DE102021208831A1 - Microfluidic device and method of its operation - Google Patents

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betreiben einer mikrofluidischen Vorrichtung in dem ein Transportmedium, welches humane Zellen enthält, mit einer Flussrate durch einen Filter (140) transportiert wird. Die Flussrate wird so gewählt, dass im Wesentlichen keine Schädigung der Zellen erfolgt. Weiterhin betrifft die Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung, welche mindestens einen Filter (140) aufweist. Diese ist eingerichtet, um mittels des Verfahrens betrieben zu werden.The invention relates to a method for operating a microfluidic device in which a transport medium containing human cells is transported through a filter (140) at a flow rate. The flow rate is chosen so that essentially no damage to the cells occurs. Furthermore, the invention relates to a microfluidic device which has at least one filter (140). This is set up to be operated using the method.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Betreiben einer mikrofluidischen Vorrichtung. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung eine mikrofluidische Vorrichtung, die eingerichtet ist, um mittels des Verfahrens betrieben zu werden.The present invention relates to a method for operating a microfluidic device. Furthermore, the present invention relates to a microfluidic device that is set up to be operated by means of the method.

Stand der TechnikState of the art

In der Diagnostik werden je nach Anwendung und Nachweismethode verschiedene sogenannte Transportmedien für biologische Proben als klinische Standards etabliert, die es möglich machen, Patientenabstriche oder Patientenproben zu einem Diagnostiklabor zu transportieren. Für molekularbiologische oder biochemische Analysen der Proben werden Transportmedien eingesetzt, deren Hauptaufgabe darin besteht, eine stabilisierende Umgebung für Nukleinsäuren und weitere Analyten zu gewährleisten, um die Probe nicht zu verändern. In diesen Medien werden außerdem Pathogene ganz oder teilweise zerstört, Nukleinsäuren freigesetzt und abbauende Proteine gehemmt. Für mikrobiologische oder zellbiologische Analysen dürfen die Transportmedien hingegen nicht lysierend sein, weil für verschiedenste Nachweise intakte lebende Zellen benötigt werden.Depending on the application and detection method, various so-called transport media for biological samples are established as clinical standards in diagnostics, which make it possible to transport patient swabs or patient samples to a diagnostic laboratory. Transport media are used for molecular-biological or biochemical analyzes of the samples, the main task of which is to ensure a stabilizing environment for nucleic acids and other analytes so that the sample is not altered. In these media, pathogens are also completely or partially destroyed, nucleic acids are released and degrading proteins are inhibited. For microbiological or cell-biological analyses, on the other hand, the transport media must not be lysing, because intact living cells are required for a wide variety of proofs.

Bei Verwendung eines nicht-lysierenden Transportmediums wird zunächst eine Akkumulation von Zellen, die beispielsweise Erreger enthalten, auf einem Rückhalteelement, wie einer Filterfritte, durchgeführt. Auf diese Weise erfolgt eine Akkumulation von Zellen, die intrazelluläre Pathogene, wie Bakterien (beispielsweise Mycoplasmen), Parasiten (beispielsweise Trichomonas oder Plasmodium sp.) oder Viren (beispielsweise Influenza oder SARS-CoV-2) enthalten können. Auf die Akkumulation folgt eine mechanische, chemische oder thermische Lyse direkt am Ort der Akkumulation, also auf der Filterfritte, um eine Konzentration in der im nächsten Schritt molekularbiologisch oder biochemisch nachzuweisenden Pathogene vorzunehmen. Dabei ist es wichtig, dass die akkumulierten Zellen auf dem Rückhalteelement vor der Lyse intakt bleiben.When using a non-lysing transport medium, cells, which contain pathogens, for example, are first accumulated on a retaining element, such as a filter frit. In this way, there is an accumulation of cells that may contain intracellular pathogens such as bacteria (e.g. mycoplasma), parasites (e.g. Trichomonas or Plasmodium sp.) or viruses (e.g. influenza or SARS-CoV-2). The accumulation is followed by a mechanical, chemical or thermal lysis directly at the site of accumulation, i.e. on the filter frit, in order to carry out a concentration in the pathogens to be detected molecular-biologically or biochemically in the next step. It is important that the accumulated cells on the retaining element remain intact before lysis.

