DE10205846A1 - Bioaktives Material und Verfahren zu dessen Herstellung - Google Patents
Bioaktives Material und Verfahren zu dessen HerstellungInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein bioaktives Material sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung. Potentielle Anwendungen sind medizinische Implantologie, Gewebezüchtungen und Biotechnologie. Der Erfindung liegt ein von einer Schicht zellausgeschiedener Produkte umgebenes Festkörpermaterial zugrunde. DOLLAR A Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Material für Anwendungen in medizinischer Implantologie, Gewebezüchtung und Biotechnologie zu schaffen, bei welchem die Oberfläche für eine breite Klasse von Festkörpermaterialien bei Kontakt mit zellulären Medien zellbiologisch spezifische Wechselwirkungen aktiv vermittelt. Der Erfindung obliegt auch die Aufgabe, ein anwendungswirksames Verfahren zur Herstellung des genannten bioaktiven Materials vorzuschlagen. DOLLAR A Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass die auf dem Basiskörper befindliche Oberflächenschicht aus den intakten Molekülen und Molekülfragmenten nicht mineralisierter Komponenten der Zellprodukte besteht und dass alle diese Bestandteile zu einer quasi-zweidimensionalen die Basiskörperoberfläche umhüllenden Struktur mit einer relativ zur Basiskörperoberfläche vertikalen Ausdehnung im Sub-mum-Bereich angeordnet sind. Das Verfahren beinhaltet, dass für eine vertikale Schichtausdehnung von unter 400 nm die Inkubationszeit maximal vier Tage beträgt und dass die nach Abtrennung von Zellen exponierte und an der Oberfläche des Basiskörpers haftende Zellproduktschicht in Kontakt mit einer Enzymlösung gebracht wird.
Description
- Die Erfindung betrifft ein bioaktives Material sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung. Potentielle Anwendungen sind medizinische Implantologie, Gewebezüchtung und Biotechnologie. Der Erfindung liegt ein von extrazellulär zellausgeschiedenen Produkten umgebenes Festkörpermaterial zugrunde. Bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung von künstlichem Knochen (EP 0 798 374 A1), bei welchem auf einem Substrat adhärierte Zellen zur Produktion der mineralisierten extrazellulären Matrix (ECM) unter in vitro-Bedingungen für mehrere Wochen kultiviert und danach wieder entfernt werden. Solche Oberflächenstrukturen, deren Schichtdicken bis zu 100 µm reichen, zeigen jedoch Hemmungen für die Zelladhäsion und ungenügende Oberflächenhaftung.
- Weiterhin bekannt ist die Oberflächenbehandlung von prothetischen Implantaten (WO 01/03750 A1), indem die natürlich vorkommenden extrazellulären Matrixproteine als eine Bedeckung auf die Implantatoberfläche aufgetragen werden. Die extrazellulären Matrixproteine werden hierbei in einem gesonderten in vitro-Prozess gewonnen, indem die durch Zellen in einem lebenden Gewebe ausgeschiedenen extrazellulären Matrixproteine auf einem Substrat durch Töten und Abtrennen der Zellen gesammelt werden. Es folgt eine Präparierung der für die Beschichtung der Implantate benötigten Zusammensetzung durch Vermischen der extrazellulären Matrixkomponenten mit weiteren pharmakologisch wirksamen und Trägersubstanzen. In der Tat weicht jedoch, bedingt durch beschriebene Verfahrensschritte, die Oberfläche hinsichtlich der Zusammensetzung und Struktur erheblich von der nativen extrazellulären Matrix ab, die die Wechselwirkungen mit Zellen vermittelt.
- Bekannt ist weiter ein aus Zellen und Komponenten der extrazellulären Matrix bestehendes Gewebematerial sowie dessen Herstellungsverfahren (WO 00/29553). Hierbei werden Zellen zur Produktion der extrazellulären Matrix kultiviert, wobei im Prozess der Kultivierung Zellen innerhalb des Matrixmaterials eingebettet sind. Diese technische Lösung ist zur Herstellung von künstlicher Haut geeignet, nicht jedoch zur Vermittlung von zellbiologisch spezifischen Wechselwirkungen.
