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Die
Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur hochparallelen mikrochemischen
Synthese, insbesondere der Festphasensynthese von Peptiden oder anderen
organischen Verbindungen gemäß den Merkmalen
des Oberbegriffs des Anspruches 1.
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Die
Herstellung von Peptiden nach der Festphasenpeptidsynthese erfolgt
in mehreren Syntheseschritten, die im Wesentlichen
- a) das Binden der ersten Aminosäure über eine Ankergruppe an einen
polymeren Träger;
- b) das schrittweise Ankondensieren der übrigen Aminosäuren der
Peptidketten;
- c) das Waschen, Abspalten von Schutzgruppen; und schließlich
- d) das Abspalten des fertigen Peptids von dem Trägermaterial
umfassen.
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Bei
der gleichzeitigen – hochparallelen – Synthese
einer Vielzahl von Peptiden werden die einzelnen, das Trägermaterial
aufnehmenden Wells einer Mikrotiterplatte mit Hilfe einer von einem
Pipettierroboter verfahrbaren Dosierpipette mit den in den oben
erwähnten
Syntheseschritten erforderlichen Reaktions-, Wasch- und Abspaltflüssigkeiten
beschickt. Nach einer entsprechenden Verweilzeit der Flüssigkeit über dem
Träger
in den einzelnen Wells werden die Reagenzien bzw. Waschflüssigkeiten
in den Zwischenschritten und im letzten Schritt schließlich auch
die Lösung
mit dem abgespaltenen Syntheseprodukt abgesaugt. Die Reaktionsgefäße (Wells) sind
oben offen und weisen am Boden eine Öffnung auf, wobei sich das
Trägermaterial
zwischen Filtern befindet, über
die die jeweiligen Flüssigkeiten
von oben mittels der Dosierpipette eingebracht und nach unten abgesaugt
werden. Die Reaktionsgefäße sind am
Boden abdichtend in die Ausnehmungen einer Halteplatte eingesetzt,
deren zur gegenüberliegenden
Seite der Halteplatte reichende Durchgangsbohrungen in eine mit
der Halteplatte abgedeckte, an eine Saugpumpe angeschlossene Absaugkammer reichen.
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Die
Absaugkammer ist abdichtend mit der Halteplatte verschlossen. Durch
Erzeugen eines Vakuums in der Absaugkammer werden die den Reaktionsgefäßen von
oben zugeführten
Reagenzien bzw. Waschflüssigkeiten
gemeinsam abgesaugt und entsorgt bzw. einer Aufarbeitung zugeführt, während die
abgespaltenen Peptide in voneinander getrennten Behältern aufgefangen
und einzeln isoliert werden. Um ein freies Auslaufen der Reaktionsgefäße zu verhindern,
wird zwischen den Absaugvorgängen
ein Inertgas in die Absaugkammer geleitet.
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Trotz
des vorteilhaften gemeinsamen und schnellen Absaugens ist die oben
beschriebene Verfahrensweise zum einen in Bezug auf die Abdichtung zwischen
den einzelnen Reaktionsgefäßen und
der Absaugkammer und zum anderen hinsichtlich der aufwendigen Trennung
zwischen dem Absaugen der Abfalllösungen und dem Absaugen der
abgespaltenen fertigen Syntheseprodukte aus den Reaktionsgefäßen nachteilig.
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Ausgehend
von dem zuvor erläuterten
System ist es weiterhin bekannt, die einzelnen Reaktionsgefäße in einer einzigen
Syntheseplatte, die beispielsweise im 96-Well-Mikrotiterplattenformat ausgebildet
ist und auf der Halteplatte mit den Absaugöffnungen/-bohrungen arretiert
ist, zusammenzufassen. Die Lösungen
mit den vom Trägermaterial
abgetrennten Syntheseprodukten werden ebenfalls über die unterhalb der Saugbohrungen
gebildete Absaugkammer gleichzeitig aus den einzelnen Reaktionsgefäßen der
Syntheseplatte abgesaugt, jedoch in eine zwischenzeitlich unterhalb
der Absaugbohrungen positionierte Probenaufnahmeplatte, die aus
einer Vielzahl im gleichen Raster wie die Reaktionsgefäße bzw.
