DE102020205364A1

DE102020205364A1 - Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation und Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist

Info

Publication number: DE102020205364A1
Application number: DE102020205364.2A
Authority: DE
Inventors: Robert David; Praveen Vasudevan; Markus Wolfien
Original assignee: Universitaet Rostock
Current assignee: Universitaet Rostock
Priority date: 2020-04-28
Filing date: 2020-04-28
Publication date: 2021-10-28
Anticipated expiration: 2040-04-29
Also published as: WO2021219604A1; DE102020205364B4

Abstract

Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation anhand der Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines spezifischen Biomarkers in einer Probe eines Probanden nach einer Kardiomyozyten-Transplantation in einem Schritt (i); und Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert in einem Schritt (ii).In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, umfassend: Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines spezifischen Biomarkers in einer Probe eines Probanden mit Myokard-Infarkt in einem Schritt (a); und Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert in einem Schritt (b).

Description

Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation anhand der Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines spezifischen Biomarkers in einer Probe eines Probanden nach einer Kardiomyozyten-Transplantation in einem Schritt (i); und Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert in einem Schritt (ii). In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, umfassend: Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines spezifischen Biomarkers in einer Probe eines Probanden mit Myokard-Infarkt in einem Schritt (a); und Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert in einem Schritt (b).
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der Welt. Myokardinfarkt (MI) aufgrund unzureichender Blutversorgung und Ischämie führt zu fortschreitenden Herzmuskelschäden und Herzumbau mit einem hohen Mortalitätsrisiko. Es gibt eine Vielzahl von Behandlungsmöglichkeiten umfassend pharmakologische Behandlungen, kleine Moleküle, die die endogene Regeneration stimulieren, Zelltransplantation und Immunmodulation zur Herztransplantation.
Bisher war die Verabreichung von Knochenmarkszellen und anderen Stammzellen an Patienten deren primärer Fokus. Der marginale Nutzen dieser Zelltransplantation wurde auf verschiedene Gründe zurückgeführt, ohne dass ein klarer Verbesserungsspielraum bestand, hauptsächlich aufgrund der Unklarheit über den Wirkungsmechanismus. Diese Probleme haben dazu geführt, dass die Zukunft der Stammzelltherapie als praktikable Behandlungsoption in Frage gestellt wurde. In diesem Zusammenhang ist allerdings zu beachten, dass die meisten der präklinischen Studien an immungeschwächten Tieren durchgeführt wurden, um das Überleben und das Anwachsen der transplantierten Zellen zu maximieren.
Ihre leichte Verfügbarkeit und die große Menge an zuvor veröffentlichter Literatur machen die Stammzelltransplantation allerdings zu einem potentiellen Kandidaten für eine präklinische und klinische Behandlungsstrategie für Myokardinfarkt. In den letzten Jahren ist eine neue Welle therapeutischer Strategien zur Behandlung von MI durch interventionelle Immuntherapie erschienen. Die verschiedenen Immunzellen sind für die Herzregeneration und den anschließenden Heilungsprozess nach MI von großer Bedeutung. Es wurde gezeigt, dass die Modulation der verschiedenen Zellmakrophagen-Subpopulationen nach MI zusammen mit einer kleineren Narbengröße zu einer verbesserten Herzfunktion beiträgt. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die Transplantation von syngenen mesenchymalen Stammzellen (MSC) auf den Übergang zu einer entzündungshemmenden Makrophagen-Untergruppe zurückgeführt werden kann und dass sie die T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen modulieren. Somit ist es zu erwarten, dass es eine klare Kommunikation zwischen der Immunantwort eines Probanden und den transplantierten Zellen gibt.
Die Zukunft der regenerativen Medizin und der Herzzelltherapie wird in der Erzeugung pluripotenter Kardiomyozyten aus Stammzellen als einer besseren Wahl des Zelltyps für die Transplantation gesehen. Es wurde gezeigt, dass diese Zellen erfolgreich transplantiert und infarkte Herzen regeneriert werden konnten. Die meisten präklinischen Studien an diesen Zellen wurden aufgrund des menschlichen Ursprungs dieser Zellen erneut an immungeschwächten Tieren durchgeführt. Es fehlen jedoch eindeutig Studien zur Wechselwirkung transplantierter Kardiomyozyten mit dem Entzündungsweg unter ischämischen Bedingungen. Der genaue Wirkungsmechanismus dieser transplantierten Zellen ist ebenfalls völlig unklar. Diese grundlegende Wissenslücke sollte zunächst aufgedeckt werden, um einen nachvollziehbaren Weg für die erfolgreiche Implementierung neuerer pluripotenter Stammzellbehandlungen in der Klinik zu finden.
Aufgabe der Erfindung war es daher, Marker bereitzustellen, anhand derer unter ischämischen Bedingungen der Verlauf einer Kardiomyozyten-Transplantation überwacht werden kann als auch solche Marker bereitzustellen, anhand derer bestimmt werden kann, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat.
Zur Lösung dieser Aufgabe wurde der Einfluss der intramyokardialen syngenen neonatalen Kardiomyozyten-Transplantation nach MI auf die Herzfunktion und die verschiedenen Immunsubpopulationen im Herzen untersucht. Kardiomyozyten von Neugeborenen wurden hierfür als Standardreferenzzelltyp verwendet, da kein Konsens darüber besteht, welches Differenzierungsprotokoll und Stadium der Zellen für die von induzierten pluripotenten Stammzellen (induced pluripoent stem cells, iPSC) abgeleitete Erzeugung und Transplantation optimal sind. Es wurde hierbei versucht, den Wirkungsmechanismus transplantierter Kardiomyozyten aufzuklären und die Eignung der Verwendung von immungeschwächten Tiermodellen zum Testen von Herzzelltherapien zu untersuchen, indem die Wirkung dieser Zellen nach MI sowohl in Wildtyp-C57BL6 / J- als auch in T-, B-Zellen defizienten Rag2^del-Mäusen mit einem intakten myeloiden Kompartiment untersucht werden.
1. Aspekt - Überwachung
Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß eines ersten Aspekts ein Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation umfassend:

i) Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NPAS2, Seq-ID Nr. 1, Seq-ID Nr. 2, ANGPTL7, Kcnd2, SLC41A3, MFGE8, Zbtb16, Seq-ID Nr. 3, Seq-ID Nr. 4, Seq-ID Nr. 5, Nkain2, CCL7, Seq-ID Nr. 6, MED13, Seq-ID Nr. 7, Seq-ID Nr. 8, Seq-ID Nr. 9, Cdh2, Seq-ID Nr. 10, Seq-ID Nr. 11, Seq-ID Nr. 12, Seq-ID Nr. 13, Seq-ID Nr. 14, Seq-ID Nr. 15, Seq-ID Nr. 16, Seq-ID Nr. 17, Seq-ID Nr. 18, Seq-ID Nr. 19, Seq-ID Nr. 20, Seq-ID Nr. 21, Seq-ID Nr. 22, Seq-ID Nr. 23, DHRSX, Seq-ID Nr. 24, PAMR1, Seq-ID Nr. 24a, Seq-ID Nr. 25, Seq-ID Nr. 26, und Seq-ID Nr. 27 in einer Probe eines Probanden nach einer Kardiomyozyten-Transplantation;
i) Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert.

