DE10235988A1

DE10235988A1 - New mutant nucleic acid encoding the human MSH3 protein, useful e.g. for diagnosis and treatment of neoplasia, also for drug discovery

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Publication number: DE10235988A1
Application number: DE2002135988
Authority: DE
Inventors: Jens Dr. Plaschke; Stefan Dr. Krüger; Hans Konrad Prof. Dr.med. Schackert
Original assignee: Technische Universitaet Dresden
Current assignee: Technische Universitaet Dresden
Priority date: 2002-08-06
Filing date: 2002-08-06
Publication date: 2004-03-04

Abstract

Nucleic acid (I), or fragment of it, that encodes the human mismatch repair gene MSH3 protein and has a sequence that differs from the reference sequence by mutation at at least one specific position, is new. Nucleic acid (I), or fragment of it, that encodes the human mismatch repair gene MSH3 protein and has a sequence that differs from the reference sequence by mutation at at least one specific position is new. The specified positions are: (a) -382, -151, -144, -50, -39 and/or -35 in the 5'-untranslated region (UTR); (b) exon 1, -151; (c) intron 2, +40, +76 and/or -7; (d) intron 3, +59; (e) intron 4, +50; (f) intron 5, +151; (g) intron 8, +71; (h) intron 9, +61; (i) intron 12, +98; (j) intron 20, -103; (k) intron 21, -29 and/or -22; (l) intron 23, +64 and/or (m) 3'-UTR, +898. Independent claims are also included for: (1) a vector that contains (I); (2) a host cell transfected with the vector of (1); (3) diagnosing a disease (or predisposition) associated with MSH3, or for predicting progression, severity and/or survival time; (4) diagnosing MSH3-dependent resistance to chemotherapy; (5) diagnostic kit for methods (3) and (4); (6) identifying a compound for treatment or prevention of MSH3-associated diseases; and (7) use of a vector that contains the MSH3 reference sequence, or part of it, for gene therapy.

Description

Die Erfindung betrifft neue Sequenzvarianten des menschlichen Mismatch-Repair-Gens MSH3 (OMIM *600887, GenBank J04810, D61397-D61419, U61981) und ihre Verwendung zur Diagnose eines Spektrums von Erkrankungen, vorzugsweise von malignen Erkrankungen, insbesondere zur Feststellung von Neoplasie-Prädispositionen sowie zur Therapeutika-Entwicklung auf der Basis pharmakogenetischer Prinzipien.The invention relates to new sequence variants of the human mismatch repair gene MSH3 (OMIM * 600887, GenBank J04810, D61397-D61419, U61981) and their use for diagnosis a spectrum of diseases, preferably malignant diseases, in particular for the determination of neoplasia predispositions and for the development of therapeutics based on pharmacogenetic principles.

Das hereditäre nichtpolyposis-assoziierte kolorektale Karzinom Syndrom (HNPCC) ist eine autosomal-dominant vererbte Tumorprädisposition mit hoher Penetranz. Neben dem kolorektalen Karzinom haben betroffene Personen ein erhöhtes Risiko für das Auftreten von Endometrium-, Urothel-, Magen-, Ovarial- und hepatobiliären Karzinomen. Als Resultat eines defekten DNR-Reparatur-Mechanismus zeigen entsprechende Tumoren Veränderungen in der Anzahl der Wiederholungen einfacher Sequenzen (Grundzahl: 1–6 Nukleotide), genannt Mikrosatelliten-Instabilitäten (MSI). Weiterhin sind ca. 10–15% der sporadischen kolorektalen Tumoren Mikrosatelliten-instabil. Mutationen in den Mismatch-Repair-Genen hMSH2, hMLH1, hMSH6 und hPMS2 konnten als HNPCC assoziierte Keimbahnveränderungen identifiziert werden, wobei hMSH2- und hMLH1-Mutationen mit zusammen ca. 70% die Mehrzahl der genetischen HNPCC-Prädispositionen darstellen.The hereditary non-polyposis-associated Colorectal Carcinoma Syndrome (HNPCC) is an autosomal dominant inherited tumor predisposition with high penetrance. In addition to colorectal cancer, those affected People an elevated Risk for the appearance of endometrial, urothelial, gastric, ovarian and hepatobiliary carcinomas. As a result of a defective DNR repair mechanism corresponding tumors show changes in the number of repetitions of simple sequences (basic number: 1-6 nucleotides), called microsatellite instabilities (MSI). Furthermore, approx. 10-15% sporadic colorectal tumors microsatellite unstable. Mutations in the mismatch repair genes hMSH2, hMLH1, hMSH6 and hPMS2 germline changes associated with HNPCC could be identified, the majority being hMSH2 and hMLH1 mutations with a total of about 70% of HNPCC genetic predispositions represent.

Darüber hinaus konnten somatische Mutationen in einem weiteren Mismatch-Repair-Gen, hMSH3, in instabilen Tumorzelllinien und Tumoren identifiziert werden. Biochemische Analysen an menschlichen und Hefe-Substraten ergaben, dass sowohl das hMSH6-Protein wie auch das hMSH3-Protein jeweils heterodimere Proteinkomplexe mit dem hMSH2-Protein bilden. Die Stabilität der hMSH6- und hMSH3-Proteine hängt von der hMSH2-Expression ab.In addition, somatic Mutations in another mismatch repair gene, hMSH3, in unstable Tumor cell lines and tumors are identified. Biochemical analysis on human and yeast substrates revealed that both the hMSH6 protein and the hMSH3 protein in each case heterodimeric protein complexes with the hMSH2 protein form. The stability the hMSH6 and hMSH3 proteins hang on hMSH2 expression.

Diese beiden Proteinkomplexe erfüllen spezifische Funktionen innerhalb des Mismatch-Repair-Systems der Zelle bei der Erkennung von DNA-Fehlpaarungen. In vitro erkennt und bindet der mutSα-Proteinkomplex (bestehend aus dem hMSH2- und hMSH6-Protein) Basen-Fehlpaarungen und Insertion/Deletion-Loops (IDLs) von einem oder zwei Basen. Der mutSβ-Proteinkomplex (bestehend aus dem hMSH2- und hMSH3-Protein) unterstützt effizient die Reparatur von Insertions/Deletions-Heterologien von 2 bis 8 Basen, ist schwach aktiv bei Ein-Basen-IDLs und hat keine messbare Aktivität bei Basen-Fehlpaarungen. Die beiden Proteinkomplexe sind also zumindest teilweise redundant, sie überlappen sich in ihren Funktionen jedoch nicht vollständig. Weiterhin konnte bei Endometriumkarzinom-Zelllinien eine Bedeutung des hMSH2/hMSH3-Heterodimers für die genomische Stabilität nachgewiesen werden, was auf eine zweite Funktion dieses Komplexes hindeutet.These two protein complexes fulfill specific requirements Functions within the cell's mismatch repair system Detection of DNA mismatches. It recognizes and binds in vitro mutSα protein complex (consisting of the hMSH2 and hMSH6 protein) base mismatches and insertion / deletion loops (IDLs) from one or two bases. The mutSβ protein complex (consisting of the hMSH2 and hMSH3 protein) efficiently supports the repair insertion / deletion heterologies of 2 to 8 bases, is weakly active with single base IDLs and has no measurable activity with base mismatches. So the two protein complexes are at least partially redundant, they overlap however, their functions are not complete. Furthermore, at Endometrial carcinoma cell lines mean the hMSH2 / hMSH3 heterodimer for the genomic stability Evidence points to a second function of this complex suggesting.

