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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Charakterisierung von Veränderungen des Reifungszustandes einer Eizelle, sowie deren Verwendung.
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Hintergrund
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Die künstliche Befruchtung von Eizellen ist eine etablierte Methode in der Reproduktionsmedizin. Sie wird routinemäßig angewendet, um Paaren, die nicht auf natürlichem Wege ein Kind bekommen können, den Kinderwunsch zu ermöglichen.
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Die Anzahl der durch künstliche Befruchtung gezeugten Kinder steigt dabei ständig an. Im Zeitraum von 2008 bis 2010 wurden etwa 1.1 Millionen Kinder so gezeugt. Im Jahr 2012 überstieg die Anzahl der so gezeugten Kinder 5 Millionen, bis heute bereits über 8 Millionen.
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Neben der humanen Reproduktionsmedizin wird die künstliche Befruchtung zum Erhalt und der Generierung von Zucht- und Versuchstieren angewendet.
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Der Erfolg der künstlichen Befruchtung hängt entscheidend von der Qualität der Eizellen ab, speziell vom Zustand der Zona pellucida (ZP), die aus einer gelatinösen Schicht extrazellulärer Matrix besteht, die während der Eizellreifung zunächst hart ist, während der Befruchtung weich und nach der Befruchtung wieder verhärtet.
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Nach der Befruchtung wird so das Eindringen weiterer Spermien verhindert.
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Die Eizell- und Embryonenqualität wird typischerweise durch eine mikroskopische Kontrolle begutachtet.
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Die mikroskopische Kontrolle ist jedoch stark von der Erfahrung und dem Können und Wissen der begutachtenden Person abhängig, d.h., die Beurteilung ist stark subjektiv. Insbesondere ist die morphologische Beurteilung der Eizelle unmittelbar vor der Befruchtung stark subjektiv und kann nur von erfahrenen Embryologen durchgeführt werden. Dass die Beurteilung nur von erfahrenen Embryologen durchgeführt werden kann, schildert z.B. der Artikel „The Istanbul consensus workshop on embryo assessment“, in Human Reproduction, Vol.26, No.6 pp. 1270-1283, 2011.
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Um die Entwicklung des Embryos unmittelbar nach der Befruchtung nicht durch Schwankungen in den Umgebungsbedingungen, wie z.B. Belichtung, Temperatur, pH-Wert, etc. zu stören, wird in aller Regel erst ab 18 Stunden nach einer Befruchtung erneut eine Beurteilung der Qualität vorgenommen.
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Bei einer Momentaufnahme fehlen allerdings wichtige Informationen über die Entwicklung des Embryos, die für eine fundierte Aussage über die Qualität wichtig sind.
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In der Vergangenheit wurden daher verschiedenste Ansätze unternommen, um zu besseren Ergebnissen zu kommen.
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Das sogenannte time-lapse-Verfahren beurteilt den Embryo, also die Eizelle erst nach der Befruchtung und ist somit aus ethischen Gründen nach deutscher Gesetzgebung nur begrenzt einsetzbar. Zudem ist dies ein sehr teures Verfahren, sodass es kaum Anwendung findet.
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Die Beurteilung mit einem Polarisationsmikroskop ist zeitaufwendig. Diese Methode wird vor allem eingesetzt um festzustellen, ob die Eizelle die vollständige Reife zur Befruchtung besitzt. Ein Zusammenhang zwischen der Brechkraft der ZP und dem Entwicklungspotenzial der Eizelle ist in verschiedenen Spezies unterschiedlich und sogar widersprüchlich. Daher ist eine Aussage über die Qualität einer Eizelle anhand der Brechkraft der ZP wenig aussagekräftig.
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Im Rahmen eines präimplantationsgenetischen Screenings (PGS) werden für die genetischen Untersuchungen dem bereits mehrzelligen Embryo Zellen entnommen. Der mechanische Eingriff ist mit Risiken für den Embryo verbunden und somit ethisch umstritten. Zudem kann diese Art der Untersuchung erst nach der Befruchtung an Embryos, nicht aber an Eizellen durchgeführt werden.
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Ebenso gibt es weitere Ansätze, wie z.B. das metabolische Profiling oder das Aminosäuren-Profiling von Embryonen, die aber alle erst nach und nicht vor der Befruchtung durchgeführt werden können.
