DE102022131984A1

DE102022131984A1 - Verfahren zum in vitro-Nachweis eines Harnblasenkarzinoms in einer Urinprobe

Info

Publication number: DE102022131984A1
Application number: DE102022131984.9
Authority: DE
Inventors: Daniel Steinbach; Marius Sperling; Marc-Oliver Grimm
Original assignee: Universitaetsklinikum Jena Koerperschaft Des Oeffentlichen Rechts
Current assignee: Universitaetsklinikum Jena Koerperschaft Des Oeffentlichen Rechts
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2024-06-13

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum in vitro-Nachweis von Harnblasenkarzinomen in Urinproben mittels Bestimmung des Vorhandenseins eines im Vergleich zu einer Referenzprobe hypermethylierten DNA-Abschnittes in der aus der Urinprobe isolierten DNA. Bei dem analysierten DNA-Abschnitt handelt es sich um eine Gen-Region, die in Tumorzellen stärker methyliert ist als die entsprechende Gen-Region in gesunden Zellen.
Ferner betrifft die Erfindung ein zugehöriges Kit sowie die Verwendung des Verfahrens zum Nachweis von Harnblasenkarzinomen in einer isolierten Urinprobe.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum in vitro-Nachweis von Harnblasenkarzinomen in Urinproben mittels Bestimmung des Vorhandenseins eines im Vergleich zu einer Referenzprobe hypermethylierten DNA-Abschnittes in der aus der Urinprobe isolierten DNA. Bei dem analysierten DNA-Abschnitt handelt es sich um eine Gen-Region, die in Tumorzellen stärker methyliert ist als die entsprechende Gen-Region in gesunden Zellen.
Ferner betrifft die Erfindung ein zugehöriges Kit sowie die Verwendung des Verfahrens zum Nachweis von Harnblasenkarzinomen in einer isolierten Urinprobe.
Hintergrund der Erfindung
Das Urothelkarzinom der Harnblase stellt die zweithäufigste Karzinomart in der Urologie mit weltweit 550.000 Neuerkrankungen und 200.000 Todesfällen dar ¹. In Deutschland erkranken jährlich ca. 31.000 Menschen an einem Harnblasenkarzinom mit ca. 5700 Sterbefällen (2018). Risikofaktoren sind vor allem das Rauchen, das Alter sowie das männliche Geschlecht. Außerdem ist durch den demographischen Wandel mit einer deutlichen Zunahme der Neuerkrankungen in den nächsten Jahren zu rechnen². Bei Erstdiagnose entfallen ca. 75% auf nicht-invasive papilläre Karzinome, welche durch die häufige Rezidiv- und Progressionsrate (31% - 70% bzw. 1% bis 45%) auch in der Nachsorge eine sehr hohe klinische Relevanz haben³.
In Tumoren findet sich oftmals eine allgemeine Hypermethylierung in Regionen im Genom mit statistisch erhöhter CpG-Dinukleotid-Dichte, sogenannten CpG-Inseln, in bestimmten Tumorsuppressorgenen. CpG-Inseln bezeichnen eine kleine Fraktion nicht-methylierter DNA mit erhöhtem CpG Aufkommen (bis zu 1% des Genoms) innerhalb des sonst an den meisten Cytosinen von CpG-Dinucleotiden methylierten (DNA-Methylierung) Genoms der Wirbeltiere. Eine Hypermethylierung bezeichnet eine übermäßige, abnormale Methylierung der DNA. Bei der Methylierung erfolgt ein Transfer von Methylgruppen (-CH₃) innerhalb einer chemischen Reaktion von einem Molekül auf ein anderes. Tumorsuppressorgene kontrollieren das Zellwachstum und die Zellvermehrung und unterdrücken den Übergang vom normalen Wachstumsverhalten der Zelle zu ungebremstem Tumorwachstum. Werden die CpG-Inseln von Tumorsuppressorgenen hypermethyliert, werden diese inaktiviert und die Karzinomentstehung und Karzinomerhaltung gefördert¹⁷.
Das Leitsymptom des Harnblasenkarzinoms ist in 68% bis 98% der Fälle vor allem eine sichtbare Rotfärbung des Urins durch Blut (Makrohämaturie), welche zumeist schmerzlos erfolgt⁴. Der positive prädiktive Wert (PPV), der angibt wie viele Personen, bei denen eine bestimmte Krankheit mittels eines Testverfahrens festgestellt wurde, auch tatsächlich krank sind, beträgt für ein Harnblasenkarzinom bei Makrohämaturie jedoch nur 2,6% - 10,3%, und steigt bei Männern über 50 Jahren bis zu 30% an^{5, 6, 7, 8}. Auch bei einer Ausscheidung von Blut im Urin, die mit dem bloßen Auge nicht sichtbar ist (Mikrohämaturie) ist die Ursache in 2% bis 12,5% in malignen Erkrankungen der Harnwege zu finden. Studien zur Versorgungsforschung mit jeweils über 1000 Patienten mit Blut im Urin (Makro- oder Mikrohämaturie) zeigen ebenfalls eine Prävalenz des Harnblasenkarzinoms von 6,2% bis 10%. Diese Tumorraten rechtfertigen eine erweiterte Diagnostik bei Patienten mit Hämaturie zum Ausschluss eines Harnblasenkarzinoms.
In der klinischen Praxis wird empfohlen grundsätzlich jede Hämaturie abzuklären. Wegen fehlender Evidenz gibt es derzeit jedoch keinen Konsens über den notwendigen Umfang. Häufig werden Patienten mit Hämaturie unnötigerweise einer Blasenspiegelung (Zystoskopie) unterzogen, weil in den verschiedenen verfügbaren Leitlinien ein Abschätzen des Risikos, dass die vorliegende fortschreitende Erkrankung zu Komplikationen oder zum Tod führen kann (Risikostratifizierung) fehlt oder unzureichend ist. Eine bessere Risikostratifizierung ist deshalb unbedingt erforderlich. Zumeist wird eine Mikrohämaturie mit weiteren Risikofaktoren wie Exposition gegenüber exogenen Noxen (Tabakrauch), höherem Lebensalter (>35), männliches Geschlecht sowie die Makrohämaturie durch eine Zystoskopie abgeklärt⁹. Die Zytoskopie ist der Goldstandard der Primärdiagnostik und Nachsorge. Ergänzend können, neben bildgebenden Verfahren, urinbasierte Marker untersucht werden. Das Nachsorgeschema und die Nachsorgeintervalle werden risikoadaptiert durchgeführt. Eine Kontrollzystoskopie kann je nach Tumorrisiko bis zu 6mal pro Jahr erfolgen.
Diese Untersuchungen sind relativ kostenintensiv, für den Patienten sehr unangenehm und bergen das Risiko von nosokomialen Infektionen. Begleitend kann eine Untersuchung des Urinsediments erfolgen (Urinzytologie), um ein High Grade Harnblasenkarzinom (Urothelkarzinom, UC) auszuschließen¹⁰. Die Sensitivität der Urinzytologie korreliert stark mit der Differenzierung des Tumors, als auch mit der Fähigkeit des Untersuchers¹¹. Für gut differenzierte Tumoren ist die Sensitivität sehr gering¹².
In Anbetracht der hohen Prävalenz einer Hämaturie mit Risikofaktoren, in Zusammenhang mit einer niedrigen Tumorrate von unter 10% und der kostenintensiven und invasiven Diagnostik besteht somit ein sehr hoher klinischer Bedarf an validen nicht invasiven Markern zum Ausschluss des Harnblasenkarzinoms. Urinbasierte Biomarker sind zum Beispiel freie und zellgebundene Tumor-DNA, RNAs, Proteine und extrazelluläre Vesikel.
Es sind bereits urinbasierte Biomarker, die auf der Methylierung der CpG-Inseln basieren, für die Diagnose und Nachsorge des Harnblasenkarzinoms sowie des Urothelkarzinoms des oberen Harntrakts bekannt^{13,14, 15}.
Die US 2012 230952 A1 betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Blasenkrebs. Hier wird die Methylierung der Marker MYO3A, CA10, NKX6-2, SOX11, DBC1, NPTX2 und/oder A2BP1 in DNA-Sediment aus einer Urinprobe bewertet, um Blasenkrebs zu diagnostizieren.