An Knock-out-Mäusen konnte gezeigt werden, dass eine Msh2-Defizienz die Aktivität beider Proteinkomplexe zunichte macht, woraus eine starke Krebsdisposition erwächst. Bei Msh6-Defizienz beschleunigt ein zusätzlicher Msh3-Verlust die Tumorigenese intestinaler Tumoren und erreicht Werte vergleichbar mit Msh2-defizienten Mäusen. Der Funktionsverlust von Msh6 oder Msh3 bedingt jedoch nur einen partiellen Mismatch-Repair-Defekt. Eine Msh3-Defizient allein (bei intaktem Msh2 und Msh6) führt bei Mäusen zu einer späteren und verringerten Entstehung gastrointestinaler Tumoren, verglichen zu Msh2- oder Msh6-defizienten Mäusen.Knock-out mice showed that an Msh2 deficiency the activity both protein complexes nullifies, resulting in a strong cancer predisposition it grows. With Msh6 deficiency accelerates one more Msh3 loss reached and reached the tumorigenesis of intestinal tumors Values comparable to Msh2-deficient mice. The loss of function of Msh6 or Msh3, however, only causes a partial mismatch repair defect. An Msh3 deficient alone (with intact Msh2 and Msh6) leads to a later and in mice decreased development of gastrointestinal tumors compared to Msh2 or Msh6 deficient mice.

Das hMSH3-Gen wurde 1989 als erstes humanes Mismatch-Repair-Gen kloniert. Es liegt auf dem langen Arm von Chromosom 5 (5g11.2-g13.2) in unmittelbarer Nachbarschaft des Dihydrofolatreduktase (DHFR)-Gens. Beide Gene werden gemeinsam mittels eines bidirektionalen Promotors in geringer Intensität in allen bisher untersuchten Geweben exprimiert. Das hMSH3-Gen besteht aus 24 Exons und erstreckt sich über eine genomische Re gion von ca. 230 kb. Die kodierende Region beträgt 3387 bp, was einem Protein von 1128 Aminosäuren entspricht. Die einzelnen Exons, bzw. die kodierenden Regionen von Exon 1 und 24 haben eine Länge zwischen 65 und 221 bp.The hMSH3 gene was first in 1989 human mismatch repair gene cloned. It is on the long arm of chromosome 5 (5g11.2-g13.2) in the immediate vicinity of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene. Both genes are linked together using a bidirectional promoter in low intensity in all tissues examined so far. The hMSH3 gene exists out of 24 exons and spans a genomic region of approx. 230 kb. The coding region is 3387 bp, which corresponds to a protein of 1128 amino acids. The single ones Exons, or the coding regions of exon 1 and 24, have one Length between 65 and 221 bp.

Bisher wurden keine pathogenen Keimbahnmutationen im hMSH3-Gen beschrieben, jedoch zeigte sich bei einer von 19 untersuchten Familien eine Kopplung der Erkrankung mit dem hMSH3-Locus. Für den Wildtyp einer Missense-Variante konnte eine, verglichen zu Normalkontrollen, signifikant erhöhte Allelfrequenz bei Patienten mit sporadischen Mikrosatelliten-instabilen Kolonkarzinomen gefunden werden. Weiterhin wurde eine 27 bp Deletion in Exon 1 beschrieben, wobei der resultierende Verlust von neun Aminosäuren jedoch zumindest keine hochpenetrante funktionelle Konsequenz zu haben scheint und als Polymorphismus interpretiert wurde. Diese 27 bp Deletion besteht in der Deletion von drei von sechs Wiederholungen eines Imperfekten Repeats [Konsens-Sequenz: (G/C)C(C/T)(G/C)CAGCG], welches 151 Nukleotide nach dem ATG-Startcodon beginnt. Für eine japanische Population wurde gezeigt, das für dieses Repeat Allele mit drei bis sieben Wiederholungen auftreten. Damit ist die Kenntnis von Sequenzvarianten des MSH3-Gens, die mit den vorstehenden Erkrankungen bzw. Dispositionen in Zusammenhang stehen und somit als diagnostische Marker von Nutzen sein könnten, noch sehr begrenzt.So far, no pathogenic germline mutations have been identified described in the hMSH3 gene, but was found in one of 19 examined Families link the disease to the hMSH3 locus. For the wild type a Missense variant could, compared to normal controls, significantly increased Allele frequency in patients with sporadic microsatellite-unstable Colon carcinomas can be found. There was also a 27 bp deletion described in exon 1, with the resulting loss of nine amino acids however at least no highly penetrative functional consequence seems to have been interpreted as polymorphism. This 27 bp deletion consists of deleting three out of six repetitions an imperfect repeat [consensus sequence: (G / C) C (C / T) (G / C) CAGCG], which begins 151 nucleotides after the ATG start codon. For a Japanese Population has been shown for this repeat alleles occur with three to seven repetitions. This is the knowledge of sequence variants of the MSH3 gene that with the above diseases or dispositions in connection stand and could thus be useful as diagnostic markers, still very limited.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, weitere Marker zur Diagnose von mit MSH3 bzw. dessen abnormaler Expression/Aktivität in Zusammenhang stehenden Erkrankungen bzw. einer entsprechenden Prädisposition dafür zur Verfügung zu stellen.Thus, the present invention based on the technical problem, additional markers for the diagnosis of related to MSH3 or its abnormal expression / activity standing diseases or a corresponding predisposition for that disposal to deliver.

Die Lösung dieses technischen Problems wird durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.The solution to this technical problem is characterized by the provision of the claims embodiments achieved.

Sequenzvarianten (Polymorphismen und Mutationen) und resultierende Haplotypen in der DNA-Sequenz des humanen MSH3-Mismatch-Repair-Gens konnten ermittelt und deren Korrelationen mit Krankheitsprädispositionen und -dispositionen festgestellt werden, d.h. in der genomischen MSH3-Sequenz konnten zahlreiche Varianten gefunden werden. Es handelt sich dabei um Varianten an den folgenden genomischen Bereichen: 5'UTR –382, 5'UTR –151, 5'UTR –144, 5'UTR –50, 5'UTR –39, 5'UTR –35, Exon1 151, Intron 2 +40, Intron 2 +76, Intron 2 –7, Intron 3 +59, Intron 4 +50, Intron 5 +151, Intron 8 +71, Intron 9 +61, Intron 12 +98, Intron 20 –103, Intron 21 –29, Intron 21 –22, Intron 23 +64 und 3'UTR +898. Es wurde ferner gefunden, dass diese genetischen Varianten teilweise mit der Prädisposition für verschiedene Krankheiten, z. B. kolorektales Karzinom, korrelieren. Ausgehend von diesen Korrelationen erscheint eine Entwicklung von Verfahren zur Diagnose dieser Krankheitsprädispositionen und -dispositionen, sowie zur Prädiktion von Schweregrad, Verlauf und Überlebenszeit entsprechender Erkrankungen möglich und außerdem ein System (a) zur Prädiktion der individuellen Ansprechbarkeit von Neoplasien auf verschiedene Chemo-Therapeutika und (b) zur Entwicklung individuell spezifischer Chemo-Therapeutika. Außerdem erlauben die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Befunde die Entwicklung von Testsystemen zur Erforschung pathophysiologischer Zusammenhänge und Entwicklung oben genannter Therapeutika. Zusammenfassend kann für jeden hMSH3-Genotyp ein individuelles Risiko an einer bestimmten Krankheit zu erkranken, vorhergesagt werden.Sequence variants (polymorphisms and mutations) and resulting haplotypes in the DNA sequence of the human MSH3 mismatch repair gene were able to determine and their correlations with disease predispositions and dispositions are determined, i.e. in the genomic Numerous variants were found in the MSH3 sequence. It deals are variants in the following genomic areas: 5'UTR -382, 5'UTR -151, 5'UTR -144, 5'UTR -50, 5'UTR -39, 5'UTR -35, Exon1 151, intron 2 +40, intron 2 +76, intron 2 -7, intron 3 +59, intron 4 +50, intron 5 +151, intron 8 +71, intron 9 +61, intron 12 +98, intron 20-103, Intron 21-29, Intron 21-22, Intron 23 +64 and 3'UTR +898. It was also found that this genetic variants partly with the predisposition to different ones Diseases, e.g. B. colorectal cancer, correlate. outgoing from these correlations a development of procedures appears to diagnose these disease predispositions and dispositions, as well as for prediction of severity, course and survival corresponding diseases possible and also a system (a) for prediction the individual responsiveness of neoplasias to different Chemotherapeutic agents and (b) to develop individually specific Chemotherapeutics. Moreover allow the findings described in the present invention the development of test systems for research into pathophysiological Connections and Development of the aforementioned therapeutic agents. In summary, for everyone hMSH3 genotype an individual risk of a particular disease to be sick, to be predicted.

