WO2021219604A1 - Verfahren zur überwachung des verlaufs einer kardiomyozyten-transplantation und methode zur bestimmung, ob ein proband für einer kardiomyozyten-transplantation geeignet ist - Google Patents

Verfahren zur überwachung des verlaufs einer kardiomyozyten-transplantation und methode zur bestimmung, ob ein proband für einer kardiomyozyten-transplantation geeignet ist Download PDF

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WO2021219604A1
WO2021219604A1 PCT/EP2021/060931 EP2021060931W WO2021219604A1 WO 2021219604 A1 WO2021219604 A1 WO 2021219604A1 EP 2021060931 W EP2021060931 W EP 2021060931W WO 2021219604 A1 WO2021219604 A1 WO 2021219604A1
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WO
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seq
determined
cardiomyocyte
expression
subject
Prior art date
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PCT/EP2021/060931
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Robert David
Praveen VASUDEVAN
Markus Wolfien
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Universität Rostock
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the invention relates to a method for monitoring the course of a cardiomyocyte transplant on the basis of the determination of the amount of expression of at least one specific biomarker in a sample of a subject after a cardiomyocyte transplant in a step (i); and comparison of the amount of expression determined in (i) with a reference value in a step (ii).
  • the invention in a second aspect, relates to a method for determining whether a subject is suitable for a cardiomyocyte transplantation or whether a cardiomyocyte transplantation has a prospect of success in a subject, comprising: determining the amount of expression of at least one specific biomarker in a sample of a Subjects with myocardial infarction in one step (a); and comparing the amount of expression determined in (i) with a reference value in a step (b).
  • Cardiovascular disease is a leading cause of morbidity and mortality in the world.
  • Myocardial infarction (Ml) due to insufficient blood supply and ischemia leads to progressive heart muscle damage and cardiac remodeling with a high risk of mortality.
  • treatment options including pharmacological treatments, small molecules that stimulate endogenous regeneration, cell transplantation, and immune modulation for heart transplantation.
  • the object of the invention was therefore to provide markers by means of which the course of a cardiomyocyte transplantation can be monitored under ischemic conditions, as well as to provide markers that can be used to determine whether a test person is suitable for a cardiomyocyte transplantation or whether a Cardiomyocyte transplantation in a subject has a chance of success.
  • Cardiomyocytes from newborns were used as the standard reference cell type because there is no consensus as to which differentiation protocol and cell stage are optimal for generation and transplantation derived from induced pluripotent stem cells (iPSC).
  • iPSC induced pluripotent stem cells
  • the present invention relates to a method for monitoring the course of a cardiomyocyte transplantation comprising: i) determining the amount of expression of at least one biomarker selected from the group consisting of NPAS2, Seq ID No. 1, Seq ID No. 2, ANGPTL7, Kcnd2, SLC41A3, MFGE8, Zbtb16, Seq ID No. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 5, Nkain2, CCL7, Seq ID No. 6, MED13, Seq ID No. 7 , Seq ID No. 8, Seq ID No. 9, Cdh2, Seq ID No. 10, Seq ID No. 11, Seq ID No. 12, Seq ID No. 13, Seq ID No. 14, Seq ID No.
  • Seq ID No. 16 Seq ID No. 17, Seq ID No. 18, Seq ID No. 19, Seq ID No. 20, Seq ID No. 21 , Seq ID No. 22, Seq ID No. 23, DHRSX, Seq ID No. 24, PAMR1, Seq ID No. 24a, Seq ID No. 25, Seq ID No. 26, and Seq- ID No. 27 in a sample from a subject after cardiomyocyte transplantation; i) Comparison of the amount of expression determined in (i) with a reference value.
  • biomarkers are understood to mean nucleic acids, in particular cDNA and RNA.
  • the biomarker for each of these nucleic acids or nucleic acid sequences also includes variants thereof, which are at least 95%, preferably at least 96%, more preferably at least 97% , more preferably at least 98%, more preferably at least 99%, are homologous to the respective sequence.
  • fragments of the nucleic acids mentioned under i) are also included, whereby this more preferably means fragments that comprise 15 to 99.5% of the sequence of the respective total nucleic acid, more preferably fragments that consist of 15 to 99.5% of the sequence consist of the respective total nucleic acid.
  • At least one of the nucleic acids of Seq ID numbers 1-10, 11-22, 24, 24a, 25, and 27 is what is known as a non-coding RNA '(ncRNA).
  • ncRNA non-coding RNA '(ncRNA)
  • it is preferred that for these at least one ncRNA of Seq ID numbers 1-10, 11-22, 24, 24a, 25, and 27 are each also encompassed fragments which comprise 15 to 99.5% of the sequence of the respective total ncRNA, more preferably fragments, which consist of 15 to 99.5% of the sequence of the respective total ncRNA. 2 or more, more preferably all of the nucleic acids of Seq ID numbers 1-10, 11-22, 24, 24a, 25, and 27 ncRNAs are further preferred, with further preference for each of these ncRNAs the same with regard to the fragments.
  • Monitoring markers show the processes that are important for the success of cardiomyocyte therapy and can be used further to optimize therapy by activating or modifying these markers and the processes in which they are involved. Monitoring markers show how cardiomyocyte therapy is progressing.
  • the expression “determination of the amount of expression of at least one biomarker” as used here relates to the quantification of the amount of expression by means of suitable methods. How the amount of expression of a biomarker is determined is known to the person skilled in the art and is described, for example, in Lohmann et al. (S. Lohmann et al., Methods 59 (2013) 10-19).
  • the success of the cardiomyocyte therapy is preferably determined in that a further step iii) is carried out: iii) assessment of the success of the cardiomyocyte therapy based on the result of the comparison according to (ii).
  • the sample of a subject is selected from the group consisting of whole blood sample, blood serum sample, blood plasma sample and tissue, in particular heart tissue, sample, the sample preferably being a whole blood, blood serum or blood plasma sample , more preferably a whole blood sample.
  • the at least one biomarker is selected from the group consisting of Seq ID No. 11, Seq ID No. 12, Seq ID No. 13, Seq ID No. 14, Seq ID No. 15, Seq ID No. 16, Seq ID No. 17, Seq ID No. 18, Seq ID No. 19, Seq ID No. 20, Seq ID No. 21, Seq ID No. 22, Seq ID No. 23, DHRSX, Seq ID No. 24, PAMR1, Seq ID No. 24a, Seq ID No. 25, Seq ID No. 26 and Seq ID No. 27.
  • This group represents the 20 biomarkers that - as described in detail in the experimental section - were determined from blood samples.
  • the at least one biomarker is preferably selected from the group consisting of Seq ID No. 21, Seq ID No. 23 and PAMR1. These three markers were determined from the 20 markers mentioned above (from blood samples) using a so-called “feature selection” algorithm (AdaBoost and Random Forest).
  • the at least one biomarker Seq ID No. 23 and / or PAMR1 is further preferred.
  • Seq ID No. 23 and PAMR1 respectively Nucleic acids that are conserved between humans and mice and are therefore particularly suitable for the application of the method to a human test person.
  • the at least one biomarker is selected from the group consisting of NPAS2, Seq ID No. 1, Seq ID No. 2, ANGPTL7, Kcnd2, SLC41A3, MFGE8, Zbtb16, Seq ID No. 2. 3, Seq ID No. 4, Seq ID No. 5, Nkain2, CCL7, Seq ID No. 6, MED13, Seq ID No. 7, Seq ID No. 8, Seq ID No. 9, Cdh2 and Seq ID No. 10.