Absaugbohrungen angeordneten Aufnahmebehältern besteht. Bei dieser Vorrichtung
ist zwar die Positionierung der Reaktionsgefäße und die Entnahme der Syntheseprodukte
weniger aufwendig, dennoch sind auch das zwischengeschaltete Einbringen der
Probenaufnahmeplatte in die Absaugkammer, das heißt, der
Schritt vom Absaugen der letzten Abfalllösung bis zum Absaugen des in
der Abspaltlösung
befindlichen Syntheseprodukts sowie ein gegebenenfalls anschließender Waschschritt
zeit- und arbeitsaufwendig. Zudem kann es bei dieser Verfahrensweise
leicht zu Kontaminationen kommen. Insbesondere können die aus den einzelnen
Reaktionsgefäßen abgesaugten
Tröpfchen
bei einem ungleichmäßigen Vakuum
in der Absaugkammer seitlich abgelenkt werden, was zu Kreuzkontaminationen
zwischen aus benachbarten Reaktionsgefäßen abgesaugten Syntheseprodukten
führen
kann.
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Eine
Vorrichtung der oben erläuterten
Art zur gleichzeitigen multiplen und hochparallelen Synthese von
Peptiden und anderen Molekülen,
die einen in drei Achsen bewegbaren Greiferarm, einen Ventilblock
zur Aufnahme und Ableitung von Spülmittellösungen, mindestens einen über einer
Syntheseplatte verfahrbaren Spülkamm
sowie unterhalb des Ventilblockes eine Probenplatte für die Aufnahme
der nach der Abspaltreaktion gelösten
Proben aufweist, wird in der
DE 101 31 088 A1 beschrieben. Nach Ablauf
einer Inkubationszeit wird der Ventilblock so geschaltet, dass die
in der Abspaltlösung
gelösten
Verbindungen in die Aufnahmekammern der mit einer Absauganlage verbundenen
Probenplatte geleitet werden.
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Der
Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die bekannten Vorrichtungen
zur hochparallelen biochemischen Synthese von Peptiden oder anderen
organischen Verbindungen so weiterzuentwickeln, dass der Synthesevorgang
automatisiert und dadurch vereinfacht und beschleunigt wird und Kreuzkontaminationen
zwischen den Syntheseprodukten vermieden werden.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe mit einer gemäß den Merkmalen
des Patentanspruches 1 ausgebildeten Vorrichtung gelöst. Aus
den Unteransprüchen
ergeben sich vorteilhafte Weiterbildungen und zweckmäßige Ausgestaltungen
der Erfindung.
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Der
Grundgedanke des vorliegenden Erfindungsvorschlags besteht mit anderen
Worten in der Einbindung eines Zweiwege-Ventilblocks in eine Vorrichtung
zur hochparallelen mikrochemischen Synthese derart, dass die am
Ende des Syntheseprozesses anfallende Lösung mit dem fertigen Syntheseprodukt
auf einem ersten Weg unter Vermeidung von Kreuzkontaminationen in
bereitgestellte Aufnahmegefäße abgezogen
werden, während
sämtliche
zwischenzeitlich oder anschließend
anfallenden Reaktions-Abtrenn-
und Waschlösungen über einen
von dem ersten Weg abzweigenden Weg zentral abgesaugt werden. Durch
das zwischengeschaltete automatisierte Abziehen der anfallenden
Abfalllösungen mit
Hilfe eines Zweiwege-Ventilblocks
wird der Syntheseprozess in wesentlichen Teilen vereinfacht und automatisiert,
d.h., es sind keine manuellen Zwischenschritte erforderlich und
die Gefahr von Kreuzkontaminationen wird deutlich verringert.