Unter „Biomarker“ (synonym „Marker“) werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren, insbesondere cDNS und RNS, verstanden.
Für jede der unter i) genannten Nukleinsäuren ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verstehen, dass der Biomarker für jede dieser Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuresequenzen auch Varianten davon umfasst, welche zu mindestens 95%, bevorzugt zu mindestens 96%, weiter bevorzugt zu mindestens 97%, weiter bevorzugt zu mindestens 98%, weiter bevorzugt zu mindestens 99%, homolog zu der jeweiligen Sequenz sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist es bevorzugt, dass auch Fragmente der unter i) genannten Nukleinsäuren umfasst sind, wobei dies weiter bevorzugt Fragmente meint, die 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten Nukleinsäure umfassen, weiter bevorzugt Fragmente, die aus 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten Nukleinsäure bestehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich insbesondere bei mindestens einer der Nukleinsäuren der Seq-ID Nummern 1-10, 11-22, 24, 24a, 25, und 27 um eine sogenannte non-coding RNS' (ncRNS). Im Rahmen dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, dass für diese mindestens eine ncRNS der Seq-ID Nummern 1-10, 11-22, 24, 24a, 25, und 27 jeweils auch Fragmente umfasst sind, die 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten ncRNS umfassen, weiter bevorzugt Fragmente, die aus 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten ncRNS bestehen. Weiter bevorzugt sind 2 oder mehr, weiter bevorzugt alle der Nukleinsäuren der Seq-ID Nummern 1-10, 11-22, 24, 24a, 25, und 27 ncRNS, wobei weiter bevorzugt für jede dieser ncRNS das gleiche bzgl. der Fragmente gilt.
Marker zur Überwachung zeigen die für den Erfolg der Kardiomyozyten-Therapie wichtigen Prozesse auf und können zur Optimierung der Therapie weiter genutzt werden, indem diese Marker und die Prozesse, an denen sie beteiligt sind, aktiviert oder modifiziert werden. Marker zur Überwachung zeigen an, wie eine Kardiomyozyten-Therapie verläuft. Der Ausdruck „Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers‟ wie hier verwendet bezieht sich auf die Quantifizierung der Expressionsmenge mittels geeigneter Methoden. Wie die Expressionsmenge eines Biomarkers bestimmt wird, ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Lohmann et al. (S. Lohmann et al., Methods 59 (2013) 10-19). Bevorzugt wird der Erfolg Kardiomyozyten-Therapie bestimmt, indem ein weiterer Schritt iii) ausgeführt wird: iii) Beurteilung des Erfolgs der Kardiomyozyten-Therapie basierend auf den Resultat des Vergleichs gemäß (ii).
Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens ist die Probe eines Probanden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vollblut-Probe, Blutserum-Probe, Blutplasma-Probe und Gewebe- , insbesondere Herzgewebe-, Probe, wobei die Probe bevorzugt eine Vollblut-, Blutserum- oder Blutplasma-Probe, weiter bevorzugt eine Vollblut-Probe, ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist der mindestens eine Biomarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq-ID Nr. 11, Seq-ID Nr. 12, Seq-ID Nr. 13, Seq-ID Nr. 14, Seq-ID Nr. 15, Seq-ID Nr. 16, Seq-ID Nr. 17, Seq-ID Nr. 18, Seq-ID Nr. 19, Seq-ID Nr. 20, Seq-ID Nr. 21, Seq-ID Nr. 22, Seq-ID Nr. 23, DHRSX, Seq-ID Nr. 24, PAMR1, Seq-ID Nr. 24a, Seq-ID Nr. 25, Seq-ID Nr. 26 und Seq-ID Nr. 27. Diese Gruppe stellt die 20 Biomarker dar, die -wie im experimentellen Teil im Detail beschrieben- aus Blutproben ermittelt wurden.
Bevorzugt ist der mindestens eine Biomarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq-ID Nr. 21, Seq-ID Nr. 23 und PAMR1. Diese drei Marker wurden aus den 20 voranstehend genannten Markern (aus Blutproben) mittels einer sogenannten „Feature selection“, Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) ermittelt. Weiter bevorzugt ist der mindestens eine Biomarker Seq-ID Nr. 23 und/oder PAMR1. Seq-ID Nr. 23 bzw. PAMR1 sind Nukleinsäuren, die zwischen Mensch und Maus konserviert sind und sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden eignen.
In einer ergänzenden oder alternativen Ausführungsform des Verfahrens ist der mindestens eine Biomarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NPAS2, Seq-ID Nr. 1, Seq-ID Nr. 2, ANGPTL7, Kcnd2, SLC41A3, MFGE8, Zbtb16, Seq-ID Nr. 3, Seq-ID Nr. 4, Seq-ID Nr. 5 , Nkain2, CCL7, Seq-ID Nr. 6, MED13, Seq-ID Nr. 7, Seq-ID Nr. 8, Seq-ID Nr. 9, Cdh2 und Seq-ID Nr. 10. Diese Gruppe stellt die 20 Biomarker dar, die -wie im experimentellen Teil im Detail beschrieben- aus Gewebeproben ermittelt wurden. Bei dieser Ausführungsform des Verfahrens ist es bevorzugt, dass der mindestens eine Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kcnd2, MFGE8, CCL7 und Seq-ID Nr. 9. Diese vier Marker wurden aus den 20 voranstehend genannten Markern (aus Herzgewebe-Proben) mittels einer sogenannten „Feature selection“, Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) ermittelt. In dieser Ausführungsform des Verfahrens ist es bevorzugt, dass der mindestens eine Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kcnd2, MFGE8 und CCL7. Kcnd2, MFGE8 und CCL7 sind Nukleinsäuren, die zwischen Mensch und Maus konserviert sind und sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden eignen.
Bei jeder der voranstehend beschriebenen Ausführungsformen des Verfahrens ist es bevorzugt, dass der Referenzwert ein Wert ist, welcher anhand einer Probe des gleichen Probanden vor der Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wurde. Bevorzugt hat der Proband einen Myokard-Infarkt erlitten.
Die Kardiomyozyten-Transplantation erfolgt vorzugsweise in akuter Entzündungsphase nach einem Myokard-Infarkt, bevorzugt innerhalb der ersten sieben Tage nach einem Myokard-Infarkt. Ein Myokard-Infarkt kann festgestellt werden, wenn entweder die kardialen Troponin T (cTnT)-Werte oder die Creatine kinase MB isozyme (CK-MB)-Werte über der 99-Perzentilreferenzgrenze liegt, sowie Anstieg und /oder Abfall bei sequentieller Bestimmung und zusätzlich mindestens eine der folgende Kriterien erfüllt wird:

• Symptome der Myokardischämie
• Neue ischämische EKG-Veränderungen
• Entwicklung von pathologischen Q-Wellen
• Lokalisierte kinetische/hypokinetische/hypoperfundierte Myokardsfläche
• Identifizierung eines Koronarthrombus

