DE10207135A1

DE10207135A1 - Verfahren und Kit zum Nachweis von spezifischen Antikörpern mittels Immunfluoreszenz

Info

Publication number: DE10207135A1
Application number: DE2002107135
Authority: DE
Inventors: Thomas Pfeiffer; Christian Probst; Ewald Mueller-Kunert; Winfried Stoecker; Kerstin Wulf; Bettina Zerbe
Original assignee: Euroimmun AG
Current assignee: Euroimmun Medizinische Labordiagnostika AG
Priority date: 2002-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2003-09-11

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen Antikörpern in einer biologischen Probe unter Verwendung rekombinant hergestellter Antigene, die von auf festen Trägern immobilisierten transformierten Wirtszellen exprimiert werden, wobei man nach entsprechender Präadsorption von gegen die Antigene der Wirtszellen gerichteten, unspezifischen Antikörpern die spezifischen Antikörper beispielsweise mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung entsprechend markierter sekundärer Antikörper, die gegen die spezifischen Antikörper gerichtet sind, nachweist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen Antikörpern in einer biologischen Probe unter Verwendung rekombinant hergestellter Antigene, die von auf festen Trägern immobilisierten transformierten Wirtszellen exprimiert werden, wobei man nach entsprechender Präadsorption von gegen die Antigene der Wirtszellen gerichteten, unspezifischen Antikörpern die spezifischen Antikörper beispielsweise mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung entsprechend markierter sekundärer Antikörper, die gegen die spezifischen Antikörper gerichtet sind, nachweist.
Einen wesentlichen Bereich in der medizinische Labordiagnostik bildet der Nachweis von Antikörpern gegen Infektionserreger, Allergene und Autoantigene. Alle diese Untersuchungen erfordern die Bereitstellung biologischen Materials in Form von Körperflüssigkeiten (wie z. B. Blut, Liquor, Stuhl) oder Gewebe.
Der Nachweis von (Auto-)Antikörpern erfolgt unter anderem mittels serologischer Methoden. Grundsätzlich werden dabei unter Verwendung bekannter Antigene spezifische Antikörper im Patientenmaterial nachgewiesen. Im Rahmen dieser serologischen Verfahren kommen unter anderem mikroskopische Techniken (indirekte Immunfluoreszenz) enzymatische Methoden (Enzymimunoassays), Isotopentechniken (Radioimmunoassay) bzw. Blottechniken zum Einsatz. Diese Methoden sind in der Regel schnell durchführbar und haben zum Teil wegen ihrer Automatisierbarkeit eine breite Anwendung gefunden.
Im Bereich der Autoantikörperdiagnostik und beim Nachweis einer Vielzahl von Antikörpern gegen Infektionserreger spielt die indirekte Immunfluoreszenz eine wichtige Rolle. Dabei werden Antigene (aus Viren, Bakterien, Eukaryonten) in Form von Ausstrichen, Gefrierschnitten oder aufgereinigten biochemisch charakterisierten Substanzen auf Objektträgern immobilisiert und in einem ersten Inkubationsschritt mit einer antikörperhaltigen Probe des Patienten inkubiert. Sind darin spezifische Antikörper, so binden sich diese an die antigenen Strukturen. Im zweiten Inkubationsschritt werden anti-human- Antikörper zugegeben, die sich an den ersten Antikörper binden. Diese anti-human Antikörper sind kovalent mit einem Floureszenzfarbstoff (Fluoreszein-Isothiozyanat) gekoppelt, und unter dem Fluoreszenzmikroskop werden somit die gebundenen ersten Antikörper "sichtbar".
Trotz der vielfältigen zur Verfügung stehenden diagnostischen Möglichkeiten sind zahlreiche Antikörper-Nachweisverfahren bislang noch nicht praktisch durchführbar, nicht ausreichend selektiv bzw. spezifisch oder für die Anwendung in der Routinediagnostik zu aufwendig.
Beispielsweise werden in der Syphilis-Diagnostik Antikörper gegen Treponema pallidum, ein streng anaerob wachsendes gramnegatives Stäbchen, das zur Familie der Spirochaetaceae gehört, mittels indirekter Immunfluoreszenz, Enzym- bzw. Radioimmunoassay und Immunoblot nachgewiesen. Für die Enzymimmuntests und Immunoblots werden die Antigene aus in Kaninchenhoden gezüchteten Treponema pallidum-Zellen aufgereinigt oder als Volllysat eingesetzt. Bei der Isolierung und Aufarbeitung der Treponemen besteht für das durchführende Personal zusätzlich die Gefahr einer Infektion. Rekombinant hergestellte Antigene (im speziellen TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47; Nomenklatur nach Norris, 1993) werden im ELISA und in den Blottechniken eingesetzt.
Im Bereich der indirekten Immunfluoreszenz werden inaktivierte Treponema pallidum-Bakterien zum Nachweis von Antikörpern gegen die Treponemen und damit von Syphilis verwendet. Auch für dieses Verfahren müssen die Bakterien in Kaninchenhoden gezüchtet und daraus isoliert werden. Die erhaltenen Zellsuspensionen werden auf Objektträgern immobilisiert und so zum Nachweis der Antikörper eingesetzt. Aufgrund einer starken Kreuzreaktivität der Antikörper mit Antigenen des humanapathogenen Stamm Treponema phagedenis muß aber zusätzlich zuvor eine Präadsorption von in den Patientenseren enthaltenen Antikörpern, die gegen die zellulären Bestandteile dieses Stammes gerichtet sind, durchgeführt werden.
Da man bei der Anwendung der Immunfluoreszenz zum Syphilis- Nachweis bislang auf die Verwendung und die Tötung von Tieren angewiesen ist, was unter dem Aspekt des Tierschutzes äußerst unerwünscht ist, und für das Laborpersonal ein nicht unerhebliches Gefährdungspotential beim Umgang mit den pathogenen Bakterienstämmen Treponema pallidum besteht, haften diesem Verfahren wesentliche Nachteile an. Bislang stehen jedoch keine alternativen Methoden mit vergleichbarer Spezifität zur Verfügung.
Ein anderes Beispiel, bei dem bislang noch kein schnelles und zuverlässiges Nachweisverfahren gefunden wurde, ist die autoimmune Hepatitis im Rahmen der chronischen Lebererkrankungen.
Die autoimmune Hepatitis ist eine chronische Entzündung, die bei rechtzeitigem Erkennen gute Heilungsaussichten hat, unbehandelt jedoch zur Zirrhose und wenige Jahre danach zum Tode führt. Eine aussagekräftige und rechtzeitige Diagnose ist daher wünschenswert, vor allem wenn man davon ausgeht, daß weltweit ca. 100.000 Patienten jährlich neu an der Autoimmunhepatitis erkranken. Durch Einleitung einer niedrig dosierten immunsuppressiven Therapie ist selbst bei fortgeschrittenem Krankheitsstadium eine langjährige, häufig lebenslange Remission zu erzielen.
Die relevanten Autoantikörper zur Diagnostik autoimmuner Lebererkrankungen werden mittels indirekter Immunfluoreszenz, Enzym- bzw. Radioimmunoassay und Immunoblot nachgewiesen. Als Zielantigene werden tierische oder humane Präparate verwendet, und rekombinant hergestellte Antigene kommen beim Nachweis von Autoantikörpern (im ELISA und Immunoblot) gegen Leber- und Nierenmikrosomen und gegen das lösliche Leber-Pankreas-Antigen (SLA/LP) zum Einsatz.
Die Autoantikörper-Serologie ist häufig von besonders großer Bedeutung, wobei zu beachten ist, daß auch Autoantikörpernegative Fälle auftreten können. Bei der Bestimmung des Autoantikörperprofiles der chronischen Leberentzündungen finden sich Antikörper gegen eine Reihe von zellulären Bestandteilen (z. B. Antikörper gegen den Zellkern, Antikörper gegen die glatte Muskulatur, antineutrophile Antikörper, Antikörper gegen Leber- und Nierenmikrosomen). Der von Manns et al. (1987) beschriebene Autoantikörper gegen lösliches Leber-Pankreas-Antigen (SLA/LP; SLA = soluble liver antigen) scheint dagegen praktisch ausschließlich bei Patienten mit autoimmuner Hepatitis aufzutreten. Von Wies et al. (2000) wurde das Zielantigen SLA identifiziert und nachgewiesen, daß das ebenfalls als diagnostischer Marker eingesetzte Pankreas Antigen mit SLA identisch ist. Autoantikörper gegen lösliches Leber-Pankreas-Antigen sind somit die diagnostischen Leitantikörper bei einer Autoimmunhepatitis. Obwohl ihre Prävalenz nur 10-30% beträgt, liegt ihr prädiktiver Wert bei nahezu 100%.