In dem Artikel S. J. Tan, H. Phan, B. M. Gerry, A. Kuhn, L. Z. Hong et al., A microfluidic device for preparing next generation DNA sequencing libraries and for automating other laboratory protocols that require one or more column chromatography steps, PLoS ONE, 8 (2013) e64084 wird beschrieben, dass bei der chromatographischen Gewinnung von DNA in mikrofluidischen Vorrichtungen eine niedrige Flussrate einer Probe vorteilhaft ist, um eine hohe DNA-Gewinnung zu erreichen.In the article SJ Tan, H Phan, BM Gerry, A Kuhn, LZ Hong et al., A microfluidic device for preparing next generation DNA sequencing libraries and for automating other laboratory protocols that require one or more column chromatography steps, PLoS ONE , 8 (2013) e64084 it is described that in the chromatographic extraction of DNA in microfluidic devices a low flow rate of a sample is advantageous in order to achieve a high DNA extraction.

Offenbarung der ErfindungDisclosure of Invention

Das Verfahren zum Betreiben einer mikrofluidischen Vorrichtung sieht vor, dass ein Medium, welches humane Zellen enthält, mit einer Flussrate durch einen Filter transportiert wird, die so gewählt oder eingestellt wird, dass eine Schädigung der Zellen vermieden wird. Dabei wird die Flussrate vorzugsweise über zumindest eine Saugkammer und/oder Pumpe eingestellt.The method for operating a microfluidic device provides that a medium containing human cells is transported through a filter at a flow rate that is selected or set such that damage to the cells is avoided. The flow rate is preferably adjusted via at least one suction chamber and/or pump.

Unter einem Medium kann ein Fluid, insbesondere eine Flüssigkeit verstanden werden. Beispielsweise kann es sich bei dem Medium um eine Körperflüssigkeit, insbesondere Sputum, Urin oder Blut handeln. Ferner kann es sich bei dem Medium vorzugsweise um ein Transportmedium, insbesondere ein nichtlysierendes Transportmedium, beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung oder UTM®,handeln, wobei das Transportmedium abhängig von einer Probennahme auch Körperflüssigkeit enthalten kann.A medium can be understood to mean a fluid, in particular a liquid. For example, the medium can be a body fluid, in particular sputum, urine or blood. Furthermore, the medium can preferably be a transport medium, in particular a nonlysing transport medium, for example a phosphate-buffered saline solution or UTM®, wherein the transport medium can also contain body fluid depending on a sampling.

Diesem Verfahren liegt die Erkenntnis zugrunde, dass humane Zellen tendenziell bereits bei geringem Scherstress lysieren. Eine niedrige Flussrate oder ein niedriger Flussratenbereich verringert diesen Scherstress, sodass eine Schädigung der Zellen vermieden werden kann. Die Flussrate wird somit derart gewählt oder eingestellt, insbesondere zumindest über eine Einstellung der Saugkammer und/oder Pumpe, dass ein möglichst hoher Anteil der Zellen intakt auf dem Filter akkumuliert wird. Die Wahl oder Einstellung der Flussrate kann dabei vorzugsweise unter Berücksichtigung der mikrofluidischen Gegebenheiten der mikrofluidschen Vorrichtung erfolgen, also insbesondere unter Berücksichtigung des fluidischen Widerstands des Filters, der Viskosität des Mediums und/oder eines fluidischen Widerstands eines Kanals, durch welchen das Medium mit den Zellen zum Filter transportiert wird. Der fluidische Widerstand des Kanals kann dabei insbesondere von der Geometrie, insbesondere einer Breite und Länge des Kanals, und/oder von einer inneren Oberfläche des Kanals abhängen. Durch die erfindungsgemäße Anpassung der Flussrate an die mikrofluidischen Gegebenheiten ist es möglich, ein sanftes Pumpen oder Saugen der in dem Medium enthaltenen Zellen auf den Filter zu realisieren, so dass vorteilhafterweise ein hoher Anteil der Zellen durch den Transport auf den Filter nicht geschädigt werden und für eine nachfolgende Bearbeitung oder Analyse intakt bleiben.This method is based on the finding that human cells tend to lyse even at low shear stress. A low flow rate or a low flow rate range reduces this shear stress, so that damage to the cells can be avoided. The flow rate is thus selected or adjusted in such a way, in particular at least by adjusting the suction chamber and/or pump, that the highest possible proportion of the cells are accumulated intact on the filter. The flow rate can preferably be selected or adjusted taking into account the microfluidic conditions of the microfluidic device, i.e. in particular taking into account the fluidic resistance of the filter, the viscosity of the medium and/or a fluidic resistance of a channel through which the medium with the cells to filter is transported. The fluidic resistance of the channel can depend in particular on the geometry, in particular a width and length of the channel, and/or on an inner surface of the channel. By adapting the flow rate to the microfluidic conditions according to the invention, it is possible to gently pump or suck the cells contained in the medium onto the filter, so that advantageously a high proportion of the cells are not damaged by transport to the filter and for remain intact for subsequent processing or analysis.