Die US 2021164031 A1 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines genomischen Methylierungsprofils in einer DNA-Probe. Das Verfahren wird zur Diagnostik oder Risikobewertung von Harnblasenkarzinomen oder anderen Krebsarten der Harnwege verwendet.
Die WO 2021/073029 A1 betrifft ein Verfahren, ein Kit und ein System für das Screening, den Nachweis oder die Diagnose von Blasenkrebs. FGFR3, TERT und PLEKHS1 Loci-Mutationen und OTX1, NID2 und NRN1 Methylierungsgrade können gleichzeitig nachgewiesen werden.
Die CN 114717311 A analysiert die Gen-Regionen NBR1, ZNF551, CYTH2 and ARL5C auf ihren Methylierungsgrad zum Nachweis von Harnblasenkarzinomen.
Die US 11220714 B2 betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Krebs, umfassend das Selektieren von mindestens einer hypermethylierten CpG-Insel, die mit dem Krebs assoziiert ist, in der DNA, wobei eine Erhöhung des Methylierungsniveaus in der CpG-Insel relativ zum Methylierungsgrad in der CPG-Insel einer Kontrolle gezeigt ist. So wird festgestellt, ob eine CPG-Insel hypermethyliert ist.
Die DE 10 2015 226 843 B3 betrifft ein Verfahren zur Diagnostik von Tumoren mittels Polymerasen-Ketten-Reaktion (PCR) in Körperflüssigkeiten. Hier werden methylierte DNA-Sequenzen stärker amplifiziert als nicht-methylierte DNA-Sequenzen und anschließend quantifiziert mittels einer speziellen digitalen PCR.
Die EP 0 926 245 A2 betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Harnblasenkarzinom in einer Urinprobe sowie dafür geeignete Reagenzien in dem die Telomerase-RNA bestimmt in der probe bestimmt wird.
Die EP 2 935 621 B1 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Hypermethylierung zur Diagnostik von Prostatatumoren.
Die Sensitivität dieser Tests beträgt zumeist <90%, im Vergleich zur Zystoskopie (Harnblasenkarzinom) und zur Computertomographie (oberer Harntrakt) von ca. 95% und sind somit nicht geeignet, die Zystoskopie als Goldstandard zu ersetzen^{13, 14}. Aus diesem Grund werden urinbasierte Tests in der Praxis kaum angewendet¹⁰.
Für die Diagnose und Nachsorge des Harnblasenkarzinoms auf Basis der DNA-Methylierung im Urin sind zwei kommerzielle Assays bekannt¹⁶.
Bladder Epicheck® (Nucleix) basiert auf der Analyse von 15 Methylierungsmarkern und hat eine Sensitivität von 91%, eine Spezifität von 85% und einen negativen Vorhersage-Wert (negative predictive value, NPV) von 99%, wobei Ta Low Grade Tumore ausgenommen sind (Herstellerangaben). Mancini et al. 2020 fasst verschiedene Studien zu Bladder Epicheck zusammen und zeigt eine Sensitivität des Tests von 62,5% bis 90% für alle Tumorgrade und 83,3% bis 100% für nicht Low Grade Tumore. Der negative Vorhersagewert beträgt bis zu 97%, wenn alle Tumorgrade betrachtet werden bzw. 100%, wenn Low Grade Tumore ausgenommen werden¹⁸.
Assure MDx for Bladder Cancer (MDxHealth) analysiert Mutationen in den Gen-Regionen FGFR3, TERT und HRAS sowie die Methylierung in den Genen OTX1, ONECUT2 und TWIST1. Die Sensitivität beträgt je nach Tumorstadium und Grading 85,5% (Low Grade) und 93,5% (High Grade). Der NPV wird mit jeweils über 99% angegeben, wobei die geringe Prävalenz eines Karzinoms von 5% bis 10% bei Patienten mit Hämaturie einberechnet wurde ^19,20.
Ein weiterer aussichtsreicher Test ist UroMark®, bei welchem mittels Next-Generation Bisulfitsequenzierung 150 Loci (CpGs) untersucht werden. Dieser Test ist zwar methodisch anspruchsvoll, erreichte in ersten Studien aber eine Sensitivität von 98% und eine Spezifität von 97%²¹. Mit der DETECT I und DETECT II Studie (NCT02676180, NCT02781428) sollte der Test in der Differentialdiagnostik bei Hämaturie und in der Nachsorge des Harnblasenkarzinoms validiert werden²². Die beiden Studien wurden im Dezember 2017 bzw. im September 2020 mit 3700 bzw. 1643 eingeschlossenen Patienten abgeschlossen. Bisher gibt es keine Aussagen der Autoren hinsichtlich der diagnostischen Güte von UroMark® in den klinischen Studien. Der Erfolg der Studien und des Tests ist somit fraglich.
Die bisher entwickelten Assays zeigen diagnostische Werte welche der Zystoskopie (einschließlich einer photodynamischen Diagnostik) mit einer durchschnittlichen Sensitivität von 93% nahe kommen²³. Kein Test zeigt jedoch bisher in großen klinischen Studien bessere diagnostische Werte als der Goldstandard Zystoskopie.
Beschreibung der Erfindung
Es ist deshalb die Aufgabe der vorliegenden Erfindung alternative molekulare Marker bereitzustellen, um neue nicht-invasive Urintests zu entwickeln oder vorhandene Tests zu verbessern.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1, insbesondere durch ein Verfahren zum in vitro-Nachweis von Harnblaskarzinomen in einer Urinprobe, umfassend das Bereitstellen einer Urinprobe, Isolieren von DNA aus der Urinprobe, Bestimmung des Vorhandenseins eines im Vergleich zu einer Referenzprobe hypermethylierten DNA-Abschnittes in der aus der Urinprobe isolierten DNA.
Die vorliegende Erfindung identifiziert neuartige Gen-Regionen, die für einen in vitro-Nachweis von Harnblaskarzinomen mittels einer Urinprobe geeignet sind. Der hier verwendete Begriff „Harnblasenkarzinom“ oder „Blasenkrebs“ bezieht sich allgemein auf Urothelzellkarzinome, d. h. auf Karzinome der Harnblase, des Harnleiters, des Nierenbeckens und der Harnröhre. Der Begriff umfasst sowohl die nicht-muskelinvasiven (NMI) oder oberflächlichen Formen als auch die muskelinvasiven (MI) Typen. Der Begriff bezieht sich auch auf die primären Formen sowie auf rezidivierende Formen des Krebses.
Erfindungsgemäß wird DNA aus einem Urinsediment extrahiert, fragmentiert und die methylierten DNA-Regionen mithilfe des „Methylated CpG-Island Recovery Assays“ (MIRA) isoliert. Mittels Tiefensequenzierung konnten Gen-Regionen identifiziert werden, die eine möglichst hohe Hypermethylierung in der Tumorgruppe sowie möglichst keine oder maximal schwache Methylierung in der Kontrollgruppe aufwiesen. Für die ausgewählten Regionen wurden erfindungsgemäß methylierungsspezifische Primer entworfen, welche an einer Standardreihe bestehend aus nicht methylierter bisulfitbehandelter Kontroll-DNA und anteilig in-vitro methylierter DNA mittels quantitativer methylierungsspezifischer PCR (q-MS-PCR) getestet wurden. Die Kontroll-DNA kann beispielsweise aus Fibroblasten oder Keratinozyten stammen. Über diese Methodik wurden für die erfolgsversprechenden Marker-Regionen in den Genen IRX2 (Iroquois Homeobox 2), NKX1-1 (NK1 Homeobox 1), LHX4 (LIM Homeobox 4) und KIFC2 (Kinesin Family Member C2) qPCR basierte Assays zur Detektion von Harnblasenkarzinomen entwickelt. Die Marker weisen eine hohe Spezifität und Empfindlichkeit auf und sind geeignet, die Zytoskopie zu ergänzen oder zu ersetzen.