- Desweiteren bekannt ist die oberflächentopographische Modulation der Zelladhäsion, -migration, -morphologie und -differenzierung (R. S. Kane, S. Takayama, E. Ostuni, D. E. Ingber, G. M. Whitesides, Biomaterials 20 (1999) 2363-2376). Hierbei erfolgt die Oberflächenstrukturierung mittels Photolithographie oder Mikrokontaktdrucken. Oberflächen, die die Abdrücke von Proteinmolekülen replizieren und spezifische Strukturerkennung gegenüber Proteinen aufweisen, werden bekannterweise durch Polymerabscheidung auf oberflächenfixierten Proteinen mittels Glimmentladung hergestellt (H. Shi, W. B. Tsai, M. D. Garrison, S. Ferreri, B. D. Ratner, Science 398 (1999) 593-597). Die Probleme liegen in der Strukturierung von nichtplanaren Realoberflächen. Zudem wird die Oberflächentopographie erst sinnvoll im Zusammenwirken mit weiteren Aspekten der Oberflächenmodifizierung. Das bekannte Verfahren bietet eine Verbesserung hinsichtlich der Struktur, berücksichtigt aber die Zusammensetzung nicht.
- Ein weiterer bekannter Ansatz ist die kovalente Bindung von zellbiologisch spezifischen Biomolekülen an Oberflächen von Biomaterialien. (WO 99/26674 A2, K. C. Dee et al., Biomaterials 17 (1996) 209). Die wenigen angebundenen spezifischen Proteine sind für die komplexe Regulation der Zellfunktion jedoch ungenügend.
- Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Material für Anwendungen in medizinischer Implantologie, Gewebezüchtung und Biotechnologie zu schaffen, bei welchem die Oberfläche für eine breite Klasse von Festkörpermaterialien bei Kontakt mit zellulären Medien zellbiologisch spezifische Wechselwirkungen aktiv vermittelt. Der Erfindung obliegt auch die Aufgabe, ein anwendungswirksames Verfahren zur Herstellung des genannten bioaktiven Materials vorzuschlagen.
- Erfindungsgemäß wird die Aufgabe mit den in den Patentansprüchen 1 und 7 ausgeführten Merkmalen gelöst. Aus- und Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.
- Es wird ein aus einem Basiskörper und einer die Basiskörperoberfläche umhüllenden Struktur aus extrazellulär zellausgeschiedenen Produkten bestehendes Material verwendet. Zellausgeschiedene Produkte im Sinne der Erfindung sind intakte Moleküle und Molekülfragmenten von Kollagenen, Glykoproteinen und Proteoglykanen, welche als nicht mineralisiert und in gewebespezifischer Zusammensetzung und Oberflächenkonzentration vorliegen. Diese Bestandteile sind zu einer quasi-zweidimensionalen die Basiskörperoberfläche umhüllenden Struktur mit einer relativ zur Basiskörperoberfläche vertikalen Ausdehnung im Sub-µm-Bereich angeordnet. Die exponierten Oberflächen sind Zelloberflächen gegenüber morphologisch komplementär. Die umhüllenden Oberflächenkomponenten sind über Bindungen zwischen proteinassoziierten und oberflächengebundenen chemisch komplementären funktionellen Gruppen an den Basiskörper verankert. Der Basiskörper ist bezüglich seiner geometrischen Struktur frei wählbar und dem Einsatzzweck angepasst. Er wird aus den Materialgruppen Metall, Legierung, Glas, Keramik, Polymer, Halbleiter oder Komposit ausgewählt.
- In weiterer Ausbildung des Verfahrens wird die mit Zellen versehene Basiskörperoberfläche in einem Kulturmedium unter in vitro Bedingungen zur Ausscheidung der Zellprodukte inkubiert und die nach selektiver Abtrennung von Zellen exponierte und an der Oberfläche des Basiskörpers haftende Zellproduktschicht in Kontakt mit einer Enzymlösung gebracht.
- Ein beispielhafter Prozess entsprechend dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren besteht aus mehreren Schritten. Im ersten Prozessschritt wird der Basiskörper zur Bildung exponierter Oberfläche mit funktionellen Gruppen behandelt. In einem zweiten Prozessschritt wird die nach dem ersten Schritt erhaltene Oberfläche in einer Zellsuspension zur Bildung einer konfluierenden Zellschicht inkubiert. In einem anschließenden Schritt wird die Oberfläche mit der Zellschicht in einem die Ausscheidung der Zellprodukte fördernden Kulturmedium inkubiert. In einem weiteren Schritt wird die aus dem vorhergehenden Schritt resultierte Oberfläche von den Zellen unter Erhaltung der oberflächengebundenen Zellprodukte selektiv befreit. Die Oberfläche mit Zellprodukten wird anschließend einer Enzymlösung ausgesetzt. Es werden zellprodukt-spezifische Enzyme eingesetzt.
