EP1999473A1 - Method for determining the therapeutic effectiveness of substances - Google Patents

Method for determining the therapeutic effectiveness of substances

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EP1999473A1
EP1999473A1 EP07723385A EP07723385A EP1999473A1 EP 1999473 A1 EP1999473 A1 EP 1999473A1 EP 07723385 A EP07723385 A EP 07723385A EP 07723385 A EP07723385 A EP 07723385A EP 1999473 A1 EP1999473 A1 EP 1999473A1
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EP
European Patent Office
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sample
peptide
protein
cell
tissue
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07723385A
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German (de)
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Inventor
Harald Gollnik
Bernd Bonnekoh
Raik BÖCKELMANN
Lars Philipsen
Ansgar Josef Pommer
Anja Bastian
Sebastian Bartsch
Yanina Malykh
Mandy KÖNNECKE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Otto Von Guericke Universitaet Magdeburg
MPB Meltec Patent und Beteiligungs GmbH
Original Assignee
Otto Von Guericke Universitaet Magdeburg
MPB Meltec Patent und Beteiligungs GmbH
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Publication date
Family has litigation
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Application filed by Otto Von Guericke Universitaet Magdeburg, MPB Meltec Patent und Beteiligungs GmbH filed Critical Otto Von Guericke Universitaet Magdeburg
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining the therapeutic efficacy of substances which contain as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide.
  • the present invention relates to a method for determining the therapeutic efficacy of substances containing as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide, the method comprising the steps of: a) providing a cell, blood or tissue sample of human or animal origin or a sample of microbial origin, wherein the cell, blood or tissue sample or microbial sample is in a predefined biological state and for which at least one therapeutically active, biotechnologically generated protein and / or peptide has relevant target structures; b) labeling the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide while maintaining its in vivo binding properties; c) applying a reagent solution containing the at least one labeled therapeutically active protein and / or peptide to the sample, wherein the
  • Psoriasis is a chronic inflammation of the skin, characterized by abnormal proliferation of the epidermal cells (hyperplasia) and increased cutaneous blood flow and in addition to the involvement of fingernails in some of the patients in addition to a disease of the joints leads so-called psoriatic arthritis.
  • the treatment options depend on the disease being developed in the individual patient and often require a combination of several drugs.
  • physical therapies such as UV irradiation exist at various points preparing preparations ranging from tar or nourishing ointments over the administration of vitamin A or D derivatives (eg Zorac®, Daivonex®) to the administration of hormones.
  • efalizumab (Raptiva®). It is a humanized monoclonal IgG1 antibody directed against the molecule CD11a.
  • CD11a ⁇ -L integrin
  • CD18 ⁇ 2 integrin
  • heterodimeric LFA-1 lymphocyte function-associated antigen-1
  • LFA-I is expressed on lymphocytes, monocytes and neutrophils and plays an important role in cell-cell adhesion processes.
  • efalizumab showed a significant improvement in the disease in 30-40% of patients within 12 weeks in clinical trials, thus offering at least some of the patients a new, promising form of therapy.
  • WO 2005/112568 discloses a method for diagnosing or predicting the response of a patient to treatment with T-cell-reducing medicaments. For example, this method identifies various haplotypes that suggest that treatment with Alefacept (Amevive®) is promising. Alefacept belongs to the group of biologics or biologics and can be used to treat psoriasis.
  • Alefacept belongs to the group of biologics or biologics and can be used to treat psoriasis.
  • a disadvantage of such DNA-based methods is their complexity and the restriction to T cell-associated diseases.
  • biologics do not work the same way in all patients. So far, a prediction of the principal effectiveness for the individual patient is hardly possible and is done according to the trial-and-error principle. Accordingly, it has not been possible in the run-up to a treatment to optimize dose detection and suitable therapy monitoring for the individual case.
  • a method for determining the therapeutic efficacy of substances which contain as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide comprises the following method steps: a) Provision of a cell, blood or tissue sample of human or animal origin or a sample of microbial origin, wherein the cell, blood or tissue sample or microbial sample is in a predefined biological state and for which at least one therapeutically active, biotechnologically generated protein and / or peptide have relevant target structures; b) labeling the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide while maintaining its in vivo binding properties; c) applying a reagent solution containing the at least one labeled therapeutically active protein and / or peptide to the sample, wherein the application of the reagent solution takes place under predefined application conditions and with predefined concentrations of the labeled therapeutically active and biotechnologically produced protein and / or peptide; d) determination of the binding behavior of the
  • the advantage achievable with the invention consists, inter alia, in the fact that the method according to the invention, based on in-vitro binding studies, provides detailed information about the actual in-vivo action and activity Biologics side effect properties in the organ reference, thereby allowing both the prediction of the efficacy of the drug or biologics in question for the individual patient and targeted therapy management and monitoring with proven efficacy of the drug.
  • the possibility of prediction also advantageously allows pharmacological-pharmaceutical development processes to be significantly shortened. Furthermore, it allows the reduction of animal studies and clinical trials.
  • the application conditions according to method step c) include the variation of carrier solutions, temperature and pressure conditions.
  • At least one of the therapeutically active biotechnologically produced proteins or peptides is selected from the group: efalizumab, alefacept, infliximab, etanercept, basiliximab, daclizumab, muromonab, trastuzumab, ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab, adalimumab or polyclonal antibodies.
  • Polyclonal antibodies may be, for example, a horse anti-T cell immune serum or rabbit anti-human T cell immune serum.
  • the labeling according to process step b) is carried out by covalent binding of one or more fluorochromes and / or by covalent binding of one or more biotin molecules and / or by covalent binding of one or more dioxigenin molecules and / or Labeling with a secondarily labeled antibody and / or a radioactive label to the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide.
  • a fluorochrome used for labeling is, for example, fluorescein isothiocyanate (FITC).
  • the determination of the binding behavior of the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide at the relevant target structures of the samples according to method step d) comprises the detection of at least one labeling pattern of the labeled protein and / or peptide.
  • the signal strength of the marker pattern is determined and compared with the signal strength of a marker pattern determined under the same experimental conditions of at least one reference sample Reference sample is a cell, blood or tissue sample or sample of microbial origin comparable to the sample tested.
  • the reference sample can thereby be in a biological state comparable to the examined sample or in another biological state which differs from that of the examined samples.
  • the biological conditions include healthy or disease-related conditions of cell, blood or tissue samples or microbial samples.
  • the cell or tissue sample may be a skin tissue affected by psoriasis, an inflammatory skin disease, a skin tumor, an inflammatory tissue or a tumor tissue, and a normal, healthy skin tissue in the reference sample.
  • a kit according to the invention for carrying out the methods described above comprises at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide and at least one marker molecule, wherein the marker molecule does not influence the in vivo binding properties of the protein and / or peptide.
  • the marker molecule may comprise fluorochromes and / or biotin molecules and / or dioxigenin molecules as well as additionally secondary antibodies.
  • the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide is selected from the following group: efalizumab, alefacept, infliximab, etanercept, basiliximab, daclizumab, muromonab, trastuzumab, ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab, adalimumab or polyclonal antibodies .
  • Polyclonal antibodies may be, for example, a horse anti-T cell immune serum or rabbit anti-human T cell immune serum.