Das Bereitstellen einer Urinprobe kann durch den Patienten selbst oder durch klinisches Personal erfolgen. Zur DNA-Isolierung kann der Urin abzentrifugiert werden und der Überstand entfernt werden, so dass das Zell-Pellet erhalten bleibt. Die DNA wird dann aus dem Urinsediment der Urinprobe isoliert. Die DNA kann ebenso aus Gesamturin isoliert werden. Zur DNA-Isolation können bekannte Methoden zum Einsatz kommen. Kommerzielle Systeme zur DNA-Isolierung aus Zellen bzw. Urinsediment oder Gesamturin sind von verschiedenen Anbietern molekularbiologischer Reagenzien erhältlich, z.B. DNeasy® Blood & Tissue Kit oder DNeasy® 96 Blood & Tissue Kit der QIAGEN GmbH, Hilden, Deutschland oder Quick-DNA Urine Kit, Zymo Research Europe GmbH, Freiburg, Deutschland. In der Regel erfolgt nach der Zentrifugation zunächst ein Aufschluss der Zellen und anschließend die DNA-Extraktion. Nach der DNA-Isolation ist eine Bisulfitkonvertierung der isolierten DNA für eine methylierungsspezifische PCR erforderlich. Jeder Tumor weist ein typisches Methylierungsmuster auf, die ihn identifizierbar machen.
Erfindungsgemäß werden definierte DNA-Abschnitte auf Methylierung untersucht, vorzugsweise indem der Anteil an methylierten CpG-Inseln in einer Patientenprobe bestimmt wird. Die Methylierung erfolgt vorzugsweise auf den Cytosinen der CpG-Inseln. Vorzugsweise wird immer nur ein spezifischer DNA-Abschnitt innerhalb einer CpG-Insel untersucht.
Erfindungsgemäß gilt eine Patientenprobe in der untersuchten Region als methyliert, wenn der Anteil der methylierten CpG-Inseln in der Patientenprobe größer ist als bei der Kontrolle. Eine Erhöhung des Anteils methylierter DNA in einer CpG-Insel des Patienten im Vergleich zum methylierten Anteil einer DNA-Region in einer CpG-Insel eines Kontrollpatienten ist ein Hinweis auf eine Hypermethylierung der CpG-Insel. Das Vorhandensein einer hypermethylierten DNA-Region in einer CpG-Insel kann darauf hindeuten, dass der Patient einem Krebsrisiko ausgesetzt ist oder an einem Harnblasenkarzinom leidet. Erfindungsgemäß wird der Methylierungsanteil mit einer definierten in-vitro hergestellten Kontrolle (Standardreihe) verglichen. Zuvor erfolgt eine Normalisierung (d.h. ein Ausgleich des unterschiedlichen DNA-Inputs) gegen eine Genregion in ACTB (Actin beta), welche unabhängig von der CpG-Methylierung ist. Die als Kontrolle dienende Referenzprobe ist so aufgebaut, dass sie keine CpG-Dinukleotide enthält. Die Referenzprobe wird als Kontrolle für die DNA-Qualität, die Mindestmenge oder zur Normalisierung auf die eingesetzte DNA-Menge verwendet.
Der methylierte DNA-Abschnitt der erfindungsgemäßen Marker ist vorzugsweise zu wenigstens 1%, bevorzugt um mehr als 10% methyliert in einer positiven Patientenprobe, d.h. in einer Probe eines Patienten mit Harnblasenkarzinom. Eine Region gilt als unmethyliert, wenn weniger als 1% der CpG-Inseln methyliert sind. Als unmethyliert gelten somit Proben mit einer Methylierung von weniger als 1%, als schwach methyliert Proben zwischen 1% und 10% und als stark methyliert Proben zwischen 10% und 100%.
Wenn beispielsweise in einer zu messenden Patientenprobe insgesamt 1.000 Zellen unterschiedlichen Zelltyps vorhanden sind und ein Methylierungsanteil von 10% bestimmt wird, geht man davon aus, dass in 100 Zellen der Probe bei einer homozygoten Methylierung die jeweilige DNA-Region methyliert ist. Bei einer heterozygoten Methylierung, d.h. wenn nur ein von zwei Allelen der DNA methyliert sind, würde man von 20% methylierten Zellen ausgehen.
Erfindungsgemäß wird der Anteil methylierter DNA-Sequenzen an allen DNA-Sequenzen der jeweiligen Region bestimmt. Vorzugsweise kommt hierfür ein methylierungsspezifischer PCR-Test zum Einsatz. Wenn bei der MS-PCR die PCR-Reaktion mit methylierungsspezifischen Primern positive PCR-Ergebnisse liefert, befindet sich die betreffende DNA-(Gen-)Region im hypermethylierten Zustand. Bei der quantitativen methylierungsspezifischen Echtzeit-PCR kann die Hypermethylierung auf der Grundlage der statistischen Differenz des Methylierungsstatuswertes im Vergleich zur Kontrollprobe (Standardreihe) bestimmt werden.
Vorzugsweise werden die Gen-Regionen IRX2, NKX1-1, KIFC2 oder LHX4 oder eine Kombination dieser Gen-Regionen auf Methylierung analysiert. Durch Kombination des Markers IRX2 mit KIFC2 und/oder LHX1 kann die Sensitivität und Spezifität signifikant erhöht werden. Die Sensitivität gibt an, bei welchem Prozentsatz ein erkrankter Patient mit Harnblasenkarzinom durch die Anwendung des Tests tatsächlich als krank erkannt wird, d.h. ein positives Testresultat vorhanden ist. Die Spezifität gibt die Wahrscheinlichkeit an, dass Gesunde, die nicht an einem Harnblasenkarzinom leiden, im Test auch tatsächlich als gesund erkannt werden. Aufgrund der höheren Spezifität und Sensitivität ist eine kombinierte Analyse der Marker-Kombination von IRX2 mit KIFC2 und/oder LHX1 besonders bevorzugt. Eine 3-fach-Kombination von IRX2 mit KIFC2 und LHX1 ist besonders bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Gen-Regionen IRX2, NKX1-1, KIFC2 oder LHX4 oder eine Kombination dieser Gen-Regionen werden mit den entsprechenden Referenzproben verglichen. Bei den Referenzproben handelt es sich vorzugsweise um die gleichen DNA-Abschnitte gesunder Zellen oder einer in-vitro hergestellten Kontrollprobe bzw. Standardreihe mit definierten Methylierungsanteil. Die Referenzproben entstammen somit keiner Tumor-Probe und liegen vorzugsweise in unmethyliertem, gering methyliertem oder definiert methylierten Zustand vor.
Die Untersuchung der aus der Urinprobe isolierten DNA auf Hypermethylierung erfolgt bevorzugt mittels quantitativer PCR. Hierfür wird vor der Quantifizierung eine Amplifikation von methylierten und nicht-methylierten DNA-Abschnitten mittels PCR durchgeführt, bei der die methylierten DNA-Abschnitte stärker amplifiziert werden als die nicht-methylierten DNA-Abschnitte. Dabei erfolgt die Quantifizierung der methylierten und nicht-methylierten DNA-Abschnitte mittels quantitativer methylierungsspezifischer PCR (q-MS-PCR). Für die q-MS-PCR werden bevorzugt methylierungsspezifische Primer bzw. Primerpaare eingesetzt, die am Anfang und Ende der Zielregion binden. Die beiden Primer binden auf jeder Seite der spezifischen Sequenz der zu amplifizierenden Zielregion. Die methylierungsspezifischen Primer enthalten vorzugsweise je zwei bis drei CpG-Dinukleotide. Somit können die Primer nur binden, wenn die DNA ursprünglich methyliert war. Bei ursprünglich nicht methylierter DNA sind diese Positionen durch Uracil (komplementär Adenin) ausgetauscht, so dass die Primer nicht binden können.
Bevorzugt sind Primer, die in den Gen-Regionen IRX2, NKX1-1, KIFC2 und/oder LHX binden. Solche Primer umfassen, sind jedoch nicht limitiert auf Primer mit folgenden Nukleinsäuresequenzen:

1. Für IRX2 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 1, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 2;
2. Für NKX1-1 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6;
3. Für KIFC2 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 13, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 14;
4. Für LHX4 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 15, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 16.

Diese Primer sind lediglich Beispiele und es sind auch Variationen der gezeigten Nukleinsäuresequenzen möglich, bei denen beispielsweise chemische Modifikationen einzelner oder mehrerer Basenpaare, Substitutionen, sowie Verkürzungen oder Verlängerungen der Nukleinsäuresequenzen vorhanden sind. Die Erfindung umfasst auch alternative methylierungsspezifische Primer, die an die Nukleinsäuresequenzen vor, innerhalb und nach den Gen-Regionen IRX2, NKX1-1, KIFC2 oder LHX4 oder einer Kombination davon binden.
Eine quantitative methylierungsspezifische PCR (q-MS PCR) zum Nachweis des Methylierungsanteils ist bevorzugt, da sie empfindlicher ist als die normale MS PCR. Sie ermöglicht zudem einen hohen Durchsatz und vermeidet eine elektrophoresebasierte Ergebnisanalyse.
Andere bei der Erfindung einsatzbaren Methoden umfassen beispielsweise Pyrosequenzierung, Bisulfit-Konversationssequenzierung, qPCR, Sequenzierung der zweiten Generation, Methylierungssequenzierung des gesamten Genoms, DNA-Anreicherungsdetektion, vereinfachte Bisulfit-Sequenzierung, HPLC oder methylierungsspezifische DNA-Restriktion und eine kombinierte Gengruppendetektion.
In einer bevorzugten Ausführungsform verläuft der Nachweis der Marker automatisiert im Batch-Verfahren. Dadurch ist es möglich, eine Vielzahl von Proben verschiedener Patienten gleichzeitig zu analysieren.
Die Erfindung umfasst ferner Kits für den Nachweis von Harnblaskarzinom in einer isolierten Urinprobe mittels quantitativer methylierungsspezifischer Polymerasenkettenreaktion (q-MS-PCR). Solche Kits umfassen methylierungsspezifische Primer, so dass im Rahmen der q-MS-PCR die methylierten DNA-Abschnitte in Tumorzellen stärker amplifiziert werden als die korrespondierenden nicht-methylierten DNA-Abschnitte gesunder Zellen. Vorzugsweise umfassen die Primer wenigstens zwei CpG-Dinukleotide.
Die q-MS-Primer zeichnen sich dadurch aus, dass sie in wenigstens einer der Gen-Regionen IRX2, NKX1-1, KIFC2 oder LHX4 oder in deren Nähe binden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden q-MS-Primer eingesetzt, die eine oder mehrere der folgenden Nukleinsäuresequenzen umfassen:

- Für IRX2 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 1, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 2;
- Für NKX1-1 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6;
- Für KIFC2 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 13, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 14;
- Für LHX4 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 15, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 16.

Das Kit umfasst bevorzugt Reagenzien zur Isolierung der DNA aus einem abzentrifugierten Urinsediment oder aus Gesamturin. Ferner umfasst das Kit bevorzugt Reagenzien zur Bisulfitkonvertierung der DNA. Die q-MS-Primer binden erfindungsgemäß vor, innerhalb und/oder nach den zu analysierenden Gen-Regionen, also IRX2, NKX1-1, KIFC2 und/oder LHX4. Bei der q-MS-PCR werden die methylierten DNA-Abschnitte in Tumorzellen stärker amplifiziert als die korrespondierenden nicht-methylierten DNA-Abschnitte gesunder Zellen. Vorzugsweise wird als nicht-methylierte Kontrolle (Negativkontrolle) DNA aus Zellen oder Zelllinien verwendet, in denen die Zielsequenzen nicht methyliert sind. Besonders bevorzugt wird als nicht-methylierte DNA-Kontrolle DNA aus Keratinozyten oder kommerziell verfügbare nicht-methylierte DNA aus Methyltransferase-Doppelknockout Zellen (DKO-Zellen) oder aus Gesamt-Genom-Amplifikation generierte nicht-methylierte DNA verwendet.
Das Kit kann zur Durchführung der erfindungsgemäßen Methodik eingesetzt werden, indem der Anteil an methylierten DNA-Molekülen (oder auch der Anteil an Zellen mit Methylierung in der jeweiligen Markerregion) in einer Probe bestimmt wird. Es wird somit nicht der Anteil an methylierten CpG-Dinucleotiden innerhalb von CpG-Insel / DNA-Region gemessen.
Als Referenz wird vorzugsweise nicht-methylierte DNA (Negativkontrolle, 0% methylierte DNA), in-vitro methylierte DNA (Positivkontrolle, zu 100% methylierte DNA) sowie Mischungen aus beiden (1% und 10% methylierte DNA) verwendet. Alle vier Kontrollen gemeinsam bilden eine Standardreihe.
Um die Proben mittels methylierungsspezifischer PCR zu analysieren, wird die DNA zuvor einer Bisulfitkonversion unterzogen. Bei dieser chemischen Reaktion werden alle nicht methylierten Cytosine in Uracil umgewandelt. Methylierte Cytosine sind durch die Methylgruppe geschützt und bleiben Cytosine. Somit entsteht zum einen ein Sequenzunterschied zur genomischer DNA und zum anderen ein methylierungsspezifischer Sequenzunterschied je nach ursprünglichem Methylierungszustand. Die methylierungsspezifischen Primer enthalten vorzugsweise je zwei bis drei CpG-Dinukleotide. Somit können die Primer nur binden, wenn die DNA ursprünglich methyliert war.
In einer weiterentwickelten Ausführungsform umfasst das Kit zur quantitativen Bestimmung von Harnblasenkarzinom in einer Urinprobe Mittel für eine Amplifikation der Ziel-Regionen mit anschließender Messung der Menge des erzeugten Amplifikats.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung des Verfahrens oder eines Kits für einen nichtinvasiven Nachweis von Harnblasenkarzinom in einer isolierten Probe.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert. Keinesfalls ist die Erfindung auf diese Beispiele beschränkt. Vielmehr umfasst sie auch Variationen und Kombinationen der hier beschriebenen Merkmale.
Ausführungsbeispiele
Patientenproben und DNA-Isolation
Für die genomweite Suche nach Methylierungsmarkern für das Harnblasenkarzinom wurden von 28 Patienten (22 männlich / 5 weiblich) mit Harnblasenkarzinom verschiedener Stadien (10 pTa low-grade, 5 pTa high-grade, 4 pT1 low-grade, 6 pT1 high-grade, 3 pTis) präoperativer Urin gesammelt.
Als Kontrollgruppe wurde Urin von Patienten, welche auf Grund von Steinleiden (Urolithiasis, n=9) oder benigner Prostatahyperplasie (n=11) in ambulanter Behandlung bzw. Kontrolle waren, verwendet. Anschließend wurde das Urinsediment 10 bis maximal 40 ml Urin durch Zentrifugation bei 1750 × g und waschen in PBS bei 175 × g gewonnen und in 500 µl PBS resuspendiert.
Die DNA-Isolation erfolgte mit der Standard Phenol-Chloroform Methode. Dazu wurde 100 µl Urinsediment mit Proteinase K verdaut. Durch Zugabe von Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol wurde die DNA in die wässrige Phase extrahiert und anschließend mit Natriumacetat und Ethanol gefällt und mit Ethanol nochmals gewaschen.
Identifikation von potentiellen Markern mittels genomweiter Sequenzierung methylierter DNA
Um die methylierten DNA-Sequenzen zu isolieren, wurden 500 ng DNA aus dem Urinsediment mittels Ultraschall (Diagenode Bioruptor, 22 Zyklen zu 30 Sekunden) zu 100 bis 350 bp Fragmenten fragmentiert. Die Anreicherung bzw. Isolation methylierter DNA-Fragmente erfolgte anschließend mittels „Methylated CpG-Island Recovery Assay (MIRA)“ unter Verwendung des MethylCollector Ultra Kit mit High-Salt Binding Buffer (Active Motif) zur anschließenden Aufreinigung mittels MinElute PCR Purification Kit (Qiagen).
Die Anreicherungseffizienz / Rückgewinnung der methylierten DNA-Fragmente wurde mittels PCR mit den Genen XIST und SNRPN, welche dem Imprinting unterliegen, und GAPDH (unmethyliert), überprüft. Die Rückgewinnung methylierter DNA betrug jeweils deutlich über 10%. Die Rückgewinnung nicht-methylierter DNA betrug deutlich unter 1%.
Aus den isolierten methylierten DNA-Fraktionen wurde je eine DNA-Library für die Illumina NovaSeq Multiplex-Sequenzierung präpariert. Verwendet wurde der SureSelect XT Low Input Kit von Agilent Technologies. Im Anschluss wurden die Libraries der verschiedenen Proben equimolar gepoolt und auf dem Illumina NovaSeq 6000 mit einer S1 Flow Cell im 2 x 150 Modus sequenziert. Für die Qualitätskontrolle und Prozessierung der Rohdaten wurde die Programme FastQC und Fastp genutzt. Anschließend wurden die prozessierten Daten (DNA-Seq Libraries) mithilfe des Programms Hisat2 auf das menschliche Referenzgenom (GrCH38, Ensembl release 100) gemappt, wobei die einzelnen Reads nicht gesplittet wurden und ein einzelner Read maximal zehn gleichwahrscheinlichen Ursprungsloci auf einmal zugeordnet wurde. Für jede der untersuchten Proben wurde dann, anhand der dazugehörigen Mappingergebnisse, untersucht, an welchen Stellen des menschlichen Genoms eine starke Anhäufung an Reads (im Folgenden Peak genannt) auftrat.
Zur Peak-Identifizierung wurde das Programm Macs2 verwendet. Für jede der untersuchten Proben wurden die Macs2 Ergebnisse in ein GTF-Annotationsformat umgewandelt und anschließend alle Peak-Annotationen zu einer einzigen Annotation vereint. Basierend auf der finalen Peak-Annotation wurde für jede Probe der Count-Wert (Methylierungsrate) mithilfe des Programms FeatureCount bestimmt und anhand der Größe der dazugehörigen DNA-Seq Library normalisiert. Nun wurde die Abdeckung (Coverage-Wert), sprich der Quotient aus normalisiertem Count-Wert und der jeweiligen Peak-Länge, für jeden Peak in jeder Probe berechnet. Für die Identifikation von potenziellen Markern wurden bei den Proben der Kontrollgruppe nur die ungefilterten Peak-Annotationen zur Auswertung verwendet. In der Tumorgruppe wurden dagegen nur annotierte Peaks berücksichtigt, welche bestimmten Eigenschaften folgten. Die Peaks mussten eine Mindestlänge von 200 Basen aufweisen und sich mit einer CpG-Insel überlappen oder direkt neben einer CpG-Insel lokalisiert sein (maximaler Abstand von 2.000 Basen). Zusätzlich musste mindestens einer der beiden benachbarten Peaks beide zuvor genannten Eigenschaften erfüllen. Anhand der Coverage-Werte konnte mit festen Grenzwerten bestimmt werden, welche der verbliebenen Peaks in den untersuchten Proben aktiv methyliert wurden. Dabei galt in den Tumorproben ein Peak ab einem mittleren Coverage-Wert von 15 und in den Kontrollproben ab einem Wert von mindestens 5 als methyliert. Hieraus resultierten die in der Tabelle 1 gezeigten 55 Marker. Für diese Markerregionen wurden die Sensitivität, Spezifität und Genauigkeit („Accuracy“) bestimmt.
Evaluierung einzelner Marker mittels quantitativer methylierungsspezifischer PCR (q-MS PCR)