  • This group represents the 20 biomarkers which - as described in detail in the experimental part - were determined from tissue samples.
  • the at least one biomarker is selected from the group consisting of Kcnd2, MFGE8, CCL7 and Seq-ID No. 9. These four markers were selected from the 20 markers mentioned above (from tissue samples) determined using a so-called "feature selection" algorithm (AdaBoost and Random Forest).
  • the at least one biomarker is selected from the group consisting of Kcnd2, MFGE8 and CCL7.
  • Kcnd2, MFGE8 and CCL7 are nucleic acids that are conserved between humans and mice and are therefore particularly suitable for using the method on a human test person.
  • the reference value is a value which was determined on the basis of a sample from the same subject before the cardiomyocyte transplantation.
  • the test subject has preferably suffered a myocardial infarction.
  • the cardiomyocyte transplant is preferably carried out in the acute inflammatory phase after a myocardial infarction, preferably within the first seven days after a myocardial infarction.
  • a myocardial infarction can be determined if either the cardiac troponin T (cTnT) values or the creatine kinase MB isozyme (CK-MB) values are above the 99th percentile reference limit, as well as increases and / or decreases in the case of sequential determination and additionally at least one of the following criteria is met:
  • the cardiomyocytes used for the transplantation are preferably obtained from pluripotent stem cells.
  • the extraction of cardiomyocytes from pluripotent stem cells is known to the person skilled in the art; WO 2015/061568 A1, US Pat. No. 9,663,764 B2, WO 2014/078414 A1, US Pat. No. 8,415,155 B2 may be mentioned here by way of example.
  • the reference value is a previously known value, which was preferably determined for at least one other test person before a cardiomyocyte transplantation, the successful course of which was determined for at least one other test person after the cardiomyocyte transplantation.
  • MFGE8, Kcnd2 and CCL7 are nucleic acids that are conserved between humans and mice and are therefore particularly suitable for the application of the method to a human test person; these markers are preferably determined from tissue samples.
  • At least one biomarker is selected from the group consisting of Mir3098 (human Seq ID No. 23 and PAMR1 by less than 0.2 , preferably less than 0.1, more preferably ⁇ 0.01, a positive course of the cardiomyocyte transplantation was found
  • Mir3098 human: SEQ ID No. 23
  • Pamrl human: PAMR1
  • these markers are preferably determined from blood samples.
  • At least one biomarker is selected from the group consisting of Gm25732 (human: SEQ ID No. 1), Gm24643 (human: SEQ ID No. 9), Mfge8 (human: MFGE8), TC0600000166 (human: Kcnd2) and Ccl7 (human: CCL7) by at least 0.01, preferably by at least 0.1, more preferably by at least 0.2; and / or, preferably and, in the case of a multiplication of the expression of at least one biomarker selected from the group consisting of SEQ ID No. 23 and PAMR1 by less than 0.2, preferably less than 0, determined in comparison with the reference value according to (ii) , 1, more preferably ⁇ 0.01, a positive course of the cardiomyocyte transplantation was determined.
  • the method for monitoring the course of a cardiomyocyte transplantation is preferably an ex i // Vo or in vitro method, more preferably an in vitro method.
  • the test subject is a mammal, preferably a human or a mouse.
  • the test subject is preferably a human, in an alternative embodiment the test subject is preferably a mouse.
  • Mus musculus is preferably understood as a mouse. This also applies to the other test person.
  • the method can comprise one or more further steps in addition to those mentioned above.
  • pretreatment steps or an evaluation of the results obtained can be included.
  • the procedure can be carried out manually or with the assistance of the device.
  • (i), (ii) and / or (iii) are carried out completely or partially with device assistance, for example using suitable automated or sensory equipment for (i) and / or a computer-implemented comparison in (ii) or (iii).
  • a second aspect of the present invention relates to a method for determining whether a test person is suitable for a cardiomyocyte transplantation or whether a cardiomyocyte transplantation has a prospect of success in a test person, comprising: a) determining the amount of expression of at least one biomarker selected from the Group consisting of IVNS1ABP, Seq ID No. 28, Seq ID No. 29, Seq ID No. 30, Seq- ID No. 31, Seq ID No. 32, Seq ID No. 33, PINK1, Seq ID No. 34, VDAC1 P5, IFI30, ATP1 B3, Seq ID No. 35, GRN, LGALS9, IFI27, Seq ID No. 36, Zfp97, Pik3ap1, Seq ID No.
  • Biomarkers are here too nucleic acids, in particular cDNA and RNA.
  • the biomarker for each of these nucleic acids or nucleic acid sequences also comprises variants thereof, which are at least 95%, preferably at least 96%, more preferably at least 97% , more preferably at least 98%, more preferably at least 99%, are homologous to the respective sequence.
  • fragments of the nucleic acids mentioned under a) are also included, which more preferably means fragments which comprise 15 to 99.5% of the sequence of the respective total nucleic acid, more preferably fragments which consist of 15 to 99.5% of the sequence consist of the respective total nucleic acid.
  • At least one of the nucleic acids of Seq ID numbers 28, 29, 31-38, 39-43 and 45-51 is what is known as a non-coding RNA (ncRNA).
  • ncRNA non-coding RNA
  • it is preferred that for this at least one ncRNA of Seq ID numbers 28, 29, 31-38, 39-43 and 45-51 are each also comprised of fragments which 15 to 99.5% of the sequence of the respective total ncRNA, more preferably fragments which consist of 15 to 99.5% of the sequence of the respective total ncRNA. 2 or more, more preferably all of the nucleic acids of Seq ID numbers 28, 29, 31-38, 39-43 and 45-51 ncRNAs are further preferred, with further preference for each of these ncRNAs the same with regard to the fragments.
  • Markers for diagnosis or prediction predict whether a test person is suitable or how likely they will show an improvement through cardiomyocyte therapy relate to the quantification of the amount of expression by means of suitable Methods. How the amount of expression of a biomarker is determined is known to the person skilled in the art and is described, for example, in Lohmann et al. (S. Lohmann et al., Methods 59 (2013) 10-19).
  • the suitability or probability of an improvement is preferably predicted in that a further step c) is carried out: c) Prediction of the suitability or probability of an improvement based on the result of the comparison according to (b).
  • the sample of a subject is selected from the group consisting of whole blood sample, blood serum sample, blood plasma sample and tissue, in particular heart tissue, sample, the sample preferably being a whole blood, blood serum or blood plasma Sample, more preferably a whole blood sample.
  • the reference value is a previously known value which was preferably determined for at least one other test person before a cardiomyocyte transplantation, the successful course of which was determined for this at least one other test person after the cardiomyocyte transplantation.
  • the person skilled in the art knows how a successful course of a cardiomyocyte transplantation is determined.
  • the at least one biomarker is selected from the group consisting of IVNS1 ABP, Seq ID No. 28, Seq ID No. 29, Seq ID No. 30, Seq ID No. 31, Seq- ID No. 32, Seq ID No. 33, PINK1, Seq ID No. 34, VDAC1 P5, IFI30, ATP1 B3, Seq ID No. 35, GRN, LGALS9, IFI27, Seq ID No. 36, Zfp97 , Pik3ap1, and Seq ID No. 38.
  • This group represents the 20 diagnostic or predictive biomarkers which - as described in detail in the experimental part - were determined from heart tissue samples.
  • the at least one biomarker is IVNS1 ABP and / or Seq ID No. 28, preferably IVNS1ABP.