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Allen vorgenannten Verfahren gemein ist somit, dass sie Embryonen untersuchen, was nach dem Deutschen Embryonen-Schutzgesetz nur unter Auflagen geschehen darf, zudem, dass ein Vorteil gegenüber dem am Anfang vorgestellten Verfahren nicht belegt ist.
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Es gibt daher derzeit keine objektive Methode, um die Qualität von Eizellen oder frühen Embryonen zuverlässig zu bestimmen.
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Wie bereits angedeutet, ist die Beurteilung von Eizellen und Embryonen auch international umstritten und sehr unterschiedlich geregelt.
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In einigen Ländern, wie z.B. Deutschland, gelten Embryonenschutzgesetze. Nach konservativer Auslegung dürfen aus ethischen Gründen nur die Eizellen im Vorkernstadium (18 Stunden nach Befruchtung) beurteilt und selektiert werden. Das heißt, zu diesem Zeitpunkt muss bereits entschieden werden, welche Eizellen (in der Regel 2 - 3) bis zu Tag 3 - 5 weiter kultiviert und schließlich wieder in den Uterus (in der Regel 1- 2 Embryos) transferiert werden. Auf diese Weise soll eine Bevorratung von Embryonen vermieden werden. Die anderen Eizellen (durchschnittlich werden pro Frau 5-10 Eizellen nach einer hormonellen Stimulation gewonnen) werden im Vorkernstadium eingefroren.
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Allerdings birgt der Vorgang der Vitrifizierung Risiken, die die Qualität der Eizellen mindert (nicht alle Eizellen, die vor der Vitrifizierung noch eine gute Qualität hatten, haben sie auch noch danach). Deshalb wäre eine zuverlässige Qualitätskontrolle der befruchteten Eizelle besonders wichtig.
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Neben der konservativen Auslegung des Embryonenschutzgesetzes gibt es auch eine liberale Auslegung: der so genannte deutsche Mittelweg.
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Hier wird aufgrund der Anamnese der Patientin entschieden, wie viele der befruchteten Eizellen (maximal 6) weiter kultiviert werden, um eine Schwangerschaft zu erzielen. Dies ist z.B. bei älteren Patientinnen der Fall, da das fortgeschrittene Alter auf Eizellen schlechterer Qualität hindeutet. Die Beurteilung und Handhabung von Eizellen und Embryonen wird aus ethischen, gesundheitlichen und wirtschaftlichen Gründen äußerst unterschiedlich gehandhabt.
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Im Ausland (von Deutschland aus betrachtet) wird eine Vielzahl von Embryonen kultiviert und dann nur der „beste“ Embryo ausgewählt (elective single embryo transfer, eSET). Ziel ist es hier, nur einen Embryo zu transferieren, nämlich den mit der besten Chance auf eine erfolgreiche Schwangerschaft, und die Risiken von Mehrlingsschwangerschaften zu vermeiden. Die übrigen Embryonen werden eingefroren oder verworfen. Nach Embryonenschutzgesetz ist dies in Deutschland nicht erlaubt.
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Die große Divergenz der rechtlichen Randbedingungen zeigt die enorme Bedeutung einer zuverlässigen Eizell- und Embryokontrolle.
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Aufgabe
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Es wäre daher wünschenswert, eine objektive Charakterisierung von Veränderungen des Reifungszustandes einer Eizelle, sowie des Embryos, bereitstellen zu können.
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Kurzdarstellung der Erfindung
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Die Aufgabe wird gelöst durch eine Vorrichtung zur Charakterisierung von Veränderungen des Reifungszustandes einer Eizelle aufweisend eine Halteeinrichtung, wobei die Halteeinrichtung zur Aufnahme einer Eizelle geeignet ist. Die Vorrichtung weist weiterhin eine Tasteinheit auf, welche mit einem Ende eine aufgenommene Eizelle kraftbelastet berühren kann, wobei das Ende der Tasteinheit Kraft in zumindest eine Richtung auf die aufgenommene Eizelle ausüben kann. Die Vorrichtung weist weiterhin eine Messeinheit, welche die auf eine aufgenommene Eizelle ausgeübte Kraft in Bezug auf den zurückgelegten Weg in Kraftrichtung, aufnehmen kann, und eine Auswerteeinrichtung auf, welche die Tasteinheit steuert, sodass auf eine aufgenommene Eizelle progressiv mehr Kraft während eines Messzyklus ausgeübt wird und während des Messzyklus von der Messeinheit zumindest zwei Messwerte ausgelesen werden, wobei im Betrieb eine Indentierung der aufgenommenen Eizelle durch die Tasteinheit erzeugt werden kann, wobei die aufgewendete Kraft gemessen werden kann, wobei aus den erhaltenen Messwerten ein Elastizitäts-Modul bestimmt werden kann, welches indikativ für den Reifegrad oder den Fortschritt der Zellteilung der Eizelle ist.