Je 250 bis 500 ng DNA aus Urinsediment wurden mittels DNA-Methylation Lightning™ Kit (Zymo Research) bisulfitbehandelt. Die Quantifizierung des Methylierungsanteils der Marker in den einzelnen Proben erfolgte durch eine q-MS-PCR. Dabei kamen die in der Tabelle 2 gezeigten Primer zum Einsatz. Ein Reaktionsansatz enthielt 10 µl EvaGreen PCR Master Mix (2X), 0,5 µl Forward und Reverse Primer (je 5 µM), 8,5 µl nukleasefreies Wasser und 1 µl (5 ng) Template (bisulfit-DNA). Das PCR Protokoll auf dem Roche Light Cycler 480 wie folgt: Präinkubation bei 94°C, 60 sek, Amplifikation für 42 Zyklen bei 94°C, 15 sek; Annealingtemperatur (primerspezifisch) 20 sek; 72°C 30 sek.. Im Anschluss folgte eine Standard-Schmelzkurvenanalyse von 60°C bis 95°C. In jeder q-MS-PCR wurde eine Standardreihe aus bisulfitbehandelter nativer und in-vitro methylierter Keratinozyten-DNA (0%, 1%, 10%, 100% methyliert) sowie eine No-Template Kontrolle (NTC) mitgeführt. Tabelle 2: Methylierungsspezifische Primer

SEQ ID NO	Gen	Ta	Größe		Sequenz
1	IRX2	60°C	152 bp	Fw	TAGGAGTTGCGTTCGGGTTAC
2				Rv	CGAACATTCAACTACGACTCCG
3	NKX1-1 (F1R1)	58°C	125 bp	Fw	TCGGCGTGGGTTAGATTTAATTC
4				Rv	GCCGAAACTAAACCGCCG
5	NKX1-1 (F2R2)	62°C	109 bp	Fw	TTAATTGGTTGCGAACGGTTTC
6				Rv	ACCGCTCTAAACTCCGAACTACG
7	OTX1	60°C	121 bp	Fw	TCGGTGTCGGAGTTATTGGTC
8				Rv	CGTAACTACCGCCCTAACCG
9	DMRTA2	58°C	129 bp	Fw	GGTCGATATTACGTTATGGTTGC
10				Rv	GCTACATCGCTACCGATAAACG
11	FBXL8	58°C	165 bp	Fw	GTTGTTCGTTGAGAGCGTGAC
12				Rv	AACTCGACCGAAACGACTACG
13	KIFC2	62°C	143 bp	Fw	TCGTATGTTTTGGTTACGTTGAC
14				Rv	CGAACGAACCCGACATAA
15	LHX4	62°C	100 bp	Fw	AGGTTTTCGTGCGGATTTAGTAGTTC
16				Rv	CTATCGAAACGACGAAACCCG
17	ZIC5	62°C	106 bp	Fw	GAGTCGCGTGATTGGTAGTAGTTTC
18				Rv	AAACGAAAACGCAAACGACC
19	NKX6-2	62°C	63 bp	Fw	GGCGGCGTTTATGGATATTAATCG
20				Rv	GCGACCAACGAAACACTACTCA
F = Forward; R = Reverse; Ta = Annealingtemperatur; SEQ ID NO = Sequenzkennzahl

Die Auswertung erfolgte mithilfe der LightCycler® 480 Software mit der „Fit Point“-Methode. Der Threshold wurde für alle PCR-Läufe auf 1,0 gesetzt. Der ΔCt-Wert ergab sich durch folgende Berechnung, wobei die Referenz zur Normalisierung der ursprünglichen DNA Konzentration aus der Probe eine Region des ACTB-Gens ist, welche keine CpG Dinucleotide enthält.
Dabei gilt folgender Zusammenhang: $Δ Ct = CtReferenzgen - CtZielgen$
Durch einen Abgleich der ΔCt-Werte der Patientenproben mit der Standardreihe, wurde der Methylierungsanteil semiquantitativ bestimmt. Als unmethyliert galten Proben mit einer Methylierung von weniger als 1%, als schwach methyliert Proben zwischen 1% und 10% und als stark methyliert Proben zwischen 10% und 100%. Eine Probe wurde als positiv eingestuft, wenn sie in der q-MS-PCR einen Methylierungsgrad von ≥ 10% aufwies.
Für die Analyse der PCRs wurde die LightCycler® 480 Software genutzt und die „Fit Point“-Methode angewandt. Dabei wurden für die Auswertung die Ct-Werte sowie ΔCt-Werte herangezogen und durch Schmelzkurvenanalyse und Gelelektrophorese verifiziert.
Auswahl von IRX2, NKX1-1, KIFC2 und LHX4 als Marker für Humankarzinome
Aus den in der Tabelle 1 gezeigten Gen-Regionen wurden die Marker IRX2, NKX1-1, KIFC2 und LHX4 für die weitere Evaluierung ausgewählt.
Die auf Basis der Sequenzdaten (Methylation-Coverage) ermittelten diagnostischen Werte der Markerregionen wurden durch q-MS-PCR Assays evaluiert ( , Tabelle 3). Hierbei wurde ein Grenzwert für ein positives Testergebnis von 10% Methylierung angenommen.
Die Marker IRX2, NKX1-1 F2/R2, DMRTA2 und KIFC2 zeigten in keiner der 20 Kontrollen ein positives Testergebnis, was einer Spezifität von 100% entspricht. Besonders bevorzugt ist der Marker IRX2, welcher unter diesen Markern die höchste Sensitivität von 78,6% zeigt. Unter Ausschluss von pTa Low Grade Tumoren werden mit diesem Marker 88,9% der Karzinome (non-pTa Low Grade) erkannt. pTa bezeichnen nichtinvasive papilläre Karzinome. Ähnliche Sensitivität zeigt der bekannte Marker OTX1 bei etwas geringerer Spezifität von 90% in unserem Probenset. NKX1-1 F1R1 erkannte alle non-pTa Low Grade Tumore (Sensitivität 100%) bei einer Spezifität von 80%.