  • IVNS1ABP diagnostic or predictive markers
  • / or Seq-ID No. 28 were determined from the 20 markers mentioned above (from heart tissue samples) by means of a so-called “feature selection” algorithm (AdaBoost and Random Forest).
  • AdaBoost feature selection algorithm
  • Random Forest Random Forest
  • the at least one biomarker is selected from the group consisting of Seq ID No. 39, SNORA79, Seq ID No. 40, Seq ID No. 41, SNORD35B, Seq ID No. 42, ATP1 B3, Seq ID No. 42, Seq ID No. 44, Seq ID No. 45, SERP1 , SLC46A3, RABGAP1 L, Seq ID No. 46, Seq ID No. 47, Seq ID No. 48, MT-TH, Seq ID No. 49, Seq ID No. 50 and Seq ID No. 51.
  • This group represents the 20 diagnostic or predictive biomarkers which - as described in detail in the experimental section - were determined from blood samples.
  • the at least one biomarker is selected from the group consisting of SNORD35B, ATP1 B3, Seq ID No. 44, MT-TH, and Seq ID No. 49.
  • Predictive markers were determined from the 20 markers mentioned above (from blood samples) using a so-called “feature selection” algorithm (AdaBoost and Random Forest).
  • the at least one biomarker is preferably selected from the group consisting of SNORD35B, ATP1 B3, Seq ID No. 44 and MT-TH.
  • At least one change in the expression determined in comparison with the reference value according to (b) is preferred Biomarkers by at least 0.01, preferably by at least 0.1, the test subject is determined to be suitable for a cardiomyocyte transplant.
  • the method for determining whether a test person is suitable for a cardiomyocyte transplantation or whether a cardiomyocyte transplantation has a prospect of success in a test person is preferably an ex vivo or in vitro method, more preferably an in vitro method.
  • the test subject is preferably a mammal, more preferably a human or a mouse. In one embodiment the test subject is preferably a human, in an alternative embodiment the test subject is preferably a mouse. Mus musculus is preferably understood as a mouse. The same applies to the other test person.
  • the method can comprise one or more further steps in addition to those mentioned above. For example, pretreatment steps or an evaluation of the results obtained can be included.
  • the method can be carried out manually or with the aid of the device. Preferably (a), (b) and / or (c) are carried out completely or partially with device assistance, for example using suitable robotic or sensory equipment for (a) and / or a computer-implemented comparison in (b) or . (c).
  • the invention is further described below on the basis of the investigations carried out, without being restricted thereto.
  • Ventricles were removed from newborn transgenic B6.eGFP mice, minced, and single cell suspensions prepared using the Pierce primary cardiomyocyte isolation kit (Thermo Fisher Scientific, USA). 1 (cons.) 10 6 cells of these neonatal GFP cardiomyocytes were then suspended in 20 ml of Matrigel for injection.
  • mice were anesthetized with intraperitoneal administration of pentobarbital (50 mg / kg body weight) and subcutaneous administration of fentanyl (2 ⁇ g / kg body weight). You were intubated and your chest opened. After thoracotomy, permanent myocardial infarction was induced by ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). The suture was left in the heart without ligation in the sham group.
  • pentobarbital 50 mg / kg body weight
  • fentanyl 2 ⁇ g / kg body weight
  • RNA integrity was assessed using the Agilent Bioanalyzer 2100 with the RNS Pico Chip Kit (Agilent Technologies, USA).
  • Agilent Bioanalyzer 2100 with the RNS Pico Chip Kit (Agilent Technologies, USA).
  • 200 ng of isolated RNA samples were applied and the hybridization was carried out as described above 1 .
  • the hybridization was carried out on Affymetrix Clariom TM D arrays according to the manufacturer's instructions (Thermo Fisher Scientific, USA).
  • the microarray data analysis was carried out with the Transcriptome Analysis Console software provided by Thermo Fischer Scientific (version 4.0.1). The analysis included quality control, data normalization and statistical tests for differential expression using the Limma package 2 .
  • the transcripts are classified as significantly differently expressed if a twice higher or lower change in the "Fold Change” (FC), a "False Discovery Rate” (FDR) less than 0.5 and a p-value less than 0, 05 are available.
  • the identification of the biomarkers and the classification of the available data were achieved using supervised and unsupervised machine learning (ML) algorithms 3 .
  • the data were preprocessed by removing biomarkers with little change between groups to reduce dimensionality according to recommendations for best ML analytical methods.
  • the following monitored algorithms were compared to the specific data: Lasso, AdaBoost, Support Vector Machines (SVM) and Random Forest (RF) 4 .
  • Small datasets are often prone to overfitting, so classifiers suitable for training on small datasets to compare features that require little training and the most appropriate algorithm or combination of algorithms have been used was made according to the accuracy and robustness against overfitting selected 5 .
  • ROC Receiveiver Operating Characteristic
  • the cell-treated mice were compared with the untreated mice and a high correlation of the respective gene expression with the cell transplantation was found, which is based on 20 transcripts (Biomarker) indicated as important factors for the mechanism of action of transplanted cardiomyocytes, which are listed in Table 1 below. It was seen that the algorithm was not biased against the mouse strains, so that none of these transcripts correlated significantly with the differences between the mouse lines (BL6 and RAG2 del ).
  • the multiples of the expression value determined for the respective myocardial infarction-induced mice, in each case with (MIC) and without cardiomyocyte transplantation (M1) from heart tissue, are summarized below in Table 1 for the respective biomarker.
  • the individual mean values are averaged from three corresponding measurements.
  • the values of the Rag2 del mice represent the comparison in which there was no improvement in heart function after the transplantation.
  • the comparison within the respective mouse group (BL6 Ml, MIC or RAG2 del MI, MIC) with regard to the multiplication of the expression or the difference between the respective multiples of the expression represents the relevant multiple.
  • Gray background using the "Feature selection” algorithm (AdaBoost and Random Forest) selectively based on their information content
  • the 20 biomarkers included the involvement of Npas2 and Med13 as transcription factors; Slc41a3 as a mitochondrial Mg 2+ transporter together with CCL7, also known as MCP-3 as a chemokine for macrophage infiltration and other ncRNAs as important targets.
  • Most of these targets differed significantly only in the C57BL / 6J mice even after cardiomyocyte transplantation, possibly explaining their superior effectiveness in improving function compared to Rag2 deL mice.
  • Only three transcripts (Mfge8, Angptl7 and ncRNS: TC0900002242) correlate positively with cardiomyocyte transplantation, while the other 17 targets correlate negatively.
  • the precursor miRNS (Gm24643) and the ncRNS (TC0600000166) it was possible to predict with an accuracy of 92.4% (AUC 91.6%) that the transplantation of cardiomyocytes was influenced by their effect on these goals in the heart was.
  • the relative expression levels of these transcripts were also of interest.
  • Gm24643 had a poorly predicted rate of conservation and no me-like hairpin regions, but interestingly it was close to the predicted binding sites of Statl, Gatal, Foxil, and Foxd3.
  • the ncRNS (TC0600000166) referred to the KCND2 transcript Dtassium Voltage Gated Channel Subfamily, D-Member 2) in humans, including the predicted me-like hairpin structures.
  • Gray background using the "Feature selection” algorithm (AdaBoost and Random Forest) selectively based on their information content
  • the precursor miRNS (Gm25732) had no specific hits with regard to hairpin structure or conservation, but according to Blastn shares also a sequence homology of 91% with MAPK1 (mitogen-activated protein kinase 1) and 91% with SPEG (striped muscle-enriched protein kinase) .