  • a biochip is additionally provided for carrying out the methods described above, wherein the biochip is a cell,
  • Origin and the sample is in a predefined biological state and has relevant target structures for at least one therapeutically active biotechnologically produced protein and / or peptide.
  • the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide is chosen from the following group: efalizumab,
  • Ibritumomab Ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab,
  • Adalimumab or polyclonal antibodies may be, for example, a horse anti-T cell immune serum or rabbit anti-human T cell immune serum.
  • the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed while preserving the relevant target structures.
  • the predefined biological condition of the skin sample is acutely psoriatic.
  • Efalizumab will covalently labeled with fluorescein-5-exuccinimidyl ester, while retaining its in vivo binding properties.
  • the labeled efalizumab is solubilized, with the screening conditions chosen to be as close as possible to the in vivo situation in the organ reference.
  • the in-solution, labeled efalizumab and optionally at least one other in solution against different cell types and / or structural components of the extracellular matrix and / or structures characteristic of cell proliferation, activation and adhesion are characterized , directed marker molecule sequentially applied to the skin sample.
  • the fluorescence labeling pattern is detected.
  • the individual marking patterns are digitized and processed.
  • the digitization and quantification of the detected signals is carried out by a method as described, for example, in EP 1 181 525.
  • phase contrast image is first recorded. This is followed by the automatic detection of the molecular patterns for single and / or multiple epitopes. These images are made accessible by the aforementioned digitization of a computer-aided evaluation.
  • the phase contrast image detected before the acquisition of the fluorescence images is used for the correct, pixel-precise superimposition of the corresponding fluorescence images.
  • the images thus oriented are subjected to background and false exposure correction in a second step and finally freed in a third step from any artifacts and / or defective pixels. This is done by applying a mask operation which marks the erroneous signals as invalid and excludes them from the following evaluation.
  • the digitized, processed images are binarized under the control of a specialist.
  • One pixel represents the topographic micro unit (TMU) at an area of 450x450 nm 2 at 20x optical magnification.
  • TMU topographic micro unit
  • the area of the digitized visual field is below this Conditions maximum 2000 x 2000 pixels.
  • the frequency of occurring pixel signals for the detected combinatorial marker patterns is set in relation to the horizontal width of the skin sample.
  • the vertical gradient of the considered skin sample can be taken into account, which is formed from tissue in the transition, growth and differentiation state.
  • the "pixel events normalized to horizontal skin width" parameter hereinafter referred to as PEN, is obtained.
  • the relevant target structures of the skin sample are mainly in the dermal compartment.
  • the detected, digitized and processed labeling patterns are used to determine the binding behavior of the labeled efalizumab in this compartment.
  • the evaluation of the determined binding behavior with regard to the efficacy of efalizumab in the concrete in vivo organ reference is made by comparing the in vitro identification and quantification data for the determined efalizumab binding structures with the typical identification and quantification data for acute psoriatic skin samples responding to efalizumab ,
  • the range of quantification values delineated with the aid of the further labeling molecules is between 1.1 ⁇ 10 3 PEN for MPO and 115 ⁇ 10 3 PEN for pan-CK and CD 138.
  • Efalizumab binding structures are up to 15 times greater in acute psoriatic skin samples against unaffected skin samples of the patient suffering from acute psoriasis and up to 32 times against healthy skin.
  • the quantitative values are 39.697 ⁇ 10.263 PEN.
  • the presence of efalizumab binding structures with quantitatively increased PEN values compared to healthy skin means that efalizumab is in principle effective for the individual patient and also enables the determination of an optimal, individually adapted dosage via the quantification data.
  • the therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed with preservation of the relevant target structures.
  • the predefined biological condition of the skin sample is a non-affected skin sample of an acute psoriatic patient.
  • an unaffected skin sample of an acutely psoriatic patient with principal efficacy of efalizumab over healthy control skin, there is a quantitative increase of the efalizumab binding structures up to 3-fold with PEN values of 2.598 ⁇ 2.448.
  • the therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed with preservation of the relevant target structures.
  • the predefined biological condition of the skin sample is a healthy skin sample of a non-psoriatic patient.
  • the quantitative determination of efalizumab binding structures in healthy skin yields values of 1.205 ⁇ 873 PEN.
  • the therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed with preservation of the relevant target structures.
  • the predefined biological condition of the skin sample is an acute psoriatic skin sample.
  • the relevant cellular targets are in T lymphocyte subpopulations which are positive for CD3, CD8, CD4, CD45RA, CLA and CD45R0.
  • the TMU-based determination of the localization of efalizumab binding structures leads to colocalization values of up to 84% for CD3 + -, up to 80% for CD8 + -, up to 93% for CD4 + DCD3 + -, up to 54% for CD45RA + , up to 73% for CLA + , and up to 87% for CD45R0 + T lymphocytes.
  • the basic efficacy of efalizumab for the specific patient can be determined by the characteristic of certain T lymphocytes as the target structure of efalizumab during its therapeutic application.

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Abstract

The present invention relates to a method for determining the therapeutic effectiveness of substances which contain, as active ingredient, at least one therapeutically effective protein and/or peptide produced using biotechnology. The invention also relates to a kit and a biochip for carrying out the method according to the invention.

Description

Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen Method for determining the therapeutic effectiveness of substances
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a) Bereitstellung einer Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einer Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobielle Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und für das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid relevante Zielstrukturen aufweist; b) Markierung des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids unter Erhaltung seiner In-vivo-Bindungseigenschaften; c) Aufbringen einer das mindestens eine markierte therapeutisch wirksame Protein und/oder Peptid enthaltenden Reagenzlösung auf die Probe, wobei das Aufbringen der Reagenzlösung unter vordefinierten Applikationsbedingungen und mit vordefinierten Konzentrationen des markierten therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids erfolgt; d) Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe; und e) Auswertung des in d) ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids in der untersuchten Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobiellen Probe. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Kit und einen Biochip zur Durchfuhrung des erfindungsgemäßen Verfahrens.The present invention relates to a method for determining the therapeutic efficacy of substances which contain as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide. In particular, the present invention relates to a method for determining the therapeutic efficacy of substances containing as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide, the method comprising the steps of: a) providing a cell, blood or tissue sample of human or animal origin or a sample of microbial origin, wherein the cell, blood or tissue sample or microbial sample is in a predefined biological state and for which at least one therapeutically active, biotechnologically generated protein and / or peptide has relevant target structures; b) labeling the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide while maintaining its in vivo binding properties; c) applying a reagent solution containing the at least one labeled therapeutically active protein and / or peptide to the sample, wherein the application of the reagent solution takes place under predefined application conditions and with predefined concentrations of the labeled therapeutically active and biotechnologically produced protein and / or peptide; d) determination of the binding behavior of the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide at the relevant target structure (s) of the sample; and e) evaluation of the binding behavior determined in d) with regard to the efficacy of the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide in the cell, blood or tissue sample or microbial sample investigated. The invention further relates to a kit and a biochip for carrying out the method according to the invention.