Durch Kombination des Markers IRX2 mit KIFC2 und/oder LHX1 wurde die Sensitivität erhöht (Tabelle 3). Drei pTa Low Grade Tumore konnten jedoch durch keinen der evaluierten Marker erkannt werden. Die Kombination IRX2 mit KIFC2 detektiert bei einer Spezifität von 100%, 82,1% aller Tumore und 94,4% der non-pTa Low Grade Tumore. Die Kombination aus IRX2, KIFC2 und LHX4 detektierte alle non-pTa Low Grade Tumore bei einer Spezifität von 95%. Tabelle 3: Diagnostische Werte der einzelnen Marker in Urinsedimenten bei Grenzwert 10% methylierte DNA

	N	IRX2	NKX1-1 F1/R1	NKX1-1 F2/R2	KIFC2	LHX4
Sensitivität
NMIBC (alle Stadien)	28	78,6	89,3	64,3	57,1	60,7
HG	14	85,7	100,0	78,6	71,4	85,7
LG	14	71,4	78,6	50,0	42,9	35,7
pTa	15	66,7	80,0	46,7	33,3	46,7
pT1	10	90,0	100,0	90,0	90,0	80,0
pTis	3	100,0	100,0	66,7	66,7	66,7
non-pTa LG	18	88,9	100,0	83,3	77,8	83,3
pTa LG	10	60,0	70,0	30,0	20,0	20,0

Spezifität
BPH / Urolithiasis	20	100,0	80,0	100,0	100,0	95,0
N Gesamtfallzahl, NMIBC nicht-muskelinvasives Harnblasenkarzinom, HG High Grade, LG Low Grade, pTx pathologisches Tumorstadium, pTa nichtinvasives papilläres Karzinom, pT1 Tumor infiltriert subepitheliales Bindegewebe, pTis Carcinoma in situ: „flacher Tumor“, non-pTa LG nicht nichtinvasives papilläres Karzinom Low Grade, pTa LG nichtinvasives papilläres Karzinom Low Grade, BPH benigne Prostatahyperplasie

Die diagnostischen Werte von Marker-Kombinationen in Urinsedimenten bei einem Grenzwert von 10% methylierter DNA, wenn mindestens ein Marker positiv ist im Vergleich zu kommerziell verfügbaren Tests, ist in Tabelle 4 gezeigt. IRX2 in Kombination mit KIFC2 oder IRX2 mit LHX4 oder eine Kombination von allen drei Markern IRX2, KIFC2 und LHX4 zeigte eine beeindruckende Sensitivität und Spezifität. Tabelle 4: Diagnostische Werte von Marker-Kombinationen in Urinsedimenten

	N	IRX2 KIFC2	IRX2 LHX4	IRX2 KIFC2 LHX4	Bladder Epicheck	Assure MDx for Bladder Cancer
Sensitivität
NMIBC (alle Stadien)	28	82,1	82,1	85,7	62,3% - 90%¹⁸
HG	14	92,9	92,9	100,0	78,9% - 100%¹⁸	93,5%^{19, 20}
LG	14	71,4	71,4	71,4	37,5% - 53,7%¹⁸	85,5%^{19, 20}
pTa	15	66,7	73,3	73,3
pT1	10	100,0	90,0	100,0
pTis	3	100,0	100,0	100,0
non-pTa LG	18	94,4	94,4	100,0	91 %*
pTa LG	10	60,0	60,0	60,0

Spezifität
BPH / Urolithiasis	20	100,0	95,0	95,0	85%* 82,1 %-90,2%¹⁸
N Gesamtfallzahl, NMIBC nicht muskelinvasives Harnblasenkarzinom, HG High Grade, LG Low Grade, pTx pathologisches Tumorstadium, , pTa nichtinvasives papilläres Karzinom, pT1 Tumor indiltriert subepitheliales Bindegewebe, pTis Carcinoma in situ: „flacher Tumor“, non-pTa LG nicht Nichtinvasives papilläres Karzinom Low Grade, pTa LG Nichtinvasives papilläres Karzinom Low Grade, BPH benigne Prostatahyperplasie, * Herstellerangabe.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

zeigt eine Heatmap in der die durch die NGS identifizierten 53 Peak-Regionen (Y-Achse) dargestellt sind. Zusätzlich kann der Methylierungsstatus der jeweiligen Regionen in den Tumor- und Kontrollproben (X-Achse) abgelesen werden. BPH (n = 11), Urolithiasis (n = 9), pTa Low Grade (n = 9), pTa High Grade (n = 5), pT1 Low Grade (n = 4), pT1 High Grade (n = 6) und Carcinoma in situ (n = 3).
zeigt die Amplifikationskurven der Standardreihe am Beispiel IRX2.
zeigt die Häufigkeit positiver Tests der einzelnen Marker im Urin bei einem Grenzwert von 10% methylierter DNA.

Detaillierte Beschreibung der Abbildungen
Aus der in gezeigten „Heatmap“ geht hervor, dass die Tumorproben im Vergleich zu den Kontrollproben einen deutlichen Unterschied im Methylierungsmuster aufweisen. Vor allem die High Grade Tumore bzw. Tumore ab dem Stadium T1 sind durch eine starke Methylierung charakterisiert. Dennoch weisen auch einige Tumorproben keine oder nur eine schwache Hypermethylierung auf. Darunter fallen vier Tumorproben mit Ta Low Grade (T25, T45, T51, K9), eine mit Ta High Grade (T17) und zwei mit T1 High Grade (T2, T5). Die Probe T2 zeichnete sich allerdings durch eine allgemein sehr niedrige Coverage aller annotierten Peaks aus (mittlere Coverage 0,6 im Vergleich zu anderen Proben mit mittlerer Coverage von > 15) und erreichte somit eine ungenügende Sequenzierqualität. Im Vergleich zu den Tumoren ist auch eine schwache Hypermethylierung bei einigen Kontrollproben erkennbar (K2, K11, K16, K37 und K39).
In der sind die einzelnen Amplifikationskurven (v.l.n.r.) für 100% (obere), 10% (mittlere) und 1% (untere) methylierte und bisulfitbehandelte Keratinozyten-DNA (m-DNA) für den Marker IRX2 veranschaulicht. Die 0% methylierte und bisulfitbehandelte Keratinozyten-DNA, die native genomische DNA (gDNA) und die non-Template Kontrolle (NTC) wurden nicht amplifiziert. Das Experiment zeigt, dass die Amplifikation abhängig vom Grad der Methylierung ist.
In der ist gezeigt wie häufig das entsprechende Gen in den Urinsedimentproben eine starke Methylierung (≥ 10%) aufwies. Die grauen Säulen entsprechen den Tumorproben (nicht-muskelinvasives Harnblasenkarzinom (NMIBC), aller Stadien und Differenzierungsgrade n=28), die schwarzen Säulen entsprechen den Tumorproben non-pTa Low Grade (n = 18), die quergestreiften Säulen entsprechen den Kontrollen (n = 20). Die zeigt, dass in allen untersuchten Gen-Abschnitten beim nicht-muskelinvasiven Harnblasenkarzinom eine starke Methylierung in mindestens 40% bis nahezu 80% der Fälle auftritt. In den nicht-muskelinvasives Harnblasenkarzinomen ohne den nichtinvasiven papillären Low Grade Karzinomen tritt in den entsprechenden Gen-Abschnitten eine starke Methylierung in mindestens 60% bis 100% der Fälle auf. Im Vergleich zeigen die Kontrollen in 0% bis maximal 20% der Fälle eine starke Methylierung. Die Marker IRX2, NKX1-1 F2/R2, DMRTA2 und KIFC2 zeigen in den 20 Kontrollen eine Methylierung von 0% und somit eine Spezifität von 100%.
Literatur