Die indirekte Immunfluoreszenz stellt prinzipiell die sicherste Methode zur Bestimmung des Autoantikörperprofils chronischer Lebererkrankungen dar, da sie geeignet ist, nahezu alle Krankheitsbilder anhand ihrer spezifischen Fluoreszenzmuster zu unterscheiden. Bisher konnte jedoch kein eindeutig dem SLA/LP zuzuordnendes Fluoreszenzmuster nachgewiesen werden, wodurch das Vorliegen einer Autoimmunhepatitis durch zusätzliche andere Verfahren diagnostiziert oder ausgeschlossen werden muß.
Eine vollständige Differentialdiagnose ist vor allem deshalb notwendig, da sich zwar die Klinik von Autoimmunhepatitis und infektiöser Hepatitis stark ähneln, die Therapien jedoch diametral sind. Während bei einer Autoimmunhepatitis immunsuppressiv behandelt wird, muß bei der chronischen Hepatitis das Immunsystem z. B. mit Interferon stimuliert werden.
Aus diesem Grund ist es bislang erforderlich, zusätzlich zu dem mit der indirekten Immunfluoreszenz bestimmten Profil routinemäßig einen SLA/LP-Nachweis durch Anwendung eines ELISA durchzuführen. Die vollständige Beurteilung, ob eine autoimmune oder eine chronische Hepatitis vorliegt ist demnach verfahrens- und kostenintensiv sowie zeitaufwendig.
Ein weiteres, bislang ungelöstes Problem stellt der Nachweis von Infektionen mit dem humanpathogenen Epstein-Barr-Virus (EBV) dar, dem Erreger der infektiösen Mononucleose (Pfeiffersches Drüsenfieber). Bislang wird das Verfahren mittels Immunfluoreszenz durchgeführt, indem man humane Zellen (Tumorzelllinien) einsetzt, die Teile des EBV-Genoms in sich tragen. Diese Zellen produzieren neben eigenen und viralen Proteinen unter anderem das zur Diagnose für eine späte Infektionsphase mit dem Epstein-Barr-Virus herangezogene EBNA- 1 (Epstein-Barr Nuclear Antigen-1; Hille et al., 1993). Die EBV-Diagnose ist bei diesem Verfahren jedoch nicht immer ausreichend sicher, da man nicht zwischen spezifischen Antikörpern gegen das im Zellkern lokalisierte EBNA-1 und in der Probe vorhandenen unspezifischen, gegen den Zellkern gerichteten Autoantikörpern unterscheiden kann. Aus diesem Grund schließen sich bei einem positiven Befund regelmäßig weitere Tests (z. B. ELISA und/oder Westernblot) an.
Die beschriebenen Probleme bei der Beurteilung und Auswertung treten immer dort auf, wo die Fluoreszenzmuster von Antikörpern gegen Antigene des Erregers mit denen von Autoantikörpern identisch oder ähnlich sind. Antinukleoläre Autoantikörper (ANA) sind störend bei der EBV-(EBNA-1) und CMV-Diagnostik (CMV: Cytomegalovirus) und bei etlichen Antikörpernachweisen gegen bakterielle Antigene, die in den Zellkern der infizierten Zelle gelangen. Dagegen stören antimitochondriale Antikörper (AMA, Fluoreszenz des Zytoplasmas) z. B. bei Parainfluenzavirus, HSV (Herpes Simplex Virus), Röteln-Virus, VZV (Varizella-Zoster Virus), RSV (Rous- Sarkom Virus), Influenza A und B, Coxsackie A und B, Echo- Virus, Bartonellen etc.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein allgemein anwendbares Verfahren zum Nachweis von spezifischen Antikörpern in biologischen Proben zur Verfügung zu stellen, das für eine breite Anwendung im Bereich der Infektions-, Allerie- und (Auto)Antikörperdiagnostik geeignet ist und die wesentlichen Nachteile der im Stand der Technik angewandten Verfahren nicht aufweist. Insbesondere ist es Aufgabe der Erfindung, ein verläßliches und vom Laborpersonal vergleichsweise einfach durchführbares Verfahren zu entwickeln, mit dem Autoimmunhepatitis spezifisch nachgewiesen werden kann und eine eindeutige Unterscheidung von anderen Hepatitiserkrankungen möglich ist. Ferner soll durch die Erfindung insbesondere auch ein spezifischer Syphilis-Nachweis ermöglicht werden, der die Verwendung und Tötung von Tieren vermeidet und ohne das Risiko einer möglichen Infektion mit Treponema pallidum bei der Erzeugung der Bakterien im Kaninchenhoden und der anschließenden Isolierung der Keime durchgeführt werden kann. Zusätzlich soll das Verfahren geeignet sein, eine gegenüber dem Stand der Technik spezifischere Diagnose von EBV-Infektionen zu ermöglichen.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gelöst, bei dem man zum Nachweis spezifischer Antikörper rekombinant hergestellte Antigene verwendet, die von auf festen Trägern immobilisierten, transformierten Wirtszellen exprimiert werden, wobei man nach entsprechender Präadsorption von gegen die Antigene der Wirtszellen gerichteten unspezifischen Antikörpern in der zu untersuchenden Probe die spezifischen Antikörper beispielsweise mittels Immunfluoreszenz unter Verwendung entsprechend markierter sekundärer Antikörper, die gegen die spezifischen Antikörper gerichtet sind, nachweist.
Das erfindungsgemäße Verfahren weist den Vorteil auf, daß durch die rekombinante Herstellung der Antigene der für die nachzuweisenden Antikörper spezifische Bindungspartner präsentiert wird. Durch das Bereitstellen dieser neuen Methode wird das Spektrum der diagnostischen Nachweisverfahren erweitert, wodurch sich in vielen, bislang unklaren Fällen eindeutigere Krankheitsdiagnosen stellen lassen.
Ferner ist es erfindungsgemäß möglich, nicht nur Antigene einzusetzen, die bislang in anderen diagnostischen Verfahren eingesetzt wurden. Durch Überproduktion des Antigens können außerdem ausreichend viele Bindungspartner für die Antikörper bereitgestellt werden, was zu einer Bindung von so vielen Antikörpern führt, daß ein oftmals sensitiverer Nachweis möglich wird, als es im Stand der Technik der Fall ist. Auf diese Weise lassen sich nunmehr auch Proben testen und Antikörper nachweisen, die sich bislang einer Routinediagnostik entzogen. Durch das Präsentieren des/der spezifischen Antigens/Antigene oder Fragmente des/der spezifischen Antigens/Antigene (ohne Kreuzreaktionen hervorrufende Bestandteile) wird auch die Spezifität des Nachweises, wie z. B. im Bereich der Diagnostik von gegen Allergene gerichteten Antikörpern, erhöht.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung weist darüber hinaus den besonderen Vorteil auf, daß unter Verwendung von mehreren, jeweils ein rekombinantes Antigen exprimierenden Zellen (bzw. einer Zelle, die gleichzeitg mehrere Antigene exprimiert) ein Screening ermöglicht wird. Vom Aufbau her entspricht dieses Verfahren dem "screening" nach neuen Antigenen. Man benutzt Genbanken (i. d. R. cDNA-Banken), kloniert die Nukleinsäuren in Expressionsplasmide und exprimiert die entsprechenden Proteine (bzw. Teile der Proteine). Einzelne Klone werden z. B. auf einer Membran immobilisiert, und man kann mit Antikörpern, die gegen eines dieser Proteine gerichtet sind, den entsprechenden Klon und schließlich das Antigen identifizieren. Die Durchführung des Verfahrens wäre mit der indirekten Immunfluoreszenz identisch, mit dem Unterschied, daß nicht nach neuen Antigenen gesucht wird, sondern mehrere, bereits bekannte Antigene nebeneinander immobilisiert werden und man die Probe nach Antikörpern gegen diese Antigene "screent". Diese Art des "Massen-Screenings" ist bislang nur im Zusammenhang mit dem ELISA möglich, jedoch weist dieses Verfahren den Nachteil auf, daß pro Inkubationsfeld jeweils nur ein Erreger getestet werden kann, während diese Beschränkung für das erfindungsgemäße Verfahren nicht besteht. Durch den Einsatz der Immunfluoreszenz wird nunmehr erstmals ein vergleichsweise einfach zu handhabendes, automatisierbares Verfahren bereitgestellt.
Ferner zeichnet sich die Erfindung durch ihre Anwendungsbreite aus, da zahlreiche etablierte Expressionssysteme, wie z. B. für E. coli, existieren und praktisch beliebige Antigene rekombinant exprimiert werden können.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum Nachweis von spezifischen Antikörpern in einer biologischen Probe unter Verwendung eines rekombinant hergestellten Antigens, gegen die die nachzuweisenden Antikörper gerichtet sind, bei dem man