Kurze Beschreibung der FigurenShort description of the figures

1: Partielle Nukleotidabfolge der Referenz-Nukleinsäuresequenz von hMSH3 mit eingezeichneten neuen Sequenzvarianten Die partiell dargestellte Referenzsequenz ist die von Watanabe et al., Genomics 31(3) (1996), 311–318 publizierte hMSH3-Mismatch-Repair-Gen-Sequenz (GenBank-Zugangsnummer: J04810 und D61397-D61419). Die Positionen der Sequenzänderungen beziehen sich auf die Positionen der Referenzsequenz. Basen des kodierenden Bereichs (der Exons) und der 5'- und der 3'nichttranslatierten Regionen (UTR) sind mit Großbuchstaben dargestellt. Basen der Introns sind mit Kleinbuchstaben dargestellt. Kursiv geschriebene Basen kennzeichnen das Translations-Start-Codon in Exon 1 und das Translations-Stop-Codon in Exon 24. Zahlen vor den Zeilen mit Großbuchstaben geben die Position der ersten Base in der jeweiligen Zeile an, wobei die erste Base (A) des Translations-Start-Codons in Exon 1 Position 1 ist. Die Positionsangaben der Sequenzvarianten im kodierenden Bereich beziehen sich ebenfalls auf den Translations-Start. Fettgedruckte Basen der Referenzsequenz kennzeichnen Basen, die durch die dargestellten Sequenzvarianten ausgetauscht oder deletiert werden. Die Positionen für Sequenzvarianten in Introns (IVS) werden ermittelt, indem ab der ersten Base eines Introns mit +1, bzw. ab der letzten Base eines Introns mit –1 gezählt wird. Insertionen erfolgten vor der mit Pfeil gekennzeichneten Base, so dass in der veränderten Sequenz diese Position durch die erste Base der Insertion eingenommen wird. Es sind nur die Bereiche des MSH3-Gens dargestellt, in denen neue Sequenzvarianten identifiziert wurden. 1 : Partial nucleotide sequence of the reference nucleic acid sequence of hMSH3 with new sequence variants shown. The partially shown reference sequence is the hMSH3 mismatch repair gene sequence published by Watanabe et al., Genomics 31 (3) (1996), 311-318 (GenBank- Accession number: J04810 and D61397-D61419). The positions of the sequence changes relate to the positions of the reference sequence. Bases of the coding region (the exons) and the 5 'and 3' untranslated regions (UTR) are shown in capital letters. Bases of the introns are shown with lower case letters. Bases in italics indicate the translation start codon in exon 1 and the translation stop codon in exon 24. Numbers in front of the lines with capital letters indicate the position of the first base in the respective line, the first base (A) of the Translation start codons in exon 1 position 1. The position information of the sequence variants in the coding area also refer to the translation start. Bases in bold in the reference sequence indicate bases that are replaced or deleted by the sequence variants shown. The positions for sequence variants in introns (IVS) are determined by counting from the first base of an intron with +1, or from the last base of an intron with -1. Insertions were made before the base marked with an arrow, so that in the changed sequence this position is taken up by the first base of the insertion. Only the regions of the MSH3 gene are shown in which new sequence variants have been identified.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Nukleinsäuremolekül, das die das humane MSH3 Protein kodierende Nukleinsäuresequenz umfaßt, wobei sich die Sequenz dieses Nukleinsäuremoleküls gegenüber einer Referenzsequenz durch eine Mutation an einer oder mehreren der folgenden Positionen unterscheidet: (a) 5'UTR –382, –151, -144, –50, –39 und/oder – 35; (b) Exon 1 +151; (c) Intron 2 +40, +76, und/oder –7; (d) Intron 3 +59; (e) Intron 4 +50; (f) Intron 5 +151; (g) Intron 8 +71; (h) Intron 9 +61; (i) Intron 12 +98; (j) Intron 20 – 103; (k) Intron 21 –29 und/oder –22; (1) Intron 23 +64; oder (m) 3'UTR +898; oder ein Fragment der das humane MSH3 Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz, das eine oder mehrere der Mutationen gemäß (a) bis (m) umfaßt.Object of the present invention is thus a nucleic acid molecule that the comprises the nucleic acid sequence encoding the human MSH3 protein, wherein the sequence of this nucleic acid molecule is opposite one Reference sequence by mutating one or more of the following Positions differ: (a) 5'UTR -382, -151, -144, -50, -39 and / or - 35; (B) Exon 1 +151; (c) intron 2 +40, +76, and / or -7; (d) intron 3 +59; (e) intron 4 +50; (f) intron 5 +151; (g) intron 8 +71; (h) intron 9 +61; (I) Intron 12 +98; (j) intron 20-103; (k) Intron 21-29 and / or -22; (1) intron 23 +64; or (m) 3'UTR +898; or a fragment of that human MSH3 protein encoding nucleic acid sequence that contains one or more the mutations according to (a) to (m) includes.

Der hier verwendete Ausdruck „Referenzsequenz" bezieht sich auf die in Watanabe et al., Genomics 31(3) (1996), 311–318, beschriebene Nukleinsäuresequenz (GenBank-Zugangsnummer: J04810 und D61397-61419). Bezüglich der Bezeichnung der Positionen wird auf die Legende zu 1 verwiesen.The term "reference sequence" used here refers to the nucleic acid sequence described in Watanabe et al., Genomics 31 (3) (1996), 311-318 (GenBank accession number: J04810 and D61397-61419) towards the legend 1 directed.

Der hier verwendete Ausdruck „Fragment" bezieht sich auf Teilstücke der das MSH3 Protein kodierenden Nukleinsäuresequenz, die aber noch die entsprechende Mutation (oder mehrere) umfassen, wobei die Mutation bevorzugt in einem mittleren Bereich des Fragments liegt. Diese Fragmente sind z.B. als Sonden in diagnostischen Assays (gegebenenfalls in Kombination mit den entsprechenden, die Sequenz der Referenzsequenz enthaltenen Oligonukleotiden) von Nutzen und weisen eine Länge von mindestens 11 Basen, vorzugsweise von mindestens 15 Basen, mehr bevorzugt von mindestens 25 und am meisten bevorzugt von mindestens 50 Basen auf, die zu der MSH3-Nukleinsäuresequenz im wesentlichen identisch bzw. komplementär sind.The term "fragment" used here refers to sections of the nucleic acid sequence encoding the MSH3 protein, but which still comprise the corresponding mutation (or more), the mutation preferably being in a central region of the fragment. These fragments are used, for example, as probes in diagnostic Assays (optionally in combination with the corresponding oligonucleotides containing the sequence of the reference sequence) are useful and have a length of at least 11 bases, preferably of at least 15 bases, more preferably of at least 25 and most preferably of at least 50 bases the MSH3 nucleic acid sequence is essentially identical or complementary are.

Der hier verwendete Ausdruck „Mutation" bezieht sich auf alle Arten von Mutationen, unabhängig davon, ob diese zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz des MSH3 Proteins führen. Diese Mutationen umfassen den Austausch, die Insertion oder die Deletion von Base(n). Bezüglich einer Insertion beziehen sich die Positionsangaben 5' zu der angegebenen Position.The term "mutation" used here refers to all types of mutations regardless of whether this leads to a change the amino acid sequence of the MSH3 protein. These mutations include exchange, insertion, or Deletion of base (s). In terms of of an insertion, the position information 5 'relates to the specified one Position.