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Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche, Abbildungen und der Beschreibung.
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Figurenliste
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Im Folgenden wird die Erfindung anhand einer Zeichnung und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Die Abbildungen sind schematische Darstellungen und nicht maßstabsgetreu. Die Abbildungen schränken die Erfindung in keiner Weise ein.
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Es zeigen:
- ein beispielhaftes Indentierung-Kraft-Diagramm bei Belastung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung,
- beispielhaftes Indentierung-Kraft-Diagramm bei Entlastung gemäß einer Ausführungsform der Erfindung,
- ein beispielhafter Kurvenfit eines Indentierung-Kraft-Diagramms gemäß einer Ausführungsform der Erfindung,
- eine schematische Darstellung von Elementen gemäß Ausführungsformen der Erfindung, und
- den Zusammenhang zwischen der Härte der Zona pellucida und der Eizelle- bzw. Embryo-Entwicklung über die Zeit.
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Ausführliche Darstellung der Erfindung
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Nachfolgend wird die Erfindung, unter Bezugnahme auf die Abbildungen, eingehender dargestellt. Dabei ist anzumerken, dass unterschiedliche Aspekte beschrieben werden, die jeweils einzeln oder in Kombination zum Einsatz kommen können. D.h. jeglicher Aspekt kann mit unterschiedlichen Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden, soweit nicht explizit als reine Alternative dargestellt.
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Weiterhin wird nachfolgend der Einfachheit halber in aller Regel immer nur auf eine Entität Bezug genommen. Soweit nicht explizit vermerkt, kann die Erfindung aber auch jeweils mehrere der betroffenen Entitäten aufweisen. Insofern ist die Verwendung der Wörter „ein“, „eine“ und „eines“ nur als Hinweis darauf zu verstehen, dass in einer einfachen Ausführungsform zumindest eine Entität verwendet wird.
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Soweit nachfolgend Verfahren beschrieben werden, sind die einzelnen Schritte eines Verfahrens in beliebiger Reihenfolge anordbar und/oder kombinierbar, soweit sich durch den Zusammenhang nicht explizit etwas Abweichendes ergibt. Weiterhin sind die Verfahren - soweit nicht ausdrücklich anderweitig gekennzeichnet - untereinander kombinierbar.
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Soweit in dieser Anmeldung Normen, Spezifikationen oder dergleichen benannt werden, werden zumindest immer die am Anmeldetag anwendbaren Normen, Spezifikationen oder dergleichen in Bezug genommen. D.h. wird eine Norm / Spezifikation etc. aktualisiert oder durch einen Nachfolger ersetzt, so ist die Erfindung auch hierauf anwendbar.
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Der Erfolg der künstlichen Befruchtung hängt entscheidend von der Qualität der Eizellen ab, speziell vom Zustand der Zona pellucida (ZP), die aus einer gelatinösen Schicht extrazellulärer Matrix besteht, die während der Reifung zunächst hart ist, während der Befruchtung weich und nach der Befruchtung wieder verhärtet.
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zeigt den Zusammenhang zwischen der Härte der Zona pellucida und der Eizelle- bzw. Embryo-Entwicklung über die Zeit. Dabei wird in der Zeitachse Bezug auf den Zustand vor der Befruchtung, als auch nach der Befruchtung und erfolgender Zellteilung bis hin zur sogenannten Blastozyste genommen. D.h., im Folgenden wird unter Eizelle nicht nur die Eizelle an sich, sondern auch die Reifung eines Embryos bis hin zum Blastozysten-Stadium, jedoch insbesondere bis zur Morula, und weiter insbesondere bis zum Mehrkern-Stadium verstanden. Wie aus der ersichtlich ist (basierend auf eigenen Messungen und ebenso aus Murayama et al., 2006 „Mouse zona pellucida dynamically changes its elasticity during oocyte maturation, fertilization and early embryo development“ entnehmbar), ändert sich die Härte der Zona pellucida mit der Entwicklung der Eizelle bzw. des Embryos. So nimmt die Härte der Zona pellucida, ausgehend vom Stadium germinal vesicle (abgek. GV) der Eizelle stetig ab, bis sie ein Minimum innerhalb der germinal vesicle breakdown Phase (abgek. GVBD) erreicht. Typischerweise findet nachfolgend im Stadium MII ( ) die Befruchtung der Eizelle statt, nach der sich die Zona pellucida zunächst verhärtet. Bei der anschließenden Entwicklung des Embryos wird sie dann wieder weicher.