a) eine Kultur von Wirtszellen bereitstellt, man
b) aus einem Teil dieser Wirtszellen ein Lysat erzeugt, man
c) die Probe mit dem Lysat aus Schritt (b) unter Bedingungen inkubiert, die zur Adsorption von gegen die Antigene der Wirtszellen gerichteten Antikörpern geeignet sind, man
d) in einen weiteren Teil dieser Wirtszellen aus Schritt (a) eine Nukleinsäuresequenz einbringt, die für das Antigen kodiert, man
e) die Wirtszellen aus Schritt (d) auf einem festen Träger immobilisiert, man
f) die Wirtszellen aus Schritt (e) mit der Probe aus Schritt (c) unter Bedingungen inkubiert, die zur Bindung von gegen das von den Wirtszellen exprimierte rekombinante Antigen gerichteten Antikörpern (spezifische Antikörper) geeignet sind, man
g) die Wirtszellen aus Schritt (f) wäscht und sie anschließend mit gegen die nachzuweisenden Antikörper (spezifische Antikörper) gerichteten Antikörpern (sekundäre Antikörper) unter Bedingungen inkubiert, die zur Bindung der sekundären Antikörper an die spezifischen Antikörper geeignet sind, wobei die sekundären Antikörper kovalent an einen Marker gebunden sind, und man
h) die Wirtszellen aus Schritt (g) wäscht und die spezifischen Antikörper durch Nachweis des Markers nachweist.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform weist man parallel mehrere spezifische Antikörper in einer Probe nach, indem man mehrere verschiedene, rekombinant hergestellte Antigene verwendet, die von den in Schritt (e) bereitgestellten Wirtszellen exprimiert werden, wobei man in Schritt (d) ein oder mehrere Nukleinsäuresequenzen in die Wirtszellen einbringt, die für die Antigene kodieren, wobei man die spezifischen Antikörper dadurch nachweist, daß man in Schritt (g) mehrere verschiedene sekundäre Antikörper verwendet, die jeweils nur an eine Immunglobulinklasse (IgA, IgG oder IgM) binden, wobei die sekundären Antikörper an unterschiedliche Marker gebunden sind und man die jeweiligen spezifischen Antikörper durch Nachweis des entsprechenden Markers nachweist.
Es ist auch möglich, daß man parallel mehrere spezifische Antikörper in einer Probe nachweist, indem man mehrere verschiedene, rekombinant hergestellte Antigene verwendet, die von den in Schritt (e) bereitgestellten Wirtszellen exprimiert werden, wobei man die jeweiligen, die verschiedenen Antigene exprimierenden Wirtszellen an unterschiedlichen Stellen (Reaktionsfeldern) auf dem festen Träger immobilisiert, so daß in jedem Reaktionsfeld nur ein Antigen präsentiert wird.
In Schritt (g) kann man gleichzeitig mehrere verschiedene sekundäre Antikörper nachweisen, die jeweils nur an eine Immunglobulinklasse binden, wobei die sekundären Antikörper an unterschiedliche Marker gebunden sind und man die jeweiligen spezifischen Antikörper durch Nachweis des entsprechenden Markers nachweist.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform unter Verwendung mehrerer Antigene führt man Schritt (g) mehrfach nacheinander oder mit unterschiedlichen sekundären Antikörpern (IgA, IgG und/oder IgM) parallel durch, wobei die Inkubation mit den sekundären Antikörpern für jedes Reaktionsfeld jeweils separat erfolgt.
Alternativ kann man Schritt (g) mehrfach nacheinander oder mit unterschiedlichen sekundären Antikörpern (IgA, IgG und/oder IgM) parallel durchführen und jeweils verschiedene sekundäre Antikörper verwenden, die jeweils nur an eine Immunglobulinklasse binden, wobei die sekundären Antikörper an unterschiedliche Marker gebunden sind. Man kann außerdem ein Antigen auf einem Reaktionsfeld gleichzeitig mit sekundären Antikörpern gegen unterschiedliche Immunglobulinklassen inkubieren, wobei die sekundären Antikörper an unterschiedliche Marker gebunden sind.
In der Praxis könnte der Ansatz beispielsweise wie folgt aussehen:

1. Ein Inkubationsfeld, bestückt mit mehreren verschiedenen rekombinanten Antigenen, dient zur Untersuchung einer Klasse von Erregern (z. B. Erreger sexuell übertragbarer Krankheiten) und man erhält einen positiven oder negativen Befund. Im Positivfall müßten sich Einzeluntersuchungen anschließen.
2. Es ist auch eine Miniaturisierung des Ansatzes möglich, bei dem die Zellen für die einzelnen Antigene als "dots" in einem Reaktionsfeld nebeneinander aufgetragen werden und man diese bei der Analyse getrennt auswertet und damit voneinander unterscheiden kann.
Dieses Verfahren ist, wie der Fachmann erkennen wird, je nach Aufgabenstellung in verschiedenen Varianten durchführbar.