- Zur Ausbildung einer oberflächenabdeckenden Konfluenzschicht werden erfindungsgemäß die angehefteten Zellen in einem die Zellteilung fördernden und für die jeweilige Zellart angepassten Nährmedium kultiviert. Bei vollständiger Bedeckung der Fläche werden ausgehend von dieser Konstellation die adhärierenden Zellen zur Synthese der extrazellulären Produkte in einem die Zelldifferenzierung und -reifung stimulierenden Nährmedium weiter kultiviert. Es werden Nährmedien und Kulturbedingungen entsprechend bekannten Vorschriften verwendet (A. Doyle, J. B. Griffiths, eds., Cell and Tissue Culture, Wiley, 1998; R. I. Freshney, Culture of Animal Cells, Wiley-Liss, 1994; T. Lindl, J. Bauer, Zell- und Gewebekultur, Gustav Fischer Verlag, 1994). Die oberflächengebundenen Zellprodukte werden entsprechend dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren zur Bildung einer umhüllenden Struktur des bioaktiven Materials von den Zellen befreit. Die selektive Zelltrennung erfolgt optionsweise durch enzymatische Reaktionen, chemische Reaktionen, Proteinfaltung und -entfaltung, komplementabhängige Zytolyse, kryophysikalische Effekte, oder eine Kombination dieser Schritte. Zellprodukt-spezifische Enzyme, vorzugsweise Matrix-Metalloproteinasen, werden zur Behandlung von nach der Entfernung von Zellen exponierten und oberflächenhaftenden Zellprodukten eingesetzt. Die Reaktion mit Enzym ist Verfahrensweise variabel bezüglich der Kombination der Enzyme, und Reihenfolge und Dauer der Behandlung gestaltet, um eine im Sub-µm-Bereich, vorzugsweise unter 100 nm, dünne Oberflächenbedeckung aus intakten Molekülen und Molekülfragmenten der Zellprodukte zu erzeugen.
- Im Herstellungsverfahren wird die zellbiologisch spezifische Synthese der Grundsubstanz für das Wachstum höher differenzierter Zellen, die bislang ein unerreichbares Ziel in künstlichen Systemen darstellt, durch Zellen übernommen. Eine breite Klasse von auf festen Unterlagen extrazelluläre Produkte synthetisierenden Zellen wird eingesetzt. Es sind aus Gewebe und Organ gewonnene Primärzellen und Zellpassagen aus Zellreihen. Bevorzugte Beispiele sind mesenchymale Zellen, Osteoblasten, Knochenmarkmatrixzellen, Perizyten, Haut-Fibroblasten, knochenbildende Zelllinien SAOS-2 (osteosarcoma) oder HOS (human osteosarcoma). Eine Option der Prozessbehandlung ist die selektive Anheftung gewünschter Zellen aus einer Mischzellkultur. An die Oberfläche des Basiskörpers werden spezies- oder zellartspezifische Antikörper, vorzugsweise Antikörper zu den komplementaktivierenden Klassen IgG oder IgM, fixiert, welche Zellen aus einem Gemisch selektiv binden. Ein sich anschließender Waschprozess entfernt die nicht beabsichtigten Zellen.
- Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren beziehen sich funktionelle Gruppen auf oberflächenexponierte chemische Gruppen, die mit ihren proteinassoziierten komplementär funktionellen Gruppen Reaktionen eingehen, wobei es zu einer verstärkten Haftung von Proteinen an Oberflächen über die chemischen Bindungen kommt. Bevorzugte funktionelle Gruppen sind Hydroxyl, Amin, Thiol, Sulfhydryl, Karboxyl und Epoxy. Die Fixierung auf der Oberfläche erfolgt durch Behandlung des Basiskörpers mit funktionellene Gruppen liefernden Substanzen entsprechend bekannten Reaktionen (nach H. H. Weetall, in Applied Biochemistry and Biotechnology, The Humana Press Inc., 1993, p. 157-188). Solche Substanzen werden aus den Materialgruppen Metalloxid, Alkalititanat, Aminoalkylsilan, Aminoarylsilan, Aminoalkyltitanat, Aminoalkylzirkonat, Dialdehyd, Succinsäureanhydrid, Hydroxysuccinimid, Disuccinimidylsuberat, Succinimidyl-3-maleimidoproprionat, Aminoalkylsäure, Merkaptoalkylsäure, Succinimidyl-3-(-2-pyridyldithio)propionat, 1,6-Bismaleimidoalkan, Dipyridyldisulfid, Aminoalkylthiolat, Aminoarylthiolat, Mercaptoalkanol, Mercaptoalkansäure, Aminoalkansäure, Poly-L-Lysin ausgewählt. Eine hydroxylierte Titanoberfläche kann beispielsweise durch Hydrolyse eines in die Oberfläche inkorporierten Natriumtitanatfilms hergestellt werden (M. T. Pham, W. Matz, H. Reuther, E. Richter, G. Steiner, J. Mater. Sci. Lett. 19 (2000) 1029-1031). Optionsweise folgt der Anbindung von funktionellen Gruppen eine Kopplung mit Antikörpern (WO 00/32249). Vorzugsweise werden Antikörper mit Affinität zu extrazellulären Matrixproteinen eingesetzt.
- Die Erfindung ermöglicht die Bereitstellung eines bioaktiven Materials mit dem besonderen Vorteil der Verfügbarkeit einer zellbiologische Wechselwirkungen vermittelnde Schichtstruktur auf dessen Oberfläche. Sie stellt die Grundvoraussetzung für die zellbiologisch spezifischen Interaktionen, die Gewebekonduktivität und -induktivität sowie die Vermeidung der Immunreaktionen dar. Mit dem erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren lassen sich die extrazellulär zellausgeschiedenen Produkte auf eine einfache Weise unter Beibehaltung der Zusammensetzung und Struktur als dünne umhüllende Filme auf Festkörperoberflächen gewinnen. Das Verfahrensprinzip ist allgemeingültig für breite Klassen von Zellen und Substraten sowie deren Kombination. Das erfindungsgemäße bioaktive Material und dessen Herstellungsverfahren sind von potentiellem Nutzen für medizinische Implantologie, Gewebezüchtung und Biotechnologie.
- Die Erfindung wird nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel für das erfindungsgemäße bioaktive Material und an elf Ausführungsbeispielen für das Herstellungsverfahren näher erläutert.
- Fig. 1 das bioaktive Material im Mehrschrittprozess seiner Herstellung, wobei bedeuten:
- A) Bildung der exponierten Oberfläche mit funktionellen Gruppen B(CH2)n-NH2,
- B) Zellenaussaat zur Bildung einer konfluierenden Zellschicht,
- C) Bildung und Prozessierung zellausgeschiedener Produkte,
- D) Exponieren von zellausgeschiedenen Produkten durch Entfernung von Zellen.
- Fig. 2 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der den Basiskörper umhüllenden Struktur
- Fig. 3 Schichtdicke der zellausgeschiedenen Produkte unter 40 nm, Atomkraftmikroskopische Aufnahme
- Fig. 4 Zelladhäsion an bioaktivem Material (oben) und an Titanmaterial (unten), fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen
- Fig. 5 Zellausbreitung auf bioaktivem Material (oben) und auf Titanmaterial (unten), fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen
- Ein bioaktives Material bildet die Kompositstruktur, wie in Figur. 1 dargestellt, die aus einem Borosilikatglasbasiskörper 1, einer mit dessen Oberfläche über Silanolgruppen verknüpften Aminosilanschicht 2 und einer an die Aminogruppen der Aminosilanschicht 2 kovalent gebundenen von Osteoblasten 3; 3a extrazellulär ausgeschiedenen Zellprodukten 4; 4a besteht.
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- a) Ein Titanplättchen (handelsübliche Reinheit, 10 × 10 × 1 mm3) wird mit Aceton, Ethanol und
destilliertem Wasser gereinigt. Es wird in 50 ml einer Mischung aus 72%-H2SO4 und 27%-
HCl (1v : 1v) gegeben. Die Lösung wird erhitzt und bei einer Temperatur von 80 bis 85°C für 20 min
gehalten. Nach gründlichem Waschen mit destilliertem Wasser wird die Titanprobe in einer
10%-HNO3-Lösung für 3 h unter Rückfluss gekocht. Es wird mit destilliertem Wasser gespült
und mit Ethanol trocken gewaschen.