„Nach einer Kardiomyozyten-Transplantation“ meint bevorzugt innerhalb des ersten Monats nach der Transplantation, weiter bevorzugt innerhalb der ersten 14 Tage nach Transplantation. Die für die Transplantation eingesetzten Kardiomyozyten sind bevorzugt aus pluripotenten Stammzellen erhalten. Die Gewinnung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen ist dem Fachmann bekannt, beispielhaft zu nennen sind hier WO 2015/061568 A1 , US 9,663,764 B2 , WO 2014/078414 A1 , US 8,415,155 B2 .
In einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens ist der Referenzwert ein vorbekannter Wert, welcher bevorzugt für mindestens einen anderen Probanden vor einer Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wurde, wobei für diesen mindestens einen anderen Probanden nach der Kardiomyozyten-Transplantation deren erfolgreicher Verlauf festgestellt wurde.
Dem Fachmann ist bekannt, wie ein erfolgreicher Verlauf einer Kardiomyozyten-Transplantation, beispielsweise mittels einer Methode ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Microarray, RT-qPCR, und RNS Sequenzierung, bestimmt wird; beispielhaft wird hierauf EP 3 105 350 A2 verwiesen.
In einer Ausführungsform des Verfahrens wird bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Änderung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MFGE8, Kcnd2 und CCL7 um mindestens 0,01, bevorzugt um mindestens 0,1, weiter bevorzugt um mindestens 0,2, ein positiver Verlauf der Kardiomyozyten-Transplantation festgestellt. Wie oben erwähnt sind MFGE8, Kcnd2 und CCL7 Nukleinsäuren, die zwischen Mensch und Maus konserviert sind und sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden eignen; diese Marker werden bevorzugt aus Herzgewebe-Proben bestimmt.
In einer ergänzenden oder alternativen Ausführungsform des Verfahrens wird bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Vervielfachung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mir3098 (human Seq-ID Nr. 23 und PAMR1 um weniger als 0,2, bevorzug von weniger als 0,1, weiter bevorzugt von ≤0,01, ein positiver Verlauf der Kardiomyozyten-Transplantation festgestellt. Wie oben erwähnt sind Mir3098 (human: SEQ ID Nr. 23) und Pamr1 (human: PAMR1) Nukleinsäuren, die zwischen Mensch und Maus konserviert sind und sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden eignen; diese Marker werden bevorzugt aus Blutproben bestimmt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Vervielfachung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gm25732 (human:SEQ ID Nr. 1), Gm24643 (human: SEQ ID Nr. 9), Mfge8 (human: MFGE8), TC0600000166 (human: Kcnd2) und Ccl7 (human: CCL7) um mindestens 0,01, bevorzugt um mindestens 0,1, weiter bevorzugt um mindestens 0,2;
und/oder, bevorzugt und,
bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Vervielfachung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 23 und PAMR1 um weniger als 0,2, bevorzugt von weniger als 0,1, weiter bevorzugt von ≤0,01,
ein positiver Verlauf der Kardiomyozyten-Transplantation festgestellt.
Das Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation ist bevorzugt ein ex vivo oder in vitro Verfahren, weiter bevorzugt ein in vitro Verfahren. Weiterhin ist es für das Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation bevorzugt, dass der Proband ein Säugetier, bevorzugt ein Mensch oder eine Maus, ist. In einer Ausführungsform ist der Proband bevorzugt ein Mensch, in einer alternativen Ausführungsform ist der Proband bevorzugt eine Maus. Als Maus wird bevorzugt Musmusculus verstanden. Dies gilt ebenso für den anderen Probanden.
Das Verfahren kann einen oder mehrere weitere Schritte, ergänzend zu den oben genannten, umfassten. Beispielsweise können Vorbehandlungsschritte oder eine Evaluierung der erhaltenen Ergebnisse umfasst sein. Das Verfahren kann manuell oder Geräte-assistiert durchgeführt werden. Vorzugsweise werden (i), (ii) und/oder (iii) vollständig oder teilweise Geräte-assistiert durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung einer geeigneten automatisierten bzw. sensorischen Ausrüstung für (i) und/oder einem computer-implementierten Vergleich in (ii) bzw. (iii).
2. Aspekt - Diagnose, Prädiktion
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, umfassend:

a) Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IVNS1ABP, Seq-ID Nr. 28, Seq-ID Nr. 29, Seq-ID Nr. 30, Seq-ID Nr. 31, Seq-ID Nr. 32, Seq-ID Nr. 33, PINK1, Seq-ID Nr. 34, VDAC1P5, IFI30, ATP1B3, Seq-ID Nr. 35, GRN, LGALS9, IFI27, Seq-ID Nr. 36, Zfp97, Pik3ap1, Seq-ID Nr. 38, Seq-ID Nr. 39, SNORA79, Seq-ID Nr. 40, Seq-ID Nr. 41, SNORD35B, Seq-ID Nr. 42, ATP1B3, Seq-ID Nr. 42, Seq-ID Nr. 44, Seq-ID Nr. 45, SERP1, SLC46A3, RABGAP 1L, Seq-ID Nr. 46, Seq-ID Nr. 47, Seq-ID Nr. 48, MT-TH, Seq-ID Nr. 49, Seq-ID Nr. 50 und Seq-ID Nr. 51 in einer Probe eines Probanden mit Myokard-Infarkt;
b) Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert.