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Entsprechend den ethischen Grundsätzen wurden nach Genehmigung Untersuchungen durchgeführt.
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Im Rahmen der Untersuchungen wurde die Zona Pellucida nach einer Behandlung gehärtet, z.B. mit Ovastacin. Weitere Schritte werden der Einfachheit halber nicht aufgeführt.
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Mittel seiner in schematisch gezeigten Vorrichtung V kann dann das E-Modul bestimmt werden.
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Oozyten oder Zweizell-Stadien Ez (unterschiedlicher genetischer Herkunft (Fetub+/+; Fetub-/-; Fetub-/-, Astl-/-) wurden auf einer Halteeinrichtung H der Vorrichtung V positioniert.
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Die Halteeinrichtung H kann z.B. ein Polyethylenterephthalat-Gewebe mit einer Maschenweite von (für diese Zellen geeigneten) 60 µm sein. Solche Gewebe sind z.B. als pluriStrainer® der Firma pluriSelect, Leipzig, Deutschland erhältlich.
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Die Halteeinrichtung H kann je nach Eizelle(n) Ez unterschiedlich ausgestaltet sein. Beispielsweise kann auch eine druckbetätigte Halteeinrichtung H vorgesehen sein, mit der eine Eizelle Ez in der Halteeinrichtung H durch Unterdruck fixiert werden kann, bzw. durch Wegnahme des Unterdruckes freigegeben werden kann. Beispielsweise, kann sich im Bodenbereich der Halteeinrichtung H eine Austrittsöffnung zu einem Fluidkanal FK befinden.
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Der Durchmesser der Öffnung in der Halteeinrichtung H ist bevorzugt kleiner als der Durchmesser der Halteeinrichtung H und der Eizelle Ez. Dies kann z.B. als Kontrolle für das Einbringen einer Eizelle Ez genutzt werden, um einen Fluidfluss, z.B. mittels Druckunterschieds, in einem zugehörigen Fluidkanal FK zu steuern. Dies kann z.B. dann von Vorteil sein, wenn die zu beobachtende Eizelle Ez nicht selbständig in die Halteeinrichtung H absinkt, z.B. in einem Zellmedium schwimmt.
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Durch Erzeugen von Unterdruck hinter der Öffnung kann Nährmedium in die Halteeinrichtung H und durch den Fluidkanal FK abgezogen werden. Dadurch kann die Eizelle Ez nach Einbringen in eine Nährlösung einfach in der Vertiefung hydrodynamisch positioniert und fixiert werden (hydrodynamische Falle). Umgekehrt kann durch Umkehrung des Fluidflusses ein Zufluss erzeugt und somit (gezielt) die Eizelle aus der Vertiefung freigesetzt werden.
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Die Oozyte bzw. das Zweizell-Stadium Ez kann in einem KSOM Medium(z.B. KSOM advanced) als Nährmedium platziert werden.
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Die erfindungsgemäße Vorrichtung V weist dazu beispielsweise eine Tasteinheit T auf.
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Die Tasteinheit T kann z.B. wie ein Hebel ausgebildet sein, an dem ein Tastelement angebracht ist. Das Tastelement bzw. der Teil der Tasteinheit T, der auf die Eizelle Ez (in ihren unterschiedlichen Reife- bzw. Entwicklungsstadien) einwirkt, ist so ausgebildet, dass die Eizelle Ez und insbesondere die Zona Pellucida unbeschädigt bleibt, im Rahmen der Messung(en). Beispielsweise ist das Tastelement T bzw. der Teil der Tasteinheit, der auf die Eizelle (in ihren unterschiedlichen Reife- bzw. Entwicklungsstadien) einwirkt sphärisch ausgebildet. Der Radius der Sphäre kann z.B. 25 µm betragen. Eine hebelartige Ausgestaltung der Tasteinheit T kann z.B. eine Federkonstante von 0.05 N/m aufweisen.