  • markers were selectively weighted using a so-called “feature selection” algorithm (AdaBoost and Random Forest) based on their information content for the classification of the groups and selected with regard to the greatest prediction accuracy.
  • AdaBoost feature selection algorithm
  • the human analogs of Gm24643, Mfge8, TC0600000166 and Ccl7 or their combination are thus preferred biomarkers for monitoring the course of a cardiomyocyte transplantation after myocardial infarction, especially when heart tissue samples (from a test subject, preferably in vitro) are examined. Since in particular Mfge8, TC0600000166, Ccl7 are conserved RNAs compared to humans, this group, individual of these markers and combinations of two or more, can be used in particular for monitoring the course of a cardiomyocyte transplantation after myocardial infarction in humans.
  • markers were selectively weighted using a so-called “feature selection” algorithm (AdaBoost and Random Forest) based on their information content for the classification of the groups and selected with regard to the greatest prediction accuracy.
  • AdaBoost feature selection algorithm
  • the human analogs of Gm25732, Mir3098 and Pamrl or their combinations are thus preferred biomarkers for monitoring the course of a cardiomyocyte transplantation after myocardial infarction, especially when blood samples (from a test subject, preferably in vitro) are examined. Since only Mir3098 and Pamrl are conserved compared to humans, one or more of these biomarkers are in particular for the Can be used to monitor the course of a cardiomyocyte transplant after myocardial infarction in humans.
  • C57BL / 6J mice became the Rag2 deL mice regardless of their treatment status (compared to induced myocardial infarction (MI) or induced myocardial infarction and transplanted cardiomyocytes (MIC). These could be used as potential diagnostic markers to measure adverse heart remodeling and cardiomyocyte transplant efficacy, and thus to stratify patients eligible for cell transplant studies , since the mouse models show significantly different functional results.
  • MI induced myocardial infarction
  • MIC induced myocardial infarction and transplanted cardiomyocytes
  • the 20 biomarkers comprised a collection of transcripts that are involved in processes ranging from apoptosis regulation (Pinkl, Ivnslabp and Ifi27), antigen processing (Ifi30), mitochondrial ion channels (Vdac3) and transcription regulation (Zfp97).
  • ATPase activity Atp1 b3
  • immune cell activation and regulation Lgals9, Pik3ap1, Ighv7-1) and lysosomal function (Grn) together with other non-coding RNA RNAs.
  • RNAs and non-coding RNAs have been identified in the blood that could serve as valuable diagnostic markers.
  • Atp1b3 is also a marker in the blood.
  • Slc46a3 which is involved in transmembrane transport
  • Serpl which is involved in ER translocation, are important indicators in the blood.
  • Two more Promising targets identified in blood are Snord35b (small nucleolar RNA) and mt-Th (mitochondrial tRNA).
  • markers were selectively weighted using a so-called “feature selection” algorithm (AdaBoost and Random Forest) based on their information content for the classification of the groups and selected with regard to the greatest prediction accuracy.
  • AdaBoost feature selection algorithm
  • the multiples of the expression value determined for the respective myocardial infarction-induced mice, in each case with (MIC) and without cardiomyocyte transplantation (M1) from heart tissue, are summarized in Table 7 below for the respective biomarker.
  • the individual mean values are averaged from three corresponding measurements.
  • the values of the Rag2 del mice represent the comparison in which there was no improvement in heart function after the transplantation.
  • the comparison of RAG2del Ml vs. BL6MI shows the differences in the expression of these markers in order to identify the subjects (before the transplantation) who are unlikely to react positively to the transplantation; the comparison with regard to the multiplication of the expression or the difference between the respective multiples of the expression represents the relevant multiple.
  • the comparison of RAG2 del MIC vs. BL6MIC represents the differences in the expression of these markers in order to determine whether the test subjects are positive or negative respond to cardiomyocyte transplant; the comparison with regard to the reproduction of the expression or the difference between the respective multiples of the expression represents the relevant multiple.
  • the "feature selection" based on the 20 biomarkers from the heart tissue resulted in the combination of Ivnslabp and precursor miRNS (Gm25035), which could be identified as a diagnostic marker on the basis of which the result of a cardiomyocyte transplantation in the heart with an accuracy of 93, 7% (AUC 91, 9%) is predictable.
  • markers were also selectively weighted using a so-called “feature selection” algorithm (AdaBoost and Random Forest) based on their information content for the classification of the groups and selected with regard to the greatest prediction accuracy.
  • AdaBoost feature selection algorithm
  • the multiples of the expression value determined from blood for the respective myocardial infarction-induced mice, in each case with (MIC) and without cardiomyocyte transplantation (M1) are summarized below in Table 8 for the respective biomarker.
  • the individual mean values are averaged from three corresponding measurements.
  • the values of the Rag2 del mice represent the comparison in which there was no improvement in heart function after the transplantation.
  • the comparison of RAG2del Ml vs. BL6MI shows the differences in the expression of these markers in order to identify the subjects (before the transplantation) who are unlikely to react positively to the transplantation; the comparison with regard to the multiplication of the expression or the difference between the respective multiples of the expression represents the relevant multiple.
  • the comparison of RAG2del MIC vs. BL6MIC represents the differences in the expression of these markers in order to determine whether the test subjects were positive or negative the cardiomyocyte transplant respond; the comparison with regard to the reproduction of the expression or the difference between the respective multiples of the expression represents the relevant multiple.

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Abstract

Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation anhand der Bestimmung der Expressionsmengemindestens eines spezifischen Biomarkers in einer Probe eines Probanden nach einer Kardiomyozyten-Transplantation in einem Schritt (i); und Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert in einem Schritt (ii). In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, umfassend: Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines spezifischen Biomarkers in einer Probe eines Probanden mit Myokard-Infarkt in einem Schritt (a); und Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert in einem Schritt (b).

Description

Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation und Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist
Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation anhand der Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines spezifischen Biomarkers in einer Probe eines Probanden nach einer Kardiomyozyten-Transplantation in einem Schritt (i); und Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert in einem Schritt (ii). In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten- Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, umfassend: Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines spezifischen Biomarkers in einer Probe eines Probanden mit Myokard infarkt in einem Schritt (a); und Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert in einem Schritt (b).
Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der Welt. Myokardinfarkt (Ml) aufgrund unzureichender Blutversorgung und Ischämie führt zu fortschreitenden Herzmuskelschäden und Herzumbau mit einem hohen Mortalitätsrisiko. Es gibt eine Vielzahl von Behandlungsmöglichkeiten umfassend pharmakologische Behandlungen, kleine Moleküle, die die endogene Regeneration stimulieren, Zelltransplantation und Immunmodulation zur Herztransplantation.
Bisher war die Verabreichung von Knochenmarkszellen und anderen Stammzellen an Patienten deren primärer Fokus. Der marginale Nutzen dieser Zelltransplantation wurde auf verschiedene Gründe zurückgeführt, ohne dass ein klarer Verbesserungsspielraum bestand, hauptsächlich aufgrund der Unklarheit über den Wirkungsmechanismus. Diese Probleme haben dazu geführt, dass die Zukunft der Stammzelltherapie als praktikable Behandlungsoption in Frage gestellt wurde. In diesem Zusammenhang ist allerdings zu beachten, dass die meisten der präklinischen Studien an immungeschwächten Tieren durchgeführt wurden, um das Überleben und das Anwachsen der transplantierten Zellen zu maximieren.