Autoimmun-Erkrankungen sind in der Bevölkerung weit verbreitet und manifestieren sich in verschiedensten Formen. In Deutschland leidet etwa 1% der Bevölkerung an der rheumatoiden Arthritis, die damit die häufigste der entzündlich rheumatischen Erkrankungen ist. Weit verbreitet sind auch Erkrankungen der Haut, wie beispielsweise die atopische Dermatitis (Neurodermitis) oder die Psoriasis (Schuppenflechte). Von der Psoriasis betroffen sind etwa 2-3% der mitteleuropäischen Bevölkerung, in den USA sogar 4-5%. Es handelt sich bei der Psoriasis um eine chronische Entzündung der Haut, die sich durch abnorme Proliferation der Epidermis-Zellen (Hyperplasie) und erhöhten kutanen Blutfluss auszeichnet und bei einem Teil der Patienten neben dem Befall von Fingernägeln zusätzlich zu einer Erkrankung der Gelenke führt, der sog. Psoriasis-Arthritis. Die Behandlungsmöglichkeiten hängen von der Ausbildung der Krankheit beim einzelnen Patienten ab und erfordern oft eine Kombination mehrerer Medikamente. Neben physikalischen Therapien wie UV-Bestrahlung existieren an verschiedenen Punkten ansetzende Präparate, die von Teer oder pflegenden Salben über die Gabe von Vitamin A- oder D- Abkömmlingen (z.B. Zorac®, Daivonex®) bis hin zur Verabreichung von Hormonen reichen. Die bei diesen Behandlungen insbesondere bei Langzeitanwendung auftretenden Nebenwirkungen begrenzen oft ihre Anwendbarkeit für den einzelnen Patienten und fuhren zu einer Nachfrage nach alternativen Therapieansätzen. Verschiedene Forschungsergebnisse weisen inzwischen auf eine zentrale Beteiligung von T-Zellen an der Pathophysiologie der Erkrankung hin. Dies führte zur Anwendung so genannter „Biologika" (engl. „Biologics") bei der Behandlung der Psoriasis und anderer Autoimmun- Erkrankungen. Bei den Biologics handelt es sich um eine vergleichsweise neue Klasse von Medikamenten, die hauptsächlich biotechnologisch hergestellte Proteine mit therapeutischer Wirkung beinhalten. Biologics können daher im Organbezug als Antikörper, Liganden oder Rezeptoren fungieren. Ihr großer Vorteil gegenüber den bisherigen Therapieformen besteht in ihrer hochgradig spezifischen Interaktion mit definierten molekularen Zielstrukturen. Dadurch können mit Biologics einerseits Medikamente zur Verfügung gestellt werden, die bei Versagen der übrigen Therapieansätze eine zusätzliche Möglichkeit der Behandlung bieten, andererseits können die bei den sonstigen Therapieformen häufig auftretenden Nebenwirkungen zum großen Teil vermieden werden. Ein unter anderem zur Behandlung von Psoriasis eingesetztes Biologie ist Efalizumab (Raptiva®). Es handelt sich hierbei um einen humanisierten monoklonalen IgGl -Antikörper, der gegen das Molekül CDl Ia gerichtet ist. CDl Ia (α-L Integrin) bildet nach seiner nicht-kovalenten Assoziierung mit CD 18 (ß2 Integrin) das heterodimere LFA-I (Lymphocyte Function-associated Antigen- 1), welches seinerseits CD54 (ICAM-I) bindet. LFA-I wird auf Lymphozyten, Monozyten und Neutrophilen exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei Zell-Zell-Adhäsionsprozessen. Efalizumab zeigte in klinischen Studien bei 30-40% der Patienten innerhalb von 12 Wochen eine deutliche Besserung der Erkrankung und bietet so zumindest einem Teil der Patienten eine neue, vielversprechende Therapieform.Autoimmune diseases are widespread in the population and manifest in a variety of forms. In Germany, about 1% of the population suffers from rheumatoid arthritis, which is the most common of inflammatory rheumatic diseases. Also widespread are diseases of the skin, such as the atopic dermatitis (atopic dermatitis) or psoriasis (psoriasis). Psoriasis affects about 2-3% of the Central European population, in the US as much as 4-5%. Psoriasis is a chronic inflammation of the skin, characterized by abnormal proliferation of the epidermal cells (hyperplasia) and increased cutaneous blood flow and in addition to the involvement of fingernails in some of the patients in addition to a disease of the joints leads so-called psoriatic arthritis. The treatment options depend on the disease being developed in the individual patient and often require a combination of several drugs. In addition to physical therapies such as UV irradiation exist at various points preparing preparations ranging from tar or nourishing ointments over the administration of vitamin A or D derivatives (eg Zorac®, Daivonex®) to the administration of hormones. The side effects associated with these treatments, particularly with long-term use, often limit their applicability to the individual patient and result in a demand for alternative therapeutic approaches. Various research results indicate a central involvement of T cells in the pathophysiology of the disease. This has led to the use of so-called "biologics" in the treatment of psoriasis and other autoimmune diseases. The biologics are a relatively new class of drugs that mainly contain biotechnologically engineered proteins with therapeutic effects. Biologics can therefore function as antibodies, ligands or receptors in the organ's reference. Their great advantage compared to the previous therapy forms is their highly specific interaction with defined molecular target structures. As a result, with Biologics on the one hand drugs can be provided, which provide an additional possibility of treatment in case of failure of the other therapeutic approaches, on the other hand, the side effects commonly occurring in other forms of therapy can be largely avoided. Another biology used to treat psoriasis is efalizumab (Raptiva®). It is a humanized monoclonal IgG1 antibody directed against the molecule CD11a. CD11a (α-L integrin) forms after its non-covalent association with CD18 (β2 integrin) the heterodimeric LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen-1), which in turn binds CD54 (ICAM-I). LFA-I is expressed on lymphocytes, monocytes and neutrophils and plays an important role in cell-cell adhesion processes. efalizumab showed a significant improvement in the disease in 30-40% of patients within 12 weeks in clinical trials, thus offering at least some of the patients a new, promising form of therapy.
Bekannte Diagnose- und Prädiktionsansätze machen Gebrauch von genetischen Methoden zur Bestimmung bestimmter Polymorphismen im Genom des einzelnen Patienten. Die so ermittelten Resultate können in bestimmten Fällen zur Ableitung der Anfälligkeit dieses Patienten gegenüber der fraglichen Krankheit verwendet werden. Aus der WO 2005/112568 ist ein Verfahren zur Diagnose oder Vorhersage des Ansprechverhaltens eines Patienten auf eine Behandlung mit T- Zellen- vermindernden Medikamenten bekannt. So werden mit Hilfe dieses Verfahrens verschiedene Haplotypen identifiziert, die darauf schließen lassen, dass eine Behandlung mit Alefacept (Amevive®) erfolgversprechend ist. Auch Alefacept gehört zur Gruppe der Biologika bzw. Biologics und kann zur Behandlung der Psoriasis verwendet werden. Nachteilig an derartigen DNA-basierten Verfahren ist jedoch ihre Aufwändigkeit und die Beschränkung auf T-Zellen-assoziierte Krankheiten. Des Weiteren wirken Biologics nicht bei allen Patienten gleich. Bisher ist eine Prädiktion über die prinzipielle Wirksamkeit für den einzelnen Patienten kaum möglich und erfolgt nach dem Trial-and-Error-Prinzip. Dementsprechend ist bisher im Vorfeld einer Behandlung keine für den Einzelfall optimierte Dosis-Ermittlung und geeignete Therapieüberwachung möglich.Known diagnostic and prediction approaches make use of genetic methods to determine particular polymorphisms in the genome of the individual patient. The results thus obtained may in certain cases be used to derive the susceptibility of this patient to the disease in question. WO 2005/112568 discloses a method for diagnosing or predicting the response of a patient to treatment with T-cell-reducing medicaments. For example, this method identifies various haplotypes that suggest that treatment with Alefacept (Amevive®) is promising. Alefacept belongs to the group of biologics or biologics and can be used to treat psoriasis. However, a disadvantage of such DNA-based methods is their complexity and the restriction to T cell-associated diseases. Furthermore, biologics do not work the same way in all patients. So far, a prediction of the principal effectiveness for the individual patient is hardly possible and is done according to the trial-and-error principle. Accordingly, it has not been possible in the run-up to a treatment to optimize dose detection and suitable therapy monitoring for the individual case.