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Erfindungsgemäß zweigt
in dem Zweiwege-Ventilblock von jeder an das jeweilige Reaktionsgefäß angeschlossenen
ersten Saugbohrung eine zweite Saugbohrung ab, die über ein
zusammenhängendes
Kanalsystem innerhalb des Zweiwege-Ventilblocks mit einem ersten Vakuumanschluß in Verbindung
steht, um die anfallenden Abfalllösungen zu jedem beliebigen
Zeitpunkt automatisch absaugen zu können. Die erste Saugbohrung
mündet
letztlich aber in eine ebenfalls mit einem Vakuumanschluss versehenen
Absaugkammer, in der eine mobile Probenaufnahmeplatte mit den in
dieser ausgebildeten Aufnahmegefäßen für die Syntheseprodukte
untergebracht ist.
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Nach
einem weiteren wichtigen Merkmal der Erfindung ist der Ventilblock
zur Einbindung des Abzugssystems für die Abfalllösungen zweiteilig
ausgebildet, wobei an der Schnittstelle zwischen einem Ventilblockoberteil
und einem Ventilblockunterteil eine Dichtungsfolie vorgesehen ist
und der Übergang zwischen
der ersten Saugbohrung im Ventilblockoberteil und eine mit dieser
fluchtenden dritten Saugbohrung im Ventilblockunterteil mit Hilfe
eines Rohrzwischenstücks
geschaffen wird. Auch der Übergang zwischen
den Absaugöffnungen
der Reaktionsgefäße in der
Syntheseplatte und den ersten Saugbohrungen sowie zwischen dem distalen
Ende der dritten Saugbohrungen und den Aufnahmegefäßen für das Syntheseprodukt
ist so ausgebildet, dass die jeweiligen Öffnungen ineinandergreifen,
so dass in dem gesamten Syntheseprozess Kreuzkontaminationen verhindert
werden.
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In
weiterer Ausbildung der Erfindung zweigen die zweiten Saugbohrungen, über die
die Abfalllösungen
abgezogen werden, in Fließrichtung
spitzwinklig von den ersten Saugbohrungen ab und haben einen größeren Durchmesser
als diese. Es wurde festgestellt, dass bei einem an den zweiten
Saugbohrungen anliegenden Vakuum die jeweilige Abfalllösung vollständig über diese
Saugbohrung abgesaugt wird und keine Abfalllösung über die erste Saugbohrung in
die Aufnahmegefäße gelangt.
Andererseits wird das Syntheseendprodukt unter der Wirkung eines
in der Absaugkammer erzeugten Vakuums vollständig in die Aufnahmegefäße abgezogen.
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Ein
Ausführungsbeispiel
der Erfindung wird anhand der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen
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1 eine
schematische Darstellung einer Vorrichtung zur hochparallelen Synthese
von Peptiden;
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2 eine
seitliche Detailansicht einer Syntheseeinheit nach 1,
in der Peptide nach der Festphasensynthese hergestellt werden mit
einem in die Syntheseeinheit integrierten Ventilblock zum automatisierten
getrennten Abführen
einerseits von Abfallflüssigkeiten
und andererseits von das fertige Syntheseprodukt enthaltender Flüssigkeit;
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3 eine
Schnittansicht der in 2 gezeigten Syntheseeinheit;
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4 eine
Unteransicht des in 3 dargestellten Ventilblockoberteils
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Gemäß 1 ist
die hier schematisch dargestellte gesamte Syntheseeinrichtung 1 auf
der Basis eines Laborpipettierroboters mit einem in der x-, y- und
z-Achse bewegbaren Greiferarm 2 aufgebaut. Auf einem Grundgestell 3 ist
die eigentliche Syntheseeinheit, in der die einzelnen Verfahrensschritte
ablaufen, angeordnet. Sie besteht aus einer Syntheseplatte 5 und
einem zweiteiligen Zweiwege-Ventilblock mit einem Ventilblockoberteil 6 und
einem Ventilblockunterteil 7 sowie einer Absaugkammer 8 mit
in diese angeordneter Probenaufnahmeplatte (in 1 nicht
dargestellt). Eine Absaugpumpe 9 ist einerseits an das
Ventilblockoberteil 6 und andererseits an die Absaugkammer 8 angeschlossen.