Unter einer Vermeidung einer Schädigung der Zellen kann somit insbesondere verstanden werden, dass zumindest 30%, bevorzugt mindestens 40%, besonders bevorzugt mindestens 50%, ganz besonders bevorzugt mindestens 60% der in dem Transportmedium enthaltenen Zellen intakt auf dem Filter akkumuliert werden. Dabei ist vorzugsweise berücksichtigt, dass aufgrund einer Beschaffenheit, insbesondere einer Porengröße des Filters und aufgrund eines durch die Flussrate auf den Filter wirkenden Drucks ein Anteil intakter Zellen auch durch den Filter hindurchtreten kann und dass ein weiterer Anteil intakter Zellen aufgrund der mikrofluidischen Beschaffenheit der mikrofluidischen Vorrichtung beim Transport verloren gehen kann.Avoiding damage to the cells can thus be understood in particular that at least 30%, preferably at least 40%, more preferably at least 50%, most preferably at least 60% of the cells contained in the transport medium intact on the filters are accumulated. It is preferably taken into account that due to a condition, in particular a pore size of the filter and due to a pressure acting on the filter due to the flow rate, a proportion of intact cells can also pass through the filter and that a further proportion of intact cells due to the microfluidic nature of the microfluidic device can be lost during transport.

Unter einer Vermeidung einer Schädigung der Zellen kann ferner in vorzugsweiser Ausgestaltung des Verfahrens verstanden werden, dass die Flussrate derart gewählt wird, dass im Wesentlichen keine Schädigung der Zellen erfolgt. Unter „im Wesentlichen keine Schädigung“ kann vorzugsweise verstanden werden, dass weniger als 40%, bevorzugt weniger als 30%, ganz bevorzugt weniger als 20% der Zellen durch den Transport zum Filter geschädigt werden.In a preferred embodiment of the method, avoiding damage to the cells can also be understood to mean that the flow rate is selected in such a way that essentially no damage to the cells occurs. “Substantially no damage” can preferably be understood to mean that less than 40%, preferably less than 30%, very preferably less than 20% of the cells are damaged by transport to the filter.

Die Flussrate beträgt bevorzugt maximal 300 µl/s und besonders bevorzugt maximal 200 µl/s. Diese Flussrate ist besonders geeignet, um eine Schädigung humaner Zellen möglichst zu verhindern. Außerdem wird bei solchen Flussraten möglichst vermieden, dass Zellen durch den Filter hindurchgedrückt werden und damit für die spätere Analyse nicht mehr zur Verfügung stehen.The flow rate is preferably at most 300 μl/s and particularly preferably at most 200 μl/s. This flow rate is particularly suitable for preventing damage to human cells as far as possible. In addition, with such flow rates, it is avoided as far as possible that cells are pushed through the filter and are therefore no longer available for later analysis.

Das Transportieren erfolgt vorzugsweise durch ein Saugen des Mediums. Während mikrofluidische Vorrichtungen, die ein Medium mittels Überdruckes durch einen Filter pressen, üblicherweise mit hohen Drücken, wie beispielsweise einem Druck von 260 kPa arbeiten und damit hohe Flussraten von beispielsweise 500 µl/s erzeugen, sind mikrofluidische Vorrichtungen in der Regel dazu eingerichtet, ein Saugen mit nur geringem Unterdrücken vorzunehmen, wodurch geringere Flussraten realisiert werden können. Grundsätzlich kann das Verfahren aber auch durch ein Pumpen Mediums realisiert werden, wenn das Pumpen mit einem so geringen Überdruck erfolgt, dass die erforderlichen geringen Flussraten realisiert werden können.The transport is preferably carried out by sucking the medium. While microfluidic devices that press a medium through a filter by means of overpressure usually work at high pressures, such as a pressure of 260 kPa, and thus generate high flow rates of, for example, 500 μl/s, microfluidic devices are usually set up to suck to be carried out with only slight suppression, as a result of which lower flow rates can be realized. In principle, however, the method can also be implemented by pumping medium if the pumping takes place with such a low overpressure that the required low flow rates can be implemented.