„Biomarker“ (synonym „Marker“) sind auch hier Nukleinsäuren, insbesondere cDNS und RNS.
Für jede der unter a) genannten Nukleinsäuren ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verstehen, dass der Biomarker für jede dieser Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuresequenzen auch Varianten davon umfasst, welche zu mindestens 95%, bevorzugt zu mindestens 96%, weiter bevorzugt zu mindestens 97%, weiter bevorzugt zu mindestens 98%, weiter bevorzugt zu mindestens 99%, homolog zu der jeweiligen Sequenz sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist es bevorzugt, dass auch Fragmente der unter a) genannten Nukleinsäuren umfasst sind, wobei dies weiter bevorzugt Fragmente meint, die 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten Nukleinsäure umfassen, weiter bevorzugt Fragmente, die aus 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten Nukleinsäure bestehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich insbesondere bei mindestens einer der Nukleinsäuren der Seq-ID Nummern 28, 29, 31-38, 39-43 und 45-51 um eine sogenannte non-coding RNS' (ncRNS). Im Rahmen dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, dass für diese mindestens eine ncRNS der Seq-ID Nummern 28, 29, 31-38, 39-43 und 45-51 jeweils auch Fragmente umfass sind, die 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten ncRNS umfassen, weiter bevorzugt Fragmente, die aus 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten ncRNS bestehen. Weiter bevorzugt sind 2 oder mehr, weiter bevorzugt alle der Nukleinsäuren der Seq-ID Nummern 28, 29, 31-38, 39-43 und 45-51 ncRNS, wobei weiter bevorzugt für jede dieser ncRNS das gleiche bzgl. der Fragmente gilt.
Marker für die Diagnostik bzw. Prädiktion sagen voraus, ob ein Proband geeignet ist bzw. wie wahrscheinlich er eine Verbesserung durch die Kardiomyozytentherapie zeigen wird. Der Ausdruck „Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers‟ wie hier verwendet bezieht sich auf die Quantifizierung der Expressionsmenge mittels geeigneter Methoden. Wie die Expressionsmenge eines Biomarkers bestimmt wird, ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Lohmann et al. (S. Lohmann et al., Methods 59 (2013) 10-19).
Bevorzugt wird die Eignung bzw. Wahrscheinlichkeit einer Verbesserung vorhergesagt, indem ein weiterer Schritt c) ausgeführt wird: c) Vorhersage der Eignung bzw. Wahrscheinlichkeit einer Verbesserung basierend auf den Resultat des Vergleichs gemäß (b).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Methode ist Probe eines Probanden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vollblut-Probe, Blutserum-Probe, Blutplasma-Probe und Gewebe-, insbesondere Herzgewebe-, Probe, wobei die Probe bevorzugt eine Vollblut-, Blutserum- oder Blutplasma-Probe, weiter bevorzugt eine Vollblut-Probe, ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Methode ist der Referenzwert ein vorbekannter Wert ist, welcher bevorzugt für mindestens einen anderen Probanden vor einer Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wurde, wobei für diesen mindestens einen anderen Probanden nach der Kardiomyozyten-Transplantation deren erfolgreicher Verlauf festgestellt wurde. Dem Fachmann ist es, wie oben zum ersten Aspekt beschrieben, bekannt, wie ein erfolgreicher Verlauf einer Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Methode ist der mindestens eine Biomarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IVNS1ABP, Seq-ID Nr. 28, Seq-ID Nr. 29, Seq-ID Nr. 30, Seq-ID Nr. 31, Seq-ID Nr. 32, Seq-ID Nr. 33, PINK1, Seq-ID Nr. 34, VDAC1P5, IF130, ATP1B3, Seq-ID Nr. 35, GRN, LGALS9, IFI27, Seq-ID Nr. 36, Zfp97, Pik3ap1, und Seq-ID Nr. 38. Diese Gruppe stellt die 20 diagnostischen bzw. prädiktiven Biomarker dar, die -wie im experimentellen Teil im Detail beschrieben- aus Herzgewebe-Proben ermittelt wurden. In dieser Ausführungsform der Methode ist es bevorzugt, dass der mindestens eine Biomarker IVNS1ABP und/oder Seq-ID Nr. 28 ist, bevorzugt IVNS1ABP. Diese zwei diagnostischen bzw. prädiktiven Marker IVNS1ABP und/oder Seq-ID Nr. 28 wurden aus den 20 voranstehend genannten Markern (aus Herzgewebe-Proben) mittels einer sogenannten „Feature selection“, Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) ermittelt. IVNS1ABP ist eine Nukleinsäure, die zwischen Mensch und Maus konserviert ist und sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden eignet.
In einer ergänzenden oder alternativen Ausführungsform der Methode ist es bevorzugt, dass der mindestens eine Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Seq-ID Nr. 39, SNORA79, Seq-ID Nr. 40, Seq-ID Nr. 41, SNORD35B, Seq-ID Nr. 42, ATP1B3, Seq-ID Nr. 42, Seq-ID Nr. 44, Seq-ID Nr. 45, SERP1, SLC46A3, RABGAP1L, Seq-ID Nr. 46, Seq-ID Nr. 47, Seq-ID Nr. 48, MT-TH, Seq-ID Nr. 49, Seq-ID Nr. 50 und Seq-ID Nr. 51. Diese Gruppe stellt die 20 diagnostischen bzw. prädiktiven Biomarker dar, die -wie im experimentellen Teil im Detail beschrieben- aus Blutproben ermittelt wurden. In dieser Ausführungsform der Methode ist es bevorzugt, dass der mindestens eine Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SNORD35B, ATP1B3, Seq-ID Nr. 44, MT-TH, und Seq-ID Nr. 49. Diese fünf diagnostischen bzw. prädiktiven Marker wurden aus den 20 voranstehend genannten Markern (aus Blutproben) mittels einer sogenannten „Feature selection“, Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) ermittelt. Bevorzugt ist der mindestens eine Biomarker aus der Gruppe bestehend aus SNORD35B, ATP1B3, Seq-ID Nr. 44 und MT-TH, ausgewählt. Diese vier Nukleinsäuren sind zwischen Mensch und Maus konserviert und eignen sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden.
Bevorzugt wird bei der Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (b) bestimmten Änderung der Expression mindestens eines Biomarkers um mindestens 0,01, bevorzugt um mindestens 0,1, der Proband als geeignet für eine Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wird.
Die Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, ist bevorzugt eine ex vivo oder in vitro Methode, weiter bevorzugt eine in vitro Methode. Der Proband ist bevorzugt ein Säugetier, weiter bevorzugt ein Mensch oder eine Maus. In einer Ausführungsform ist der Proband bevorzugt ein Mensch, in einer alternativen Ausführungsform ist der Proband bevorzugt eine Maus. Als Maus wird bevorzugt Mus musculus verstanden. Gleiches gilt für den anderen Probanden.
Die Methode kann einen oder mehrere weitere Schritte, ergänzend zu den oben genannten, umfassten. Beispielsweise können Vorbehandlungsschritte oder eine Evaluierung der erhaltenen Ergebnisse umfasst sein. Die Methode kann manuell oder Geräte-assistiert durchgeführt werden. Vorzugsweise werden (a), (b) und/oder (c) vollständig oder teilweise Geräte-assistiert durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung einer geeigneten robotischen bzw. sensorischen Ausrüstung für (a) und/oder einem computer-implementierten Vergleich in (b) bzw. (c).
Die Erfindung wird nachfolgend weiter anhand der durchgeführten Untersuchungen beschrieben, ohne sie hierauf zu beschränken.
Experimenteller Teil
1 Methoden
1.1 Verwendete Mausstämme
Für die Studie wurden 8-12 Wochen alte C57BL / 6J-Mäuse (= „Black 6“ i.e.BL6, Charles River, Deutschland) und B6.RAG2^delMäuse (= RAG2^del, Jackson-Labor, USA) verwendet, die vor der Verwendung unter pathogen-freien Bedingungen mit Nahrung und Wasser ad libitum gehalten wurden. Alle Tierversuche wurden vom örtlichen Tierschutzausschuss des Landesamtes für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (LALLF) genehmigt (Zulassungsnummer. LALLF M-V / TSD / 7221.3-1-015 / 15).
1.2 Neugeborenen-Kardiomyozyten-Isolierung (neonatale GFP-Kardiomyozyten)
Ventrikel wurden aus transgenen B6.eGFP-Mäusen von Neugeborenen entnommen, zerkleinert und Einzelzellsuspensionen unter Verwendung des primären Kardiomyozyten-Isolierungskits von Pierce (Thermo Fisher Scientific, USA) hergestellt. 1(kons.)10⁶ Zellen dieser neonatalen GFP-Kardiomyozyten wurden dann in 20 µl Matrigel zur Injektion suspendiert.
1.3 Chirurgische Prozedur - Induzierung Myokardinfarkt und Kardiomyozyten-Transplantation