Die Probe wird in 40 ml trockenem Aceton gegeben. Die Lösung wird mit 2 ml Aminopropyltriethoxysilan und 1 ml Triethylamin versetzt. Dieser Arbeitsgang wird unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Unter Rückfluss wird 2 h bei 40°C behandelt. Mit Aceton, Ethanol und destilliertem Wasser wird die Probe gewaschen. Bei 110°C wird die Probe in einer Stickstoffatmosphäre für 8 h getrocknet. - b) Die vorbehandelte Probe wird in einer Zellkulturschale (4 ml Volumen) liegend plaziert. 2 ml einer Zellsuspension (human osteosarcoma cell line SAOS-2 in α-Minimal Essential Medium, im Weiteren als α-MEM bezeichnet, mit 10% fetalem Kälberserum, FKS) mit einer Konzentration von 2 × 105 Zellen/ml werden zugegeben. Es wird 80 h bei 37°C unter kontrollierter Luftfeuchtigkeit (95%) und CO2 Gaskonzentration (5%) inkubiert.
- c) Die Probe wird aus der Suspension herausgenommen, mit neutraler isotoner Pufferlösung (PBS, phosphate-buffered sahne) gewaschen und in eine neue Kulturschale überführt. 2 ml des α-MEM mit 10% FKS, versetzt mit Askorbinsäure (50 mg/l), werden zugegeben. Die Inkubation wird unter den gleichen kontrollierten Bedingungen für 4 Tage fortgesetzt. Während dieser Zeit wird das Medium alle 30 Stunden erneuert.
- d) Der Lösungsüberstand wird abgesaugt. Die Probe wird mit 1 ml einer 15 mM NH3-Lösung für 8 min behandelt. Die Probe wird aus der Lösung herausgenommen, mit PBS gespült und in einer Kollagenase-Lösung (38 U/ml Kollagenase in 25 mM Trishydroxymethylaminomethan-HCl (Tris-HCl), 5 mM CaCl2, pH 8) bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Die Probe wird aus der Lösung herausgenommen, mit PBS gespült und mit Ethanol trocken gewaschen. Zellprodukte mit charakteristischen Strukturen auf der Oberfläche des hergestellten Materials sind in Fig. 2 gezeigt. Die den Basiskörper umhüllende Struktur der Zellprodukte bemisst eine Schichtdicke unter 40 nm, wie in Fig. 3 demonstriert.
- Ti-Proben, hergestellt wie im Beispiel 2 beschrieben, wurden in einer SAOS-2-Zellsuspension mit einer Konzentration von 2 × 104 Zellen/ml in α-MEM ohne Serumzusatz für 4 Stunden bei 37°C unter kontrollierter Luftfeuchtigkeit (95%) und CO2-Gaskonzentration (5%) inkubiert. Die Proben wurden mit einer Glutaraldehydlösung (2,5% Glutaraldehyd + 1% Saccharose in PBS, pH 7,3) für 2 Stunden bei Zimmertemperatur, dann mit einer Serie von Isopropanollösungen (30, 50, 70, 90, 100%) behandelt. Der ersten Isopropanollösung wurde zur Färbung der Zellkerne 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoesäure), 0,1 µg/ml, zugesetzt. Die Proben wurden anschließend in CO2 Kritisch-Punkt getrocknet. Die Zelladhäsion und die Zellausbreitung wurden fluoreszenzmikroskopisch beurteilt. Auf dem gemäß Beispiel 2 hergestellten Material zeigen Zellen eine verstärkte Adhäsion und Ausbreitung im Vergleich zu reinem Ti-Material, wie die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen in Fig. 4 und 5 demonstrieren.
- Ausgegangen wird von einem Titanplättchen. Die Behandlung erfolgt auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 bis Ende des Schrittes a. Die Probe wird 30 min in Dimethylformamid, dann 60 min. in einer N-Succinimidyl-3-maleimidopropionat (10 mM in Dimethylformamid) bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird mit Dimethylformamid und destilliertem Wasser gewaschen. Die erhaltene Probe wird einer 2-stündigen Inkubation in einer Lösung von 11- Mercaptoundecansäure (20 mM in destilliertem Wasser) bei Raumtemperatur unterzogen. Es wird mit destilliertem Wasser gewaschen und mit N2 getrocknet. Der weitere Prozess ist identisch mit Schritt b, c und d in Beispiel 2.