1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a cancer journal for clinicians. 2018;68:394-424. https://doi.org/10.3322/caac.21492
2. RKI, GEKID. Krebs in Deutschland für 2017/2018. 13. Ausgabe. Robert Koch-Institut (Hrsg) und die Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e. V. (Hrsg). Berlin, 20212021.
3. Sylvester RJ, van der Meijden AP, Oosterlinck W, et al. Predicting recurrence and progression in individual patients with stage Ta T1 bladder cancer using EORTC risk tables: a combined analysis of 2596 patients from seven EORTC trials. European urology. 2006;49:466-465; discussion 475-467. https://doi.org/10.1016/j.eururo.2005.12.031
4. Deutsche Krebsgesellschaft DK, AWMF. Leitlinienprogramm Onkologie : S3-Leitlinie Früherkennung, Diagnose, Therapie und Nachsorge des Harnblasenkarzinoms, Langversion 1.1, 2016, AWMF-Registrierungsnummer 032/038OL, http://leitlinienprogramm-onkologie.de/Harnblasenkarzinom.92.0.html. 2016.
5. Bruyninckx R, Buntinx F, Aertgeerts B, Van Casteren V. The diagnostic value of macroscopic haematuria for the diagnosis of urological cancer in general practice. The British journal of general practice : the journal of the Royal College of General Practitioners. 2003;53:31-35.
6. Jones R, Latinovic R, Charlton J, Gulliford MC. Alarm symptoms in early diagnosis of cancer in primary care: cohort study using General Practice Research Database. Bmj. 2007;334:1040. https://doi.org/10.1136/bmj.39171.637106.AE
7. Shephard EA, Stapley S, Neal RD, Rose P, Walter FM, Hamilton WT. Clinical features of bladder cancer in primary care. The British journal of general practice : the journal of the Royal College of General Practitioners. 2012;62:e598-604. https://doi.org/10.3399/bjgp12X654560
8. Khadra MH, Pickard RS, Charlton M, Powell PH, Neal DE. A prospective analysis of 1,930 patients with hematuria to evaluate current diagnostic practice. The Journal of urology. 2000;163:524-527.
9. Bolenz C, Schroppel B, Eisenhardt A, Schmitz-Drager BJ, Grimm MO. The Investigation of Hematuria. Deutsches Arzteblatt international. 2018;115:801-807. https://doi.org/10.3238/arztebl.2018.0801
10. Leitlinienprogramm Onkologie (Deutsche Krebsgesellschaft, Deutsche Krebshilfe, AWMF): S3-Leitlinie Früherkennung, Diagnose, Therapie und Nachsorge des Harnblasenkarzinoms, Langversion 1.1, 2016, AWMF-Registrierungsnummer 032/038OL, http://leitlinienprogramm-onkologie.de/Harnblasenkarzinom.92.0.html, Stand: September 2019
11. Karakiewicz PI, Benayoun S, Zippe C, et al. Institutional variability in the accuracy of urinary cytology for predicting recurrence of transitional cell carcinoma of the bladder. BJU international. 2006;97:997-1001. https://doi.org/10.1111/j.1464-410X.2006.06036.x
12. Yafi FA, Brimo F, Auger M, Aprikian A, Tanguay S, Kassouf W. Is the performance of urinary cytology as high as reported historically? A contemporary analysis in the detection and surveillance of bladder cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 2014;32:27.e21-27.e26. https://doi.org/10.1016/j.urolonc.2012.09.011
13. Miyake M, Owari T, Hori S, Nakai Y, Fujimoto K. Emerging biomarkers for the diagnosis and monitoring of urothelial carcinoma. Research and reports in urology. 2018;10:251-261. https://doi.org/10.2147/RRU.S173027
14. Oliveira MC, Caires HR, Oliveira MJ, Fraga A, Vasconcelos MH, Ribeiro R. Urinary Biomarkers in Bladder Cancer: Where Do We Stand and Potential Role of Extracellular Vesicles. Cancers. 2020;12. https://doi.org/10.3390/cancers12061400
15. Laukhtina E, Shim SR, Mori K, et al. Diagnostic Accuracy of Novel Urinary Biomarker Tests in Non–muscle-invasive Bladder Cancer: A Systematic Review and Network Meta-analysis. European Urology Oncology. 2021;4:927-942. https://doi.org/10.1016/j.euo.2021.10.003
16. Humayun-Zakaria N, Ward DG, Arnold R, Bryan RT. Trends in urine biomarker discovery for urothelial bladder cancer: DNA, RNA, or protein? Translational andrology and urology. 2021;10:2787-2808. https://doi.org/10.21037/tau-20-1327
17. Brenet F, Moh M, Funk P, et al. DNA methylation of the first exon is tightly linked to transcriptional silencing. PloS one. 2011;6:e14524. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014524
18. Mancini M, Righetto M, Zumerle S, Montopoli M, Zattoni F. The Bladder EpiCheck Test as a Non-Invasive Tool Based on the Identification of DNA Methylation in Bladder Cancer Cells in the Urine: A Review of Published Evidence. International journal of molecular sciences. 2020;21:6542. https://doi.org/10.3390/ijms21186542
19. van Kessel KE, Beukers W, Lurkin I, et al. Validation of a DNA Methylation-Mutation Urine Assay to Select Patients with Hematuria for Cystoscopy. The Journal of urology. 2017; 197:590-595. https://doi.org/10.1016/j.juro.2016.09.118
20. van Kessel KE, Van Neste L, Lurkin I, Zwarthoff EC, Van Criekinge W. Evaluation of an Epigenetic Profile for the Detection of Bladder Cancer in Patients with Hematuria. The Journal of urology. 2016; 195:601-607. https://doi.org/10.1016/j.juro.2015.08.085
21. Feber A, Dhami P, Dong L, et al. UroMark-a urinary biomarker assay for the detection of bladder cancer. Clinical epigenetics. 2017;9:8. https://doi.org/10.1186/s13148-016-0303-5
22. Tan WS, Feber A, Dong L, et al. DETECT I & DETECT II: a study protocol for a prospective multicentre observational study to validate the UroMark assay for the detection of bladder cancer from urinary cells. BMC cancer 2017;17:767-767. https://doi.org/10.1186/s12885-017-3758-7
23. Jocham D, Stepp H, Waidelich R. Photodynamic Diagnosis in Urology: State-of-the-Art. European urology. 2008;53:1138-1150. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.eururo.2007.11.048
24. Rauch T, Li H, Wu X, Pfeifer GP. MIRA-assisted microarray analysis, a new technology for the determination of DNA methylation patterns, identifies frequent methylation of homeodomain-containing genes in lung cancer cells. Cancer research. 2006;66:7939-7947. https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-06-1888
25. Jung M, Kadam S, Xiong W, Rauch TA, Jin S-G, Pfeifer GP. MIRA-seq for DNA methylation analysis of CpG islands. Epigenomics. 2015;7:695-706. https://doi.org/10.2217/epi.15.33
26. Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996;93:9821-9826. https://doi.org/10.1073/pnas.93.18.9821
27. Sigalotti L, Covre A, Colizzi F, Fratta E. Quantitative Methylation-Specific PCR: A Simple Method for Studying Epigenetic Modifications of Cell-Free DNA. Methods in molecular biology. 2019; 1909:137-162. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8973-7_11