In einer bevorzugten Ausführungsform unterscheidet sich die Nukleinsäuresequenz des erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls gegenüber der Referenzsequenz durch folgende Mutation(en): (a) 5'UTR: –382: 19 Basen (TGGCGCGTCCCGCCCAGGT) deletiert; –151: Insertion eines C; –144: T→C; –50: C→T; –39: C→T; oder –35: A→G; (b) Exon 1 +151: 8 × 9 bp-Wiederholungseinheit SCYSCAGCK (mit S = C oder G; Y = C oder T; K = G oder T; eine analoge Schreibweise ist: (C/G)C(C/T)(C/G)CAGC(G/T)); (c) Intron 2 +40: T→C; +76: CTG, oder C→A; oder –7: G→A; (d) Intron 3 +59: G→A; (e) Intron 4 +50: G→A; (f) Intron 5 +151: G→A; (g) Intron 8 +71: T→C; (h) Intron 9 +61: C→A; (i) Intron 12 +98: A→G; (j) Intron 20 –103: T→C; (k) Intron 21 –29: Insertion TGAA; oder –22: T→A; (1) Intron 23 +64: G→A; oder (m) 3'UTR +898: G→A.In a preferred embodiment the nucleic acid sequence differs of the nucleic acid molecule according to the invention compared to the Reference sequence by the following mutation (s): (a) 5'UTR: -382: 19 Bases (TGGCGCGTCCCGCCCAGGT) deleted; -151: insertion of a C; -144: T → C; -50: C → T; -39: C → T; or -35: A → G; (b) Exon 1 +151: 8 × 9 bp repeat unit SCYSCAGCK (with S = C or G; Y = C or T; K = G or T; an analogous notation is: (C / G) C (C / T) (C / G) CAGC (G / T)); (c) Intron 2 +40: T → C; +76: CTG, or C → A; or –7: G → A; (D) Intron 3 +59: G → A; (e) intron 4 +50: G → A; (f) Intron 5 +151: G → A; (g) Intron 8 +71: T → C; (h) intron 9 +61: C → A; (i) Intron 12 +98: A → G; (j) Intron 20-103: T → C; (K) Intron 21-29: Insertion TGAA; or –22: T → A; (1) Intron 23 +64: G → A; or (m) 3'UTR +898: G → A.

In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform trägt das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder Fragment davon eine nachweisbare Markierung, vorzugsweise ist diese Markierung ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder Enzym-Cofaktor.In an even more preferred embodiment carries that nucleic acid molecule or fragment according to the invention of which a detectable marking, preferably this marking a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme or Enzyme cofactor.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen Vektor, der eine erfindungsgemäße DNA-Sequenz enthält. Geeignete Vektoren sind dem Fachmann bekannt. Allgemeine, auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Vektoren, die die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und gegebenenfalls geeignete Reportergene zum Studium der Promotoraktivität enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989), beschrieben sind.The present invention relates to furthermore a vector which contains a DNA sequence according to the invention. suitable Vectors are known to the person skilled in the art. General, in the field known methods can for the construction of vectors containing the DNA sequences according to the invention and, if appropriate, contain suitable reporter genes for studying the promoter activity, be used. These methods include, for example, in vitro recombination techniques, synthetic methods, as well as in vivo recombination methods, as for example in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989) are.

Dieser Vektor gestattet z.B. Untersuchungen zur Aktivität des veränderten MSH3 Proteins in einer humanen Zellinie oder die Suche nach Verbindungen, die die Aktivität des Proteins in gewünschter Weise beeinflussen und somit das Screenen nach therapeutischen Wirkstoffen erlauben. Verfahren zur Isolierung bzw. Synthese solcher Wirkstoffe sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise können möglicherweise nützliche Verbindungen in Extrakten von natürlichen Produkten als Ausgangsmaterial ge screent werden. Solche Extrakte können beispielsweise aus Pilzen, Actinomyceten, Algen, Insekten, Protozoen, Pflanzen und Bakterien stammen. Solche Verbindungen können auch synthetisch hergestellt werden. Die Herstellung und das simultane Screenen von großen Banken aus synthetischen Molekülen kann mittels gut bekannter Verfahren der kombinatorischen Chemie ausgeführt werden, siehe beispielsweise van Breemen, Anal. Chem. 69 (1997), 2159–2164 und Lam, Anticancer Drug Des. 12 (1997), 145–167. Die Methodik der kombinatorischen Chemie kann dazu verwendet werden, eine riesige Anzahl von Verbindungen zu erzeugen, die hinsichtlich spezifischer Verbindungen, die geeignete Bindungsaffinitäten, z.B. zu dem MSH3 Protein besitzen, sehr schnell gescreent werden können und Spezifitäten gegen ein beliebiges Ziel, wie die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, können genutzt werden (siehe für eine allgemeine Hintergrundinformation Gold, J. of Biol. Chem. 270 (1995), 13581–13584). Nützliche Verbindungen können auch mittels des "Rational drug design" erhalten werden, das einen integrierten Satz an Methoden beinhaltet, zu denen die Strukturanalyse von Zielmolekülen, synthetische Chemie und fortgeschrittene Computerverfahren zählen. Bei der Verwendung zum Entwurf von Modulatoren der MSH3-Proteinaktivität besteht das Ziel von "rational drug design" in einem Verständnis der dreidimensionalen Gestalt und der Chemie eines Moleküls. "Rational drug design" wird unterstützt von Daten, die durch Röntgenstrukturanalyse oder NMR gewonnen wurden; siehe dazu beispielsweise Coldren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 6635–6640.This vector allows e.g. investigations to activity of the changed MSH3 protein in a human cell line or the search for compounds the the activity of the protein in the desired Affect way and thus the screening for therapeutic agents allow. Process for the isolation or synthesis of such active substances are known to the person skilled in the art. For example, there may be useful compounds in extracts of natural Products are screened as starting material. Such extracts can for example from fungi, actinomycetes, algae, insects, protozoa, Plants and bacteria come from. Such connections can also be made synthetically. The manufacturing and the simultaneous Screening of large Banks made of synthetic molecules can be done using well known combinatorial chemistry techniques accomplished see, for example, van Breemen, Anal. Chem. 69: 2159-2164 (1997) and Lam, Anticancer Drug Des. 12: 145-167 (1997). The methodology of combinatorial Chemistry can be used to make a huge number of compounds to generate the most appropriate in terms of specific compounds Binding affinities, e.g. to which MSH3 have protein can be screened very quickly can and specificities against any target, such as the DNA sequences according to the invention, can be used (see for general background information Gold, J. of Biol. Chem. 270 (1995), 13581-13584). helpful Connections can can also be obtained by means of the "rational drug design", the one includes an integrated set of methods, including structural analysis of target molecules, synthetic chemistry and advanced computer techniques count. at use to design modulators of MSH3 protein activity the goal of "rational drug design" in an understanding of three-dimensional shape and chemistry of a molecule. "Rational drug design "is supported of data by X-ray structural analysis or NMR were obtained; see, for example, Coldren, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6635-6640 (1997).

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung, die zur Therapie oder Prävention einer mit MSH3 assoziierten Erkrankung geeignet ist, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Inkontaktbringen einer zu untersuchenden Verbindung mit einem von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodierten MSH3-Protein oder einer diese Nukleinsäure exprimierenden Zelle; und
(b) Bestimmen der Wirkung dieser Verbindung auf die Aktivität des MSH3-Protreins, wobei eine Steigerung oder Wiederherstellung der Aktivität ein Anzeichen dafür ist, dass die Verbindung therapeutisch von Nutzen ist.

The present invention thus also relates to a method for identifying a compound which is suitable for the therapy or prevention of a disease associated with MSH3, the method comprising the following steps:

(a) bringing a compound to be examined into contact with an MSH3 protein encoded by a nucleic acid according to the invention or with a cell expressing this nucleic acid; and
(b) determining the effect of this compound on the activity of the MSH3 protein, an increase or restoration of the activity being an indication that the compound is therapeutically useful.