Die Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Verabreichung von Pentobarbital (50 mg / kg Körpergewicht) und einer subkutanen Verabreichung von Fentanyl (2 ug / kg Körpergewicht) anästhesiert. Sie wurden intubiert und der Brustkorb geöffnet. Nach der Thorakotomie wurde ein permanenter Myokardinfarkt durch Ligation der linken anterioren absteigenden Koronararterie (LAD) induziert. Die Naht wurde in der Sham-Gruppe ohne Ligation im Herzen belassen. Drei Tage nach der anfänglichen Thorakotomie wurden entweder 1 ×10⁶ neonatale GFP-Kardiomyozyten suspendiert in 20 µl Matrigel (Corning, Berlin, Deutschland) (MIC und MIC + I) oder nur Matrigel (Sham und MI) in vier getrennten Injektionen intramyokardial um die Peri-Infarkt-Grenzzone injiziert. Nach diesen Eingriffen wurde der Brustkorb geschlossen und die Haut mit einer resorbierbaren Naht vernäht. Vetalgin (Metamizol) wurde als Analgetikum verabreicht, indem es in das Trinkwasser eingemischt wurde. In der MIC + I-Gruppe wurde die Hemmung der Infiltration von Monozyten in das Herz mit der oralen Verabreichung eines CCR2-Inhibitors (RS504393; Sigma-Aldrich, USA) zweimal täglich (2 mg / kg Körpergewicht) für fünf Tage nach MI durchgeführt („MI“: Myokard-Infarkt induziert; „C“: Kardiomyozyten transplantiert; „I“: Inhibitor verabreicht).
1.4 Experimentelle Anordnung des Microarray's
Die RNS-Integrität wurde unter Verwendung des Agilent Bioanalyzer 2100 mit dem RNS-Pico-Chip-Kit (Agilent Technologies, USA) bewertet. Für die Microarray-Analyse wurden 200 ng isolierte RNS-Proben aufgetragen und die Hybridisierung wie zuvor beschrieben durchgeführt¹. Die Hybridisierung wurde auf Affymetrix Clariom™ D-Arrays gemäß den Anweisungen des Herstellers (Thermo Fisher Scientific, USA) durchgeführt.
1.5 Microarray Datenanalyse
Die Microarray-Datenanalyse wurde mit der bereitgestellten Transcriptome Analysis Console Software von Thermo Fischer Scientific (Version 4.0.1) durchgeführt. Die Analyse umfasste Qualitätskontrolle, Datennormalisierung und statistische Tests auf differentielle Expression mit Hilfe des Limma Paketes². Die Transkripte werden als signifikant unterschiedlich exprimiert eingestuft sofern eine zweifach höhere oder niedrigere Änderung des „Fold-Change“ (FC), eine „False-Discovery-Rate“ (FDR) kleiner als 0,5 sowie ein p-Wert kleiner als 0,05 vorliegen.
1.6 Anwendung maschinellen Lernens zur Identifizierung von Biomarkern
Die Identifizierung der Biomarker und die Klassifizierung der vorliegenden Daten wurden mithilfe von überwachten und nicht-überwachten Algorithmen für maschinelles Lernen (machine learning, ML) erzielt ³. Die Daten wurden vorverarbeitet indem Biomarker mit geringer Veränderung zwischen den Gruppen entfernt wurden, um die Dimensionalität gemäß den Empfehlungen für bewährte ML Analyseverfahren zu reduzieren. Die folgenden überwachten Algorithmen wurden mit den spezifischen Daten verglichen: Lasso, AdaBoost, Support Vector Machines (SVM) und Random Forest (RF) ⁴. Kleine Datensätze sind häufig anfällig für Überanpassungen, deshalb wurden Klassifikatoren verwendet, die für das Training mit kleinen Datensätzen geeignet sind, um Merkmale zu vergleichen, für die nur wenig Training erforderlich ist, und der jeweils am besten geeignete Algorithmus bzw. eine Kombination von Algorithmen wurde entsprechend der Genauigkeit und Robustheit gegen Überanpassung ausgewählt ⁵. Überwachte ML-Modelle wurden zehnfach kreuzvalidiert und durch sogenannte „Receiver Operating Characteristic“ (ROC) Kurven für binäre Klassifizierungen verglichen. „Principal Component Analysis“ (PCA), „t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding“ (t-SNE) und „Uniform Manifold Approximation and Projection“ (UMAP) wurden zur nicht-überwachten ML-Klassifizierung und nicht linearen Dimensionsreduktion verwendet^6,7
2 Ergebnisse - Identifikation von Biomarkern, die als potenzielle Marker für die Überwachung der Herzzelltherapie verwendet werden können
Ein auf Maschinellem Lernen (ML) basierender Ansatz zur Merkmalsauswahl wurde angewendet, um die Wichtigkeit der identifizierten signifikant unterschiedlich exprimierten Biomarker unabhängig zu bewerten⁸. Das resultierende ML-Modell wurde kreuzvalidiert und erhielt eine sehr gute Prognoseleistung von 91,6% AUC („AUC“ = Fläche unter der Kurve, englisch: Area Under the Curve).
Um die identifizierten Biomarker zu verstehen, die für die Zelltransplantation wichtig sind und um den möglichen zugrunde liegenden Mechanismus zu verstehen, wurden die mit Zellen behandelten Mäuse mit den unbehandelten Mäusen verglichen und eine hohe Korrelation der jeweiligen Genexpression mit der Zelltransplantation festgestellt, was auf 20 Transkripte (Biomarker) hindeutete als wichtige Faktoren für den Wirkmechanismus von transplantierten Kardiomyozyten, die nachfolgend in Tabelle 1 gelistet sind. Es war ersichtlich, dass der Algorithmus nicht gegen die Mausstämme voreingenommen war, so dass keines dieser Transkripte signifikant mit den Unterschieden zwischen den Mauslinien korrelierte (BL6 und RAG2^del).
Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (MI) aus Herzgewebe bestimmten Vielfachen des Expressionswerts sind für den jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle 1 zusammengefasst. Die einzelnen Mittelwerte sind aus jeweils drei entsprechenden Messungen gemittelt. Die Werte der Rag2^del Mäuse stellen dabei den Vergleich dar, bei welchem keine Verbesserung der Herzfunktion auf die Transplantation zu verzeichnen war. Der Vergleich innerhalb der jeweiligen Mausgruppe (BL6 MI, MIC bzw. RAG2^delMI, MIC) bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar.
Im Herzen schlossen die 20 Biomarker dies die Beteiligung von Npas2, Med13 als Transkriptionsfaktoren ein; Slc41a3 als mitochondrialer Mg²⁺-Transporter zusammen mit CCL7, auch bekannt als MCP-3 als Chemokin für die Makrophageninfiltration und andere ncRNSs als wichtige Ziele. Die meisten dieser Ziele unterschieden sich auch nach der Transplantation von Kardiomyozyten nur in den C57BL / 6J-Mäusen signifikant, was möglicherweise ihre überlegene Wirksamkeit bei der Funktionsverbesserung im Vergleich zu Rag2^del-Mäusen erklärt. Nur drei Transkripte (Mfge8, Angptl7 und ncRNS: TC0900002242) korrelieren positiv mit der Kardiomyozyten-Transplantation, während die anderen 17 Ziele negativ korrelieren. Mit der Kombination der Transkripte Mfge8, CCL7, der Vorläufer-miRNS (Gm24643) und der ncRNS (TC0600000166) konnte mit einer Genauigkeit von 92,4% (AUC 91,6%) vorhergesagt werden, dass die Transplantation von Kardiomyozyten durch ihre Wirkung beeinflusst auf diese Ziele im Herzen wurde. Interessant waren auch die relativen Expressionswerte dieser Transkripte. Gm24643 wies nur eine gering vorhergesagte Konservierungsrate und keine mir-ähnlichen Haarnadelregionen auf, lag jedoch interessanterweise in der Nähe der vorhergesagten Bindungsstellen von Stat1, Gata1, Foxi1 und Foxd3. Die ncRNS (TC0600000166) bezog sich jedoch auf das KCND2-Transkript (Potassium Voltage Gated Channel Subfamily, D-Mitglied 2) beim Menschen, einschließlich vieler vorhergesagter mir-ähnlicher Haarnadelstrukturen.
Im Blut identifizierte die Analyse einen anderen Satz von 20 Biomarkern, von denen die Mehrheit ncRNSn waren. Die 20 identifizierten Biomarker sind nachfolgend in Tabelle 2 aufgelistet. Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (MI) aus Blut bestimmten Vielfachen des Expressionswerts sind für den jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle 2 dargestellt. Die einzelnen Mittelwerte sind aus jeweils drei entsprechenden Messungen gemittelt. Die Werte der Rag2^del Mäuse stellen dabei den Vergleich da, bei welchem keine Verbesserung der Herzfunktion auf die Transplantation zu verzeichnen war. Der Vergleich innerhalb der jeweiligen Mausgruppe (BL6 MI, MIC bzw. RAG2^delMI, MIC) bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar.
Dies eröffnete einen neuen Weg, wie eine lokale Behandlung im Herzen eine globale Reaktion im Blut und den Zusammenhang zwischen den verschiedenen Prozessen zwischen Herz und Blut hervorruft. Mit der Kombination von Pamr1, Mir3098 und dem Vorläufer der reifen miRNS (Gm25732) konnte der Wirkungsmechanismus transplantierter Kardiomyozyten im Blut durch ihre Wirkung auf diese Targets mit einer Genauigkeit von 90,2% ausreichend vorhergesagt werden (AUC 91,6%). Mir3098 enthält eine 5p- (MIMAT0014917) und eine 3p-(MIMAT0014918) Region sowie eine Mir-artige Haarnadelstruktur, die gut konserviert ist. Potentiell vorhergesagte Transkriptionsfaktorbindungsstellen in der Nähe der miRNS umfassten wiederum Foxd3 und Foxi1. Die Vorläufer-miRNS (Gm25732) hatte keine spezifischen Treffer in Bezug auf Haarnadelstruktur oder -konservierung, aber laut Blastn-Anteilen ebenfalls eine Sequenzhomologie von 91% mit MAPK1 (Mitogen-aktivierte Proteinkinase 1) und 91% mit SPEG (gestreifte muskelangereicherte Proteinkinase).