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 2012230952 A1 [0010]
US 2021164031 A1 [0011]
WO 2021073029 A1 [0012]
CN 114717311 A [0013]
US 11220714 B2 [0014]
DE 102015226843 B3 [0015]
EP 0926245 A2 [0016]
EP 2935621 B1 [0017]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a cancer journal for clinicians. 2018;68:394-424. https://doi.org/10.3322/caac.21492 [0071]
RKI, GEKID. Krebs in Deutschland für 2017/2018. 13. Ausgabe. Robert Koch-Institut (Hrsg) und die Gesellschaft der epidemiologischen Krebsregister in Deutschland e. V. (Hrsg). Berlin, 20212021 [0071]
Sylvester RJ, van der Meijden AP, Oosterlinck W, et al. Predicting recurrence and progression in individual patients with stage Ta T1 bladder cancer using EORTC risk tables: a combined analysis of 2596 patients from seven EORTC trials. European urology. 2006;49:466-465; discussion 475-467. https://doi.org/10.1016/j.eururo.2005.12.031 [0071]
http://leitlinienprogramm-onkologie.de/Harnblasenkarzinom.92.0.html. 2016 [0071]
Bruyninckx R, Buntinx F, Aertgeerts B, Van Casteren V. The diagnostic value of macroscopic haematuria for the diagnosis of urological cancer in general practice. The British journal of general practice : the journal of the Royal College of General Practitioners. 2003;53:31-35 [0071]
Jones R, Latinovic R, Charlton J, Gulliford MC. Alarm symptoms in early diagnosis of cancer in primary care: cohort study using General Practice Research Database. Bmj. 2007;334:1040. https://doi.org/10.1136/bmj.39171.637106 [0071]
Shephard EA, Stapley S, Neal RD, Rose P, Walter FM, Hamilton WT. Clinical features of bladder cancer in primary care. The British journal of general practice : the journal of the Royal College of General Practitioners. 2012;62:e598-604. https://doi.org/10.3399/bjgp12X654560 [0071]
Khadra MH, Pickard RS, Charlton M, Powell PH, Neal DE. A prospective analysis of 1,930 patients with hematuria to evaluate current diagnostic practice. The Journal of urology. 2000;163:524-527 [0071]
Bolenz C, Schroppel B, Eisenhardt A, Schmitz-Drager BJ, Grimm MO. The Investigation of Hematuria. Deutsches Arzteblatt international. 2018;115:801-807. https://doi.org/10.3238/arztebl.2018.0801 [0071]
http://leitlinienprogramm-onkologie.de/Harnblasenkarzinom.92.0.html, Stand: September 2019 [0071]
Karakiewicz PI, Benayoun S, Zippe C, et al. Institutional variability in the accuracy of urinary cytology for predicting recurrence of transitional cell carcinoma of the bladder. BJU international. 2006;97:997-1001. https://doi.org/10.1111/j.1464-410X.2006.06036.x [0071]
Yafi FA, Brimo F, Auger M, Aprikian A, Tanguay S, Kassouf W. Is the performance of urinary cytology as high as reported historically? A contemporary analysis in the detection and surveillance of bladder cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 2014;32:27.e21-27.e26. https://doi.org/10.1016/j.urolonc.2012.09.011 [0071]
Miyake M, Owari T, Hori S, Nakai Y, Fujimoto K. Emerging biomarkers for the diagnosis and monitoring of urothelial carcinoma. Research and reports in urology. 2018;10:251-261. https://doi.org/10.2147/RRU.S173027 [0071]
Oliveira MC, Caires HR, Oliveira MJ, Fraga A, Vasconcelos MH, Ribeiro R. Urinary Biomarkers in Bladder Cancer: Where Do We Stand and Potential Role of Extracellular Vesicles. Cancers. 2020;12. https://doi.org/10.3390/cancers12061400 [0071]
Laukhtina E, Shim SR, Mori K, et al. Diagnostic Accuracy of Novel Urinary Biomarker Tests in Non–muscle-invasive Bladder Cancer: A Systematic Review and Network Meta-analysis. European Urology Oncology. 2021;4:927-942. https://doi.org/10.1016/j.euo.2021.10.003 [0071]
Humayun-Zakaria N, Ward DG, Arnold R, Bryan RT. Trends in urine biomarker discovery for urothelial bladder cancer: DNA, RNA, or protein? Translational andrology and urology. 2021;10:2787-2808. https://doi.org/10.21037/tau-20-1327 [0071]
Brenet F, Moh M, Funk P, et al. DNA methylation of the first exon is tightly linked to transcriptional silencing. PloS one. 2011;6:e14524. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014524 [0071]
Mancini M, Righetto M, Zumerle S, Montopoli M, Zattoni F. The Bladder EpiCheck Test as a Non-Invasive Tool Based on the Identification of DNA Methylation in Bladder Cancer Cells in the Urine: A Review of Published Evidence. International journal of molecular sciences. 2020;21:6542. https://doi.org/10.3390/ijms21186542 [0071]
van Kessel KE, Beukers W, Lurkin I, et al. Validation of a DNA Methylation-Mutation Urine Assay to Select Patients with Hematuria for Cystoscopy. The Journal of urology. 2017; 197:590-595. https://doi.org/10.1016/j.juro.2016.09.118 [0071]
van Kessel KE, Van Neste L, Lurkin I, Zwarthoff EC, Van Criekinge W. Evaluation of an Epigenetic Profile for the Detection of Bladder Cancer in Patients with Hematuria. The Journal of urology. 2016; 195:601-607. https://doi.org/10.1016/j.juro.2015.08.085 [0071]
Feber A, Dhami P, Dong L, et al. UroMark-a urinary biomarker assay for the detection of bladder cancer. Clinical epigenetics. 2017;9:8. https://doi.org/10.1186/s13148-016-0303-5 [0071]
Tan WS, Feber A, Dong L, et al. DETECT I & DETECT II: a study protocol for a prospective multicentre observational study to validate the UroMark assay for the detection of bladder cancer from urinary cells. BMC cancer 2017;17:767-767. https://doi.org/10.1186/s12885-017-3758-7 [0071]
Jocham D, Stepp H, Waidelich R. Photodynamic Diagnosis in Urology: State-of-the-Art. European urology. 2008;53:1138-1150. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.eururo.2007.11.048 [0071]
Rauch T, Li H, Wu X, Pfeifer GP. MIRA-assisted microarray analysis, a new technology for the determination of DNA methylation patterns, identifies frequent methylation of homeodomain-containing genes in lung cancer cells. Cancer research. 2006;66:7939-7947. https://doi.org/10.1158/0008-5472.can-06-1888 [0071]
Jung M, Kadam S, Xiong W, Rauch TA, Jin S-G, Pfeifer GP. MIRA-seq for DNA methylation analysis of CpG islands. Epigenomics. 2015;7:695-706. https://doi.org/10.2217/epi.15.33 [0071]
Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996;93:9821-9826. https://doi.org/10.1073/pnas.93.18.9821 [0071]
Sigalotti L, Covre A, Colizzi F, Fratta E. Quantitative Methylation-Specific PCR: A Simple Method for Studying Epigenetic Modifications of Cell-Free DNA. Methods in molecular biology. 2019; 1909:137-162. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8973-7_11 [0071]

Claims

Verfahren zum in vitro-Nachweis von Harnblaskarzinomen in einer Urinprobe, umfassend: - Bereitstellen einer Urinprobe, - Isolieren von DNA aus der Urinprobe, - Bestimmung des Vorhandenseins eines im Vergleich zu einer Referenzprobe hypermethylierten DNA-Abschnittes in der aus der Urinprobe isolierten DNA, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem analysierten DNA-Abschnitt um eine Gen-Region handelt, die in Tumorzellen stärker methyliert ist als die entsprechende Gen-Region in gesunden Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den analysierten Gen-Regionen um IRX2 (Iroquois Homeobox 2), NKX1-1 (NK1 Homeobox 1), LHX4 (LIM Homeobox 4) oder KIFC2 (Kinesin Family Member C2) oder eine Kombination von diesen handelt.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung des Vorhandenseins eines im Vergleich zu einer Referenzprobe hypermethylierten DNA-Abschnittes in der aus der Urinprobe isolierten DNA erfolgt durch: - Bedarfsweise Amplifikation von methylierten und nicht-methylierten DNA-Abschnitten mittels Polymerasekettenreaktion (PCR), bei der die methylierten DNA-Abschnitte stärker amplifiziert werden als die nicht-methylierten DNA-Abschnitte. - Quantifizierung der methylierten und nicht-methylierten DNA-Abschnitte mittels quantitativer methylierungsspezifischer PCR (q-MS-PCR).
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass für die q-MS-PCR Primer eingesetzt werden, die eine oder mehrere der folgenden Nukleinsäuresequenzen umfassen: - Für IRX2 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 1, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 2; - Für NKX1-1 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6; - Für KIFC2 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 13, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 14; - Für LHX4 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 15, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 16.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass für den Nachweis von Tumorzellen eine qualitative oder quantitative Analyse des DNA-Methylierungsanteils in ausgewählten Gen-Regionen durchgeführt wird, wobei es sich bei den ausgewählten Gen-Regionen um eine Kombination der Gen-Regionen IRX2 mit KIFC2 und/oder LHX1 handelt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der methylierte DNA-Abschnitt wenigstens zu mehr als 1%, vorzugsweise zu mehr als 10% stärker methyliert ist als der nicht-methylierte DNA-Abschnitt.
Kit für den Nachweis von Harnblaskarzinom in einer isolierten Urinprobe, umfassend Primer zur quantitativen methylierungsspezifischen Polymerasenkettenreaktion (q-MS-PCR), bei der die methylierten DNA-Abschnitte in Tumorzellen stärker amplifiziert werden als die korrespondierenden nicht-methylierten DNA-Abschnitte gesunder Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass die q-MS-Primer in wenigstens einer der Gen-Regionen IRX2, NKX1-1, KIFC2 oder LHX4 binden.
Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Primer wenigstens zwei CpG-Dinukleotide enthalten.
Kit nach einem der Ansprüche 7 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass q-MS-Primer eingesetzt werden, die eine oder mehrere der folgenden Nukleinsäuresequenzen umfassen: - Für IRX2 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 1, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 2; - Für NKX1-1 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 5, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6; - Für KIFC2 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 13, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 14; - Für LHX4 ein Forward-Primer mit der Nukleinsäuresequenz der SEQ ID NO: 15, und/oder ein Reverse-Primer mit der Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NO: 16.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Kits nach einem der Ansprüche 7 bis 9 für einen nicht-invasiven Nachweis von Harnblasenkarzinom in einer isolierten Probe.