Geeignete Assays zur Bestimmung der biologischen Aktivität von MSH3 sind dem Fachmann bekannt und z.B. auch in Acharya et al., 1996, PNAS 93:13629–13634 beschrieben.Suitable assays for determining the biological activity of MSH3 are known to the person skilled in the art and e.g. also in Acharya et al., 1996, PNAS 93: 13629-13634 described.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die vorstehend beschriebenen Vektoren enthaltende Wirtszellen. Zu diesen Wirtszellen zählen vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugte Säugerzellen sind CHO-, VERO-, BHK-, HeLa-, COS-, MDCK, 293- und WI38-Zellen. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zum Studium der Expression von Reportergenen unter Kontrolle der erfindungsgemäßen DNA-Moleküle unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.The present invention also relates to host cells containing the vectors described above. These host cells preferably include mammalian cells. Preferred mammalian cells are CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293 and WI38 cells. Methods for transforming these host cells, for phenotypically selecting transformants and for studying the expression of reporter genes under the control of the DNA molecules according to the invention using the vectors described above are known in the art.

Die vorliegende Erfindung ermöglicht es auch, Störungen bzw. Krankheiten, die mit MSH3 in Zusammenhang stehen, d.h., mit dessen gestörter Expression bzw. einer (gegenüber der Normalsituation veränderten) Aktivität des kodierten Proteins, auf genetischer Ebene zu untersuchen. Mit einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz bzw. davon abgeleiteten Sonden oder Primern kann in Säugern, insbesondere dem Menschen, z.B. festgestellt werden, ob die DNA-Sequenz die eine oder mehrere der erfindungsgemäßen Mutationen aufweist.The present invention makes it possible also, disorders or diseases related to MSH3, i.e. with its disturbed Expression or one (opposite changed the normal situation) activity of the encoded protein to be examined at the genetic level. With a DNA sequence according to the invention or thereof derived probes or primers can be found in mammals, particularly humans, e.g. determine whether the DNA sequence is one or more of the mutations according to the invention having.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose einer mit MSH3 in Zusammenhang stehenden Erkrankung oder einer Prädisposition dafür oder zur Prädikation des Verlaufs, des Schweregrads und/oder der Überlebensdauer bei einer solchen Erkrankung, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure enthaltende Probe von einer zu untersuchenden Person gewonnen und mindestens an einer Position gemäß Anspruch 1 oder 2 genotypisiert und mit einer Referenzsequenz verglichen wird, wobei das Vorliegen einer oder mehrerer Veränderungen gemäß Anspruch 1 oder 2 ein Anzeichen für eine Erkrankung oder eine Prädisposition dafür ist oder eine Prädikation des Verlaufs, des Schweregrads und/oder der Überlebensdauer bei einer solchen Erkrankung erlaubt.The present invention thus relates also a method of diagnosing an MSH3-related Disease or predisposition for it or for predication the course, severity and / or survival of such Disease, characterized in that a nucleic acid-containing Sample obtained from a person to be examined and at least in a position according to claim 1 or 2 genotyped and compared to a reference sequence being, the presence of one or more changes according to claim 1 or 2 an indication of a disease or predisposition for that is or a predication the course, severity and / or survival of such Disease allowed.

Der Fachmann kennt Verfahren zur Probenentnahme, wobei geeignete Proben z.B Blut, Normal- oder Tumorgewebe sowie Speichel sind. Nukleinsäure des Patienten kann dabei ohne vorherige Reinigung oder in gereinigter Form – je nach verwendetem Analyseverfahren – genotypisiert werden. Die Genotypisierung kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen, z.8. durch Sequenzierung oder durch andere Methoden, die für die Detektion von Punktmutationen oder Insertionen/Deletionen geeignet sind. Dazu gehören PCR-gestützte Genotypisierungsverfahren wie z. B. allelspezifische PCR, andere Genotypisierungsverfahren unter Verwendung von Oligonukleotiden (z.B. „dot blotting" oder „Oligonucleotide Ligation Assays" (OLA), Verfahren unter Verwendung von Restriktionsenzymen und „Single Nucleotide Polymorphism" (SNP)-Analyse mittels „Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry" (MALDI), sowie die Chip-Technologie in all ihren technologischen Ausführungen. Die Insertions- und Deletionsvarianten können des weiteren auch durch Fragmentlängenbestimmung auf Agarose- oder Polyacrylamid-Gelen oder anderen geeigneten Separationsmedien bestimmt werden. Vorzugsweise sind die Primer für die PCR Oligonukleotide, die einen Nukleinsäure-Bereich umfassen, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (gemäß der Definition in Sambrook, supra) mit mindestens 11, vorzugsweise mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotiden der MSH3-Sequenz hybridisieren und den Bereich mit der fraglichen Mutation 5' und 3' flankieren. Die Primer können auch eine Markierung tragen, z.B. ein Radioisotop, fluoreszierende Verbindung, Enzym oder Enzym-Cofaktor.The person skilled in the art knows processes for Sampling, whereby suitable samples e.g. blood, normal or tumor tissue as well as saliva. nucleic acid the patient can do so without prior cleaning or in cleaned Shape - each according to the analysis method used - be genotyped. The Genotyping can be carried out by methods known to the person skilled in the art, Z.8. by sequencing or by other methods used for detection point mutations or insertions / deletions. To belong PCR-based Genotyping procedures such as B. allele-specific PCR, others Genotyping method using oligonucleotides (e.g. "dot blotting "or" oligonucleotides Ligation Assays "(OLA), method using restriction enzymes and "Single Nucleotide Polymorphism "(SNP) analysis using" Matrix-assisted Laser Desorption / Ionization Mass Spectrometry "(MALDI), as well as the chip technology in all its technological Versions. The insertion and deletion variants can also be determined by fragment length on agarose or polyacrylamide gels or other suitable separation media be determined. The primers for the PCR are preferably oligonucleotides, which is a nucleic acid region include, under stringent hybridization conditions (as defined in Sambrook, supra) with at least 11, preferably at least 15 hybridize successive nucleotides of the MSH3 sequence and flank the area with the mutation 5 'and 3' in question. The Primers can also carry a marker, e.g. a radioisotope, fluorescent Compound, enzyme or enzyme cofactor.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren dadurch gekennzeichnet, dass es die Diagnose einer malignen Erkrankung, vorzugsweise eine Neoplasie, ein kolorektales Karzinom, ein Ovarialkarzinom oder eine Leukämie bzw. Prädisposition dafür etc., betrifft. So kann mit dem erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren beispielsweise eine Prädisposition für das Entstehen von kolorektalen Adenomen und deren Weiterentwicklung zum kolorektalen Karzinom untersucht werden. Das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren eignet sich schließlich auch für den Nachweis von Krankheitsprädispositionen in Populationen als auch Familien.In a preferred embodiment is the diagnostic method according to the invention characterized in that it is the diagnosis of a malignancy, preferably neoplasia, colorectal cancer, ovarian cancer or leukemia or predisposition for that etc., concerns. For example, with the diagnostic method according to the invention a predisposition for the Emergence of colorectal adenomas and their further development for colorectal cancer. The diagnostic method according to the invention is ultimately suitable also for the detection of disease predispositions in populations as well as families.

Die Diagnose von Mismatch-Reparatur(MMR)-Defizienz bei Tumoren aufgrund von Mutationen in den entsprechenden Genen ist auch deshalb von Bedeutung, da entsprechende Tumoren Resistenzen gegen verschiedene Chemo-Therapeutika (Cisplatin, Alkylanzien), vermutlich aufgrund der hohen Mutationsraten, entwickeln. In Hefe konnte gezeigt werden, dass die Inaktivierung von MSH3, analog zur Inaktivierung von MLH1, MSH2 und MSH6, eine gesteigerte Resistenz gegen Cisplatin, Carboplatin und Doxorubicin hervorruft. Daraus können sich unmittelbare Konsequenzen für die Therapie von Patienten ergeben, deren Tumoren auf Basis einer hMSH3-Defizienz entstanden sind.Diagnosing Mismatch Repair (MMR) Deficiency in tumors due to mutations in the corresponding genes is also important because corresponding tumors are resistant against various chemotherapeutic agents (cisplatin, alkylating agents), probably due to the high mutation rates. In yeast could be shown that the inactivation of MSH3, analogous to Inactivation of MLH1, MSH2 and MSH6, increased resistance against cisplatin, carboplatin and doxorubicin. From that you can immediate consequences for the therapy of patients whose tumors are based on a hMSH3 deficiency have arisen.

Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Diagnose einer MSH3-bedingten Chemotherapie-Resistenz, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure enthaltende Probe von einer zu untersuchenden Person gewonnen wird und mindestens an einer Position gemäß Anspruch 1 oder 2 genotypisiert und mit einer Referenzsequenz verglichen wird, wobei das Vorliegen einer oder mehrerer Veränderungen gemäß Anspruch 1 oder 2 ein Anzeichen für eine Chemotherapie-Resistenz, vorzugsweise gegenüber Cysplatin, Carboplatin oder Doxorubicin ist. Die Diagnose einer solchen Resistenz erlaubt die Durchführung entsprechend angepaßter therapeutischer Maßnahmen.The present invention thus relates also a method for diagnosing MSH3-related chemotherapy resistance, characterized in that a sample containing nucleic acid from a person to be examined is won and at least at one position according to claim 1 or 2 genotyped and compared to a reference sequence being, the presence of one or more changes according to claim 1 or 2 an indication of chemotherapy resistance, preferably to cysplatin, carboplatin or doxorubicin. The diagnosis of such resistance allows the implementation accordingly adapted therapeutic measures.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens, der ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül oder ein Fragment davon gemäß vorstehender Definiton enthält oder mindestens einen Primer oder Primersatz gemäß der vorstehenden Definition. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können das Nukleinsäuremolekül oder das Fragment davon bzw. der (die) Primer immobilisiert sein.Finally, the present concerns Invention a diagnostic kit for performing the diagnostic method according to the invention, which is a nucleic acid molecule according to the invention or a Fragment of it according to the above Definiton contains or at least one primer or set of primers as defined above. Depending on the configuration of the diagnostic kit, the nucleic acid molecule or the fragment thereof or the primer (s) be immobilized.

Unter die Definition der erfindungsgemäßen Wirtszellen fallen auch Kulturen von z.B. neoplastischen Zellen, die die erfindungsgemäßen individuellen hMSH3-Genvarianten oder unterschiedliche Kombinationen davon aufweisen können als in vitro-Testmodelle für die Entwicklung individuell spezifischer Therapeutika (z.B. Chemotherapeutika, die nicht zu einer Resistenz der neoplastischen Zellen führen) dienen. Für diesen Zweck können aber auch in vivo-Testmodelle (vorzugsweise nicht-menschliche transgene Tiere) verwendet werden, die die erfindungsgemäßen individuellen hMSH3-Genvarianten oder unterschiedliche Kombinationen davon tragen. Als individuelle Testmodelle erlauben sie in vitro (= ex vivo) z.B. eine Vorhersage zum individuellen Funktionszustand von Chemotherapeutika bei der Behandlung von Neoplasien, deren Entstehung durch die Defizienz des hMSH3-Mismatch-Repair-gens vermittelt wird.The definition of the host cells according to the invention also includes cultures of, for example, neoplastic cells which may have the individual hMSH3 gene variants according to the invention or different combinations thereof as in vitro test models for the development of individually specific therapeutic agents (for example Chemotherapy drugs that do not result in resistance of the neoplastic cells). However, in vivo test models (preferably non-human transgenic animals) which carry the individual hMSH3 gene variants according to the invention or different combinations thereof can also be used for this purpose. As individual test models they allow in vitro (= ex vivo), for example, a prediction of the individual functional state of chemotherapeutic agents in the treatment of neoplasia, the development of which is mediated by the deficiency of the hMSH3 mismatch repair gene.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Vektors, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die sich von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz dadurch unterscheidet, dass sie keine Austausche enthält, sondern in dem verwendeten Bereich der MSH3-Referenzsequenz oder einem Teil davon entspricht, zur Gentherapie.The present invention relates to also the use of a vector containing a nucleic acid sequence which differs from a nucleic acid sequence according to the invention differs in that it contains no exchanges, but rather or part of the MSH3 reference sequence used of which corresponds to gene therapy.

Vorzugsweise werden diese Nukleinsäuresequenzen, vorzugsweise DNA-Sequenzen, in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert, beispielsweise unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors, und in die Zellen eingeschleust. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehend beschriebenen DNA-Sequenzen enthaltende Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder Adenovirus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Für Zwecke der Gentherapie können die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).These nucleic acid sequences are preferably preferably DNA sequences, in one suitable for gene therapy Vector inserted, for example under the control of a tissue-specific one Promotors, and introduced into the cells. In a preferred one embodiment is the vector containing the DNA sequences described above a virus, for example an adenovirus, vaccinia virus or adenovirus. Especially retroviruses are preferred. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV. For gene therapy purposes, the DNA sequences according to the invention also transported in the form of colloidal dispersions to the target cells become. These include for example liposomes or lipoplexes (Mannino et al., Biotechniques 6: 682 (1988).

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Arzneimittel, das einen vorstehend beschriebenen Vektor bzw. eine MSH3-Referenzsequenz oder ein Fragment davon oder eine gemäß dem erfindungsgemäßen Screening-Verfahren identifizierte Verbindung enthält. Dieses Arzneimittel enthält gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung des Arzneimittels kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle, intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, der Art und dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc..Finally, the present concerns The invention also includes a medicament comprising one described above Vector or an MSH3 reference sequence or a fragment thereof or one according to the screening method according to the invention contains identified compound. This medicine contains if necessary additionally a pharmaceutically acceptable one Carrier. Suitable carriers and the formulation of such drugs are known to those skilled in the art. To suitable carriers counting for example phosphate buffered saline solutions, water, emulsions, for example oil / water emulsions, Wetting agents, sterile solutions etc. Administration of the drug can be oral or parenteral respectively. The procedures for parenteral administration includes topical, intra-arterial, intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal or intranasal administration. The right dosage is determined by the attending physician and depends on various factors depending, for example, on the age, gender, weight of the Patients, the type and stage of the disease, the mode of administration Etc..

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the Invention.

Beispiel 1example 1

Allgemeine VerfahrenGeneral procedures

Für die Erhebung des gesamten polymorphen Spektrums des hMSH3-Mismatch-Repair-Gens wurden die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die DNA-Sequenzierung nach Sanger verwendet. Hierzu wurde die gesamte kodierende Sequenz inklusive der flankierenden Intronbereiche und Teile der 5'- und 3'-nichttranslatierten Regionen in 22 Fragmente unterteilt und mittels PCR amplifiziert. Die hierfür erstellten und genutzten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt.For the collection of the entire polymorphic spectrum of the hMSH3 mismatch repair gene were the polymerase chain reaction (PCR) and DNA sequencing used according to Sanger. For this, the entire coding sequence including the flanking intron areas and parts of the 5 'and 3'-untranslated regions divided into 22 fragments and by PCR amplified. The one for this primers created and used are listed in Table 1.

Die PCR wurde in 25 μl Reaktionsvolumen mit 30–50 ng genomischer DNA, 1,7 mM MgCl, 200 nM jedes der vier Dinukleotide, 200 nM jeder der beiden Primer, 1 Unit Taq-Polymerase (Ampli-Taq von PE Applied Biosystems, Deutschland, Weiterstadt) und 10% des zur Taq-Polymerase mitgelieferten 10 × PCR-Puffers durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen waren 5 min 94°C gefolgt von 35 Zyklen mit 1 min 94°C, 1 min 58 °C und 2 min 72°C und abschließend 7 min 72°C. Das erste Fragment, welches Exon 1 enthält, wurde abweichend zu den oben genannten Bedingungen mit einer Denaturations-Temperatur von 96°C und einer Annealing-Temperatur von 60°C amplifiziert, wobei als DNA-Polymerase und PCR-Puffer der Expand High Fidelity Kit (Roche Diagnostics, Deutschland, Mannheim) genutzt wurde.The PCR was in 25 ul reaction volume with 30-50 ng genomic DNA, 1.7 mM MgCl, 200 nM each of the four dinucleotides, 200 nM each of the two primers, 1 unit Taq polymerase (Ampli-Taq from PE Applied Biosystems, Germany, Weiterstadt) and 10% of the supplied Taq polymerase 10 × PCR buffers performed. The Reaction conditions were 94 ° C for 5 min followed by 35 cycles 1 min 94 ° C, 1 min 58 ° C and 2 min 72 ° C and finally 7 min 72 ° C. The first fragment, which contains exon 1, deviated from that above conditions with a denaturation temperature of 96 ° C and an annealing temperature of 60 ° C amplified, being used as a DNA polymerase and PCR buffer from the Expand High Fidelity Kit (Roche Diagnostics, Germany, Mannheim) was used.