Da Biologics als Immunsuppresiva schwerwiegende Nebenwirkungen haben können ist, ist die Entwicklung einer zuverlässigen Prädiktionmethode zur Vermeidung einer unwirksamen therapeutischen Anwendung sehr wichtig.Since biologics as immunosuppresives can have serious side effects, the development of a reliable prediction method to avoid ineffective therapeutic application is very important.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid („Biologics") enthalten, bereitzustellen, welches Aussagen über die grundsätzliche Wirksamkeit von einem oder mehreren therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteinen und/oder Peptiden für den individuellen Patienten im Vorfeld der Behandlung erlaubt und/oder mit deren Hilfe sich der Verlauf der therapeutischen Behandlung kontrollieren lässt. Es ist weiterhin Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Kit und einen Biochip zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitzustellen.It is therefore an object of the present invention to provide a method for determining the therapeutic efficacy of substances which contain as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide ("biologics"), which provides information about the basic efficacy of one or more allows several therapeutically effective, biotechnologically produced proteins and / or peptides for the individual patient prior to treatment and / or with the aid of which the course of the therapeutic treatment can be controlled. It is a further object of the present invention to provide a kit and a biochip for carrying out the method according to the invention.
Gelöst werden diese Aufgaben durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 , einem Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 14 und einem Biochip mit den Merkmalen des Anspruchs 17.These objects are achieved by a method having the features of claim 1, a kit having the features of claim 14 and a biochip having the features of claim 17.
Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den jeweiligen Unteransprüchen beschrieben.Advantageous embodiments of the invention are described in the respective subclaims.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten, umfasst folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellung einer Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einer Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Zell-, Blutoder Gewebeprobe oder mikrobielle Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und für das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid relevante Zielstrukturen aufweist; b) Markierung des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids unter Erhaltung seiner In-vivo-Bindungseigenschaften; c) Aufbringen einer das mindestens eine markierte therapeutisch wirksame Protein und/oder Peptid enthaltenden Reagenzlösung auf die Probe, wobei das Aufbringen der Reagenzlösung unter vordefinierten Applikationsbedingungen und mit vordefinierten Konzentrationen des markierten therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids erfolgt; d) Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe; und e) Auswertung des in d) ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids in der untersuchten Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobiellen Probe. Der mit der Erfindung erzielbare Vorteil besteht unter anderem darin, dass das erfindungsgemäße Verfahren ausgehend von in-vitro Bindungsstudien detaillierte Erkenntnisse über die tatsächlichen in-vivo Wirkungs- und Nebenwirkungseigenschaften von Biologics im Organbezug liefert und dadurch sowohl die Prädiktion der Wirksamkeit des das oder die fraglichen Biologics enthaltenden Medikaments für den einzelnen Patienten als auch eine gezielte Therapieführung und - Überwachung bei erwiesener Wirksamkeit des Medikaments erlaubt. Durch die Möglichkeit einer Prädiktion lassen sich zudem vorteilhafterweise pharmakologisch- pharmazeutische Ent-wicklungsprozesse signifikant verkürzen. Weiterhin erlaubt es die Verringerung von Tierversuchen und klinischen Studien. Dabei umfassen in einer vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens die Applikationsbedingungen gemäß Verfahrensschritt c) die Variation von Trägerlösungen, Temperatur- und Druckbedingungen. Mindestens eines der therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteine oder Peptide ist gewählt aus der Gruppe: Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper können zum Beispiel ein Anti-T-Zell-Immunserum vom Pferd oder ein Antihuman T-Zell-Immunserum vom Kaninchen sein. Durch die Möglichkeit der Prädiktion und Auswahl wirksamer Medikamente im Vorfeld der Behandlung und der genauen Kontrollierbarkeit ihrer therapeutischen Anwendung ergeben sich zudem vorteilhafterweise deutliche Kostensenkungen in diesem Bereich.A method according to the invention for determining the therapeutic efficacy of substances which contain as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide comprises the following method steps: a) Provision of a cell, blood or tissue sample of human or animal origin or a sample of microbial origin, wherein the cell, blood or tissue sample or microbial sample is in a predefined biological state and for which at least one therapeutically active, biotechnologically generated protein and / or peptide have relevant target structures; b) labeling the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide while maintaining its in vivo binding properties; c) applying a reagent solution containing the at least one labeled therapeutically active protein and / or peptide to the sample, wherein the application of the reagent solution takes place under predefined application conditions and with predefined concentrations of the labeled therapeutically active and biotechnologically produced protein and / or peptide; d) determination of the binding behavior of the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide at the relevant target structure (s) of the sample; and e) evaluation of the binding behavior determined in d) with regard to the efficacy of the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide in the cell, blood or tissue sample or microbial sample investigated. The advantage achievable with the invention consists, inter alia, in the fact that the method according to the invention, based on in-vitro binding studies, provides detailed information about the actual in-vivo action and activity Biologics side effect properties in the organ reference, thereby allowing both the prediction of the efficacy of the drug or biologics in question for the individual patient and targeted therapy management and monitoring with proven efficacy of the drug. The possibility of prediction also advantageously allows pharmacological-pharmaceutical development processes to be significantly shortened. Furthermore, it allows the reduction of animal studies and clinical trials. In an advantageous embodiment of the method according to the invention, the application conditions according to method step c) include the variation of carrier solutions, temperature and pressure conditions. At least one of the therapeutically active biotechnologically produced proteins or peptides is selected from the group: efalizumab, alefacept, infliximab, etanercept, basiliximab, daclizumab, muromonab, trastuzumab, ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab, adalimumab or polyclonal antibodies. Polyclonal antibodies may be, for example, a horse anti-T cell immune serum or rabbit anti-human T cell immune serum. The possibility of prediction and selection of effective drugs in advance of the treatment and the exact controllability of their therapeutic application also advantageously result in significant cost reductions in this area.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Markierung gemäß Verfahrensschritt b) durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Fluorochrome und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Biotin-Moleküle und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Dioxigenin-Moleküle und/oder durch Markierung mit einem sekundär markiertem Antikörper und/oder einer radioaktiven Markierung an das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid. Ein zur Markierung geeignetes verwendetes Fluorchrom ist zum Beispiel Fluoresceinisothiocyanat (FITC).In a further advantageous embodiment of the method according to the invention, the labeling according to process step b) is carried out by covalent binding of one or more fluorochromes and / or by covalent binding of one or more biotin molecules and / or by covalent binding of one or more dioxigenin molecules and / or Labeling with a secondarily labeled antibody and / or a radioactive label to the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide. A fluorochrome used for labeling is, for example, fluorescein isothiocyanate (FITC).