Aus den für Herzgewebe-Proben ermittelten 20 Biomarkern wurden durch einen sog. „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv Marker anhand ihres Informationsgehaltes zur Klassifikation der Gruppen gewichtet und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählt.
Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (MI) aus Herzgewebe bestimmten Vielfachen des Expressionswerts sind für die mittels „Feature selection“ ermittelten jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3

Biomarker im Herzgewebe - Überwachung
Gen Symbol (Maus) bzw. ID-Nummer	Gen Symbol (human) oder Seq-ID Nr.	BL6MIC vs BL6MI Vielfachen des Expressionswerts (Fold Change)	RAG2^delMIC vs RAG2^delMI Vielfachen des Expressionswerts (Fold Change)	Relevantes Vielfaches
TC0600000166	Kcnd2	-1,67	-2,00	0,33
Mfge8	MFGE8	1,32	2,08	0,76
Ccl7	CCL7	-1,72	-2,50	0,78
Gm24643	Seq-ID Nr. 9	-1,59	-1,39	0,20

Fett formatiert: zwischen Mensch und Maus konserviert

Die humanen Analoga von Gm24643, Mfge8, TC0600000166 und Ccl7 bzw. deren Kombination sind somit bevorzugte Biomarker für die Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation nach Myokard-Infarkt, insbesondere wenn Herzgewebe-Proben (eines Probanden, bevorzugt in vitro, untersucht werden). Da insbesondere Mfge8, TC0600000166, Ccl7 im Vergleich zum Menschen konservierte RNS sind, ist insbesondere diese Gruppe, einzelne dieser Marker und Kombinationen von zwei oder mehr, für die Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation nach Myokard-Infarkt im Menschen einsetzbar.
Aus den für Blut-Proben ermittelten 20 Biomarkern wurden durch einen sog. „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv Marker anhand ihres Informationsgehaltes zur Klassifikation der Gruppen gewichtet und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählt.

Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (MI) aus Blut bestimmten Vielfachen des Expressionswerts sind für die mittels „Feature selection“ ermittelten jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4

Biomarker im Blut - Überwachung
Gen Symbol (Maus)	Gen Symbol (human) oder Seq-ID Nr.	BL6MIC vs BL6MI Vielfachen des Expressionswerts (Fold Change)	RAG2^delMIC vs RAG2^delMI Vielfachen des Expressionswerts (Fold Change)	Relevantes Vielfaches
Gm25732	Seq-ID Nr. 21	4,64	1,08	3,56
Mir3098	Seq-ID Nr. 23	4,5	4,33	0,17
Pamr1	PAMR1	-1,11	-1,1	0,01