Das Saugen erfolgt bevorzugt durch Einstellen eines Drucks auf einer stromabwärtigen Seite des Filters, welcher maximal 90 kPa beträgt. Besonders bevorzugt liegt der Druck im Bereich von 30 kPa bis 40 kPa. Da in einer mikrofluidischen Vorrichtung, in der keine aktiven Pump- oder Saugvorgänge ablaufen, üblicherweise Atmosphärendruck herrscht, bewirken diese Druckbereiche einen nur geringen Unterdruck während des Saugvorgangs, der ein schonendes Filtrieren der im Medium, insbesondere im Transportmedium enthaltenen Zellen ermöglicht.The suction is preferably performed by setting a pressure on a downstream side of the filter which is at most 90 kPa. Most preferably the pressure is in the range of 30 kPa to 40 kPa. Since atmospheric pressure usually prevails in a microfluidic device in which no active pumping or suction processes take place, these pressure ranges cause only a slight negative pressure during the suction process, which enables gentle filtration of the cells contained in the medium, in particular in the transport medium.

Das Saugen erfolgt vorzugsweise mittels einer Saugkammer, die stromabwärts des Filters angeordnet ist. Besonders bevorzugt ist sie unmittelbar stromabwärts des Filters angeordnet. Unter „unmittelbar stromabwärts“ wird dabei verstanden, dass der Filter und die Saugkammer nur durch eine Leitung miteinander verbunden sind, ohne dass in dieser Leitung weitere mikrofluidische Elemente angeordnet sind. Das Verwenden einer solchen Saugkammer ermöglicht das sehr präzise Anlegen eines Unterdrucks stromabwärts des Filters und somit ein genaues Steuern der Flussrate. Bei der Saugkammer kann es sich auch um eine Pumpe handeln, welche so betrieben werden kann, dass sie Fluide, insbesondere Flüssigkeiten, ansaugt.The suction is preferably performed by means of a suction chamber located downstream of the filter. It is particularly preferably arranged immediately downstream of the filter. “Immediately downstream” is understood to mean that the filter and the suction chamber are only connected to one another by a line, without further microfluidic elements being arranged in this line. Using such a suction chamber enables a vacuum to be applied very precisely downstream of the filter and thus to precisely control the flow rate. The suction chamber can also be a pump which can be operated in such a way that it sucks in fluids, in particular liquids.

Die mikrofluidische Vorrichtung ist eingerichtet, um mittels des Verfahrens betrieben zu werden. Diese Einrichtung erfolgt insbesondere dadurch, dass die Verfahrensschritte auf einer Recheneinheit oder Steuereinheit der mikrofluidischen Vorrichtung als Computerprogramm implementiert sind. Die mikrofluidische Vorrichtung weist einen Filter auf, der insbesondere als Filterfritte ausgeführt ist. Ein zahlenmittlerer Porendurchmesser des Filters liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 µm bis 10,0 µm. Da humane Zellen üblicherweise einen Durchmesser von mehr als 10 µm bis 20 µm aufweisen, wird hiermit ein sicheres Zurückhalten der Zellen gewährleistet, während gleichzeitig weitere im Transportmedium enthaltene Partikel von den Zellen abgetrennt werden können.The microfluidic device is set up to be operated using the method. This setup takes place in particular in that the method steps are implemented as a computer program on a computing unit or control unit of the microfluidic device. The microfluidic device has a filter, which is designed in particular as a filter frit. A number-average pore diameter of the filter is preferably in the range of 0.5 μm to 10.0 μm. Since human cells usually have a diameter of more than 10 μm to 20 μm, this ensures that the cells are retained safely, while at the same time other particles contained in the transport medium can be separated from the cells.

Eine Saugkammer ist vorzugsweise stromabwärts des Filters angeordnet. Besonders bevorzugt ist sie unmittelbar stromabwärts des Filters angeordnet. Die Saugkammer weist dabei eine Membran auf, die sie in einen ersten Teil und einem zweiten Teil unterteilt. Der erste Teil liegt in einer Fluidikschicht der mikrofluidischen Vorrichtung, durch welche das Medium transportiert wird. Der zweite Teil liegt in einer Pneumatikschicht, in welcher ein Überdruck oder ein Unterdruck erzeugt werden kann. Eine Saugkammer unterscheidet sich von einer Pumpkammer dadurch, dass ihr zweiter Teil mit einem Kanal der Pneumatikschicht verbunden ist, welcher eingerichtet ist, damit darin ein Unterdruck erzeugt wird, während der zweite Teil einer Pumpkammer mit einem Kanal der Pneumatikschicht verbunden ist, welcher eingerichtet ist, damit darin ein Überdruck erzeugt wird. Wird im zweiten Teil der Saugkammer ein Unterdruck erzeugt, so wird die Membran in die Pneumatikschicht hinein ausgelenkt, wodurch auch im ersten Teil der Saugkammer ein Unterdruck entsteht.A suction chamber is preferably located downstream of the filter. It is particularly preferably arranged immediately downstream of the filter. The suction chamber has a membrane that divides it into a first part and a second part. The first part lies in a fluidic layer of the microfluidic device through which the medium is transported. The second part is in a pneumatic layer in which an overpressure or a negative pressure can be generated. A suction chamber differs from a pumping chamber in that its second part is connected to a channel of the pneumatic layer arranged to create a negative pressure therein, while the second part of a pumping chamber is connected to a channel of the pneumatic layer arranged to so that an overpressure is generated in it. If a negative pressure is generated in the second part of the suction chamber, the membrane is deflected into the pneumatic layer, as a result of which a negative pressure is also created in the first part of the suction chamber.