Die fertigen Reaktionen wurden auf Agarosegelen (1 % Agarose, 1 × TAE-Puffer) im elektrischen Feld aufgetrennt und mit Ethidiumbromid angefärbt. Anschließend wurden die amplifizierten Fragmente unter UV-Licht aus den Agarose-Gelen ausgeschnitten und mit sterilem, deionisiertem Wasser durch Inkubieren für 3 h bei 75°C oder für 10 h bei 30 °C oder durch Filterzentrifugation für 2 min bei 800 G eluiert.The finished reactions were on Agarose gels (1% agarose, 1 × TAE buffer) separated in an electric field and stained with ethidium bromide. Then were the amplified fragments under UV light from the agarose gels cut out and incubate with sterile, deionized water for 3 h at 75 ° C or for 10 h at 30 ° C or eluted by filter centrifugation at 800 G for 2 min.

Die so gewonnenen Eluate wurden mittels des Thermo Sequenase^TM Fluorescent Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Deutschland, Freiburg) und Primer, die auch zur Fragmentamplifikation genutzt wurden, sowie weitere, fragmentinterne Primer (wie in Tabelle 1 aufgeführt) sequenziert. Für jede zu generierende Sequenz wurden vier Reaktionen durchgeführt, welche 5 μl Eluat, 1 μl eines 1 mM Sequenzier-Primers und 2 μl Sequenzierreagent-Mix (Thermo Sequenase, dNTPs und jeweils ddATPs, ddCTPs, ddGTPs oder ddTTPs) in einem Gesamtvolumen von 8 μl enthielten. Die Reaktionsbedingungen waren 2 min 94°C, gefolgt von 20 Zyklen 30 sec 94°C und 30 sec 60°C und abschließend 2 min 72°C. Alle für die Sequenzierung genutzten Primer waren Cy5-Farbstoff markiert, was die Detektion der Produkte der Sequenzierreaktionen auf „Automated Laser Fluorescent (ALF) express"-Sequenzierautomaten (Amersham Pharmacia Biotech, Deutschland, Freiburg) ermöglichte. Entsprechend erfolgte die Bestimmung der Sequenzen mittels ALFexpress Sequenzierautomaten. Die Elektrophorese wurde mit Standardplatten mit 0,3 mm starken Long Ranger^TM- (FMC BioProducts, Rockland, Maine, USA) oder Polyacrylamid (PAA)-Gelen (6,5 % Long Ranger oder PAA, 7 M Urea, 1 × TBE-Puffer) bei 950 V, 38 mA und 42 W für 10 Stunden durchgeführt. Sämtliche PCR- und Sequenzierungsreaktionen wurden mittels GeneAmp^® PCR Systemen 9700 (PE Applied Biosystems, Deutschland, Weiterstadt) durchgeführt.The eluates obtained in this way were sequenced using the Thermo Sequenase ^™ Fluorescent Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Germany, Freiburg) and primers, which were also used for fragment amplification, as well as further, internal fragment primers (as listed in Table 1). For each sequence to be generated, four reactions were carried out, which included 5 μl eluate, 1 μl of a 1 mM sequencing primer and 2 μl sequencing reagent mix (Thermo Sequenase, dNTPs and each ddATPs, ddCTPs, ddGTPs or ddTTPs) in a total volume of 8 μl contained. The reaction conditions were 94 ° C for 2 minutes, followed by 20 cycles of 94 ° C for 30 seconds and 60 ° C for 30 seconds and finally 72 ° C for 2 minutes. All for sequencing Primers used were labeled with Cy5 dye, which made it possible to detect the products of the sequencing reactions on "Automated Laser Fluorescent (ALF) express" automated sequencers (Amersham Pharmacia Biotech, Germany, Freiburg). The sequences were accordingly determined using ALFexpress automated sequencers. The electrophoresis was made with standard plates with 0.3 mm Long Ranger ^TM (FMC BioProducts, Rockland, Maine, USA) or polyacrylamide (PAA) gels (6.5% Long Ranger or PAA, 7 M urea, 1 × TBE buffer) at 950 V, 38 mA and 42 W performed for 10 hours. All PCR and sequencing reactions ^® PCR system 9700 (PE Applied Biosystems, Germany, Weiterstadt, Germany) were performed using GeneAmp.

Tabelle 1: Primer für die Amplifikation und Sequenzierung des hMSH3-Mismatch-Repair-Gens

Table 1: Primers for the amplification and sequencing of the hMSH3 mismatch repair gene

^aPrimer mit einem 'y' in der Bezeichnung sind Cy5 Farbstoffmarkiert und wurden für die Sequenzierung eingesetzt. ^a Primers with a 'y' in the designation are labeled with Cy5 dye and were used for sequencing.

Beispiel 2: In Patienten mit vererbten oder sporadischen Neoplasien neu identifizierte MSH3-VariantenExample 2: In patients MSH3 variants newly identified with inherited or sporadic neoplasms

Es wurde die genomische DNA-Sequenz des menschlichen MSH3-Gens (Teile der 5'- und 3'-nichttranslatierten Region, sowie alle 24 kodierenden Exons und deren flankierende Intronbereiche) in Patienten mit vererbten oder sporadischen Neoplasien und nicht betroffenen Kontrollpersonen mittels der DNA-Sequenzierung nach Sanger (nach erfolgter Amplifikation der entsprechenden Gen-Abschnitte mittels Polymerasekettenreaktion und spezifischen Primern) untersucht, und zunächst eine Reihe von genetischen Varianten identifiziert, wobei die Untersuchungsanzahl 40 DNAs betrug. In den untersuchten Gen-Abschnitten wurden insgesamt 21 neue Varianten entdeckt (siehe Tabelle 2).It became the genomic DNA sequence of the human MSH3 gene (parts of the 5'- and 3'-untranslated Region, as well as all 24 coding exons and their flanking intron areas) in patients with inherited or sporadic neoplasms and not affected control subjects by means of DNA sequencing Sanger (after the corresponding gene segments have been amplified using a polymerase chain reaction and specific primers), and first identified a number of genetic variants, the number of tests Was 40 DNAs. In the examined gene sections, a total of 21 new variants discovered (see Table 2).

Als Referenzsequenz für die Varianten, deren Positionen und Konsequenzen für die Aminosäurekodierung dienten die genomische und die mRNA Gen-Sequenz von hMSH3 (GenBank Accession Nr.: U61981 sowie GenBank Accessions J04810 und D61397-D61419). Die Positionsangaben für die Sequenzvarianten in den Exons beziehen sich auf die erste Base des Translations-Start- Codons (Position 1). Die Positionsangaben für die Sequerizvarianten in den Introns (Intron 1 liegt zwischen Exon 1 und 2 u.s.w.) beziehen sich entweder auf die erste Base des jeweiligen Introns nach dem vorhergehenden Exon (Position +1), oder auf die letzte Base des jeweiligen Introns vor dem nächsten Exon (Position –1). Für Insertionen und Deletionen ist jeweils die in Leserichtung letzte Möglichkeit einer Mutation, die zur gefundenen Sequenz führt, angegeben.As a reference sequence for the variants, their positions and consequences for amino acid coding served the genomic and the mRNA gene sequence of hMSH3 (GenBank Accession no .: U61981 and GenBank Accessions J04810 and D61397-D61419). The position information for the Sequence variants in the exons refer to the first base of the Translation start codons (Position 1). The position information for the Sequeriz variants in relate to the introns (intron 1 lies between exon 1 and 2 etc.) either on the first base of the respective intron after the previous exon (position +1), or to the last base of the respective introns before the next Exon (position -1). For insertions and deletions is the last option in the direction of reading a mutation that leads to the sequence found.