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird für den Fall, dass eine direkte Markierung des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids nicht möglich ist oder zu einer Beeinflussung seiner in-vivo Bindungseigenschaften führt, wird zwischen das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid und die mindestens eine Markierung mindestens ein Spacer eingefugt.In a further advantageous embodiment of the method according to the invention, in the event that a direct labeling of the therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide is not possible or leads to an influence on its in vivo binding properties, between the at least one therapeutic effective, biotechnologically produced protein and / or peptide and the at least one label at least one spacer inserted.
In weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Proben gemäß Verfahrensschritt d) die Detektion von mindestens einem Markierungsmuster des markierten Proteins und/oder Peptids umfasst. Dabei wird zur Quantifizierung der Wirksamkeit des mindestens einen an die Zielstruktur bzw. Zielstrukturen gebundenen therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids die Signalstärke des Markierungsmusters ermittelt und mit der Signalstärke eines unter den gleichen Versuchsbedingungen ermittelten Markierungsmusters von mindestens einer Referenzprobe verglichen, wobei die Referenzprobe eine zur untersuchten Probe vergleichbare Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder Probe mikrobiellen Ursprungs ist. Die Referenzprobe kann sich dabei in einem zur untersuchten Probe vergleichbaren biologischen Zustand oder in einem weiteren, sich von dem der untersuchten Proben unterscheidenden biologischen Zustand befinden. So umfassen die biologischen Zustände gesunde oder krankheitsbedingte Zustände von Zell-, Blut- oder Gewebeproben oder mikrobiellen Proben. Beispielhaft kann es sich bei der Zell- oder Gewebeprobe um ein durch Psoriasis, eine entzündliche Hauterkrankung, einen Hauttumor, ein entzündliches Gewebe oder ein Tumorgewebe betroffenes Hautgewebe und bei der Referenzprobe um ein normales, gesundes Hautgewebe handeln.In further advantageous embodiments of the method according to the invention, the determination of the binding behavior of the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide at the relevant target structures of the samples according to method step d) comprises the detection of at least one labeling pattern of the labeled protein and / or peptide. In order to quantify the effectiveness of the at least one therapeutically active and biotechnologically produced protein and / or peptide bound to the target structure or target structures, the signal strength of the marker pattern is determined and compared with the signal strength of a marker pattern determined under the same experimental conditions of at least one reference sample Reference sample is a cell, blood or tissue sample or sample of microbial origin comparable to the sample tested. The reference sample can thereby be in a biological state comparable to the examined sample or in another biological state which differs from that of the examined samples. Thus, the biological conditions include healthy or disease-related conditions of cell, blood or tissue samples or microbial samples. By way of example, the cell or tissue sample may be a skin tissue affected by psoriasis, an inflammatory skin disease, a skin tumor, an inflammatory tissue or a tumor tissue, and a normal, healthy skin tissue in the reference sample.
In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die relevanten Zielstrukturen der Zell-, Blut- oder Gewebeproben und/oder derIn a further advantageous embodiment of the method according to the invention, the relevant target structures of the cell, blood or tissue samples and / or the
Referenzproben mittels eines automatisierten Verfahrens durch wiederholtes Aufbringen von Referenzlösungen, die jeweils mindestens ein Markiermolekül umfassen, ermittelt.Reference samples by an automated method by repeated application of reference solutions, each comprising at least one marker molecule determined.
Nach dem Einwirken einer Referenzlösung wird jeweils mindestens einAfter the influence of a reference solution at least one
Markierungsmuster automatisch detektiert, wobei die detektierten Markierungsmuster zu einem komplexen molekularen Kombinationsmuster der Zell-, Blut- oder Gewebeproben oder mikrobiellen Proben und/oder der Referenzproben zusammengefasst werden. Ein derartiges Verfahren ist in der EP 0 810 428 oder der DE 197 09 348 beschrieben. Ein erfindungsgemäßer Kit zur Durchfuhrung der im Vorhergehenden beschriebenen Verfahren umfasst mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch hergestelltes Protein und/oder Peptid und mindestens ein Markierungsmolekül, wobei das Markierungsmolekül die In-vivo-Bindungseigenschaften des Proteins und/oder Peptids nicht beeinflusst. Dabei kann das Markierungsmolekül Fluorochrome und/oder Biotin- Moleküle und/oder Dioxigenin-Moleküle sowie zusätzlich sekundäre Antikörper umfassen. Das therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid ist dabei aus folgender Gruppe gewählt: Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper können zum Beispiel ein Anti-T-Zell-Immunserum vom Pferd oder ein Antihuman T-Zell-Immunserum vom Kaninchen sein.Labeling pattern detected automatically, wherein the detected marker patterns are combined into a complex molecular combination pattern of cell, blood or tissue samples or microbial samples and / or the reference samples. Such a method is described in EP 0 810 428 or DE 197 09 348. A kit according to the invention for carrying out the methods described above comprises at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide and at least one marker molecule, wherein the marker molecule does not influence the in vivo binding properties of the protein and / or peptide. The marker molecule may comprise fluorochromes and / or biotin molecules and / or dioxigenin molecules as well as additionally secondary antibodies. The therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide is selected from the following group: efalizumab, alefacept, infliximab, etanercept, basiliximab, daclizumab, muromonab, trastuzumab, ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab, adalimumab or polyclonal antibodies , Polyclonal antibodies may be, for example, a horse anti-T cell immune serum or rabbit anti-human T cell immune serum.
Im Rahmen der Erfindung wird zudem ein Biochip zur Durchführung der im Vorhergehenden beschriebenen Verfahren bereitgestellt, wobei der Biochip eine Zell-,In the context of the invention, a biochip is additionally provided for carrying out the methods described above, wherein the biochip is a cell,
Blut- oder Gewebeprobe menschlichen, tierischen Ursprungs oder eine Probe mikrobiellenBlood or tissue sample of human or animal origin or a sample of microbial
Ursprungs umfasst und die Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und relevante Zielstrukturen für mindestens ein therapeutisch wirksames biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid aufweist. Das therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid ist dabei aus folgender Gruppe gewählt: Efalizumab,Origin and the sample is in a predefined biological state and has relevant target structures for at least one therapeutically active biotechnologically produced protein and / or peptide. The therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide is chosen from the following group: efalizumab,
Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab,Alefacept, infliximab, etanercept, basiliximab, daclizumab, muromonab, trastuzumab,
Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab,Ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab,
Adalimumab oder polyklonale Antikörper. Polyklonale Antikörper können zum Beispiel ein Anti-T-Zell-Immunserum vom Pferd oder ein Antihuman T-Zell-Immunserum vom Kaninchen sein.Adalimumab or polyclonal antibodies. Polyclonal antibodies may be, for example, a horse anti-T cell immune serum or rabbit anti-human T cell immune serum.