Um ein einfaches Auslenken der Membran zu ermöglichen, besteht diese vorzugsweise aus einem Elastomer. Besonders bevorzugte Elastomere sind thermoplastisches Polyurethan oder Polydimethylsiloxan (PDMS).In order to enable the membrane to be easily deflected, it preferably consists of an elastomer. Particularly preferred elastomers are thermoplastic polyurethane or polydimethylsiloxane (PDMS).

Um der Membran eine gute mechanische Stabilität zu verleihen und gleichzeitig ihre Elastizität zu erhalten, liegt die Dicke der Membran vorzugsweise im Bereich von 50 µm bis 300 µm. Besonders bevorzugt liegt sie im Bereich von 75 µm bis 125 µm. Weiterhin ist bevorzugt, dass der Radius der Membran im Bereich von 1 mm bis 10 mm liegt. Besonders bevorzugt liegt er im Bereich von 2,5 mm bis 3,5 mm.In order to give the membrane good mechanical stability and at the same time maintain its elasticity, the thickness of the membrane is preferably in the range from 50 μm to 300 μm. It is particularly preferably in the range from 75 μm to 125 μm. Furthermore, it is preferred that the radius of the membrane is in the range from 1 mm to 10 mm. It is particularly preferably in the range from 2.5 mm to 3.5 mm.

Die Saugkammer ist mit dem Filter über einen Kanal verbunden, dessen Kanalquerschnitt bevorzugt im Bereich von 0,1 mm2 bis 0,4 mm2 und besonders bevorzugt im Bereich von 0,22 mm2 bis 0,26 mm2 liegt. Dieser Querschnitt ermöglicht vorteilhaft die Einstellung der gewünschten Flussraten durch den Kanal.The suction chamber is connected to the filter via a channel, the channel cross section of which is preferably in the range from 0.1 mm 2 to 0.4 mm 2 and particularly preferably in the range from 0.22 mm 2 to 0.26 mm 2 . This cross section advantageously enables the desired flow rates to be set through the channel.

Figurenlistecharacter list

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und werden in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.

  • 1 zeigt schematisch Elemente einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß dem Stand der Technik.
  • 2 zeigt schematisch Elemente einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
  • 3 zeigt schematisch eine Saugkammer einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung.
  • 4 zeigt in einem Diagramm einen Vergleich einer RNA-Rückgewinnung aus humanen Zellen in einem Vergleichsbeispiel und einem erfindungsgemäßen Beispiel des Verfahrens.
  • 5 zeigt in einem Diagramm einen Vergleich der RNA-Rückgewinnung in drei erfindungsgemäßen Beispielen des Verfahrens.
Embodiments of the invention are shown in the drawings and are explained in more detail in the following description.
  • 1 shows schematically elements of a microfluidic device according to the prior art.
  • 2 shows schematically elements of a microfluidic device according to an embodiment of the invention.
  • 3 shows schematically a suction chamber of a microfluidic device according to an embodiment of the invention.
  • 4 shows in a diagram a comparison of RNA recovery from human cells in a comparative example and an example of the method according to the invention.
  • 5 shows in a diagram a comparison of the RNA recovery in three examples of the method according to the invention.