- Ausgangsmaterial ist ein Titanplättchen. Es wird mit Aceton, Ethanol und Wasser gereinigt. Es folgt ein mechanisches Läppen und Polieren mit Hilfe einer Kieselsäuregelsuspension. Es wird mit Aceton, Ethanol und Wasser gereinigt. Anschließend wird die polierte Oberfläche mit einem Na-Ionenstrahl bei einer Energie von 22 keV und mit einer Ionendosis von 2 × 1017 Na+/cm2 beschossen. Es folgt eine hydrothermische Behandlung der Probe in einem Autoklav bei 120°C gespanntem Wasserdampf für 2 h. Die weitere Prozessbehandlung geschieht auf gleiche Weise entsprechend Schritt b, c und d in Beispiel 2.
- Ausgangsprobe ist ein Sinterkörper aus Hydroxylapatit (20 mm Durchmesser, 3 mm Dicke). In 50 ml Phosphatpufferlösung (pH 7,4) wird die Probe für 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann folgt eine Trocknung bei 60°C in einer Luftatmosphäre für 4 h. Die Probe wird in einer Aminopropyltriethoxysilanlösung (5% in trockenem Aceton, versetzt mit 3% Triethylamin) bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre für 48 h inkubiert. Mit Aceton, dann Ethanol und destilliertem Wasser wird die Probe gewaschen. Danach erfolgt eine Trocknung bei 110°C unter Luftatmosphäre für 8 h. Die Probe wird in einer Aldehydlösung (2% Glutaraldehyd in Phosphatpufferlösung, pH 7) bei Raumtemperatur für 70 min inkubiert. Mit Phosphatpufferlösung wird die Probe gewaschen. Die weitere Prozessbehandlung geschieht entsprechend Schritt b, c und d in Beispiel 2.
- Ausgangsmaterial ist ein Plättchen (8 × 8 mm2) aus Polyethylenterephthalat (PET). Die Probe wird mit Aceton 24 h bei Raumtemperatur behandelt. Es folgt eine Inkubation in 18,5% Formaldehyd + 1 M Essigsäure in Wasser für 8 h bei 37°C. Ein Waschen mit destilliertem Wasser schließt sich an. Die Probe wird in einer wässrigen Lösung von N-(2-Aminoethyl)-3- Aminopropyltriethoxysilan (10%) gegeben und der pH-Wert mit 6 n HCl auf 4,0 gebracht. Die Lösung mit der Probe wird in einem Wasserbad bei 75°C für 5 h gehalten. Anschließend wird die Probe mit destilliertem Wasser und dann mit Ethanol gewaschen. Es wird 5 h bei 40°C in Stickstoffatmosphäre getempert. Die Probe wird in einer Aldehydlösung (2% Glutaraldehyd in Phosphatpufferlösung, pH 7) bei Raumtemperatur für 70 min. inkubiert. Mit Phosphatpufferlösung wird die Probe gewaschen. Die weitere Prozessbehandlung erfolgt entsprechend Schritt b, c und d nach Beispiel 2.
- 1 Glassubstrat (Borosilikatglas, als Deckglas für Mikroskopie) wird mit Aceton, Ethanol dann destilliertem Wasser gereinigt. Es wird 1 h in 1 M NaOH behandelt. Es folgt eine gründliche Waschung mit destilliertem Wasser, dann eine Behandlung in siedendem Wasser für 2 h. Die Probe wird in einer wässrigen Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan (10%) gegeben und der pH-Wert mit 6 M HCl auf 4,0 gebracht. Die Lösung mit der Probe wird in einem Wasserbad bei 75°C für 5 h gehalten. Anschließend wird die Probe mit destilliertem Wasser und dann mit Ethanol gewaschen. Eine Trocknung bei 110°C in Ar-Atmosphäre für 8 h schließt sich an. Die weitere Prozessbehandlung erfolgt auf gleiche Weise entsprechend Schritt b, c und d in Beispiel 2.