Bei der verwendeten biologischen Probe handelt es sich um eine humane oder tierische Probe, die vorzugsweise Serum, Plasma, Blut, Liquor, Urin, Sputum, Stuhl, Cerebrospinalflüssigkeit, Ascites oder Amnionflüssigkeit ist, wobei die Probe gegebenenfalls (d. h., soweit erforderlich) zuvor in eine für die Inkubation in Schritt (f) geeignete Form überführt ist.
Gemäß Stufe (d) des Verfahrens werden zur Expression des Antigens/der Antigene ein oder mehrere Nukleinsäuresequenzen in die Wirtszellen eingebracht. Dies kann z. B. durch Inkubation der Wirtszellen mit einem Virus erfolgen, wenn die Wirtszellen anschließend das gewünschte virale Antigen exprimieren. Selbstverständlich können die für die gewünschten Antigene kodierenden Nukleinsäuresequenzen auch in jeweils einen oder in mehrere geeignete Expressionsvektoren einkloniert werden. Diese Methoden sind dem Fachmann wohlbekannt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden die Wirtszellen, die das oder die gewünschten Antigen(e) exprimieren, allgemein als "transformierte" Wirtszellen bezeichnet, ohne die Erfindung auf die enge Bedeutung dieses Begriffes zu beschränken. Die Bezeichnung soll lediglich der Unterscheidung der Antigen exprimierenden Wirtszellen von den entsprechenden Zellen dienen, die kein Antigen exprimieren.
Bei den im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Wirtszellen handelt es sich um prokaryontische oder eukaryontische Zellen, insbesondere um solche, für die bereits gut etablierte Expressionssysteme zur rekombinanten Herstellung von Proteinen existieren. E. coli-Zellen, Zellen der Gattung Saccharomyces, Insektenzellen, insbesondere der Gattung Spodoptera frugiperda (Sf), humane oder tierische Zellen (besonders Hamsterzellen, wie Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen) sind besonders bevorzugt.
Das zur Bindung an die spezifischen Antikörper eingesetzte Antigen ist ein virales, prokaryontisches und/oder eukaryontisches Protein, wobei der Begriff "eukaryontisches Protein" parasitäre (z. B. Würmer) oder pflanzliche Proteine (Allergene) einschließt. Vorzugsweise ist es ein virales, bakterielles und/oder humanes Protein, das je nachdem, welche Wirtszellen zur Expression verwendet werden, nicht glykosyliert oder glykosyliert oder anderweitig modifiziert sein kann. Die Modifikationen, die die Organismen an die Proteine anfügen können, sind vielfältig. Als Resultat erhält man neben phosphorylierten Proteinen, Mucopeptide, Glyko- und Lipoproteine. Auch Modifikationen einzelner Aminosäuren sind möglich (Hydroxylierungen beim Hydroxyprolin, etc.).
Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren besonders zum getrennten oder gemeinsamen Nachweis von EBNA-1, von SLA/LP und/oder von Treponema pallidum- Proteinen und damit zum Nachweis von EBV-Infektionen, von Syphilis und der autoimmunen Hepatitis geeignet ist. Die im Zusammenhang mit den im Stand der Technik bekannten Nachteile werden bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung vermieden.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren ein Verfahren zur Diagnose der Autoimmunhepatitis im Rahmen der chronischen Lebererkrankungen, bei dem man als biologische Probe humanes Serum verwendet und das Antigen SLA (soluble liver antigen) ist.
Gemäß einer weiteren, besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren ein Verfahren zur Diagnose von EBV- Infektionen, bei dem man als biologische Probe humanes Serum verwendet und das Antigen EBNA-1 ist.
Vorzugsweise weisen SLA und EBNA-1 die in SEQ ID NO: 2 (SLA; vgl. DE-A-198 05 815) und EBNA-1 die SEQ ID NO: 4 (EBNA-1) dargestellten Aminosäuresequenzen auf.
Als Nukleinsäuresequenzen, die für SLA und EBNA-1 kodieren, werden beispielsweise die erfindungsgemäß bevorzugten, in SEQ ID NO: 1 (SLA) und SEQ ID NO: 3 (EBNA-1) dargestellten Sequenzen verwendet.
Gemäß einer weiteren, besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren ein Verfahren zur Syphilis-Diagnose, bei dem man als biologische Probe humanes Serum und das rekombinante Antigen TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und/oder TpN47 ist.
Vorzugsweise weisen TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 die in SEQ ID NO: 6, 8, 10 und 12 dargestellten Aminosäuresequenzen auf.
Als Nukleinsäuresequenzen, die für TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 kodieren, werden beispielsweise die erfindungsgemäß bevorzugten, in SEQ ID NO: 5, 7, 9 und 11 dargestellten Sequenzen verwendet.
Für den Fachmann ist selbstverständlich, daß neben den explizit genannten und hier offenbarten Nukleinsäuresequenzen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes auch andere Sequenzen verwendet werden können, die für die selben Proteine kodieren. Ebenso sind Modifikationen denkbar, wie der Austausch, die Deletion und/oder die Insertion einzelner oder mehrerer Aminosäuren, die nicht zwangsläufig zu einer Veränderung der Antigenität führen. Bei Kenntnis der jeweiligen Epitope lassen sich auch Teile (Fragmente) größerer Proteine einsetzen, wodurch die Spezifität des Nachweises erhöht werden kann. Beispielhaft können hier Peptide des MOMP- Antigens (Major Outer Membran Protein) aus Chlamydia pneumoniae aufgeführt werden. Diese reichen für einen typspezifischen ELISA und zur Vermeidung von Kreuzreaktionen mit z. B. Chlamydia trachomatis aus.
Zum Nachweis der Bindung der spezifischen Antikörper an das Antigen bzw. die Antigene werden markierte, gegen die spezifischen Antikörper gerichtete sekundäre Antikörper verwendet. Als Marker kommen beispielsweise Chromogene, Fluoreszenzfarbstoffe (wie z. B. Fluorescein-Isothiocyanat), Lumineszenzfarbstoffe, radioaktive Marker, Metalle (wie z. B. Gold) und/oder Enzyme in Frage.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung von transformierten Wirtszellen, in die eine Nukleinsäuresequenz eingebracht ist, die für ein Antigen (virales, bakterielles oder eukaryontisches Antigen) kodiert, zur Verwendung in einem vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren. Bei den Wirtszellen handelt es sich vorzugsweise um prokaryontische oder eukaryontische Zellen, insbesondere E. coli-Zellen, Zellen der Gattung Saccharomyces oder Insektenzellen, vor allem der Gattung Spodoptera frugiperda, humane oder tierische Zellen (siehe oben).
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Kit zur Verwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
Gemäß einer besonderen Ausführungsform enthält das Kit einen Objektträger mit darauf immobilisierten transformierten Wirtszellen und sekundäre Antikörper, wie oben beschrieben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Kit, bei dem die Wirtszellen verschiedene transformierte Zellen sind, die jeweils nur eines der verschiedenen Antigene exprimieren, wobei die jeweiligen, die verschiedenen Antigene exprimierenden Wirtszellen in separaten Reaktionsfeldern auf dem Objektträger immobilisiert sind, so daß in jedem Reaktionsfeld nur ein Antigen präsentiert wird. In diesem Zusammenhang ist ein Kit eingeschlossen, bei dem die sekundären Antikörper unterschiedlich markiert sind.
Vorzugsweise enthält ein Kit der vorliegenden Erfindung ferner Wirtszellen zur Herstellung des Lysats von Schritt (b) des Verfahrens und/oder weitere, zur Durchführung des Verfahrens erforderliche oder nützliche Reagenzien und Hilfsmittel.
Hinsichtlich der Antigene, die von den im vorgenannten Kit enthaltenen transformierten Wirtszellen exprimiert werden sowie hinsichtlich der bevorzugten Aminosäuresequenzen und Nukleinsäuresequenzen wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf die obigen Angaben und Ausführungen Bezug genommen. Demgemäß handelt es sich bei dem Kit besonders bevorzugt um ein Kit zur Syphilis-Diagnose, zum Nachweis autoimmuner Hepatitis oder zur Diagnose von EBV-Infektionen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ferner ein fester Träger bereitgestellt, auf dessen Oberfläche transformierte Wirtszellen immobilisiert sind, in die ein Expressionsvektor einbracht ist, der eine Nukleinsäuresequenz enthält, die für SLA oder EBNA-1 kodiert. Alternativ kann die Nukleinsäuresequenz für ein oder mehrere Proteine aus der Gruppe bestehend aus TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 kodieren.
Die Erfindung schließt ferner einen fester Träger ein, auf dessen Oberfläche transformierte Wirtszellen immobilisiert sind, wobei die Wirtszellen verschiedene transformierte Zellen sind, in die jeweils eine Nukleinsäuresequenz eingebracht ist, die jeweils für ein anderes Antigen kodiert, wobei die jeweiligen, die verschiedenen Antigene exprimierenden Wirtszellen in separaten Reaktionsfeldern auf dem Objektträger immobilisiert sind, so daß in jedem Reaktionsfeld nur ein Antigen präsentiert wird, und die Wirtszellen verschiedene transformierte Zellen sind, die jeweils nur eines der verschiedenen Antigene exprimieren, wobei die jeweiligen, die verschiedenen Antigene exprimierenden Wirtszellen in separaten Reaktionsfeldern auf dem Objektträger immobilisiert sind, so daß in jedem Reaktionsfeld nur ein Antigen präsentiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene aus der Gruppe bestehend aus TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 ausgewählt sind.
Im Hinblick auf die Wirtszellen, die bevorzugten Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen sowie die Expressionsvektoren wird wiederum auf die obigen Angaben und Ausführungen verwiesen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen, Figuren und einem Sequenzprotokoll beschrieben:

Beispiel 1

Material und Methoden - Allgemeine Versuchsbeschreibung

A. Herstellung eines Escherichia coli-Lysates zur Präadsorption

Wichtig bei der Absorption der wirtsspezifischen Antikörper ist die Herstellung eines Präadsorbens, dessen antigene Bestandteile mit denen der das rekombinante Protein exprimierenden Wirtszellen identisch sein müssen. Um dies zu erreichen, wird die Wirtszelle ohne die plasmidal oder chromosomal insertierte kodierende DNA für das rekombinante Antigen identisch kultiviert wie der jeweilige Expressionsstamm.

Herstellungsbedingungen

Escherichia coli-Zellen werden aus einer Glycerin-Kultur auf einer LB-Agarplatte ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert (nach Sambrook et al., 1989). Ein vereinzelt gewachsener Klon wird in 50 ml LB-Medium überführt und erneut bei 37°C unter kräftigem Schütteln über Nacht inkubiert. Von dieser Vorkultur werden 20 ml in 1000 ml frisches LB-Medium übergeimpft und bis zu einer optischen Dichte von ca. 2 (gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm) kultiviert (etwa 4 Stunden). Die Extinktion einer E. coli- Suspension ist bei dieser Wellenlänge proportional zur Zelldichte. Die Zellsuspension wird für 15 Minuten mit 4000 Upm (Rotor: Beckman JA-17) zentrifugiert und das erhaltene Zellpellet in insgesamt 30 ml PBS/Tween-Puffer (für 1 Liter: 8.5 g NaCl, 1.42 g Na₂HPO₄, 0.29 g NaH₂PO₄, 0.02% Tween-20) resuspendiert. Diese Zellsuspension wird 5 Minuten mit Ultraschall behandelt (Branson, Sonifier Cell Disruptor B15) wobei die Zellen lysieren und die Antigene für die Absorption der wirtsspezifischen Antikörper zugänglich vorliegen. Dieses als Präadsorbens bezeichnete Escherichia coli-Lysat wird aliquotiert, bei -20°C eingefroren und ist so gelagert über einen Zeitraum von einem Jahr einsetzbar.

B. Einsatz des Escherichia coli-Präadsorbens

10 µl dieses Präadsorbens werden mit 10 µl der antikörperhaltigen Probe (Verhältnis 1 : 1) gemischt, 80 µl PBS/Tween-Puffer dazugegeben und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der erfolgten Präadsorption der E. coli-spezifischen Antikörper wird die Lösung entsprechend der jeweiligen Testanforderung verdünnt und zur Analyse der spezifischen Antikörper eingesetzt.

C. Überexpression rekombinanter Antigene

Ein die für ein rekombinantes Antigen kodierende Nukleinsäure enthaltener E. coli-Stamm wird aus einer Glycerinkultur (Standard nach Sambrook et al., 1989) auf einer Ampicillinhaltigen LB-Agarplatte (100 µg/ml Ampicillin) ausgestrichen und über Nacht bei 37°C im Brutschrank inkubiert. Von den am nächsten Tag gewachsenen Kolonien wird eine in 5 ml Ampicillin-haltiges LB-Medium (100 µg/ml Ampicillin) in ein Reagenzglas übergeimpft und diese Vorkultur wird über Nacht unter Schütteln im 37°C Warmluftschüttler inkubiert. Am folgenden Tag wird 1 ml der Vorkultur in 100 ml Ampicillinhaltiges Medium überführt (100 µg/ml Ampicillin, im Erlenmeyerkolben) und erneut bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Bei einer optischen Dichte zwischen 0.5 und 1.2 (gemessen bei einer Wellenlänge von 600 nm) wird zur Induktion der Expression des rekombinanten Proteins IPTG (Isopropyl-β- thiogalactosid) in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben und die Kultur weitere 4 Stunden unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Antigen-enthaltene Zellsuspension hat nun eine optische Dichte von etwa 2 und kann nun in der Diagnostik eingesetzt werden.

D. Immobilisierung der transformierten Wirtszellen auf festen Trägern

1 ml einer rekombinantes Antigen enthaltenen E. coli- Zellsuspension (C) wird für 5 Minuten mit einer Tischzentrifuge im Eppendorf-Reaktionsgefäß bei 13.000 Upm zentrifugiert. Das erhaltene Bakterienpellet wird in 1 ml PBS- Puffer (für 1 Liter: 8.5 g NaCl, 1.42 g Na₂HPO₄, 0.29 g NaH₂PO₄) resuspendiert. 100 µl dieser Suspension werden auf einem Glasobjektträger (26 × 76 mm) ausgestrichen und luftgetrocknet. Der Objektträger mit den angetrockneten Zellen wird 10 Minuten in Methanol und anschließend 10 Sekunden in Aceton getaucht. Abschließend läßt man den Objektträger erneut an der Luft trocknen und setzt die Zellen entweder sofort als Substrate in der indirekten Immunfluoreszenz zum Nachweis von Antikörpern ein oder bewahrt sie in flüssigem Stickstoff auf. Dort sind die Substrate über mehrere Jahre haltbar.