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Die Tasteinheit T ist bevorzugt wechselbar, sodass für unterschiedliche Arten von Eizellen Ez unterschiedliche Arten von Tasteinheiten T verwendet werden können.
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Das Material für die Tasteinheit T ist bevorzugt so ausgestaltet, dass eine Wechselwirkung mit der zu untersuchenden Eizelle Ez ausgeschlossen ist. Zudem sollte die Tasteinheit gut sterilisierbar sein. Beispielsweise kann die Tasteinheit T Metall(-Legierung) oder Glas aufweisen.
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Zusätzlich kann vorgesehen sein, dass die Vorrichtung eine visuelle (mikroskopische) Kontrolle des Messvorganges ermöglicht. Bevorzugt ist dafür die Halteeinrichtung H im optischen Bereich transparent, sodass die Eizelle Ez mittels Durchleuchtung observiert werden kann. Andernfalls ist die Eizelle Ez in Reflektion observierbar.
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Weiterhin weist die Vorrichtung V eine Temperiereinheit zur Bereitstellung einer vorwählbaren Temperatur auf. So kann für die jeweilige Spezies angepasst die Temperatur eingestellt werden, z.B. 37° Celsius.
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Wie in der gezeigt, kann die Tasteinheit T auf die Eizelle Ez zubewegt werden. Beispielsweise kann dafür eine (kontinuierliche) Bewegung von z.B. 1 µm/s verwendet werden. Es ist jedoch auch möglich eine stufenweise Erhöhung vorzusehen.
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Sobald die Tasteinheit T auf der Eizelle Ez aufliegt, kann die Kraft unmittelbar oder mittelbar bestimmt werden. Das Aufliegen zeigt sich durch eine Zunahme der Kraft an. Nach einer gewissen Indentierung von beispielsweise 2000 nm (abhängig von der Eizelle Ez) nimmt die Kraft nahezu linear mit der Indentierungstiefe der Tasteinheit T zu. Der nahezu lineare Bereich ist dabei von besonderem Interesse. Um eine Beschädigung der Eizelle Ez zu vermeiden, sollte der lineare Bereich nicht verlassen werden. Beispielsweise reicht es bei dem Diagramm der aus, bis in etwa einer Eindringtiefe von 4 µm zu indentieren.
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Anschließend kann diese Eindringtiefe für eine vorbestimmte Zeit, z.B. 1 Sekunde, gehalten werden. Anschließend kann die Indentierung wieder zurückgenommen werden, wie in gezeigt. Der Entlastungsvorgang kann dabei ebenfalls wieder mit einer bestimmten Geschwindigkeit oder stufenweise vorgenommen werden. Die Geschwindigkeit / Stufenhöhe der Belastung und der Entlastung können gleich oder verschieden sein.
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Ohne Beschränkung der Allgemeinheit kann vorgesehen sein, dass die entsprechenden Messvorgänge einmalig oder mehrmalig vorgenommen werden. Bei mehrmaliger Messung kann eine Mittelwertbildung und ebenso auch ein Kurvenfit vorgenommen werden, wie in 1c angedeutet.
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Aus den unterschiedlichen Eindringtiefen und Kräften kann dann das Elastizitäts-Modul (im englischen auch als Young's modulus bezeichnet) bestimmt werden. Dieses beschreibt bei linear-elastischem Verhalten den proportionalen Zusammenhang zwischen Spannung und Dehnung eines festen Körpers bei der Verformung.
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Mittels der Messeinheit M kann die auf eine aufgenommene Eizelle Ez ausgeübte Kraft in Bezug auf den zurückgelegten Weg in Kraftrichtung aufgenommen werden. Hierzu können unterschiedliche Messprinzipen Verwendung finden. Beispielhafte Messprinzipen sind z.B. Widerstandsmessstreifen oder optische Messungen (Verbiegung der Tasteinheit T) etc..
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Mittels einer Auswerteeinrichtung PC kann die Tasteinheit T so gesteuert werden, dass auf eine aufgenommene Eizelle Ez (progressiv) mehr Kraft während eines Messzyklus ausgeübt wird. Ebenso kann die Auswerteeinrichtung PC während des Messzyklus von der Messeinheit M zumindest zwei Messwerte auslesen.