Fett formatiert: zwischen Mensch und Maus konserviert

Die humanen Analoga von Gm25732, Mir3098 und Pamr1 bzw. deren Kombinationen sind somit bevorzugte Biomarker für die Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation nach Myokard-Infarkt, insbesondere wenn Blut-Proben (eines Probanden, bevorzugt in vitro, untersucht werden). Da nur Mir3098 und Pamr1 im Vergleich zum Menschen konserviert sind, sind insbesondere einer oder mehrere dieser Biomarker für die Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation nach Myokard-Infarkt im Menschen einsetzbar.
3 Ergebnisse - Identifikation von Biomarkern, die als potenzielle diagnostische bzw. prädiktive Marker für die Vorhersage der Erfolgsaussichten einer Herzzelltherapie verwendet werden können bzw. für die Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist
Um die Biomarker zu verstehen, die für die Erklärung der beobachteten Unterschiede zwischen C57BL / 6J- und Rag2^del-Mäusen unter ischämischen Bedingungen und bei der Transplantation von Kardiomyozyten wichtig sind, wurden die C57BL / 6J-Mäuse mit den Rag2^del-Mäusen unabhängig von ihrem Behandlungsstatus (mit induziertem Myokardinfarkt (MI) oder mit induziertem Myokardinfarkt und transplantierten Kardiomyozyten (MIC) verglichen. Diese könnten als potenzielle diagnostische Marker zur Messung des nachteiligen Umbaus des Herzens und der Wirksamkeit der Kardiomyozyten-Transplantation und damit zur Schichtung der für Zelltransplantationsstudien geeigneten Patienten verwendet werden, da die Mausmodelle deutlich unterschiedliche funktionelle Ergebnisse aufweisen. Jeweils 20 Biomarker wurden in Herzgewebe und in Blut identifiziert und sind nachfolgend in Tabelle 5 und Tabelle 6 gelistet, deren Expression mit den Unterschieden zwischen den Mäusen C57BL / 6J und Rag2^del korrelierte - diese Ziele wurden als mögliche Ursachen für Variationen zwischen diesen Mausmodellen festgestellt. Es war ersichtlich, dass keines dieser Merkmale mit den Unterschieden korrelierte, die allein aufgrund einer Kardiomyozyten-Transplantation (Zellen) beobachtet wurden.
Im Herzgewebe umfassten die 20 Biomarker eine Zusammenführung von Transkripten, die an Prozessen beteiligt sind, die von Apoptoseregelung (Pink1, Ivnslabp und Ifi27), Antigenverarbeitung (Ifi30), mitochondrialen lonenkanälen (Vdac3) und Transkriptionsregulation (Zfp97) reichen. ATPase-Aktivität (Atp1b3), Immunzellaktivierung sowie Regulation (Lgals9, Pik3ap1, Ighv7-1) und lysosomale Funktion (Grn) zusammen mit anderen nichtkodierenden RNSRNSn.
Im Blut wurden verschiedene kleine RNSn und nicht-kodierende RNSn identifiziert, die als wertvolle diagnostische Marker dienen könnten. Interessanterweise ist Atp1b3 auch ein Marker im Blut. Abgesehen davon sind Slc46a3, das am Transmembrantransport beteiligt ist, und Serp1, das an der ER-Translokation beteiligt ist, wichtige Indikatoren im Blut. Zwei weitere vielversprechende Ziele, die im Blut identifiziert wurden, sind Snord35b (kleine nukleolare RNS) und mt-Th (mitochondriale tRNS).
Aus den für Herzgewebe-Proben ermittelten 20 Biomarkern wurden durch einen sog. „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv Marker anhand ihres Informationsgehaltes zur Klassifikation der Gruppen gewichtet und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählt.
Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (MI) aus Herzgewebe bestimmten Vielfachen des Expressionswerts sind für den jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle 7 zusammengefasst. Die einzelnen Mittelwerte sind aus jeweils drei entsprechenden Messungen gemittelt. Die Werte der Rag2^del Mäuse stellen dabei den Vergleich da, bei welchem keine Verbesserung der Herzfunktion auf die Transplantation zu verzeichnen war. Der Vergleich RAG2del MI vs. BL6MI stellt die Unterschiede in der Expression dieser Marker dar, um die Probanden (vor der Transplantation) zu identifizieren, die wahrscheinlich nicht positiv auf die Transplantation reagieren werden; der Vergleich bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar. Der Vergleich RAG2^del MIC vs. BL6MIC stellt die Unterschiede in der Expression dieser Marker dar, um festzustellen, ob die Probanden positiv oder negativ auf die Kardiomyozytentransplantation reagieren; der Vergleich bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar.
Die „Feature selection“ auf Basis der 20 Biomarker aus dem Herzgewebe ergab die Kombination von Ivns1abp und Vorläufer-miRNS (Gm25035), welche als diagnostischer Marker identifiziert werden konnte, anhand dessen das Ergebnis einer Kardiomyozyten-Transplantation im Herzen mit einer Genauigkeit von 93,7% (AUC 91,9%) vorhersagbar ist.
Aus den für Blut-Proben ermittelten 20 Biomarkern wurden ebenfalls durch einen sog. „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv Marker anhand ihres Informationsgehaltes zur Klassifikation der Gruppen gewichtet und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählt.
Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (MI) aus Blut bestimmten Vielfachen des Expressionswerts sind für den jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle 8 zusammengefasst. Die einzelnen Mittelwerte sind aus jeweils drei entsprechenden Messungen gemittelt. Die Werte der Rag2^del Mäuse stellen dabei den Vergleich da, bei welchem keine Verbesserung der Herzfunktion auf die Transplantation zu verzeichnen war. Der Vergleich RAG2del MI vs. BL6MI stellt die Unterschiede in der Expression dieser Marker dar, um die Probanden (vor der Transplantation) zu identifizieren, die wahrscheinlich nicht positiv auf die Transplantation reagieren werden; der Vergleich bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar. Der Vergleich RAG2del MIC vs. BL6MIC stellt die Unterschiede in der Expression dieser Marker dar, um festzustellen, ob die Probanden positiv oder negativ auf die Kardiomyozytentransplantation reagieren; der Vergleich bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar.

Die „Feature selection“ auf Basis der 20 Biomarker aus Blut ergab die Kombination von Mir3471-2, Atp1b3, Snord35b, mt-Th und nicht-kodierende RNS (LOC100861878), welche als diagnostischer Marker identifiziert werden konnte, anhand dessen das Ergebnis einer Kardiomyozyten-Transplantation im Herzen mit einer Genauigkeit von 86,6 % (AUC 70,7%) vorhersagbar ist.

Tabelle 7

Biomarker aus Herzgewebe - Prädiktion
Gen-Symbol (Maus)	Gen Symbol (human) oder Seq-ID Nr.	RAG2^delMI vs BL6MI Vielfachen des Expressionswerts (Fold Change)	RAG2^delMIC vs BL6MIC Vielfachen des Expressionswerts (Fold Change)	Relevantes Vielfache
Ivns1abp	IVNS1ABP	-1,12	-1,25	0,13
Gm25035	Seq-ID Nr. 28	1,17	1,37	0,20

Fett formatiert: zwischen Mensch und Maus konservierte Marker Tabelle 8

Biomarker aus Blut - Prädiktion
Gen-Symbol (Maus)	Gen Symbol (human) oder Seq-ID Nr.	RAG2^delMI vs BL6MI Vielfachen des Expressionswerts (Fold Change)	RAG2^delMIC vs BL6MIC Vielfachen des Expressionswerts (Fold Change)	Relevantes Vielfache
Snord35b	SNORD35B	-1,58	-4,08	2,5
Atp1 b3	ATP1B3	-2,21	-5,44	3,23
Mir3471-2	Seq-ID Nr. 44	1,04	-7,34	6,3
mt-Th	MT-TH	1,67	-1,44	3,11
LOC100861878	Seq-ID Nr. 49	1,08	1,22	0,14