Weitere Einzelheiten und Anwendungsbereiche ergeben sich aus der folgenden Beschreibung mehrerer Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens:Further details and fields of application emerge from the following description of several embodiments of the method according to the invention:
In einer bevorzugten Ausführung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fixiert wurde. Der vordefinierte biologische Zustand der Hautprobe ist akut psoriatisch. Efalizumab wird unter Erhaltung seiner in- vivo Bindungseigenschaften kovalent mit Fluorescein-5-ex- succinimidylester markiert. Das markierte Efalizumab wird in Lösung gebracht, wobei die Vεrsuchsbedingungen so gewählt werden, dass sie der in-vivo Situation im Organbezug so weit wie möglich entsprechen. Mittels eines automatisierten Verfahrens wird das in Lösung vorliegende, markierte Efalizumab sowie gegebenenfalls mindestens ein weiteres in Lösung vorliegendes, gegen unterschiedliche Zelltypen und/oder gegen strukturelle Komponenten der extrazellulären Matrix und/oder gegen Strukturen, die für Zeilproliferation, -aktivierung und -adhäsion charakteristisch sind, gerichtetes Markierungsmolekül nacheinander auf die Hautprobe aufgebracht. In jedem Durchgang wird das Fluoreszenz-Markierungsmuster detektiert. Die einzelnen Markierungsmuster werden digitalisiert und prozessiert. Dabei erfolgt die Digitalisierung und Quantifizierung der detektierten Signale durch eine Methode, wie sie zum Beispiel in der EP 1 181 525 beschrieben ist.In a preferred embodiment, the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed while preserving the relevant target structures. The predefined biological condition of the skin sample is acutely psoriatic. Efalizumab will covalently labeled with fluorescein-5-exuccinimidyl ester, while retaining its in vivo binding properties. The labeled efalizumab is solubilized, with the screening conditions chosen to be as close as possible to the in vivo situation in the organ reference. By an automated method, the in-solution, labeled efalizumab and optionally at least one other in solution against different cell types and / or structural components of the extracellular matrix and / or structures characteristic of cell proliferation, activation and adhesion are characterized , directed marker molecule sequentially applied to the skin sample. In each pass, the fluorescence labeling pattern is detected. The individual marking patterns are digitized and processed. The digitization and quantification of the detected signals is carried out by a method as described, for example, in EP 1 181 525.
Von einer Hautgewebeprobe wird zunächst ein Phasenkontrastbild aufgenommen. Anschließend folgt die automatische Detektion der molekularen Muster für Einzel- und/oder Mehrfachepitope. Diese Bilder werden durch die genannte Digitalisierung einer computergestützten Auswertung zugänglich gemacht. Das vor der Aufnahme der Fluoreszenzbilder detektierte Phasenkontrastbild wird zur korrekten, pixelgenauen Überlagerung der korrespondierenden Fluoreszenzaufnahmen verwendet. Die so ausgerichteten Bilder werden in einem zweiten Schritt einer Hintergrund- und Fehlbelichtungskorrektur unterzogen und schließlich in einem dritten Schritt von eventuell vorhandenen Artefakten und/oder fehlerhaften Pixeln befreit. Dies geschieht durch die Anwendung einer Maskenoperation, welche die fehlerhaften Signale als ungültig markiert und von der folgenden Auswertung ausschließt.From a skin tissue sample, a phase contrast image is first recorded. This is followed by the automatic detection of the molecular patterns for single and / or multiple epitopes. These images are made accessible by the aforementioned digitization of a computer-aided evaluation. The phase contrast image detected before the acquisition of the fluorescence images is used for the correct, pixel-precise superimposition of the corresponding fluorescence images. The images thus oriented are subjected to background and false exposure correction in a second step and finally freed in a third step from any artifacts and / or defective pixels. This is done by applying a mask operation which marks the erroneous signals as invalid and excludes them from the following evaluation.
Die digitalisierten, bearbeiteten Bilder werden unter der Kontrolle eines Fachmanns binarisiert. Durch Überlagerung der binarisierten Bilder für jedes der detektierten Epitope erhält man eine Matrix der molekularen Signale, welche binär kodierten, der Boole 'sehen Logik folgenden Vektoren (l=ja/wahr, 0=nein/falsch) für jedes Pixel des digitalisierten visuellen Feldes entsprechen. Ein Pixel stellt bei einer Fläche von 450x450 nm2 bei 20facher optischer Vergrößerung die topographischen Basiseinheit (topographic micro unit - TMU) dar. Die Fläche des digitalisierten visuellen Feldes beträgt unter diesen Bedingungen maximal 2000 x 2000 Pixel. Die Häufigkeit der auftretenden Pixel-Signale für die detektierten kombinatorischen Markierungsmuster wird ins Verhältnis zu der horizontalen Breite der Hautprobe gesetzt. Auf diese Weise kann der vertikale Gradient der betrachteten Hautprobe berücksichtig werden, welcher aus Gewebe im Übergangs-, Wachstums- und Differenzierungzustand gebildet wird. Man erhält als geeignete Kenngröße zur Quantifizierung der Exprimierung und Co-Exprimierung von Epitopen den „pixel events normalized to horizontal skin width"-Parameter, im Folgenden kurz PEN genannt.The digitized, processed images are binarized under the control of a specialist. By superimposing the binarized images for each of the detected epitopes, one obtains a matrix of molecular signals which encode binary Boolean logic corresponding vectors (l = yes / true, 0 = no / false) for each pixel of the digitized visual field , One pixel represents the topographic micro unit (TMU) at an area of 450x450 nm 2 at 20x optical magnification. The area of the digitized visual field is below this Conditions maximum 2000 x 2000 pixels. The frequency of occurring pixel signals for the detected combinatorial marker patterns is set in relation to the horizontal width of the skin sample. In this way, the vertical gradient of the considered skin sample can be taken into account, which is formed from tissue in the transition, growth and differentiation state. As a suitable parameter for quantifying the expression and coexpression of epitopes, the "pixel events normalized to horizontal skin width" parameter, hereinafter referred to as PEN, is obtained.
Die relevanten Zielstrukturen der Hautprobe liegen hauptsächlich im dermalen Kompartiment. Die detektierten, digitalisierten und prozessierten Markierungsmuster werden zur Ermittlung des Bindungsverhaltens des markierten Efalizumabs in diesem Kompartiment verwendet. Die Auswertung des ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit von Efalizumab im konkreten in-vivo Organbezug erfolgt durch den Vergleich der in-vitro Identifizierungs- und Quantifizierungsdaten für die ermittelten Efalizumab-Bindungsstrukturen mit den für akut-psoriatische, auf Efalizumab ansprechenden Hautproben typischen Identifizierungs- und Quantifizierungsdaten. Der mit Hilfe der weiteren Markierungsmoleküle abgegrenzte Bereich der Quantifizierungswerte liegt dabei zwischen 1,1 x 103 PEN für MPO und 115 x 103 PEN für pan-CK und CD 138. Efalizumab-Bindungsstrukturen sind bei akut-psoriatischen Hautproben um das bis zu 15fache gegenüber nicht befallenen Hautproben des unter akuter Psoriasis leidenden Patienten und um das bis zu 32fache gegenüber gesunder Haut exprimiert. Die quantitativen Werte liegen bei 39,697 ± 10,263 PEN. Ein Vorliegen von Efalizumab- Bindungsstrukturen mit gegenüber gesunder Haut quantitativ erhöhten PEN-Werten bedeutet die prinzipielle Wirksamkeit von Efalizumab für den individuellen Patienten und ermöglicht über die Quantifizierungsdaten zudem die Ermittlung einer optimalen, individuell angepassten Dosierung.The relevant target structures of the skin sample are mainly in the dermal compartment. The detected, digitized and processed labeling patterns are used to determine the binding behavior of the labeled efalizumab in this compartment. The evaluation of the determined binding behavior with regard to the efficacy of efalizumab in the concrete in vivo organ reference is made by comparing the in vitro identification and quantification data for the determined efalizumab binding structures with the typical identification and quantification data for acute psoriatic skin samples responding to efalizumab , The range of quantification values delineated with the aid of the further labeling molecules is between 1.1 × 10 3 PEN for MPO and 115 × 10 3 PEN for pan-CK and CD 138. Efalizumab binding structures are up to 15 times greater in acute psoriatic skin samples against unaffected skin samples of the patient suffering from acute psoriasis and up to 32 times against healthy skin. The quantitative values are 39.697 ± 10.263 PEN. The presence of efalizumab binding structures with quantitatively increased PEN values compared to healthy skin means that efalizumab is in principle effective for the individual patient and also enables the determination of an optimal, individually adapted dosage via the quantification data.
