde insgesamt 30 μg Gesamtprotein aus der Retina auf ein SDS-Polyacrylamidgel gegeben und das Neuroglobin unter Anwendung eines polyklonalen, Neuroglobin-spezifischen Antikörpers nachgewiesen. Zur Kontrolle dienten gleiche Mengen von auf gleiche Weise gewonnenen Proteinextrakten aus dem Gehirn ("brain"), der Leber ("liver"), dem Muskel ("muscle") und dem Blut ("blood"). Als Standard wurde dabei rekombinantes Neuroglobin ("Ngb") mit einer Molekularmasse von 16 kDa aufgetragen. Das Ergebnis ist in 1 dargestellt.Eight to 10 retinae were prepared from mouse eyes and homogenized in 100 μl sample buffer. To detect neuroglobin in the mouse retina, a total of 30 μg of total protein from the retina was placed on an SDS polyacrylamide gel and the neuroglobin using a polyclonal, Neuroglo bin-specific antibody detected. The same quantities of protein extracts obtained in the same way from the brain ("brain"), the liver ("liver"), the muscle ("muscle") and the blood ("blood") were used as controls. Recombinant neuroglobin ("Ngb") with a molecular mass of 16 kDa was applied as the standard. The result is in 1 shown.

Aus 1 ergibt sich, dass Neuroglobin offensichtlich unter denaturierenden Bedingungen als in vivo Monomer von etwa 17 kDa vorliegt, sowie in der Lage ist, ein stabiles, dimeres Assoziationsprodukt mit einer Molekularmasse von 34 kDa auszubilden. Infolge der aus 1 ersichtlichen Proteinbande des aus der Retina isolierten Neuroglobins, die größer ist als das rekombinante Neuroglobin wird gefolgert, dass Neuroglobin in vivo in posttranslational modifizierter Form vorliegt.Out 1 it follows that neuroglobin is evidently present as an in vivo monomer of about 17 kDa under denaturing conditions, and is able to form a stable, dimeric association product with a molecular mass of 34 kDa. As a result of 1 apparent protein band of the neuroglobin isolated from the retina, which is larger than the recombinant neuroglobin, it is concluded that neuroglobin is present in vivo in a post-translationally modified form.

Beispiel 2: Phasenkontrastaufnahme eines Querschnitts durch eine Retina der MausExample 2: Phase contrast recording a cross-section through a mouse retina

2 stellt eine Phasenkontrastaufnahme eines 15 um Gefrierschnitt durch eine Retina der Maus dar, die unter Anwendung von Standardtechniken erstellt wurde. Das Präparat wurde im folgenden Beispiel 3 einer Immunfluoreszenz-Studie unterzogen. Der Stern bezeichnet das retinale Pigmentepitel, PL die Photorezeptoren (Außen- und Innensegmente), ONL die äußere Körnerschicht, OPL die äußere retikuläre Schicht, INL die innere Körnerschicht, IPL die innere retikuläre Schicht, und GC die Ganglienzellen. 2 Figure 15 shows a phase contrast image of a 15 µm frozen section through a mouse retina taken using standard techniques. The preparation was subjected to an immunofluorescence study in Example 3 below. The asterisk denotes the retinal pigment epithelium, PL the photoreceptors (outer and inner segments), ONL the outer granular layer, OPL the outer reticular layer, INL the inner granular layer, IPL the inner reticular layer, and GC the ganglion cells.

Beispiel 3: Immunfluoreszenzstudien betreffend Verteilung von Neuroglobin im RetinaquerschnittExample 3: Immunofluorescence studies regarding distribution of neuroglobin in the retinal cross section

Ausgehend von dem gemäß Beispiel 2 hergestellten Präparat wurde eine Immunfluoreszenzstudie durchgeführt unter Verwendung spezifischer anti-Neuroglobin-Antikörper. Diese wurden gegen ein aus der Sequenz des Neuroglobins gewonnenes Peptid (HN₂-CLSSPEFLDHIRKVML-CONH₂) in Kaninchen hergestellt und mittlels Affinitätschromatographie gereinigt. Der Nachweis des Neuroglobins erfolgte über einen mit Fluoreszenzfarbstoff (Alexa® 546; Molecular Probes, USA) gekoppelten, gegen Kaninchen IgG gerichteten Sekundärantikörper.Starting from the preparation prepared according to Example 2, an immunofluorescence study was carried out using specific anti-neuroglobin antibodies. These were prepared against a peptide (HN ₂ -CLSSPEFLDHIRKVML-CONH ₂ ) obtained from the sequence of the neuroglobin in rabbits and purified by means of affinity chromatography. The neuroglobin was detected using a secondary antibody directed against rabbit IgG and coupled with fluorescent dye (Alexa® 546; Molecular Probes, USA).

Das Ergebnis ist in 3 dargestellt. The result is in 3 shown.