In der Zeichnung ist eine einzige Syntheseplatte 5 dargestellt.
Es können
aber auch mehrere Syntheseplatten, die von bekannten Mikrotiterplatten
mit einem 96-Well-. 384-Well- oder 1536-Well-Rasterformat abgeleitet sind, angeordnet
sein. Die Zuführung
der Reaktionslösungen
mit den verschiedenen Synthesebausteinen zu den Reaktionsgefäßen der
Syntheseplatten 5, in denen sich das Trägermaterial für die Festphasensynthese
befindet, erfolgt mit Hilfe von durch den Greiferarm 2 verfahrbaren
Synthesestiften 11. Die einzelnen Synthesestifte mit dem
jeweiligen Synthesebaustein werden in einer Halterung 4 bereitgestellt. Für die zwischen
den verschiedenen Syntheseschritten nach dem Absaugen der Reaktionslösung mit
Hilfe des Ventilblockoberteils 6 erforderlichen Abtrenn- und
Waschschritte wird mit speziellen Flüssigkeitskämmen (nicht dargestellt) Wasch-
bzw. Abspaltlösung
zugeführt,
die ebenfalls mit dem Ventilblockoberteil 6 und der Absaugpumpe 9 abgezogen
wird, bevor in dem nächsten
Syntheseschritt mit dem Synthesestift 11 eine weitere Reaktionslösung zugeführt wird.
Das fertige Syntheseprodukt wird schließlich über das Ventilblockunterteil 7 und
die Absaugkammer 8 in die in der Absaugkammer bereitgestellte Probenaufnahmeplatte
abgesaugt. Auf diese Weise wird allein die Lösung mit dem abgespaltenen
fertigen Syntheseprodukt über
die Absaugkammer 8 abgesaugt, während alle anderen Reaktions-,
Abspalt- und Waschlösungen,
die als Abfalllösungen entsorgt werden,
bereits unmittelbar über
die an das Ventilblockoberteil 6 angeschlossenen Absaugpumpe 9 abgezogen
werden, d.h. ohne mit dem Ventilblockunterteil 7 und der
an dieses anschließenden
Absaugkammer 8 in Berührung
zu kommen.
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In
den 2 und 3 ist die eigentliche Syntheseeinheit
in einer Seitenansicht und einer Schnittansicht detailliert wiedergegeben.
Sie umfasst die Syntheseplatte 5, das Ventilblockoberteil 6 mit
einem ersten Vakuumanschluss 10, das mit dem Ventilblockoberteil 6 über eine
Dichtungsplatte 12 fest verbundene Ventilblockunterteil 7 und
den aus einem Oberteil 13a und einem Unterteil 13b gebildeten zweiteiligen
Absaugblock 13, der einen zweiten Vakuumanschluss 14 aufweist
und die an die Unterseite des Ventilblockunterteil 7 angeschlossene
Absaugkammer 8 zum Abziehen der fertigen Syntheseprodukte
in die Probenaufnahmeplatte 15 bildet.
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In
der Syntheseplatte 5 sind zwölf Spalten mit jeweils acht
zylindrischen Reaktionsgefäßen 16, die
eine obere Zufuhröffnung 17 und
einen gewölbten Boden
mit einer Absaugöffnung 18 haben.
Außerdem weist
die Syntheseplatte 5 einen umlaufenden Stützrand 19 auf.
In dem Reaktionsgefäß 16 sind
ein oberes und ein unteres feines Sieb (Fritte) 20 angeordnet.
Zwischen den beiden Sieben 20 befindet sich ein Trägermaterial 21 für die Festphasensynthese
und unter dem unteren Sieb 20 ist eine geschlitzte oder mit
engen Poren versehene Membran 22 vorgesehen. Über die
Zufuhröffnungen 17 wird,
wie oben beschrieben, Reaktionslösung
sowie Abspalt- und Waschlösung
zugeführt,
während
die verbrauchten Abfalllösungen
oder die Lösung
mit dem fertigen Syntheseprodukt durch einen unterhalb der Absaugöffnung 18 erzeugten
Unterdruck abgesaugt werden.