Ausführungsbeispiele der ErfindungEmbodiments of the invention

Eine mikrofluidische Vorrichtung (beispielsweise Vivalytic®, Robert Bosch GmbH, Deutschland) gemäß dem Stand der Technik, die in 1 dargestellt ist, weist eine Fluidikschicht 100 und eine Pneumatikschicht 200 auf. In der Fluidikschicht 100 ist ein Einlass 110 angeordnet, über den ein Medium, insbesondere ein Transportmedium in ein Kanalsystem eingeführt werden kann. Bei dem Transportmedium handelt es sich beispielsweise um das UTM®-RT-Medium (Universal Transport Medium Room Temperature, COPAN Diagnostics, USA). Dieses zellstabilisierende Transportmedium enthält Salze zur Pufferung eines neutralen pH-Werts und Zuckerverbindungen zur Stabilisierung von humanen Zellen. Das Transportmedium, welches im vorliegenden Ausführungsbeispiel humane Zellen enthält, wird mittels einer Pumpkammer 210 mit einem Druck von 260 kPa durch das Kanalsystem gepumpt. Die Pumpkammer 210 weist hierzu eine Membran 211 auf, welche sie in einen ersten Teil in der Fluidikschicht 100 und einen zweiten Teil in der Pneumatikschicht 200 unterteilt. Zwischen dem Einlass 110 und der Pumpkammer 210 zweigt ein erstes Reservoir 120, das ein Ventil 121 aufweist, vom Kanalsystem ab. Stromabwärts der Pumpkammer 210 zweigt ein zweites Reservoir 130, welches ein Ventil 131 aufweist, vom Kanalsystem ab. Aus den beiden Reservoirs 120, 130 können Reagenzien in das Kanalsystem eindosiert werden. Ein Filter 140 ist stromabwärts der Pumpkammer 210 und des zweiten Reservoir 130 im Kanalsystem angeordnet. Er ist als Filterfritte mit einem zahlenmittleren Porendurchmesser von 5 µm ausgeführt. Stromabwärts des Filters 140 zweigt ein drittes Reservoir 150 mit einem Ventil 151 vom Kanalsystem ab, durch welches ebenfalls Reagenzien in das Kanalsystem eindosiert werden können. Ein Sammelgefäß 160, welches ein Ventil 161 aufweist, sammelt stromabwärts des dritten Reservoir 150 das Transportmedium, welches durch den Filter 140 gepumpt wurde. Bei diesem Pumpvorgang treten Flussraten von bis zu 500 µl/s auf.A prior art microfluidic device (e.g. Vivalytic ® , Robert Bosch GmbH, Germany) disclosed in 1 is shown has a fluidic layer 100 and a pneumatic layer 200 . An inlet 110 is arranged in the fluidic layer 100, via which a medium, in particular a transport medium, can be introduced into a channel system. The transport medium is, for example, the UTM® -RT medium (Universal Transport Medium Room Temperature, COPAN Diagnostics, USA). This cell-stabilizing transport medium contains salts to buffer a neutral pH value and sugar compounds to stabilize human cells. The transport medium, which in the present exemplary embodiment contains human cells, is pumped through the channel system by means of a pump chamber 210 at a pressure of 260 kPa. For this purpose, the pump chamber 210 has a membrane 211 which divides it into a first part in the fluidic layer 100 and a second part in the pneumatic layer 200 . Between the inlet 110 and the pump chamber 210, a first reservoir 120, which has a valve 121, branches off from the channel system. A second reservoir 130 which has a valve 131 branches off from the channel system downstream of the pump chamber 210 . Reagents can be metered into the channel system from the two reservoirs 120, 130. A filter 140 is located downstream of the pumping chamber 210 and the second reservoir 130 in the duct system. It is designed as a filter frit with a number-average pore diameter of 5 µm. Downstream of the filter 140, a third reservoir 150 branches off from the channel system with a valve 151, through which reagents can also be metered into the channel system. A collection vessel 160, which has a valve 161, collects the transport medium, which was pumped through the filter 140, downstream of the third reservoir 150. Flow rates of up to 500 µl/s occur during this pumping process.

2 zeigt ein Ausführungsbeispiel einer mikrofluidischen Vorrichtung gemäß der Erfindung. Diese Vorrichtung unterscheidet sich von der Vorrichtung gemäß 1 dadurch, dass stromabwärts des Filters 140 und stromaufwärts des dritten Reservoirs 150 eine Saugkammer 220 mit einer Membran 221 im Kanalsystem angeordnet ist. Das Transportieren des Mediums, insbesondere des Transportmediums durch den Filter 140 erfolgt nicht unter Verwendung der Pumpkammer 210, welcher einen Überdruck stromaufwärts des Filters 140 erzeugt, sondern unter Verwendung der Saugkammer 220, welcher einen Unterdruck stromabwärts des Filters 140 erzeugt. 2 shows an embodiment of a microfluidic device according to the invention. This device differs from the device according to FIG 1 in that downstream of the filter 140 and upstream of the third reservoir 150 a suction chamber 220 with a membrane 221 is arranged in the channel system. The transport of the medium, in particular the transport medium, through the filter 140 does not take place using the pump chamber 210, which generates an overpressure upstream of the filter 140, but using the suction chamber 220, which generates a negative pressure downstream of the filter 140.