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Wie aus den - ersichtlich ist, gehen die Kurven nach einer anfänglichen nichtlinearen Zuordnung in einen nahezu linearen Bereich über, in dem das Elastizitäts-Modul bestimmt werden kann. Die Bereitstellung von zwei Messungen kann daher der Absicherung dienen, dass der lineare Bereich erreicht ist, in diesem Fall sollten die ermittelten Elastizitäts-Module kaum voneinander abweichen. D.h. ist zuvor bekannt, ab welcher Eindringtiefe (für eine bestimmte Art von Eizelle Ez) der lineare Bereich zu erwarten ist, so kann es ausreichend sein, nur eine Messung vorzunehmen. Ohne Beschränkung der Allgemeinheit können aber auch bereits ab Beginn der Indentierung die Ergebnisse für einen Kurvenfit wie in 1c gezeigt, verwendet werden.
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Ohne Beschränkung der Allgemeinheit kann die Auswerteeinrichtung ein herkömmlicher PC mit entsprechenden Schnittstellen sein. Alternativ oder zusätzlich kann die Vorrichtung aber auch über einen eigenen Microprozessor und Speicher verfügen, um eigenständig die beschriebene Funktionalität zur Verfügung zustellen
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Im Betrieb kann eine Indentierung der aufgenommenen Eizelle Ez durch die Tasteinheit T erzeugt werden, wobei die aufgewendete Kraft mittels der Messeinheit M gemessen werden kann. Aus den erhaltenen Messwerten kann ein Elastizitäts-Modul bestimmt werden, der indikativ für den Reifegrad oder den Fortschritt der Zellteilung der Eizelle Ez ist.
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Weiterhin kann die Vorrichtung V eine Einheit zur atmosphärischen Steuerung aufweisen. Beispielsweise kann die Vorrichtung auch mit einem Gas, wie z.B. CO2-haltige Gasmischungen (z.B. vorzugsweise 5% CO2) überströmt sein, oder aber in einer geschlossenen Atmosphäre befindlich sein. Dies kann z.B. für bestimmte Langzeituntersuchungen vorteilhaft sein.
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In den humanen Fertilitätskliniken werden alle Eizellen einer Frau nach der Follikelpunktion mit Hilfe der Vorrichtung beurteilt. Mithilfe der Elastizitäts-Modul-Messungen werden bevorzugt die Eizellen/Embryonen bester Qualität (optimaler Reifungsprozess) ausgewählt. Somit kann der Befruchtungserfolg durch die Bestimmung der optimalen Befruchtungszeitpunkte, und dadurch das Entwicklungspotenzial des Embryos, erhöht werden. Die Chance auf eine erfolgreiche Schwangerschaft steigt und das Risiko weiterer erforderlicher Eingriffe sinkt.
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In der Tierzucht kann die Bestimmung der besten Eizell-/Embryoqualität zu einer Reduktion der zu verwendenden Tiere führen. Durch die Erhöhung der Befruchtungsrate eines einzelnen Tieres müssen insgesamt weniger weibliche Tiere zur Eizellgewinnung eingesetzt werden.
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Zum Schutz von bedrohten Tierarten muss die Befruchtung der Eizelle optimiert werden. Eizellen und Spermien stehen hier oft in nur reduzierter Quantität zur Verfügung. Mithilfe der Vorrichtung können die Eizellen/Embryonen bester Qualität bestimmt und damit der Erfolg einer erfolgreichen Schwangerschaft gesteigert werden.
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Neben der Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einem erfindungsgemäßen System zur Vorbereitung einer künstlichen Befruchtung kann die erfindungsgemäße Vorrichtung auch in einem System zur Charakterisierung von Kontrazeptiva Verwendung finden. Kontrazeptiva können dabei z.B. so wirken, dass die ZP durch Einwirkung von Stoffen so verändert wird, dass eine Befruchtung über vorbestimmte Zeiträume unmöglich wird. Um solche Stoffe auf Ihre Eignung überprüfen zu können, kann sowohl eine Eizelle in der Vorrichtung der Einwirkung eines solchen Stoffes ausgesetzt werden als auch die Wirksamkeit durch nachfolgendes Hinzufügen von Samenzellen ins Medium unmittelbar getestet werden.