Fett formatiert: zwischen Mensch und Maus konservierte Marker

Zitierte Literatur

WO 2015/061568 A1
US 9,663,764 B2
WO 2014/078414 A1
US 8,415,155 B2
EP 3 105 350 A2

S. Lohmann et al., Methods 59 (2013) 10-19

1. Koczan D, Fitzner B, Zettl UK, Hecker M. Microarray data of transcriptome shifts in blood cell subsets during S1P receptor modulator therapy. Sci Data 2018;5:180145.
2. Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, Smyth GK. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res 2015;43:e47-e47.
3. Kuhn M. Building Predictive Models in R Using the caret Package. J Stat Softw2008;28.
4. Forman G, Cohen I. Learning from Little: Comparison of Classifiers Given Little Training. 2004. p. 161-172.
5. Saeb ATM, Al-Naqeb D. The Impact of Evolutionary Driving Forces on Human Complex Diseases: A Population Genetics Approach. Scientifica (Cairo) 2016;2016:1-10.
6. Mclnnes L, Healy J, Melville J. UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction. 2018;
7. Maaten L van der, Hinton G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res2008;9.
8. Steinhoff G, Nesteruk J, Wolfien M, Kundt G, PERFECT Trial Investigators Group, Börgermann J, David R, Garbade J, Große J, Haverich A, Hennig H, Kaminski A, Lotz J, Mohr F-W, Müller P, Oostendorp R, Ruch U, Sarikouch S, Skorska A, Stamm C, Tiedemann G, Wagner FM, Wolkenhauer O. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response-: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133+ Application After Myocardial Infarction. EBiomedicine 2017;22:208-224.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2015/061568 A1 [0018, 0065]
US 9663764 B2 [0018, 0065]
WO 2014/078414 A1 [0018, 0065]
US 8415155 B2 [0018, 0065]
EP 3105350 A2 [0019, 0065]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Lohmann et al. (S. Lohmann et al., Methods 59 (2013) 10-19) [0011, 0030]
S. Lohmann et al., Methods 59 (2013) 10-19 [0065]
Koczan D, Fitzner B, Zettl UK, Hecker M. Microarray data of transcriptome shifts in blood cell subsets during S1P receptor modulator therapy. Sci Data 2018;5:180145 [0065]
Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, Smyth GK. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res 2015;43:e47-e47 [0065]
Kuhn M. Building Predictive Models in R Using the caret Package. J Stat Softw2008;28 [0065]
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Saeb ATM, Al-Naqeb D. The Impact of Evolutionary Driving Forces on Human Complex Diseases: A Population Genetics Approach. Scientifica (Cairo) 2016;2016:1-10 [0065]
Mclnnes L, Healy J, Melville J. UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction. 2018 [0065]
Maaten L van der, Hinton G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res2008;9 [0065]
Steinhoff G, Nesteruk J, Wolfien M, Kundt G, PERFECT Trial Investigators Group, Börgermann J, David R, Garbade J, Große J, Haverich A, Hennig H, Kaminski A, Lotz J, Mohr F-W, Müller P, Oostendorp R, Ruch U, Sarikouch S, Skorska A, Stamm C, Tiedemann G, Wagner FM, Wolkenhauer O. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response-: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133+ Application After Myocardial Infarction. EBiomedicine 2017;22:208-224 [0065]

Claims

Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation umfassend: ii) Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NPAS2, Seq-ID Nr. 1, Seq-ID Nr. 2, ANGPTL7, Kcnd2, SLC41A3, MFGE8, Zbtb16, Seq-ID Nr. 3, Seq-ID Nr. 4, Seq-ID Nr. 5, Nkain2, CCL7, Seq-ID Nr. 6, MED13, Seq-ID Nr. 7, Seq-ID Nr. 8, Seq-ID Nr. 9, Cdh2, Seq-ID Nr. 10, Seq-ID Nr. 11, Seq-ID Nr. 12, Seq-ID Nr. 13, Seq-ID Nr. 14, Seq-ID Nr. 15, Seq-ID Nr. 16, Seq-ID Nr. 17, Seq-ID Nr. 18, Seq-ID Nr. 19, Seq-ID Nr. 20, Seq-ID Nr. 21, Seq-ID Nr. 22, Seq-ID Nr. 23, DHRSX, Seq-ID Nr. 24, PAMR1, Seq-ID Nr. 24a, Seq-ID Nr. 25, Seq-ID Nr. 26, und Seq-ID Nr. 27 in einer Probe eines Probanden nach einer Kardiomyozyten-Transplantation; ii) Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Referenzwert ein Wert ist, welcher anhand einer Probe des gleichen Probanden vor der Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wurde.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Proband einen Myokard-Infarkt erlitten hat.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Referenzwert ein vorbekannter Wert ist, welcher bevorzugt für mindestens einen anderen Probanden vor einer Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wurde, wobei für diesen mindestens einen anderen Probanden nach der Kardiomyozyten-Transplantation deren erfolgreicher Verlauf festgestellt wurde.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Vervielfachung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gm25732 (human:SEQ ID Nr. 1), Gm24643 (human: SEQ ID Nr. 9), Mfge8 (human: MFGE8), TC0600000166 (human: Kcnd2) und Ccl7 (human: CCL7) um mindestens 0,01, bevorzugt um mindestens 0,1, weiter bevorzugt um mindestens 0,2; und/oder, bevorzugt und, bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Vervielfachung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 23 und PAMR1 um weniger als 0,2, bevorzugt von weniger als 0,1, weiter bevorzugt von ≤0,01, ein positiver Verlauf der Kardiomyozyten-Transplantation festgestellt wird.
Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, umfassend: a) Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IVNS1ABP, Seq-ID Nr. 28, Seq-ID Nr. 29, Seq-ID Nr. 30, Seq-ID Nr. 31, Seq-ID Nr. 32, Seq-ID Nr. 33, PINK1, Seq-ID Nr. 34, VDAC1P5, IF130, ATP1B3, Seq-ID Nr. 35, GRN, LGALS9, IF127, Seq-ID Nr. 36, Zfp97, Pik3ap1, Seq-ID Nr. 38, Seq-ID Nr. 39, SNORA79, Seq-ID Nr. 40, Seq-ID Nr. 41, SNORD35B, Seq-ID Nr. 42, ATP1B3, Seq-ID Nr. 42, Seq-ID Nr. 44, Seq-ID Nr. 45, SERP1, SLC46A3, RABGAP1L, Seq-ID Nr. 46, Seq-ID Nr. 47, Seq-ID Nr. 48, MT-TH, Seq-ID Nr. 49, Seq-ID Nr. 50 und Seq-ID Nr. 51 in einer Probe eines Probanden mit Myokard-Infarkt; b) Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert.
Methode nach Anspruch 6, wobei der Referenzwert ein vorbekannter Wert ist, welcher bevorzugt für mindestens einen anderen Probanden vor einer Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wurde, wobei für diesen mindestens einen anderen Probanden nach der Kardiomyozyten-Transplantation deren erfolgreicher Verlauf festgestellt wurde.
Methode gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (b) bestimmten Änderung der Expression mindestens eines Biomarkers um mindestens 0,01, bevorzugt um mindestens 0,1, der Proband als geeignet für eine Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Methode nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Probe eines Probanden ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vollblut-Probe, Blutserum-Probe, Blutplasma-Probe und Gewebe-, insbesondere Herzgewebe-, Probe, wobei die Probe bevorzugt eine Vollblut-, Blutserum- oder Blutplasma-Probe, weiter bevorzugt eine Vollblut-Probe, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Methode nach einem der Ansprüche 6 bis 8, welche(s) ein in vitro Verfahren bzw. eine in vitro Methode, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Methode nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der Proband ein Säugetier, bevorzugt ein Mensch oder eine Maus, ist.