Ihre leichte Verfügbarkeit und die große Menge an zuvor veröffentlichter Literatur machen die Stammzelltransplantation allerdings zu einem potentiellen Kandidaten für eine präklinische und klinische Behandlungsstrategie für Myokardinfarkt. In den letzten Jahren ist eine neue Welle therapeutischer Strategien zur Behandlung von Ml durch interventioneile Immuntherapie erschienen. Die verschiedenen Immunzellen sind für die Herzregeneration und den anschließenden Heilungsprozess nach Ml von großer Bedeutung. Es wurde gezeigt, dass die Modulation der verschiedenen Zellmakrophagen-Subpopulationen nach Ml zusammen mit einer kleineren Narbengröße zu einer verbesserten Herzfunktion beiträgt. Es wurde weiterhin gezeigt, dass die Transplantation von syngenen mesenchymalen Stammzellen (MSC) auf den Übergang zu einer entzündungshemmenden Makrophagen-Untergruppe zurückgeführt werden kann und dass sie die T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen modulieren. Somit ist es zu erwarten, dass es eine klare Kommunikation zwischen der Immunantwort eines Probanden und den transplantierten Zellen gibt.
Die Zukunft der regenerativen Medizin und der Herzzelltherapie wird in der Erzeugung pluripotenter Kardiomyozyten aus Stammzellen als einer besseren Wahl des Zelltyps für die Transplantation gesehen. Es wurde gezeigt, dass diese Zellen erfolgreich transplantiert und infarkte Herzen regeneriert werden konnten. Die meisten präklinischen Studien an diesen Zellen wurden aufgrund des menschlichen Ursprungs dieser Zellen erneut an immungeschwächten Tieren durchgeführt. Es fehlen jedoch eindeutig Studien zur Wechselwirkung transplantierter Kardiomyozyten mit dem Entzündungsweg unter ischämischen Bedingungen. Der genaue Wirkungsmechanismus dieser transplantierten Zellen ist ebenfalls völlig unklar. Diese grundlegende Wissenslücke sollte zunächst aufgedeckt werden, um einen nachvollziehbaren Weg für die erfolgreiche Implementierung neuerer pluripotenter Stammzellbehandlungen in der Klinik zu finden.
Aufgabe der Erfindung war es daher, Marker bereitzustellen, anhand derer unter ischämischen Bedingungen der Verlauf einer Kardiomyozyten-Transplantation überwacht werden kann als auch solche Marker bereitzustellen, anhand derer bestimmt werden kann, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten- Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat.
Zur Lösung dieser Aufgabe wurde der Einfluss der intramyokardialen syngenen neonatalen Kardiomyozyten-Transplantation nach Ml auf die Herzfunktion und die verschiedenen Immunsubpopulationen im Herzen untersucht. Kardiomyozyten von Neugeborenen wurden hierfür als Standardreferenzzelltyp verwendet, da kein Konsens darüber besteht, welches Differenzierungsprotokoll und Stadium der Zellen für die von induzierten pluripotenten Stammzellen (induced pluripoent stem cells, iPSC) abgeleitete Erzeugung und Transplantation optimal sind. Es wurde hierbei versucht, den Wirkungsmechanismus transplantierter Kardiomyozyten aufzuklären und die Eignung der Verwendung von immungeschwächten Tiermodellen zum Testen von Herzzelltherapien zu untersuchen, indem die Wirkung dieser Zellen nach Ml sowohl in Wildtyp-C57BL6 / J- als auch in T-, B-Zellen defizienten Rag2del-Mäusen mit einem intakten myeloiden Kompartiment untersucht werden.
1 . Aspekt - Überwachung
Die vorliegende Erfindung betrifft gemäß eines ersten Aspekts ein Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation umfassend: i) Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NPAS2, Seq-ID Nr. 1 , Seq-ID Nr. 2, ANGPTL7, Kcnd2, SLC41A3, MFGE8, Zbtb16, Seq-ID Nr. 3, Seq-ID Nr. 4, Seq-ID Nr. 5, Nkain2, CCL7, Seq-ID Nr. 6, MED13, Seq-ID Nr. 7, Seq-ID Nr. 8, Seq-ID Nr. 9, Cdh2, Seq-ID Nr. 10, Seq-ID Nr. 11 , Seq-ID Nr. 12, Seq-ID Nr. 13, Seq-ID Nr. 14, Seq-ID Nr. 15, Seq-ID Nr. 16, Seq-ID Nr. 17, Seq-ID Nr. 18, Seq-ID Nr. 19, Seq-ID Nr. 20, Seq-ID Nr. 21 , Seq-ID Nr. 22, Seq-ID Nr. 23, DHRSX, Seq-ID Nr. 24, PAMR1 , Seq-ID Nr. 24a, Seq-ID Nr. 25, Seq-ID Nr. 26, und Seq-ID Nr. 27 in einer Probe eines Probanden nach einer Kardiomyozyten-T ransplantation; i) Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert.
Unter „Biomarker“ (synonym „Marker“) werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren, insbesondere cDNS und RNS, verstanden.
Für jede der unter i) genannten Nukleinsäuren ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verstehen, dass der Biomarker für jede dieser Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuresequenzen auch Varianten davon umfasst, welche zu mindestens 95%, bevorzugt zu mindestens 96%, weiter bevorzugt zu mindestens 97%, weiter bevorzugt zu mindestens 98%, weiter bevorzugt zu mindestens 99%, homolog zu der jeweiligen Sequenz sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist es bevorzugt, dass auch Fragmente der unter i) genannten Nukleinsäuren umfasst sind, wobei dies weiter bevorzugt Fragmente meint, die 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten Nukleinsäure umfassen, weiter bevorzugt Fragmente, die aus 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten Nukleinsäure bestehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich insbesondere bei mindestens einer der Nukleinsäuren der Seq-ID Nummern 1-10, 11-22, 24, 24a, 25, und 27 um eine sogenannte non-coding RNS‘ (ncRNS). Im Rahmen dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, dass für diese mindestens eine ncRNS der Seq-ID Nummern 1-10, 11-22, 24, 24a, 25, und 27 jeweils auch Fragmente umfasst sind, die 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten ncRNS umfassen, weiter bevorzugt Fragmente, die aus 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten ncRNS bestehen. Weiter bevorzugt sind 2 oder mehr, weiter bevorzugt alle der Nukleinsäuren der Seq-ID Nummern 1-10, 11-22, 24, 24a, 25, und 27 ncRNS, wobei weiter bevorzugt für jede dieser ncRNS das gleiche bzgl. der Fragmente gilt.
Marker zur Überwachung zeigen die für den Erfolg der Kardiomyozyten-Therapie wichtigen Prozesse auf und können zur Optimierung der Therapie weiter genutzt werden, indem diese Marker und die Prozesse, an denen sie beteiligt sind, aktiviert oder modifiziert werden. Marker zur Überwachung zeigen an, wie eine Kardiomyozyten-Therapie verläuft. Der Ausdruck “ Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers ” wie hier verwendet bezieht sich auf die Quantifizierung der Expressionsmenge mittels geeigneter Methoden. Wie die Expressionsmenge eines Biomarkers bestimmt wird, ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Lohmann et al. (S. Lohmann et al., Methods 59 (2013) 10-19). Bevorzugt wird der Erfolg Kardiomyozyten-Therapie bestimmt, indem ein weiterer Schritt iii) ausgeführt wird: iii) Beurteilung des Erfolgs der Kardiomyozyten-Therapie basierend auf den Resultat des Vergleichs gemäß (ii).