In 3 sind Details der Saugkammer 220 dargestellt. Die Membran 221 der Saugkammer 220 weist eine Dicke d von 100 µm auf. Ihr Radius r beträgt 3,0 mm. Der kreisförmigen Kanalquerschnitt a in einem Kanal 222 des Kanalsystems zwischen dem Filter 140 und der Saugkammer 220 beträgt 0,24 mm2. In 3 details of suction chamber 220 are shown. The membrane 221 of the suction chamber 220 has a thickness d of 100 μm. Its radius r is 3.0 mm. The circular channel cross-section a in a channel 222 of the channel system between the filter 140 and the suction chamber 220 is 0.24 mm 2 .

4 zeigt den Vergleich eines Vergleichsbeispiels VB1 und eines erfindungsgemäßen Beispiels B1 des Akkumulierens humaner Zellen auf dem Filter 140. In beiden Fällen wurden jeweils 10.000 Zellen mittels des Transportmediums in ein Ausführungsbeispiel der mikrofluidischen Vorrichtung gemäß 2 eingegeben. Nach Beenden der Akkumulation wurden diese lysiert und die Masse m der zurückgewonnenen RNA wurde ermittelt. Diese Masse m stellt ein Maß für die Anzahl intakt akkumulierter Zellen dar. Im Vergleichsbeispiel VB1 wurde die Vorrichtung gemäß 1 verwendet und das Transportmedium mittels der Pumpkammer 210 mit einem Druck von 260 kPa gepumpt. Im erfindungsgemäßen Beispiel B1 wurde die Vorrichtung gemäß 2 verwendet und das Transportmedium wurde mittels der Saugkammer 220 mit einem Druck von 35 kPa gesaugt. Während im Vergleichsbeispiel VB1 nur 1,8 ng RNA zurückgewonnen werden konnte, gelang es im erfindungsgemäßen Beispiel B1 10,1 ng RNA zurückzugewinnen. Dies zeigt, dass das erfindungsgemäß Saugen zu einer geringen Flussrate und einem geringen Scherstress auf die humanen Zellen führte, wodurch nur wenige Zellen auf dem Filter 140 zerstört wurden. 4 shows the comparison of a comparative example VB1 and an example B1 according to the invention of the accumulation of human cells on the filter 140. In both cases, 10,000 cells were transported by means of the transport medium into an exemplary embodiment of the microfluidic device according to FIG 2 entered. After the end of the accumulation, these were lysed and the mass m of the recovered RNA was determined. This mass m represents a measure of the number of intact accumulated cells the device according to 1 used and the transport medium pumped by means of the pumping chamber 210 with a pressure of 260 kPa. In example B1 according to the invention, the device was 2 used and the transport medium was sucked by the suction chamber 220 with a pressure of 35 kPa. While only 1.8 ng of RNA could be recovered in comparative example VB1, it was possible to recover 10.1 ng of RNA in example B1 according to the invention. This shows that suction according to the invention resulted in a low flow rate and low shear stress on the human cells, thereby destroying only a few cells on the filter 140.