Wie aus 3 ersichtlich kann eine bevorzugte Expression von Neuroglobin in den Innensegment der Photorezeptorzellen, der äußeren und der inneren retikulären (plexiformen) Schicht nachgewiesen werden. Infolge dieser auch räumlich engen Korrelation der Neuroglobinexpression und der Orte des Sauerstoffverbrauchs (vergl. 4) sind die vorliegenden Erfider zu dem Ergebnis gelangt, dass Neuroglobin mutmaßlich an der Sauerstoffversorgung dieses metabolisch ausgesprochen aktiven Gewebes bzw. infolge der dort ablaufenden physioko-chemischen Vorgänge als Radikalfänger verwendet werden kann.How out 3 a preferred expression of neuroglobin can be seen in the inner segment of the photoreceptor cells, the outer and the inner reticular (plexiform) layer. As a result of this spatially close correlation of neuroglobin expression and the locations of oxygen consumption (cf. 4 ) the present inventors came to the conclusion that neuroglobin can presumably be used as a radical scavenger for the oxygen supply of this metabolically very active tissue or as a result of the physiocochemical processes taking place there.

Zum Vergleich des Aufbaus der Retina wird auf die in 4 dargestellt schematische Skizze hingewiesen. In 4 sind ferner die sauerstoffverbrauchenden Bereiche der Retina grau schraffiert dargestellt.To compare the structure of the retina, reference is made to the in 4 shown schematic sketch pointed. In 4 the oxygen-consuming areas of the retina are also shown in gray hatching.

Beispiel 4: Erzeugung polyklonaler Antikörper gegen NeuroglobinExample 4: Generation polyclonal antibody against neuroglobin

Es wurden zwei verschiedene polyklonale Antikörper gegen Neurogloln erzeugt (Auftragsarbeit von Eurogentech). Der erste Antikörper wurde in Hühnchen gegen rekombinantes Neuroglobin der Maus (Maus-Ngb) erzeugt. Die IgY-Fraktion wurde aus dem Eidotter mittels des EGGstract-Kit (Promega) gereinigt. Spezifische anti-Ngb-Antikörper wurden unter Verwendung von an eine SulfoLink-Säule (Pierce) gekoppeltem Neuroglobin der Maus entsprechend den Herstellerangaben affinitätsgereinigt und bei 50 mM Tris, 100 nm Glycin, pH ∼ 7.4, ergänzt durch 0,1 % NaN₃ gelagert. Der zweite Antikörper wurde in Kaninchen gegen ein synthetisches Ngb-Peptid erzeugt, das die konservierten Aminosäurepositionen 55 bis 70 von Ngb von der Maus und des Menschen (HN₂-CLSSPEFLDHIRKVML-CONH₂) abdeckt. Die Affinitätsreinigung unter Verwendung des an eine SulfoLink-Säule gekoppelten synthetischen Peptids wurde wie oben beschrieben durchgeführt.Two different polyclonal antibodies against neurogloln were generated (commissioned by Eurogentech). The first antibody was raised in chicken against recombinant mouse neuroglobin (mouse Ngb). The IgY fraction was purified from the egg yolk using the EGGstract kit (Promega). Specific anti-Ngb antibodies were affinity-purified using neuroglobin of the mouse coupled to a SulfoLink column (Pierce) according to the manufacturer's instructions and stored at 50 mM Tris, 100 nm glycine, pH ∼ 7.4, supplemented by 0.1% NaN ₃ . The second antibody was raised in rabbits against a synthetic Ngb peptide covering the conserved amino acid positions 55 to 70 of mouse and human Ngb (HN ₂ -CLSSPEFLDHIRKVML-CONH ₂ ). Affinity purification using the synthetic peptide coupled to a SulfoLink column was performed as described above.

Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.The ones in the previous description, the claims and the features of the invention disclosed in the drawings can both individually or in any combination to achieve the Invention in its various embodiments may be essential.

SEQUENZPROTOKOLL

SEQUENCE LISTING

Claims

Use of neuroglobin to produce a Medicament for the treatment of diseases of the retina and / or for the production of a diagnostic agent for the diagnosis of diseases the retina.

Use according to claim 1, characterized in that that the neuroglobin is an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 6 has.

Use of a nucleic acid coding for neuroglobin for Manufacture of a medicament for the treatment of diseases of the Retina and / or for the manufacture of a diagnostic agent for the Diagnosis of diseases of the retina.

Use according to claim 3, characterized in that that the neuroglobin is an amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 6 has.

Use according to claim 3 or 4, characterized in that that the nucleic acid a nucleic acid according to SEQ ID NO. 7 to SEQ ID NO. 12 is.

Use according to claim 3, characterized in that that the nucleic acid with the nucleic acid according to SEQ ID NO. 7 to SEQ ID NO. 12 without the degeneracy of the genetic Codes would hybridize.