- Ein Titanplättchen wird in diesem Ausführungsbeispiel als Ausgangsprobe verwendet. Auf gleiche Weise wird die Behandlung entsprechend Schritt a, b und c nach Beispiel 2 durchgeführt. Die nach dem Schritt c gemäß Beispiel 1 erhaltene Probe wird mit einer Phosphatpufferlösung (pH 7,4) gewaschen. In einem 4 ml-Behälter wird die Probe mit 2 ml Phosphatpufferlösung versetzt und bei -70°C für 2 h eingefroren. Das eingefrorene Produkt wird bei Raumtemperatur für 3 h zum Abtauen gehalten. Der Prozess Einfrieren und Abtauen wird noch einmal wiederholt. Mit Phosphatpufferlösung und destilliertem Wasser wird die Probe gewaschen.
- Ein Sinterkörper aus Hydroxylapatit entsprechend Beispiel 6 wird als Probe verwendet. In 50 ml Phosphatpufferlösung (pH 7,4) wird die Probe für 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Es wird mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann folgt eine Trocknung bei 60°C in einer Luftatmosphäre für 4 h. Die Probe wird in einer Aminopropyltriethoxysilanlösung (5% in trockenem Aceton, versetzt mit 3% Triethylamin) bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre für 48 h inkubiert. Mit Aceton, dann Ethanol und destilliertem Wasser wird die Probe gewaschen. Danach erfolgt eine Trocknung bei 110°C unter Luftatmosphäre für 8 h. Die anschließende Prozessbehandlung geschieht entsprechend Schritt b und c des Beispiels 2. Die erhaltene Probe wird mit Phosphatpufferlösung gewaschen, anschließend mit 1 ml einer Ammoniumhydroxydlösung (pH 10) versetzt und darin für 12 min inkubiert. Die Probe wird aus der Lösung herausgenommen, mit destilliertem Wasser gespült und mit Ethanol trocken gewaschen.
- 1 Block (10 × 10 × 3 mm3) aus porösem Hydroxylapatit (200 µm interkonnektierte Poren) wird als Testprobe verwendet. Eine Inkubation in 50 ml Phosphatpuffer (pH 7,4) wird für 3 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Probe wird mit destilliertem Wasser gespült und bei 60°C Luftatmosphäre für 6 h getrocknet. Die Probe wird in einer wässrigen Lösung von 3- Aminopropyltriethoxysilan (10%) gegeben und der pH-Wert mit 6 M HCl auf 4,0 gebracht. Die Lösung mit der Probe wird in einem Wasserbad bei 75°C für 5 h gehalten. Anschließend wird die Probe mit destilliertem Wasser und dann mit Ethanol gewaschen. Eine Trocknung bei 110°C in Ar-Atmosphäre für 8 h schließt sich an.
- Plaziert in einer 35 mm-Kulturschale wird die Probe mit 3 ml einer Suspension von Knochenmarkzellen in Eagle Minimal Essential Medium mit 15% fetalem Kälberserum, 2 × 105 Zellen/ml versetzt (Verwendete Zellen wurden durch 10-tägige Kultivierung des Knochenmarks aus den Oberschenkelknochen einer 7-wochenalten Rate gewonnen) und bei 37°C mit 95% Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 für 2 Tage inkubiert. Die Probe wird in eine neue Kulturschale überführt, mit 2 ml des obigen Mediums versetzt. Dem Medium ist Askorbinsäure (50 mg/l) zugegeben. Die Inkubation wird unter den gleichen kontrollierten Bedingungen für 4 Tage durchgeführt. Während dieser Zeit wird das Medium alle 30 Stunden erneuert.
- Der Lösungsüberstand wird abgesaugt. Die Probe wird mit 2 ml einer Trypsinlösung (0,1% in Phosphatpufferlösung) für 10 min. behandelt. Es folgt eine Inkubation in einer Kollagenase- Lösung (38 U/ml Kollagenase in 25 mM Tris HCl, 5 mM CaCl2, pH 8) bei 37°C für 4 Stunden. Die Probe wird aus der Lösung herausgenommen, mit destilliertem Wasser perfundiert und mit Ethanol trocken gewaschen.