5 zeigt die Rückgewinnung von RNA aus jeweils 10.000 humanen Zellen in drei weiteren erfindungsgemäßen Beispielen B2 bis B4. In allen Beispielen wurde ein anderes Ausführungsbeispiel der mikrofluidischen Vorrichtung gemäß 2 verwendet und das Transportmedium wurde mittels der Saugkammer 220 gesaugt. Dabei betrug der mittels der Saugkammer 220 eingestellte Druck stromabwärts des Filters 140 im zweiten Beispiel B2 70 kPa, im dritten Beispiel B3 50 kPa und im vierten Beispiel B4 35 kPa. Es ist erkennbar, dass die in diesen erfindungsgemäßen Beispielen B2 bis B4 eingestellten Drücke zwar zu einer geringeren RNA-Rückgewinnung als im ersten erfindungsgemäßen Beispiel B1 führen, diese jedoch immer noch höher ist als im Vergleichsbeispiel VB1. Je geringer der eingestellte Druck ist, desto geringer ist die RNA-Rückgewinnung. Geringere Drücke in der Saugkammer 220 führen zu einer größeren Druckdifferenz gegenüber dem Eingang des Filters 140, an dem Umgebungsdruck herrscht, sodass die Flussrate durch den Filter 140 steigt und damit mehr Zellen zerstört werden. Auch ein Druck von 35 kPa stellt jedoch sicher, dass im Vergleich zur Verwendung der nicht erfindungsgemäßen Vorrichtung nur wenige Zellen zerstört werden. Weiterhin wurde bei diesem Druck im Beispiel B4 zwar im Mittel eine geringere RNA-Rückgewinnung erzielt, diese war allerdings reproduzierbarer und zeigte eine geringere Streuung als in den Beispielen B2 und B3. 5 shows the recovery of RNA from 10,000 human cells in each case in three further examples B2 to B4 according to the invention. In all examples, a different embodiment of the microfluidic device according to FIG 2 used and the transport medium was sucked by means of the suction chamber 220. At this time, the pressure adjusted by the suction chamber 220 downstream of the filter 140 was 70 kPa in the second example B2, 50 kPa in the third example B3, and 35 kPa in the fourth example B4. It can be seen that the pressures set in these examples B2 to B4 according to the invention lead to a lower RNA recovery than in the first example B1 according to the invention, but this is still higher than in comparative example VB1. The lower the set pressure, the lower the RNA recovery. Lower pressures in the suction chamber 220 result in a greater pressure difference compared to the inlet of the filter 140, which is at ambient pressure, so that the flow rate through the filter 140 increases and thus more cells are destroyed. However, even a pressure of 35 kPa ensures that only a few cells are destroyed compared to using the device not according to the invention. Furthermore, although a lower average RNA recovery was achieved at this pressure in example B4, this was more reproducible and showed less scatter than in examples B2 and B3.

Claims (11)

Verfahren zum Betreiben einer mikrofluidischen Vorrichtung in dem ein Medium, insbesondere ein Transportmedium, welches humane Zellen enthält, mit einer Flussrate durch einen Filter (140) transportiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussrate für eine Vermeidung einer Schädigung der Zellen eingestellt wird.Method for operating a microfluidic device in which a medium, in particular a transport medium containing human cells, is transported through a filter (140) at a flow rate, characterized in that the flow rate is adjusted to avoid damage to the cells. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flussrate maximal 300 µl/s beträgt.procedure after claim 1 , characterized in that the flow rate is a maximum of 300 µl/s. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Transportieren durch ein Saugen des Mediums erfolgt.procedure after claim 1 or 2 , characterized in that the transporting takes place by suction of the medium. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Saugen durch Einstellen eines Drucks auf einer stromabwärtigen Seite des Filters (140) erfolgt, welcher maximal 90 kPa beträgt.procedure after claim 3 , characterized in that the suction is performed by setting a pressure on a downstream side of the filter (140) which is at most 90 kPa. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Druck im Bereich von 30 kPa bis 40 kPa liegt.procedure after claim 4 , characterized in that the pressure is in the range of 30 kPa to 40 kPa. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Saugen mittels einer Saugkammer (220) erfolgt, die stromabwärts des Filters (140) angeordnet ist.Procedure according to one of claims 3 until 5 , characterized in that the suction takes place by means of a suction chamber (220) arranged downstream of the filter (140). Mikrofluidische Vorrichtung, welche mindestens einen Filter (140) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass sie eingerichtet ist, um mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6 betrieben zu werden.Microfluidic device, which has at least one filter (140), characterized in that it is set up to use a method according to one of Claims 1 until 6 to be operated. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine Saugkammer (220) stromabwärts des Filters (140) angeordnet ist.Microfluidic device claim 7 , characterized in that a suction chamber (220) is arranged downstream of the filter (140). Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Saugkammer (220) eine Membran (221) aufweist, deren Dicke (d) im Bereich von 50 µm bis 300 µm liegt.Microfluidic device claim 8 , characterized in that the suction chamber (220) has a membrane (221) whose thickness (d) is in the range of 50 µm to 300 µm. Mikrofluidische Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Saugkammer (220) eine Membran (221) aufweist, deren Radius (r) im Bereich von 1 mm bis 10 mm liegt.Microfluidic device claim 8 or 9 , characterized in that the suction chamber (220) has a membrane (221) whose radius (r) is in the range of 1 mm to 10 mm. Mikrofluidische Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Saugkammer (220) über einen Kanal (222) mit dem Filter (114) verbunden ist, dessen Kanalquerschnitt (a) im Bereich von 0,1 mm2 bis 0,4 mm2 liegt.Microfluidic device according to any one of Claims 8 until 10 , characterized in that the suction chamber (220) is connected to the filter (114) via a channel (222), the channel cross-section (a) of which is in the range from 0.1 mm 2 to 0.4 mm 2 .
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