Gemäß einer Ausführungsform des Verfahrens ist die Probe eines Probanden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vollblut-Probe, Blutserum-Probe, Blutplasma-Probe und Gewebe- , insbesondere Herzgewebe-, Probe, wobei die Probe bevorzugt eine Vollblut-, Blutserum oder Blutplasma-Probe, weiter bevorzugt eine Vollblut-Probe, ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens ist der mindestens eine Biomarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq-ID Nr. 11 , Seq-ID Nr. 12, Seq-ID Nr. 13, Seq-ID Nr. 14, Seq-ID Nr. 15, Seq-ID Nr. 16, Seq-ID Nr. 17, Seq-ID Nr. 18, Seq-ID Nr. 19, Seq-ID Nr. 20, Seq-ID Nr. 21 , Seq-ID Nr. 22, Seq-ID Nr. 23, DHRSX, Seq-ID Nr. 24, PAMR1 , Seq-ID Nr. 24a, Seq-ID Nr. 25, Seq-ID Nr. 26 und Seq-ID Nr. 27. Diese Gruppe stellt die 20 Biomarker dar, die -wie im experimentellen Teil im Detail beschrieben- aus Blutproben ermittelt wurden.
Bevorzugt ist der mindestens eine Biomarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Seq- ID Nr. 21 , Seq-ID Nr. 23 und PAMR1. Diese drei Marker wurden aus den 20 voranstehend genannten Markern (aus Blutproben) mittels einer sogenannten „Feature selection“, Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) ermittelt. Weiter bevorzugt ist der mindestens eine Biomarker Seq-ID Nr. 23 und/oder PAMR1. Seq-ID Nr. 23 bzw. PAMR1 sind Nukleinsäuren, die zwischen Mensch und Maus konserviert sind und sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden eignen.
In einer ergänzenden oder alternativen Ausführungsform des Verfahrens ist der mindestens eine Biomarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NPAS2, Seq-ID Nr. 1 , Seq-ID Nr. 2, ANGPTL7, Kcnd2, SLC41A3, MFGE8, Zbtb16, Seq-ID Nr. 3, Seq-ID Nr. 4, Seq-ID Nr. 5 , Nkain2, CCL7, Seq-ID Nr. 6, MED13, Seq-ID Nr. 7, Seq-ID Nr. 8, Seq-ID Nr. 9, Cdh2 und Seq- ID Nr. 10. Diese Gruppe stellt die 20 Biomarker dar, die -wie im experimentellen Teil im Detail beschrieben- aus Gewebeproben ermittelt wurden. Bei dieser Ausführungsform des Verfahrens ist es bevorzugt, dass der mindestens eine Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kcnd2, MFGE8, CCL7 und Seq-ID Nr. 9. Diese vier Marker wurden aus den 20 voranstehend genannten Markern (aus Flerzgewebe-Proben) mittels einer sogenannten „Feature selection“, Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) ermittelt. In dieser Ausführungsform des Verfahrens ist es bevorzugt, dass der mindestens eine Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kcnd2, MFGE8 und CCL7. Kcnd2, MFGE8 und CCL7 sind Nukleinsäuren, die zwischen Mensch und Maus konserviert sind und sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden eignen.
Bei jeder der voranstehend beschriebenen Ausführungsformen des Verfahrens ist es bevorzugt, dass der Referenzwert ein Wert ist, welcher anhand einer Probe des gleichen Probanden vor der Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wurde. Bevorzugt hat der Proband einen Myokard-Infarkt erlitten.
Die Kardiomyozyten-Transplantation erfolgt vorzugsweise in akuter Entzündungsphase nach einem Myokard-Infarkt, bevorzugt innerhalb der ersten sieben Tage nach einem Myokard infarkt. Ein Myokard-Infarkt kann festgestellt werden, wenn entweder die kardialen Troponin T (cTnT)-Werte oder die Creatine kinase MB isozyme (CK-MB)-Werte über der 99- Perzentilreferenzgrenze liegt, sowie Anstieg und /oder Abfall bei sequentieller Bestimmung und zusätzlich mindestens eine der folgende Kriterien erfüllt wird:
• Symptome der Myokardischämie
• Neue ischämische EKG-Veränderungen
• Entwicklung von pathologischen Q-Wellen
• Lokalisierte kinetische/hypokinetische/hypoperfundierte Myokardsfläche
• Identifizierung eines Koronarthrombus „Nach einer Kardiomyozyten-Transplantation“ meint bevorzugt innerhalb des ersten Monats nach der Transplantation, weiter bevorzugt innerhalb der ersten 14 Tage nach Transplantation. Die für die Transplantation eingesetzten Kardiomyozyten sind bevorzugt aus pluripotenten Stammzellen erhalten. Die Gewinnung von Kardiomyozyten aus pluripotenten Stammzellen ist dem Fachmann bekannt, beispielhaft zu nennen sind hier WO 2015/061568 A1 , US 9,663,764 B2, WO 2014/078414 A1 , US 8,415,155 B2.
In einer alternativen Ausführungsform des Verfahrens ist der Referenzwert ein vorbekannter Wert, welcher bevorzugt für mindestens einen anderen Probanden vor einer Kardiomyozyten- Transplantation bestimmt wurde, wobei für diesen mindestens einen anderen Probanden nach der Kardiomyozyten-Transplantation deren erfolgreicher Verlauf festgestellt wurde.
Dem Fachmann ist bekannt, wie ein erfolgreicher Verlauf einer Kardiomyozyten- Transplantation, beispielsweise mittels einer Methode ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Microarray, RT-qPCR, und RNS Sequenzierung, bestimmt wird; beispielhaft wird hier auf EP 3 105 350 A2 verwiesen.
In einer Ausführungsform des Verfahrens wird bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Änderung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MFGE8, Kcnd2 und CCL7 um mindestens 0,01 , bevorzugt um mindestens 0,1 , weiter bevorzugt um mindestens 0,2, ein positiver Verlauf der Kardiomyozyten-Transplantation festgestellt. Wie oben erwähnt sind MFGE8, Kcnd2 und CCL7 Nukleinsäuren, die zwischen Mensch und Maus konserviert sind und sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden eignen; diese Marker werden bevorzugt aus Flerzgewebe-Proben bestimmt.
In einer ergänzenden oder alternativen Ausführungsform des Verfahrens wird bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Vervielfachung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mir3098 (human Seq-ID Nr. 23 und PAMR1 um weniger als 0,2, bevorzug von weniger als 0,1 , weiter bevorzugt von <0,01 , ein positiver Verlauf der Kardiomyozyten-Transplantation festgestellt. Wie oben erwähnt sind Mir3098 (human: SEQ ID Nr. 23) und Pamrl (human: PAMR1) Nukleinsäuren, die zwischen Mensch und Maus konserviert sind und sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden eignen; diese Marker werden bevorzugt aus Blutproben bestimmt. In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Vervielfachung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gm25732 (human:SEQ ID Nr. 1), Gm24643 (human: SEQ ID Nr. 9), Mfge8 (human: MFGE8), TC0600000166 (human: Kcnd2) und Ccl7 (human: CCL7) um mindestens 0,01 , bevorzugt um mindestens 0,1 , weiter bevorzugt um mindestens 0,2; und/oder, bevorzugt und, bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Vervielfachung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 23 und PAMR1 um weniger als 0,2, bevorzugt von weniger als 0,1 , weiter bevorzugt von <0,01, ein positiver Verlauf der Kardiomyozyten-Transplantation festgestellt.