- Ausgangsmaterial ist eine semipermeable Polyurethanmembran. Sie wird mit Poly-L-Lysin in neutralem Phosphatpuffer adsorptiv beschichtet. Ito-Zellen der Leber werden in Dubecco's modified Eagle's medium (DMEM) mit 10% fetalem Kälberserum, 10 ng/ml epidermalem Wachstumsfaktor, 10 mM/l Nikotinamid, 0,2 mM/l L-Askorbinsäure 2-Phosphat und 1% Dimethylsulfoxid mit 5 × 104 Zellen/cm2 ausgesät und bis zur Ausbildung einer konfluierenden Zellschicht wachsen lassen. Dann wird die Probe gemäß Beispiel 9 einem mehrfachen Frier- Tau-Prozess unterzogen.
Claims (9)
1. Bioaktives Material für die medizinische Implantologie, Gewebezüchtung, Biotechnologie
und Mikrobiosensorik, bestehend aus einem Basiskörper und einer auf diesem
aufgebrachten Oberflächenschicht zellproduzierter Produkte, dadurch gekennzeichnet, dass
die auf dem Basiskörper befindliche Oberflächenschicht aus den intakten Molekülen und
Molekülfragmenten nicht mineralisierter Komponenten der Zellprodukte besteht und dass
alle diese Bestandteile zu einer quasi-zweidimensionalen die Basiskörperoberfläche
umhüllenden Struktur mit einer relativ zur Basiskörperoberfläche vertikalen Ausdehnung
im Sub-µm-Bereich angeordnet sind.
2. Bioaktives Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die intakten Moleküle
der Zellprodukte Kollagene, Glykoproteine und Proteoglykane sind.
3. Bioaktives Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Molekülfragmente
aus den Molekülen Kollagen, Glykoproteinen und Proteoglykanen abgeleitet sind.
4. Bioaktives Material nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass die
Molekülfragmente in einem sich von Oligo- über Polypeptiden und Proteinen bis zu
funktionell assoziierten Proteinen erstreckenden Größenspektrum vorkommen.
5. Bioaktives Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die vertikale
Ausdehnung der die Basiskörper umhüllenden Struktur im Bereich zwischen 1 nm und 400 nm,
und vorzugsweise zwischen 10 nm und 100 nm, bemessen wird.
6. Bioaktives Material nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Basiskörper aus
einem der Materialien Metall, Legierung, Glas, Keramik, Polymer, Halbleiter oder
Komposit hergestellt ist.
7. Verfahren zur Herstellung eines bioaktiven Materials entsprechend Anspruch 1, wobei der
Basiskörper mit einer Zellschicht versehen und in einem Kulturmedium zur Bildung
zellausgeschiedener Produkte auf der Oberfläche des Basiskörpers inkubiert wird, dadurch
gekennzeichnet, dass für eine vertikale Schichtausdehnung von unter 400 nm die
Inkubationszeit maximal vier Tage beträgt und dass die nach Abtrennung von Zellen
exponierte und an der Oberfläche des Basiskörpers haftende Zellproduktschicht in Kontakt
mit einer Enzymlösung gebracht wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass in der Enzymlösung für die
Inkubation von an der Basiskörperoberfläche haftenden Zellprodukten die
Matrixmetalloproteinasen Kollagenase, Stromelysin und/oder Gelatinase als Enzyme enthalten
sind.
9. Verfahren nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, dass eine an der Oberfläche
des Basiskörpers haftende Zellproduktschicht mit einer Enzymlösung für einige Stunden in
Kontakt gebracht wird, bis eine umhüllende Schicht aus intakten Molekülen und
Molekülfragmenten der Zellprodukte entsteht.
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DE2002105846 DE10205846A1 (de) | 2002-02-13 | 2002-02-13 | Bioaktives Material und Verfahren zu dessen Herstellung |
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---|---|---|---|---|
EP0798374A1 (de) * | 1996-03-01 | 1997-10-01 | Matrix Medical B.V. | Verfahren zur in vitro Herstellung von Knochen |
EP0891783A1 (de) * | 1997-07-16 | 1999-01-20 | Isotis B.V. | Vorrichtung zur Knochenbehandlung bestehend aus abbaubarem thermoplastischen Copolyester und kultivierten Zellen |
-
2002
- 2002-02-13 DE DE2002105846 patent/DE10205846A1/de not_active Ceased
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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EP0798374A1 (de) * | 1996-03-01 | 1997-10-01 | Matrix Medical B.V. | Verfahren zur in vitro Herstellung von Knochen |
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