Beispiel 2

Nachweis von anti-Treponema pallidum-Antikörpern in der Syphilis Diagnose

A. Herstellung von E. coli-Wirtszellen, die Treponema pallidum-Proteine exprimieren

Klonierung der Treponemen-Antigene in Expressionsvektoren: Die kodierenden Sequenzen der für die Syphilis-Diagnose relevanten Treponemen-Antigene TpN15, TpN17, TpN44.5 (tmpA) und TpN47 (SEQ ID No. 5, 7, 9 und 11) wurden mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert und in einen Expressionsvektor (pTriEx-1, Novagen) ligiert. Nach Transformation der Plasmide in einen E. coli-Expressionstamm (BL21 (DE3) pLysE, Novagen) wurden die Antigene exprimiert und in situ für diagnostische Zwecke eingesetzt.

Durchführung

Treponema pallidum wurde aus infizierten Kaninchenhoden gewonnen und die genomische DNA durch eine modifizierte Proteinase K/SDS-Methode isoliert (Sambrook et al., 1989). Die Aufreinigung wurde mittels eines Agarosegeles analysiert. Die Genamplifikation erfolgte mit Hilfe spezifischer Primer an deren 5'-Ende jeweils die Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen kodiert vorlagen, so daß die nach dem Verdau entstehenden 5'-Überhänge den Einbau der Amplifikate in die NcoI/XhoI Klonierungsstelle des Plasmides ermöglichten. Die 3'- terminalen Primer waren so konzipiert, daß direkt im Anschluß an die kodierende Sequenz ein Stop-Codon folgte, was den Abbruch der Translation zur Folge hatte und dadurch der in diesem Plasmid kodierte Histidin-Tag nicht Teil des rekombinanten Proteins wurde.
Die PCR wurde in einem Endvolumen von 50 µl nach Herstellerangaben (Stratagene) durchgeführt und enthielt folgende Komponenten: 34 µl Wasser, 5 µl 10 × Pfu-Puffer (Stratagene), 4 µl dNTPs (je 2.5 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 1 µl Treponema pallidum genomische DNA, je 2.5 µl der 5'-und 3'-terminalen Primer (jeweils 10 µM) und 1 µl Pfu DNA- Polymerase (Stratagene). Die Reaktionen wurden im Primus 96 Thermocycler (MWG-Biotech) durchgeführt (Denaturierung 45 Sekunden, 95°C; Annealing 30 Sekunden, 56°C; Polymerisation 2 Minuten, 71°C). Die Größe der PCR-Produkte wurde über native Agarosegelelektrophorese überprüft.
Restriktion und Ligation von Vektoren und PCR-Produkten erfolgten nach Standard-Protokollen (Sambrook et al., 1989) unter Berücksichtigung der Herstellerangaben zu den jeweiligen Enzymen (Restriktionsendonukleasen, MBI-Fermentas; T4-DNA Ligase und alkalische Phosphatase, Roche). Nach Transformation der Ligationsprodukte in E. coli-Zellen wurde der korrekte Einbau der PCR-Produkte in das Plasmid durch Restriktionsanalyse überprüft und in der Expression getestet. Die überexprimierten Proteine (Vorgehensweise siehe Beispiel 1, C) wurden über SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese und Coomassie-Färbung sowie Detektion im Westernblot durch charakterisierte Seren getestet.
Die Überexpression der Treponema pallidum-Proteine exprimierenden Zellen erfolgt entsprechend dem in Beispiel 1C. angegebenen allgemeinen Protokoll.

B. Syphilis-Diagnostik

Zum Nachweis der für Treponema pallidum spezifischen Antikörper wurde eine humane Probe gewonnen (klinisch charakterisiertes humanes Serum; Treponemen-positiv) und mit dem oben in Beispiel 1A. genannten Lysat unter den in Beispiel 1B. beschriebenen Bedingungen gemischt und inkubiert.
Nach der Inkubation mit dem Präadsorbens (Beispiel 1B.) liegen die Antiseren in einer Verdünnung von 1 : 10 vor. Diese werden entweder direkt im Immunfluoreszenznachweis eingesetzt oder nochmals mit PBS/Tween-Puffer 1 : 10 verdünnt (Endverdünnung 1 : 100). Auf den Objektträger werden pro Inkubationsfeld jeweils 25 µl der verdünnten Proben pipettiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird der komplette Objetträger mit PBS/Tween-Puffer gewaschen. Nicht gebundene Antikörper und weitere Bestandteile der Probe sowie des Präadsorbens werden dadurch entfernt. Die Detektion der gebundenen spezifischen Antikörper erfolgt über die Zugabe von jeweils 25 µl FITC-gekoppelten anti-human IgG-Antikörpern in PBS/Tween-Puffer für 30 Minuten (wahlweise sind hier dann anti-IgA bzw. anti-IgM-Antikörper einsetzbar). Erneut werden die Objektträger mit PBS/Tween-Puffer gewaschen (zur Entfernung von unspezifisch gebundenen FITC-IgG-Konjugaten). Vor der abschließenden Kontrolle und Beurteilung unter dem Fluoreszenzmikroskop werden auf jeden Objektträger 3 Tropfen 90%iges Glycerin pipettiert und der Objektträger mit einem Deckgläschen eingedeckt. Das Ergebnis der Inkubationen wird exemplarisch an TpN17 gezeigt (Fig. 1).
Abb. 1(A-D) zeigt die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen von T. pallidum TpN17 exprimierenden E. coli Zellen nach Inkubation mit je einem Positiv- (C und D) und einem Negativserum (A und B). Ohne Präadsorption binden Antikörper aus beiden eingesetzten Seren an die korrespondierenden Antigene (A und C). Demzufolge befinden sich im T. pallidum- Negativserum Antikörper gegen Komponenten aus E. coli (A) die im Fall des Positivserums neben den anti-TpN17-spezifischen Antikörpern ebenso vorliegen können (C). Das Fluoreszenzbild nach der durchgeführten Präadsorption zeigt dagegen ein eindeutig auszuwertendes Muster (B und D). Im Fall des Negativserums verschwindet die Fluoreszenz beinahe vollständig (B) während bei dem eingesetzten T. pallidum Positivserum die Fluoreszenz zwar schwächer ist, jedoch eindeutig ein positives Signal liefert (D). Bei den anderen getesteten 3 Treponemen- Antigenen TpN15, TpN44.5 und TpN47 erhält man die gleichen Ergebnisse wie bei TpN17.
Die Vorteile dieses Verfahrens sind bereits genannt. Dazu gehören die dann nicht mehr notwendige Kultivierung der Treponemen in Kaninchenhoden, keine Infektionsgefahr für das die Treponemen isolierende Laborpersonal, keine Präadsorption mehr mit einem weiteren Stamm (Treponema phagedenis). Weiterhin ist die Kultivierung von E. coli-Zellen einfach durchzuführen und liefert in kurzer Zeit große Mengen an Antigenen. Da die Zellen jeweils nur ein apathogenes Antigen aus T. pallidum exprimieren besteht keine Infektionsgefahr mehr.

Beispiel 3

Nachweis von Antikörpern gegen das lösliche Leber-Pankreas- Antigen (anti-SLA/LP-Antikörper) zur Diagnose der autoimmunen Hepatitis im Rahmen der chronischen Lebererkrankungen

A. Herstellung von E. coli-Wirtszellen, die lösliches Leber- Pankreas-Antigen exprimieren

Das SLA-Antigen und dessen Einsatz in der Diagnostik autoimmuner Lebererkrankungen ist im Patent DE 198 05 815 C1 beschrieben. Die Klonierung und Expression des SLA-Antigens ist in der dazugehörenden Veröffentlichung (Wies et al., 2000) detailliert dargelegt. Für den Einsatz in der Immunfluoreszenz werden die das Antigen produzierenden Zellen wie beschrieben kultiviert und fixiert.
Der Expressionsvektor ist in diesem Fall pQE-31 (Qiagen), der Überexpressionsstamm E. coli M15 (pREP).