Tabelle 2: Neu identifizierte Sequenzvarianten im Mismatch-Repair-Gen hMSH3

Table 2: Newly identified sequence variants in the mismatch repair gene hMSH3

Diese Varianten sind in 1 in Bezug auf die Basenabfolge der Referenzsequenzen (GenBank J04810, D61397-D61419, U61981) des hMSH3-Gens übersichtlich dargestellt.These variants are in 1 with regard to the base sequence of the reference sequences (GenBank J04810, D61397-D61419, U61981) of the hMSH3 gene is clearly shown.

Korrelationen mit Erkrankungen, Prädispositionen bzw. klinisch relevanten Phänotypen:Correlations with diseases, predispositions or clinically relevant phenotypes:

Einen spezifischen Einfluß auf das Risiko an einem Karzinom zu erkranken, konnte z.B. für die variable Region beginnend an Position 151 (Exon 1) und für die C → T Transition an Position –39 der 5'UTR nachgewiesen werden. Die Insertion/Deletion führt bei der Translation zu einer variablen Anzahl der Aminosäuren Alanin und Prolin. In Tumorzellen von Patienten ist das zweite Allel des hMSH3-Gens oft durch eine weitere, somatische Mutation (meist Verlust des gesamten Alleles) inaktiviert, so dass diese Zellen ohne vollständiges hMSH3-Genprodukt bleiben. Analog treten die hier beschriebenen Sequenzvarianten in der 5'UTR bei bestimmten Gruppen von Patienten mit nach molekulargenetischen Merkmalen subklassifizierten kolorektalen Karzinomen häufiger auf, als in der Normalbevölkerung. Damit ergibt sich für diese Varianten ein weiterer hier identifizierter Risikofaktor.A specific influence on that Risk of developing cancer, for example, could for the variable region starting at position 151 (exon 1) and for the C → T transition at position –39 the 5'UTR can be detected. The insertion / deletion leads to translation to a variable number of amino acids alanine and proline. In patient tumor cells, the second allele is the hMSH3 gene often due to another somatic mutation (mostly loss of the entire allele) is inactivated so that these cells remain without a complete hMSH3 gene product. The sequence variants described here occur analogously in the 5'UTR in certain groups of patients with molecular genetic Features subclassified colorectal cancer more often, than in the general population. This results in these variants are another risk factor identified here.

Von den Erfindern wurde herausgefunden, daß die Sequenzvariante an Position 151 von Exon 1 mit 8 Wiederholungen des Imperfekten 9 bp Repeats seltener bei Patienten mit kolorektalen Tumoren (1–2% in > 60 Patienten) als in der Normalbevölkerung (4–5% in > 150 Individuen) auftritt. Für die 5'UTR Position –39 ist das T-Allel mit dem Auftreten von kolorektalen Karzinomen assoziiert. Ähnliche Assoziationen liegen für die weiteren Sequenzvarianten bzw. Haplotypen vor. Somit läßt sich ein indi viduelles Risiko an einer Krankheit (z.B. kolorektalem Karzinom) zu erkranken für jede Sequenz- bzw. Haplotypenvariante der hier beschriebenen Polymorphismen mit oder ohne Berücksichtung weiterer, bereits bekannter, Polymorphismen bestimmen.The inventors found out that the Sequence variant at position 151 of exon 1 with 8 repeats of the imperfect 9 bp repeats less common in patients with colorectal Tumors (1–2% in> 60 patients) than in the general population (4-5% in> 150 individuals) occurs. For the 5'UTR position -39 the T allele is associated with the appearance of colorectal cancer. Similar Associations lie for the further sequence variants or haplotypes. So you can an individual risk of a disease (e.g. colorectal cancer) to fall ill for any sequence or haplotype variant of the polymorphisms described here with or without consideration determine other, already known, polymorphisms.

Claims

Nucleic acid molecule comprising the nucleic acid sequence encoding the human MSH3 protein, where wherein the sequence of this nucleic acid molecule differs from a reference sequence by a mutation at one or more of the following positions: (a) 5'UTR -382, -151, -144, -50, -39 and / or -35; (b) exon 1 +151; (c) intron 2 +40, +76, and / or -7; (d) intron 3 +59; (e) intron 4 +50; (f) intron 5 +151; (g) intron 8 +71; (h) intron 9 +61; (i) intron 12 +98; (j) intron 20-103; (k) intron 21-29 and / or -22; (l) intron 23 +64; and / or (m) 3'UTR +898; or a fragment of the nucleic acid sequence encoding the human MSH3 protein, which comprises one or more of the mutations according to (a) to (m).

Nucleic acid molecule according to claim 1, its nucleic acid sequence across from distinguishes a reference sequence by the following mutation (s): (A) 5'UTR: -382: 19 bases (TGGCGCGTCCCGCCCAGGT) deleted; -151: insertion of a C; -144: T → C; -50: C → T; -39: C → T; or -35: A → G; (B) Exon 1 +151: 8 × 9 bp repeat unit SCYSCAGCK (with S = C or G; Y = C or T; K = G or T); (c) Intron 2 +40: T → C; +76: C → G or C → A; or -7: G → A; (d) intron 3 +59: G → A; (E) Intron 4 +50: G → A; (F) Intron 5 +151: G → A; (G) Intron 8 +71: T → C; (H) Intron 9 +61: C → A; (I) Intron 12 +98: A → G; (J) Intron 20-103: T → C; (K) Intron 21-29: Insertion TGAA; or –22: T → A; (L) Intron 23 +64: G → A; or (m) 3'UTR +898: G → A.

Nucleic acid molecule according to claim 1 or 2 or fragment thereof bearing a detectable label.

Vector, a nucleic acid sequence according to claim 1 or 2 containing.

Host cell that transfects with the vector of claim 4 is.

Procedure for diagnosing a MSH3-related Disease or predisposition for it or for predication the course, severity and / or survival of such Disease, characterized in that a nucleic acid-containing Sample is obtained from a person to be examined and at least in a position according to claim 1 or 2 genotyped and compared to a reference sequence being, the presence of one or more changes according to claim 1 or 2 an indication of a disease or predisposition for that is or a predication of the Course, severity and / or survival of such Disease allowed.

The method of claim 6, wherein at least the possible Mutations according to claim 1 (a) and 1 (b) or 2 (a) and 2 (b) genotyped and with a reference sequence be compared.

The method of claim 6 or 7, wherein the disease is a is malignant disease.

The method of claim 8, wherein the malignant disease is a Neoplasia, a colorectal cancer, an endometrial cancer Ovarian cancer or leukemia is.

Method for diagnosing MSH3-related chemotherapy resistance, characterized in that a sample containing nucleic acid is obtained from a person to be examined and at least genotyped at least one position according to claim 1 or 2 and compared with a reference sequence, wherein the presence of one or more changes according to claim 1 or 2 is an indication of chemotherapy resistance.

Diagnostic kit for carrying out the method according to one of claims 6 to 10, which contains a nucleic acid molecule according to one of claims 1 to 3 or at least one primer or primer set, the primers having a mutated region as defined in claim 1 (a) to 1 ( m) 5 ' and or 3 ' flank.

Method of identifying a compound used for therapy or prevention a disease associated with MSH3 is suitable, the method includes the following steps: (A) Bringing a compound under investigation into contact with one of a nucleic acid molecule according to claim 1 or 2 encoded MSH3 protein or one expressing this nucleic acid Cell; and (b) determining the effect of this compound on the activity of the MSH3 protein, with an increase or recovery of activity an indication of that is that the compound is therapeutically useful.

Use of a vector representing the MSH3 reference sequence or contains part of it for gene therapy.

Medicament, a vector as defined in claim 13, the nucleic acid inserted into this vector or one according to the method containing identified compound according to claim 12.

Use of a compound as defined in claim 14 for treatment a disease related to MSH3.