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Das
Ventilblockoberteil 6 weist entsprechend dem Raster der
Reaktionsgefäße 16 ausgebildete konische
Vertiefungen 23 auf, an deren oberem Rand das jeweilige
Reaktionsgefäß 16 abgestützt ist.
Die Reaktionsgefäße 16 haben
einen gewölbten
Boden, der in die Vertiefungen 23 ragt. Dadurch werden Kreuzkontaminationen
verhindert. Außerdem
ist am Rand des Ventilblockoberteils 6 eine umlaufende
Nut 24 ausgebildet, von der senkrechte erste Durchgangsbohrungen 24a ausgehen,
an die sich zweite Duchgangsbohrungen 24b im Ventilblockunterteil 7 anschließen. Dadurch
wird eine Verbindung zwischen der Absaugkammer 8 und der
umlaufenden Nut 24, in der der Stützrand 19 der Syntheseplatte 5 liegt,
geschaffen. Bei Anlegen eines von der Absaugpumpe 9 in
der Absaugkammer 8 erzeugten Vakuums wird somit die Syntheseplatte 5 fest
an die Oberseite des Ventilblockoberteils 6 gedrückt.
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Vom
Boden der konischen Vertiefungen 23 im Ventilblockoberteil 6 gehen
senkrechte erste Saugbohrungen 25 aus, die in dritte senkrechte Saugbohrungen 26 im
Ventilblockunterteil 7 übergehen.
Die sichere Verbindung zwischen den ersten und dritten Saugbohrungen 25 und 26 wird über ein Rohrzwischenstück 27 geschaffen,
dass in die erste Saugbohrung 25 gesteckt ist und in die
dritte Saugbohrung 26 ragt. Dadurch werden Kreuzkontaminationen
verhindert. In die dritten Saugbohrungen 26 im Ventilblockunterteil 7 sind
ausgehend von dessen Unterseite jeweils Auslaufrohrstücke 28 gesteckt,
die in die Absaugkammer 8 ragen und mit ihrer Austragsseite
geringfügig
unterhalb der Öffnungsebene
der Aufnahmegefäße 29 in
der Probenaufnahmeplatte 15 enden. Durch die in die Aufnahmegefäße 29 ragenden
Auslaufrohrstücke 28 wird
beim Absaugen der fertigen Syntheseprodukte in die Aufnahmegefäße 29 ebenfalls
eine Kreuzkontamination vermieden.
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Aus
den 3 und 4 ist ersichtlich, dass in der
unteren, an die Dichtungsplatte 12 grenzenden Fläche des
Ventilblockoberteils 6 parallel zu den ersten Saugbohrungen 25 im
Ventilblockoberteil 6 verlaufende Kanäle 30 ausgebildet
sind, die an einem Ende in einen Querkanal 31 münden. Die
Kanäle 30 stehen über zweite
Saugbohrungen 32 jeweils mit den ersten Saugbohrungen 25 in
Verbindung.
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In
den Querkanal 31 mündet
ein Verbindungskanal 33, der am anderen Ende über den
ersten Vakuumanschluss 10 im Ventilblock 6 mit
der Absaugpumpe 9 in Verbindung steht. Der Durchmesser der
zweiten Saugbohrung 32, die zum Absaugen der während des
gesamten Syntheseprozesses jeweils anfallenden Abfalllösungen dient,
ist geringfügig
größer als
der Durchmesser der ersten Saugbohrung 25, die über das
Rohrzwischenstück 27 fluchtend
in die dritte Saugbohrung 26 mit ebenfalls größerem Durchmesser übergeht.
Die dritte Saugbohrung 26 ist im oberen, zur Dichtungsplatte 12 weisenden
Teil trichterförmig
erweitert.
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Nachfolgend
wird die Funktion der erfindungsgemäßen Syntheseeinheit und deren
Kernstücks,
dem Zweiwege-Ventilblock,
beschrieben.