In einer weiteren Anwendung der Erfindung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fixiert wurde. Bei dem vordefinierten biologischen Zustand der Hautprobe handelt es sich um eine nicht befallene Hautprobe eines unter akuter Psoriasis leidenden Patienten. Bei einer nicht befallenen Hautprobe eines akut psoriatischen Patienten findet sich bei prinzipieller Wirksamkeit von Efalizumab gegenüber gesunder Kontrollhaut eine quantitative Erhöhung der Efalizumab-Bindungsstrukturen um das bis zu 3 fache mit PEN- Werten von 2,598 ± 2,448.In a further application of the invention, the therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed with preservation of the relevant target structures. The predefined biological condition of the skin sample is a non-affected skin sample of an acute psoriatic patient. at In an unaffected skin sample of an acutely psoriatic patient, with principal efficacy of efalizumab over healthy control skin, there is a quantitative increase of the efalizumab binding structures up to 3-fold with PEN values of 2.598 ± 2.448.
In einer weiteren Anwendung der Erfindung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fixiert wurde. Bei dem vordefinierten biologischen Zustand der Hautprobe handelt es sich um eine gesunde Hautprobe eines nicht unter Psoriasis leidenden Patienten. Die quantitative Bestimmung von Efalizumab-Bindungsstrukturen in gesunder Haut liefert Werte von 1,205 ± 873 PEN.In a further application of the invention, the therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed with preservation of the relevant target structures. The predefined biological condition of the skin sample is a healthy skin sample of a non-psoriatic patient. The quantitative determination of efalizumab binding structures in healthy skin yields values of 1.205 ± 873 PEN.
In einer weiteren Anwendung der Erfindung ist das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid Efalizumab und die Zell- oder Gewebeprobe eine Hautprobe, welche unter Konservierung der relevanten Zielstrukturen fixiert wurde. Bei dem vordefinierten biologischen Zustand der Hautprobe handelt es sich um eine akut psoriatische Hautprobe. Die relevanten zellulären Zielstrukturen liegen in T- Lymphozyten-Subpopulationen, die positiv für CD3, CD8, CD4, CD45RA, CLA und CD45R0 sind. Die TMU-basierte Bestimmung der Lokalisierung von Efalizumab- Bindungsstrukturen führt zu Kolokalisierungs-werten von bis zu 84% bei CD3+-, bis zu 80% bei CD8+-, bis zu 93% bei CD4+DCD3+-, bis zu 54% bei CD45RA+-, bis zu 73% bei CLA+- und bis zu 87% bei CD45R0+-T-Lymphozyten. Auf diese Weise kann über die Eigenschaft bestimmter T-Lymphozyten als Zielstruktur von Efalizumab während dessen therapeutischer Anwendung die grundsätzliche Wirksamkeit von Efalizumab für den konkreten Patienten ermittelt werden. In a further application of the invention, the therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide efalizumab and the cell or tissue sample is a skin sample which has been fixed with preservation of the relevant target structures. The predefined biological condition of the skin sample is an acute psoriatic skin sample. The relevant cellular targets are in T lymphocyte subpopulations which are positive for CD3, CD8, CD4, CD45RA, CLA and CD45R0. The TMU-based determination of the localization of efalizumab binding structures leads to colocalization values of up to 84% for CD3 + -, up to 80% for CD8 + -, up to 93% for CD4 + DCD3 + -, up to 54% for CD45RA + , up to 73% for CLA + , and up to 87% for CD45R0 + T lymphocytes. In this way, the basic efficacy of efalizumab for the specific patient can be determined by the characteristic of certain T lymphocytes as the target structure of efalizumab during its therapeutic application.

Claims

Patentansprüche claims
1. Verfahren zur Bestimmung der therapeutischen Wirksamkeit von Substanzen, welche als Wirkstoff mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst:1. A method for determining the therapeutic efficacy of substances which contain as active ingredient at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide, characterized in that the method comprises the following steps:
(a) Bereitstellung einer Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen oder tierischen Ursprungs oder einer Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobielle Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und für das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid relevante Zielstrukturen aufweist;(a) providing a cell, blood or tissue sample of human or animal origin or a sample of microbial origin, wherein the cell, blood or tissue sample or microbial sample is in a predefined biological state and for the at least one therapeutically-efficient, biotechnologically-engineered Having protein and / or peptide relevant target structures;
(b) Markierung des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids unter(b) labeling the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide under
Erhaltung seiner In-vivo-Bindungseigenschaften;Maintenance of its in vivo binding properties;
(c) Aufbringen einer das mindestens eine markierte therapeutisch wirksame Protein und/oder Peptid enthaltenden Reagenzlösung auf die Probe, wobei das Aufbringen der Reagenzlösung unter vordefinierten Applikationsbedingungen und mit vordefinierten(c) applying a reagent solution containing the at least one labeled therapeutically active protein and / or peptide to the sample, wherein the application of the reagent solution under predefined application conditions and with predefined
Konzentrationen des markierten therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids erfolgt;Concentrations of the labeled therapeutically active and biotechnologically produced protein and / or peptide take place;
(d) Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe; und(d) determining the binding behavior of the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide at the relevant target structure (s) of the sample; and
(e) Auswertung des in 0 ermittelten Bindungsverhaltens hinsichtlich der Wirksamkeit des mindestens einen therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids in der untersuchten Zell-, Blut- oder Gewebeprobe oder mikrobiellen Probe.(e) evaluation of the binding behavior determined in 0 with regard to the efficacy of the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide in the cell, blood or tissue sample or microbial sample investigated.
2. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens eines der therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteine und/oder Peptide Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper umfasst.2. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that at least one of the therapeutically effective, biotechnologically produced Proteins and / or peptides include efalizumab, alefacept, infliximab, etanercept, basiliximab, daclizumab, muromonab, trastuzumab, ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab, adalimumab or polyclonal antibodies.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierung gemäß Verfahrensschritt b) durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Fluorochrome und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Biotin-Moleküle und/oder durch kovalente Bindung eines oder mehrerer Dioxigenin-Moleküle und/oder durch Markierung mit einem sekundären markierten3. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the label according to method step b) by covalent binding of one or more fluorochromes and / or by covalent binding of one or more biotin molecules and / or by covalent bonding of one or more dioxigenin molecules and / or by marking with a secondary labeled
Antikörper und/oder einer radioaktiven Markierung an das therapeutisch wirksame, biotechnologisch erzeugte Protein und/oder Peptid erfolgt.Antibody and / or a radioactive label to the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide takes place.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein zur Markierung verwendetes Fluorchrom Fluoresceinisothiocyanat (FITC) umfasst.4. The method according to claim 3, characterized in that at least one fluorochrome used for labeling comprises fluorescein isothiocyanate (FITC).
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen das mindestens eine therapeutisch wirksame, biotechnologisch hergestellte Protein und/oder Peptid und die mindestens eine Markierung mindestens ein Spacer eingefügt ist.5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that at least one spacer is inserted between the at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide and the at least one label.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Applikationsbedingungen gemäß Verfahrensschritt c) die Variation von Trägerlösungen, Temperatur- und Druckbedingungen umfasst.6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the application conditions according to method step c) comprises the variation of carrier solutions, temperature and pressure conditions.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Ermittlung des Bindungsverhaltens des therapeutisch wirksamen, biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids an der oder den relevanten Zielstrukturen der Probe gemäß Verfahrensschritt d) die Detektion von mindestens einem Markierungsmuster des markierten Proteins und/oder Peptids umfasst.7. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the determination of the binding behavior of the therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide at the one or more relevant target structures of the sample according to step d) the detection of at least one labeling pattern of the labeled protein and / or peptides.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass zur Quantifizierung der Wirksamkeit des mindestens einen an die Zielstruktur bzw. Zielstrukturen gebundenen therapeutisch wirksamen und biotechnologisch erzeugten Proteins und/oder Peptids die Signalstärke des Markierungsmusters ermittelt wird und mit der Signalstärke eines unter den gleichen Versuchsbedingungen ermittelten Markierungsmusters von mindestens einer Referenzprobe verglichen wird, wobei die Referenzprobe eine zur untersuchten Probe vergleichbare Zell-, Blut- oder8. The method according to claim 7, characterized in that for quantifying the effectiveness of the at least one of the target structure or target structures the signal strength of the marker pattern is determined and compared with the signal strength of a determined under the same experimental conditions marker pattern of at least one reference sample, wherein the reference sample comparable to the examined sample cell, blood or
Gewebeprobe oder mikrobielle Probe ist.Tissue sample or microbial sample is.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Referenzprobe in einem zur untersuchten Probe vergleichbaren biologischen Zustand befindet.9. The method according to claim 8, characterized in that the reference sample is in a comparable to the examined sample biological state.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Referenzprobe in einem weiteren, sich von dem der untersuchten Proben unterscheidenden biologischen Zustand befindet.10. The method according to claim 8, characterized in that the reference sample is in a different, different from that of the examined samples biological state.
1 1. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Zustände gesunde oder krankheitsbedingte biologische Zustände von Zell-, Blutoder Gewebeproben oder mikrobiellen Proben darstellen.1 1. The method of claim 9 or 10, characterized in that the biological states represent healthy or disease-related biological conditions of cell, blood or tissue samples or microbial samples.
12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zell- oder Gewebeprobe ein durch Psoriasis, eine entzündliche Hauterkrankung, einen12. The method of claim 1 1, characterized in that the cell or tissue sample by psoriasis, an inflammatory skin disease, a
Hauttumor, ein entzündliches Gewebe oder ein Tumorgewebe betroffenes Hautgewebe und die Referenzprobe ein normales, gesundes Hautgewebe ist.Skin tumor, an inflammatory tissue or a tumor tissue affected skin tissue and the reference sample is a normal, healthy skin tissue.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die relevanten Zielstrukturen der Zell-, Blut- oder Gewebeproben oder Proben mikrobiellen Ursprungs und/oder der Referenzproben mittels eines automatisierten Verfahrens durch wiederholtes Aufbringen von Referenzlösungen, die jeweils mindestens ein Markiermolekül umfassen, ermittelt werden und nach dem Einwirken einer Referenzlösung jeweils mindestens ein Markierungsmuster automatisch detektiert wird, wobei die detektierten Markierungsmuster zu einem komplexen molekularen Kombinationsmuster der Zell-, Blut- oder Gewebeproben und/oder der Referenzproben zusammengefasst werden. 13. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the relevant target structures of the cell, blood or tissue samples or samples of microbial origin and / or the reference samples by an automated method by repeated application of reference solutions, each comprising at least one marker molecule, are determined and after the action of a reference solution in each case at least one marker pattern is detected automatically, the detected marker patterns are combined to form a complex molecular combination pattern of cell, blood or tissue samples and / or the reference samples.
14. Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 umfassend mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch hergestelltes Protein und/oder Peptid und mindestens ein Markierungsmolekül, wobei das Markierungsmolekül die In-vivo-Bindungseigenschaften des Proteins und/oder Peptids nicht beeinflusst.14. Kit for carrying out the method according to one of claims 1 to 13 comprising at least one therapeutically active, biotechnologically produced protein and / or peptide and at least one marker molecule, wherein the marker molecule does not affect the in vivo binding properties of the protein and / or peptide.
15. Kit nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Markierungsmolekül Fluorochrome und/oder Biotin-Moleküle und/oder Dioxigenin-Moleküle sowie sekundäre Antikörper umfasst.15. Kit according to claim 14, characterized in that the marker molecule comprises fluorochromes and / or biotin molecules and / or dioxigenin molecules and secondary antibodies.
16. Kit nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Protein und/oder Peptid Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept, Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyklonale Antikörper umfasst.16. Kit according to claim 14 or 15, characterized in that the at least one protein and / or peptide efalizumab, alefacept, infliximab, etanercept, basiliximab, daclizumab, muromonab, trastuzumab, ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab, adalimumab or polyclonal antibodies.
17. Biochip zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 umfassend eine Zell-, Blut- oder Gewebeprobe menschlichen, tierischen oder eine Probe mikrobiellen Ursprungs, wobei die Probe in einem vordefinierten biologischen Zustand vorliegt und relevante Zielstrukturen für mindestens ein therapeutisch wirksames, biotechnologisch erzeugtes Protein und/oder Peptid aufweist.17. A biochip for carrying out the method according to claim 1, comprising a cell, blood or tissue sample of human, animal or a sample of microbial origin, wherein the sample is in a predefined biological state and has relevant target structures for at least one therapeutically effective, biotechnologically produced protein and / or peptide.
18. Biochip nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Protein und/oder Peptid Efalizumab, Alefacept, Infliximab, Etanercept,18. Biochip according to claim 17, characterized in that the at least one protein and / or peptide efalizumab, alefacept, infliximab, etanercept,
Basiliximab, Daclizumab, Muromonab, Trastuzumab, Ibritumomab, Bevacizumab, Cetuximab, Rituximab, Omalizumab, Alemtuzumab, Adalimumab oder polyclonale Antikörper umfasst. Basiliximab, daclizumab, muromonab, trastuzumab, ibritumomab, bevacizumab, cetuximab, rituximab, omalizumab, alemtuzumab, adalimumab or polyclonal antibodies.
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