B. Diagnostik der Autoimmunhepatitis

Zum Nachweis von Antikörpern gegen das lösliche Leber- Pankreas-Antigen wurde ein humanes Serum eingesetzt und mit dem oben in Beispiel 1A. genannten Lysat unter den in Beispiel 1B. beschriebenen Bedingungen gemischt und inkubiert.
Nach der Inkubation mit dem Präadsorbens (s. Beispiel 1B.) erfolgte der Nachweis von anti-SLA/LP-Antikörpern entsprechend dem in Beispiel 2B. für Treponema pallidum beschriebenen Protokoll.
Der entscheidende Vorteil dieses erfindungsgemäßen Ansatzes liegt in der Zusammenführung der verschiedenen, bei der Diagnostik der chronischen Lebererkrankungen verwendeten Nachweisverfahren durch die indirekte Immunfluoreszenz zu einem einzigen Verfahren. Weitere Untersuchungen mittels ELISA oder Westernblot wären zur Identifizierung der Autoimmunhepatitis nicht mehr notwendig. Ob die Antigenität durch unseren neuen Ansatz (die Detektion des rekombinanten SLA in der Immunfluoreszenz) verbessert wird oder nicht, können wir beim gegenwärtigen Zeitpunkt nicht sagen.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1 fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der das Treponemen-Antigen TpN17 produzierenden E. coli- Zellen mit und ohne Präadsorption nach Inkubation mit je einem Positiv- und einem Negativserum (jeweils 1 : 100 Verdünnung). Referenzen 1. Hille A, Klein K, Bäumler S Grässer FA, Müller-Lantzsch N. Expression of Epstein-Barr Virus Nuclear Antigen 1, 2A and 2B in the Baculovirus Expression System: Serological evaluation of human antibodies to these proteins. J. Med. Virol. 1993, 39: 233-241.
2. Manns M, Gerken G, Kyriatsoulis A, Staritz M, Meyer zum Büschenfelde KH. Characterization of a new subgroup of autoimmune chronic activ hepatitis by autoantibodies against a soluble liver antigen. Lancet 1987, 1: 292-4.
3. Norris SJ. Polypeptides of Treponema pallidum: progress toward understanding their structural, functional and immunologic roles. Treponema Pallidum Polypeptide Research Group. Microbiol. Rev. 1993, 57(3): 750-79.
4. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. Edition 2. Cold Spring Harbor Press, New York 1989.
5. Wies I, Brunner S, Henninger J, Herkel J, Kanzler S, Meyer zum Büschenfelde KH, Lohse AW. Identification of target antigen for SLA/LP autoantibodies in autoimmune hepatitis. Lancet 2000, 29; 355(9214): 1510-5. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von spezifischen Antikörpern in einer biologischen Probe unter Verwendung von Antigenen, gegen die die nachzuweisenden Antikörper gerichtet sind, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Kultur von Wirtszellen bereitstellt, man

b) aus einem Teil dieser Wirtszellen ein Lysat erzeugt, man

c) die Probe mit dem Lysat aus Schritt (b) unter Bedingungen inkubiert, die zur Adsorption von gegen die Antigene der Wirtszellen gerichteten Antikörpern geeignet sind, man

d) in einen weiteren Teil dieser Wirtszellen aus Schritt (a) eine Nukleinsäuresequenz einbringt, die für das Antigen kodiert, man

e) die Wirtszellen aus Schritt (d) auf einem festen Träger immobilisiert, man

f) die Wirtszellen aus Schritt (e) mit der Probe aus Schritt (c) unter Bedingungen inkubiert, die zur Bindung von gegen das von den Wirtszellen exprimierte rekombinante Antigen gerichteten Antikörpern (spezifische Antikörper) geeignet sind, man

g) die Wirtszellen aus Schritt (f) wäscht und sie anschließend mit gegen die nachzuweisenden Antikörper (spezifische Antikörper) gerichteten Antikörpern (sekundäre Antikörper) unter Bedingungen inkubiert, die zur Bindung der sekundären Antikörper an die spezifischen Antikörper geeignet sind, wobei die sekundären Antikörper kovalent an einen Marker gebunden sind, und man

h) die Wirtszellen aus Schritt (g) wäscht und die spezifischen Antikörper durch Nachweis des Markers nachweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man parallel mehrere spezifische Antikörper in einer Probe nachweist, indem man mehrere verschiedene Antigene verwendet, die von den in Schritt (e) bereitgestellten Wirtszellen exprimiert werden, wobei man in Schritt (d) ein oder mehrere Nukleinsäuresequenzen in die Wirtszellen einbringt, die für die Antigene kodieren, wobei man die spezifischen Antikörper dadurch nachweist, daß man in Schritt (g) mehrere verschiedene sekundäre Antikörper verwendet, die jeweils nur an eine Immunglobulinklasse binden, wobei die sekundären Antikörper an unterschiedliche Marker gebunden sind und man die jeweiligen spezifischen Antikörper durch Nachweis des entsprechenden Markers nachweist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man parallel mehrere spezifische Antikörper in einer Probe nachweist, indem man mehrere verschiedene, rekombinant hergestellte Antigene verwendet, die von den in Schritt (e) bereitgestellten Wirtszellen exprimiert werden, wobei man die jeweiligen, die verschiedenen Antigene exprimierenden Wirtszellen an unterschiedlichen Stellen (Reaktionsfeldern) auf dem festen Träger immobilisiert, so daß in jedem Reaktionsfeld nur ein Antigen präsentiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man in Schritt (g) gleichzeitig mehrere verschiedene sekundäre Antikörper verwendet, die jeweils nur an eine Immunglobulinklasse binden, wobei die sekundären Antikörper an unterschiedliche Marker gebunden sind und man die jeweiligen spezifischen Antikörper durch Nachweis des entsprechenden Markers nachweist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Schritt (g) mit unterschiedlichen sekundären Antikörpern (IgA, IgG und/oder IgM) parallel durchführt, wobei die Inkubation mit den sekundären Antikörpern für jedes Reaktionsfeld jeweils separat erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Schritt (g) mehrfach nacheinander oder mit unterschiedlichen sekundären Antikörpern (IgA, IgG und/oder IgM) parallel durchführt und jeweils verschiedene sekundäre Antikörper verwendet, die jeweils nur an eine Immunglobulinklasse binden, wobei die sekundären Antikörper an unterschiedliche Marker gebunden sind.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine humane oder tierische Probe ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Serum, Plasma, Blut, Liquor, Urin, Sputum, Stuhl, Cerebrospinalflüssigkeit, Ascites oder Amnionflüssigkeit ist, wobei die Probe gegebenenfalls zuvor in eine für die Inkubation in Schritt (f) geeignete Form überführt ist.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen prokaryontische oder eukaryontische Zellen sind.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen E. coli-Zellen, Zellen der Gattung Saccharomyces, Insektenzellen, humane oder tierische Zellen sind.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein virales, prokaryontisches und/oder eukaryontisches Protein ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein virales, bakterielles, parasitäres, pflanzliches und/oder humanes Protein ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen EBV-Antigen, EBNA-1, SLA/LP und/oder ein Treponema pallidum-Protein ist.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker ein Chromogen, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Lumineszenzfarbstoff, ein radioaktiver Marker, ein Metall und/oder ein Enzym ist.

15. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14 zur Autoimmunhepatitis-Diagnose, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe humanes Serum und das Antigen SLA ist.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14 zur Diagnose einer EBV-Infektion, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe humanes Serum und das Antigen EBNA-1 ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß SLA die in SEQ ID NO: 2 und EBNA-1 die SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die für SLA kodierende Nukleinsäuresequenz die in SEQ ID NO: 1 und die für EBNA-1 kodierende Nukleinsäuresequenz die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz aufweist.

19. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14 zur Syphilis- Diagnose, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe humanes Serum und das rekombinante Antigen TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und/oder TpN47 ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 die in SEQ ID NO: 6, 8, 10 und 12 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweisen.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die für TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 kodierenden Nukleinsäuresequenzen die in SEQ ID NO: 5, 7, 9 und 11 dargestellten Sequenzen aufweisen.

22. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen humane Zellen, Insektenzellen oder E.-coli-Zellen sind und die Expressionsvektoren die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 dargestellten Sequenzen enthalten.

23. Verwendung von transformierten Wirtszellen, in die eine Nukleinsäuresequenz eingebracht ist, die für ein Antigen kodiert, zur Verwendung in einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 22.

24. Verwendung nach Anspruch 23 zur Autoimmunhepatitis- Diagnose, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe humanes Serum und das Antigen SLA ist.

25. Verwendung nach Anspruch 23 zur Diagnose einer EBV- Infektion, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe humanes Serum und das Antigen EBNA-1 ist.

26. Verwendung nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß SLA die in SEQ ID NO: 2 und EBNA-1 die SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die für SLA kodierende Nukleinsäuresequenz die in SEQ ID NO: 1 und die für EBNA-1 kodierende Nukleinsäuresequenz die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz aufweist.

28. Verwendung nach Anspruch 23 zur Syphilis-Diagnose, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe humanes Serum und das Antigen TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und/oder TpN47 ist.

29. Verwendung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 die in SEQ ID NO: 6, 8, 10 und 12 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweisen.

30. Verwendung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß die für TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 kodierenden Nukleinsäuresequenzen die in SEQ ID NO: 5, 7, 9 und 11 dargestellten Sequenzen aufweisen.

31. Verwendung nach den Ansprüchen 23 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen prokaryontische oder eukaryontische Zellen sind.

32. Verwendung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen E. coli-Zellen, Zellen der Gattung Saccharomyces, Insektenzellen, humane oder tierische Zellen sind.

33. Verwendung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen E. coli-Zellen sind und die Nukleinsäuresequenzen die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 oder 11 dargestellten Sequenzen enthalten.

34. Kit zur Verwendung in einem Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 22.

35. Kit nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Objekträger mit darauf immobilisierten transformierten Wirtszellen und sekundäre Antikörper enthält.

36. Kit nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen Zellen sind, in die ein oder mehrere Nukleinsäuresequenzen eingebracht sind, die für verschiedene Antigene kodieren.

37. Kit nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen verschiedene transformierte Zellen sind, die jeweils nur eines der verschiedenen Antigene exprimieren, wobei die jeweiligen, die verschiedener Antigene exprimierenden Wirtszellen in separaten Reaktionsfeldern auf dem Objektträger immobilisiert sind, so daß in jedem Reaktionsfeld nur ein Antigen präsentiert wird.

38. Kit nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die sekundären Antikörper unterschiedlich markiert sind.

39. Kit nach den Ansprüchen 35 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner Wirtszellen zur Herstellung des Lysats von Schritt (b) des Verfahrens und/oder weitere, zur Durchführung des Verfahrens erforderliche oder nützliche Reagenzien und Hilfsmittel enthält.

40. Kit nach den Ansprüchen 35 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen SLA oder EBNA-1 ist.

41. Kit nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß SLA die in SEQ ID NO: 2 und EBNA-1 die SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

42. Kit nach Anspruch 41, dadurch gekennzeichnet, daß die für SLA kodierende Nukleinsäuresequenz die in SEQ ID NO: 1 und die für EBNA-1 kodierende Nukleinsäuresequenz die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz aufweist.

43. Kit nach den Ansprüchen 35 bis 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und/oder TpN47 ist.

44. Kit nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 die in SEQ ID NO: 6, 8, 10 und 12 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweisen.

45. Kit nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß die für TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 kodierender Nukleinsäuresequenzen die in SEQ ID NO: 5, 7, 9 und 11 dargestellten Sequenzen aufweisen.

46. Kit nach den Ansprüchen 35 bis 45, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen prokaryontische oder eukaryontische Zellen sind.

47. Kit nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen E. coli-Zellen, Zellen der Gattung Saccharomyces, Insektenzellen, humane oder tierische Zellen sind.

48. Kit nach den Ansprüchen 40 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen humane Zellen, Insektenzellen oder E. coli-Zellen sind und die Nukleinsäuresequenzen die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 und 11 dargestellten Sequenzen aufweisen.

49. Fester Träger, auf dessen Oberfläche transformierte Wirtszellen immobilisiert sind, in die eine Nukleinsäuresequenz eingebracht ist, die für SLA oder EBNA-1 kodiert.

50. Träger nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß SLA die in SEQ ID NO: 2 und EBNA-1 die SEQ ID NO: 4 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.

51. Träger nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß die für SLA kodierende Nukleinsäuresequenz die in SEQ ID NO: 1 und die für EBNA-1 kodierende Nukleinsäuresequenz die in SEQ ID NO: 3 dargestellte Sequenz aufweist.

52. Fester Träger, auf dessen Oberfläche transformierte Wirtszellen immobilisiert sind, in die ein oder mehrere Nukleinsäuresequenzen eingebracht sind, die für verschiedene Antigene kodieren, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene aus der Gruppe bestehend aus TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 ausgewählt sind.

53. Fester Träger, auf dessen Oberfläche transformierte Wirtszellen immobilisiert sind, wobei die Wirtszellen verschiedene transformierte Zellen sind, in die jeweils eine Nukleinsäuresequenz eingebracht ist, die jeweils für ein anderes Antigen kodiert, wobei die jeweiligen, die verschiedenen Antigene exprimierenden Wirtszellen in separaten Reaktionsfeldern auf dem Objektträger immobilisiert sind, so daß in jedem Reaktionsfeld nur ein Antigen präsentiert wird, und die Wirtszellen verschiedene transformierte Zellen sind, die jeweils nur eines der verschiedenen Antigene exprimieren, wobei die jeweiligen, die verschiedenen Antigene exprimierenden Wirtszellen in separaten Reaktionsfeldern auf dem Objektträger immobilisiert sind, so daß in jedem Reaktionsfeld nur ein Antigen präsentiert wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Antigene aus der Gruppe bestehend aus TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 ausgewählt sind.

54. Träger nach Anspruch 52 und 53, dadurch gekennzeichnet, daß TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 die in SEQ ID NO: 6, 8, 10 und 12 dargestellten Aminosäuresequenzen aufweisen.

55. Träger nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, daß die für TpN15, TpN17, TpN44,5 [TmpA] und TpN47 kodierenden Nukleinsäuresequenzen die in SEQ ID NO: 5, 7, 9 und 11 dargestellten Sequenzen aufweisen.

56. Träger nach den Ansprüchen 49 bis 55, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen prokaryontische oder eukaryontische Zellen sind.

57. Träger nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen E. coli-Zellen, Zellen der Gattung Saccharomyces, Insektenzellen, humane oder tierische Zellen sind.

58. Träger nach den Ansprüchen 49 bis 57, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen humane Zellen, Insektenzellen oder E. coli-Zellen und die Nukleinsäuresequenzen die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 und 11 dargestellten Sequenzen aufweisen.