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In
den Reaktionsgefäßen 16 befindet
sich zwischen den feinen Sieben 20 ein Trägermaterial 21.
Während
des Syntheseprozesses werden Reaktionslösungen sowie zwischenzeitlich
Abtrenn- und Waschlösungen
in die Reaktionsgefäße 16 eingebracht.
Diese Lösungen
werden über
die Absaugöffnung 18,
die konische Vertiefung 23, die zweite Saugbohrung 32,
die die erste Saugbohrung 25 mit den Kanälen 30 verbindet,
und den an den ersten Vakuumanschluß 10 gekoppelten Querkanal 31,
abgesaugt. Diese Lösungen
werden als gemeinsamer Abfall gesammelt und entsorgt. Es wurde festgestellt, dass
die Abfalllösungen
tatsächlich
vollständig über die
zweiten Saugbohrungen 32 abgesaugt werden. Es gelangt keine
Abfalllösung über die
dritte Saugbohrung 26 in die Absaugkammer 8 und
die darin befindlichen Aufnahmegefäße 29 für das fertige
Syntheseprodukt.
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Nach
Fertigstellung des Syntheseproduktes an dem Trägermaterial wird die das Fertigprodukt enthaltende
Abtrennlösung
durch Erzeugen eines Vakuums in der an die Absaugpumpe 9 angeschlossenen
Absaugkammer 8 in die Aufnahmegefäße 29 der vor dem
Syntheseprozess in die Absaugkammer eingebrachten Probeaufnahmeplatte 15 abgesaugt. Diese
Lösung
fließt
von der in die Vertiefungen 23 (im Ventilblockoberteil 6)
ragenden Absaugöffnung 18 über die
erste Saugbohrung 25, das Rohrzwischenstück 27,
die dritte Saugbohrung 26 und das Auslaufrohrstück 28 unmittelbar
in die Aufnahmegefäße 29. Durch
diese Ausbildung werden Kreuzkontaminationen an den Schnittstellen
zwischen den Reaktionsgefäßen 16 und
dem Ventilblockoberteil 6, zwischen dem Ventilblockoberteil 6 und
den Ventilblockunterteil 7 sowie zwischen dem Ventilblockunterteil 7 und den
Aufnahmegefäßen 29 verhindert.
Nachdem die Probenaufnahmeplatte 15 entnommen und eine neue
Probenaufnahmeplatte 15 eingesetzt wurde, steht die Einrichtung
für einen
erneuten Syntheseprozess zur Verfügung.
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- 1
- Syntheseeinrichtung
- 2
- Greiferarm
- 3
- Grundgestell
- 4
- Halterung
für Synthesestifte
- 5
- Syntheseplatte
- 6
- Ventilblockoberteil
- 7
- Ventilblockunterteil
- 8
- Absaugkammer
- 9
- Absaugpumpe
- 10
- erster
Vakuumanschluß in 6
- 11
- Synthesestifte
- 12
- Dichtungsplatte/-folie
- 13
- Absaugblock
- 13a
- Oberteil
v. 13
- 13b
- Unterteil
v. 13
- 14
- zweiter
Vakuumanschluß in 13
- 15
- Probenaufnahmeplatte
- 16
- Reaktionsgefäße von 5
- 17
- Zufuhröffnung in 16
- 18
- Absaugöffnung in 16
- 19
- Stützrand
- 20
- Sieb
(Fritte)
- 21
- Trägermaterial
- 22
- Membran
- 23
- konische
Vertiefungen in 6
- 24
- umlaufende
Nut in 6
- 24a
- erste
Durchgangsbohrungen
- 24b
- zweite
Durchgangsbohrungen
- 25
- erste
Saugbohrungen in 6
- 26
- dritte
Saugbohrung in 7
- 27
- Rohrzwischenstücke in 6
- 28
- Auslaufrohrstücke in 7
- 29
- Aufnahmegefäße in 15
- 30
- Kanäle in 6 (Längskanäle)
- 31
- Querkanal
in 6
- 32
- Zweite
Saugbohrung in 6
- 33
- Verbindungskanal
in 6