Use according to one of claims 1 to 6, characterized in that that the disease is selected is from the group that includes retinal blastoma, glaucoma, retinal pigmentosa, age-related Macular degeneration and uveitis includes.

Method of screening an agent for treatment of diseases of the retina and / or a diagnostic agent for the Diagnosis of diseases of the retina, comprising the steps: a) Providing a candidate connection, b) Provide a neuroglobin expression system and / or neuroglobin activity system; c) Contacting the candidate compound with the neuroglobin expression system and / or the neuroglobin activity system; d) Determine whether expression under the influence of the candidate compound and / or the activity of neuroglobin changed becomes.

A method according to claim 8, characterized in that the candidate link contained in a link library is.

A method according to claim 8 or 9, characterized in that the candidate connection selected is from the group of compound classes, the peptides, proteins, Antibody, Anticaline, functional nucleic acids and small molecules includes.

A method according to claim 10, characterized in that the functional nucleic acids selected are from the group consisting of aptamers, aptazymes, ribozymes, Spiegelmers, Includes antisense oligonucleotides and RNAi.

Use of neuroglobin and / or a coding for it nucleic acid and / or a particularly natural one Interaction partner of neuroglobin and / or a coding for it nucleic acid as a target for the Development and / or production of a diagnostic agent for Diagnosis of diseases of the retina, and / or for development and / or Manufacture of a medication for prevention and / or treatment of diseases of the retina.

Use according to claim 12, characterized in that that the drug or diagnostic agent comprises an agent that selected is from the group, the antibodies, Peptides, anticalins, small molecules, antisense molecules, aptamers, Spiegelmers and RNAi molecules includes.

Use according to claim 13, characterized in that the agent contains neuroglobin or a particularly natural one Interaction partner of neuroglobin interacts.

Use according to claim 13, characterized in that the agent with one for Nucleic acid encoding neuroglobin and / or with one for a particularly natural one Interaction partners of nucleic acid encoding neuroglobin, in particular with mRNA, genomic nucleic acid or cDNA for neuroglobin interacts.

Use one with neuroglobin or with one especially natural Interaction partner of neuroglobin interacting Polypeptide for the development or manufacture of a diagnostic For the diagnosis of diseases of the retina, and / or for development or manufacture of a medicament for prevention and / or treatment of diseases of the retina.

Use according to claim 16, characterized in that that the polypeptide is selected is from the group called antibodies against neuroglobin and neuroglobin binding polypeptides.

Use one with neuroglobin or with one especially natural Interaction partner of neuroglobin interacting nucleic acid for the development or manufacture of a diagnostic agent for Diagnosis of diseases of the retina, and / or for development or Manufacture of a medication for prevention and / or treatment of diseases of the retina.

Use according to claim 18, characterized in that that the nucleic acid selected is from the group that includes aptamers and Spiegelmers.

Use one with for neuroglobin or for one especially natural Interaction partner of nucleic acid encoding neuroglobin in interaction emerging nucleic acid for the development or manufacture of a diagnostic agent for Diagnosis of diseases of the retina, and / or for development or Manufacture of a medication for prevention and / or treatment of diseases of the retina.

Use according to claim 20, characterized in that that the interacting nucleic acid is an antisense oligonucleotide, is a ribozyme and / or RNAi.

Use according to claim 20 or 21, characterized in that that for Neuroglobin or for one especially natural Interaction partner of nucleic acid encoding neuroglobin respective cDNA or mRNA.

Pharmaceutical composition comprising at least one agent which is selected from the group which interacts with neuroglobin, with a nucleic acid coding therefor, with a particularly natural interaction partner of neuroglobin and / or with a nucleic acid coding therefor, polypeptides, with neuroglobin or a particularly natural one Interaction partner of neuroglobin interacting nucleic acids and with for neuroglobin or for one in particular whose natural interaction partner of nucleic acid (s) coding for neuroglobin comprises interacting nucleic acids, and at least one pharmaceutically acceptable carrier, in particular for the prevention and / or treatment of diseases of the retina.

Kit for the characterization of the state of the retina, comprising a with Neuroglobin, with a coding for it Nucleic acid, with one in particular. natural Interaction partner of neuroglobin or with a coding for it nucleic acid interacting polypeptide, one with neuroglobin, with one for that coding nucleic acid, with a particularly natural one Interaction partner of neuroglobin or a coding for it nucleic acid interacting nucleic acid and / or one for neuroglobin coding and / or for a particularly natural one Interaction partners of nucleic acid encoding neuroglobin in interaction stepping nucleic acid.

Antibody, especially monoclonal antibodies, directed against neuroglobin.

antibody 25 according to claim 25, characterized in that the neuroglobin amino acid sequence according to SEQ ID NO. 1 to SEQ ID NO. 6 has.

Use of an antibody according to claim 25 or 26, for the manufacture of a medicament for the treatment of diseases the retina and / or for the production of a diagnostic agent for the Diagnosis of diseases of the retina.