Das Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation ist bevorzugt ein ex i//Vooder in vitro Verfahren, weiter bevorzugt ein in vitro Verfahren. Weiterhin ist es für das Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation bevorzugt, dass der Proband ein Säugetier, bevorzugt ein Mensch oder eine Maus, ist. In einer Ausführungsform ist der Proband bevorzugt ein Mensch, in einer alternativen Ausführungsform ist der Proband bevorzugt eine Maus. Als Maus wird bevorzugt Mus musculus verstanden. Dies gilt ebenso für den anderen Probanden.
Das Verfahren kann einen oder mehrere weitere Schritte, ergänzend zu den oben genannten, umfassten. Beispielsweise können Vorbehandlungsschritte oder eine Evaluierung der erhaltenen Ergebnisse umfasst sein. Das Verfahren kann manuell oder Geräte-assistiert durchgeführt werden. Vorzugsweise werden (i), (ii) und/oder (iii) vollständig oder teilweise Geräte-assistiert durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung einer geeigneten automatisierten bzw. sensorischen Ausrüstung für (i) und/oder einem computer implementierten Vergleich in (ii) bzw. (iii).
2. Aspekt - Diagnose, Prädiktion
Ein zweiter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten- Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, umfassend: a) Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IVNS1ABP, Seq-ID Nr. 28, Seq-ID Nr. 29, Seq-ID Nr. 30, Seq- ID Nr. 31 , Seq-ID Nr. 32, Seq-ID Nr. 33, PINK1 , Seq-ID Nr. 34, VDAC1 P5, IFI30, ATP1 B3, Seq-ID Nr. 35, GRN, LGALS9, IFI27, Seq-ID Nr. 36, Zfp97, Pik3ap1 , Seq-ID Nr. 38, Seq-ID Nr. 39, SNORA79, Seq-ID Nr. 40, Seq-ID Nr. 41 , SNORD35B, Seq-ID Nr. 42, ATP1 B3, Seq-ID Nr. 42, Seq-ID Nr. 44, Seq-ID Nr. 45, SERP1 , SLC46A3, RABGAP1 L, Seq-ID Nr. 46, Seq-ID Nr. 47, Seq-ID Nr. 48, MT-TH, Seq-ID Nr. 49, Seq- ID Nr. 50 und Seq-ID Nr. 51 in einer Probe eines Probanden mit Myokard-Infarkt; b) Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert.
„Biomarker“ (synonym „Marker“) sind auch hier Nukleinsäuren, insbesondere cDNS und RNS.
Für jede der unter a) genannten Nukleinsäuren ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verstehen, dass der Biomarker für jede dieser Nukleinsäuren bzw. Nukleinsäuresequenzen auch Varianten davon umfasst, welche zu mindestens 95%, bevorzugt zu mindestens 96%, weiter bevorzugt zu mindestens 97%, weiter bevorzugt zu mindestens 98%, weiter bevorzugt zu mindestens 99%, homolog zu der jeweiligen Sequenz sind.
In einer weiteren Ausführungsform ist es bevorzugt, dass auch Fragmente der unter a) genannten Nukleinsäuren umfasst sind, wobei dies weiter bevorzugt Fragmente meint, die 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten Nukleinsäure umfassen, weiter bevorzugt Fragmente, die aus 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten Nukleinsäure bestehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich insbesondere bei mindestens einer der Nukleinsäuren der Seq-ID Nummern 28, 29, 31-38, 39-43 und 45-51 um eine sogenannte non- coding RNS‘ (ncRNS). Im Rahmen dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, dass für diese mindestens eine ncRNS der Seq-ID Nummern 28, 29, 31-38, 39-43 und 45-51 jeweils auch Fragmente umfass sind, die 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten ncRNS umfassen, weiter bevorzugt Fragmente, die aus 15 bis 99,5% der Sequenz der jeweiligen gesamten ncRNS bestehen. Weiter bevorzugt sind 2 oder mehr, weiter bevorzugt alle der Nukleinsäuren der Seq-ID Nummern 28, 29, 31-38, 39-43 und 45-51 ncRNS, wobei weiter bevorzugt für jede dieser ncRNS das gleiche bzgl. der Fragmente gilt.
Marker für die Diagnostik bzw. Prädiktion sagen voraus, ob ein Proband geeignet ist bzw. wie wahrscheinlich er eine Verbesserung durch die Kardiomyozytentherapie zeigen wird. Der Ausdruck “ Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers ” wie hier verwendet bezieht sich auf die Quantifizierung der Expressionsmenge mittels geeigneter Methoden. Wie die Expressionsmenge eines Biomarkers bestimmt wird, ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise beschrieben in Lohmann et al. (S. Lohmann et al., Methods 59 (2013) 10-19).
Bevorzugt wird die Eignung bzw. Wahrscheinlichkeit einer Verbesserung vorhergesagt, indem ein weiterer Schritt c) ausgeführt wird: c) Vorhersage der Eignung bzw. Wahrscheinlichkeit einer Verbesserung basierend auf den Resultat des Vergleichs gemäß (b).
In einer bevorzugten Ausführungsform der Methode ist Probe eines Probanden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Vollblut-Probe, Blutserum-Probe, Blutplasma-Probe und Gewebe-, insbesondere Herzgewebe-, Probe, wobei die Probe bevorzugt eine Vollblut-, Blutserum- oder Blutplasma-Probe, weiter bevorzugt eine Vollblut-Probe, ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Methode ist der Referenzwert ein vorbekannter Wert ist, welcher bevorzugt für mindestens einen anderen Probanden vor einer Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wurde, wobei für diesen mindestens einen anderen Probanden nach der Kardiomyozyten-Transplantation deren erfolgreicher Verlauf festgestellt wurde. Dem Fachmann ist es, wie oben zum ersten Aspekt beschrieben, bekannt, wie ein erfolgreicher Verlauf einer Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Methode ist der mindestens eine Biomarker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IVNS1 ABP, Seq-ID Nr. 28, Seq-ID Nr. 29, Seq-ID Nr. 30, Seq-ID Nr. 31 , Seq-ID Nr. 32, Seq-ID Nr. 33, PINK1 , Seq-ID Nr. 34, VDAC1 P5, IFI30, ATP1 B3, Seq-ID Nr. 35, GRN, LGALS9, IFI27, Seq-ID Nr. 36, Zfp97, Pik3ap1 , und Seq-ID Nr. 38. Diese Gruppe stellt die 20 diagnostischen bzw. prädiktiven Biomarker dar, die -wie im experimentellen Teil im Detail beschrieben- aus Herzgewebe-Proben ermittelt wurden. In dieser Ausführungsform der Methode ist es bevorzugt, dass der mindestens eine Biomarker IVNS1 ABP und/oder Seq-ID Nr. 28 ist, bevorzugt IVNS1ABP. Diese zwei diagnostischen bzw. prädiktiven Marker IVNS1ABP und/oder Seq-ID Nr. 28 wurden aus den 20 voranstehend genannten Markern (aus Herzgewebe-Proben) mittels einer sogenannten „Feature selection“, Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) ermittelt. IVNS1ABP ist eine Nukleinsäure, die zwischen Mensch und Maus konserviert ist und sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden eignet.
In einer ergänzenden oder alternativen Ausführungsform der Methode ist es bevorzugt, dass der mindestens eine Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Seq-ID Nr. 39, SNORA79, Seq-ID Nr. 40, Seq-ID Nr. 41 , SNORD35B, Seq-ID Nr. 42, ATP1 B3, Seq-ID Nr. 42, Seq-ID Nr. 44, Seq-ID Nr. 45, SERP1 , SLC46A3, RABGAP1 L, Seq-ID Nr. 46, Seq-ID Nr. 47, Seq-ID Nr. 48, MT-TH, Seq-ID Nr. 49, Seq-ID Nr. 50 und Seq-ID Nr. 51. Diese Gruppe stellt die 20 diagnostischen bzw. prädiktiven Biomarker dar, die -wie im experimentellen Teil im Detail beschrieben- aus Blutproben ermittelt wurden. In dieser Ausführungsform der Methode ist es bevorzugt, dass der mindestens eine Biomarker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SNORD35B, ATP1 B3, Seq-ID Nr. 44, MT-TH, und Seq-ID Nr. 49. Diese fünf diagnostischen bzw. prädiktiven Marker wurden aus den 20 voranstehend genannten Markern (aus Blutproben) mittels einer sogenannten „Feature selection“, Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) ermittelt. Bevorzugt ist der mindestens eine Biomarker aus der Gruppe bestehend aus SNORD35B, ATP1 B3, Seq-ID Nr. 44 und MT-TH, ausgewählt. Diese vier Nukleinsäuren sind zwischen Mensch und Maus konserviert und eignen sich daher besonders für die Anwendung des Verfahrens bei einem menschlichen Probanden.
Bevorzugt wird bei der Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten- Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (b) bestimmten Änderung der Expression mindestens eines Biomarkers um mindestens 0,01 , bevorzugt um mindestens 0,1 , der Proband als geeignet für eine Kardiomyozyten- Transplantation bestimmt wird.
Die Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, ist bevorzugt eine ex vivo oder in vitro Methode, weiter bevorzugt eine in vitro Methode. Der Proband ist bevorzugt ein Säugetier, weiter bevorzugt ein Mensch oder eine Maus. In einer Ausführungsform ist der Proband bevorzugt ein Mensch, in einer alternativen Ausführungsform ist der Proband bevorzugt eine Maus. Als Maus wird bevorzugt Mus musculus verstanden. Gleiches gilt für den anderen Probanden.
Die Methode kann einen oder mehrere weitere Schritte, ergänzend zu den oben genannten, umfassten. Beispielsweise können Vorbehandlungsschritte oder eine Evaluierung der erhaltenen Ergebnisse umfasst sein. Die Methode kann manuell oder Geräte-assistiert durchgeführt werden. Vorzugsweise werden (a), (b) und/oder (c) vollständig oder teilweise Geräte-assistiert durchgeführt, beispielsweise unter Verwendung einer geeigneten robotischen bzw. sensorischen Ausrüstung für (a) und/oder einem computer-implementierten Vergleich in (b) bzw. (c). Die Erfindung wird nachfolgend weiter anhand der durchgeführten Untersuchungen beschrieben, ohne sie hierauf zu beschränken.
Experimenteller Teil
1 Methoden
1.1 Verwendete Mausstämme
Für die Studie wurden 8-12 Wochen alte C57BL/6J-Mäuse (= „Black 6“ i.e.BL6, Charles River, Deutschland) und B6.RAG2deLMäuse (= RAG2del, Jackson-Labor, USA) verwendet, die vor der Verwendung unter pathogen-freien Bedingungen mit Nahrung und Wasser ad libitum gehalten wurden. Alle Tierversuche wurden vom örtlichen Tierschutzausschuss des Landesamtes für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern (LALLF) genehmigt (Zulassungsnummer. LALLF M-V / TSD / 7221.3-1-015 / 15).
1.2 Neugeborenen-Kardiomyozyten-Isolierung (neonatale GFP-Kardiomyozyten)
Ventrikel wurden aus transgenen B6.eGFP-Mäusen von Neugeborenen entnommen, zerkleinert und Einzelzellsuspensionen unter Verwendung des primären Kardiomyozyten- Isolierungskits von Pierce (Thermo Fisher Scientific, USA) hergestellt. 1 (kons.)106 Zellen dieser neonatalen GFP-Kardiomyozyten wurden dann in 20 mI Matrigel zur Injektion suspendiert.
1.3 Chirurgische Prozedur - Induzierung Myokardinfarkt und Kardiomyozyten- Transplantation
Die Mäuse wurden mit einer intraperitonealen Verabreichung von Pentobarbital (50 mg / kg Körpergewicht) und einer subkutanen Verabreichung von Fentanyl (2 ug / kg Körpergewicht) anästhesiert. Sie wurden intubiert und der Brustkorb geöffnet. Nach der Thorakotomie wurde ein permanenter Myokardinfarkt durch Ligation der linken anterioren absteigenden Koronararterie (LAD) induziert. Die Naht wurde in der Sham-Gruppe ohne Ligation im Herzen belassen. Drei Tage nach der anfänglichen Thorakotomie wurden entweder 1 x106 neonatale GFP-Kardiomyozyten suspendiert in 20 mI Matrigel (Corning, Berlin, Deutschland) (MIC und MIC + I) oder nur Matrigel (Sham und Ml) in vier getrennten Injektionen intramyokardial um die Peri-Infarkt-Grenzzone injiziert. Nach diesen Eingriffen wurde der Brustkorb geschlossen und die Haut mit einer resorbierbaren Naht vernäht. Vetalgin (Metamizol) wurde als Analgetikum verabreicht, indem es in das Trinkwasser eingemischt wurde. In der MIC + I-Gruppe wurde die Hemmung der Infiltration von Monozyten in das Herz mit der oralen Verabreichung eines CCR2-lnhibitors (RS504393; Sigma-Aldrich, USA) zweimal täglich (2 mg / kg Körpergewicht) für fünf Tage nach Ml durchgeführt („Ml“: Myokard-Infarkt induziert; „C“: Kardiomyozyten transplantiert; „I“: Inhibitor verabreicht).
1.4 Experimentelle Anordnung des Microarray’s
Die RNS-Integrität wurde unter Verwendung des Agilent Bioanalyzer 2100 mit dem RNS-Pico- Chip-Kit (Agilent Technologies, USA) bewertet. Für die Microarray-Analyse wurden 200 ng isolierte RNS-Proben aufgetragen und die Hybridisierung wie zuvor beschrieben durchgeführt1. Die Hybridisierung wurde auf Affymetrix Clariom™ D-Arrays gemäß den Anweisungen des Herstellers (Thermo Fisher Scientific, USA) durchgeführt.
1.5 Microarray Datenanalyse
Die Microarray-Datenanalyse wurde mit der bereitgestellten Transcriptome Analysis Console Software von Thermo Fischer Scientific (Version 4.0.1) durchgeführt. Die Analyse umfasste Qualitätskontrolle, Datennormalisierung und statistische Tests auf differentielle Expression mit Hilfe des Limma Paketes 2. Die Transkripte werden als signifikant unterschiedlich exprimiert eingestuft sofern eine zweifach höhere oder niedrigere Änderung des „Fold-Change“ (FC), eine „False-Discovery-Rate“ (FDR) kleiner als 0,5 sowie ein p-Wert kleiner als 0,05 vorliegen.
1.6 Anwendung maschinellen Lernens zur Identifizierung von Biomarkern
Die Identifizierung der Biomarker und die Klassifizierung der vorliegenden Daten wurden mithilfe von überwachten und nicht-überwachten Algorithmen für maschinelles Lernen (machine learning, ML) erzielt 3. Die Daten wurden vorverarbeitet indem Biomarker mit geringer Veränderung zwischen den Gruppen entfernt wurden, um die Dimensionalität gemäß den Empfehlungen für bewährte ML Analyseverfahren zu reduzieren. Die folgenden überwachten Algorithmen wurden mit den spezifischen Daten verglichen: Lasso, AdaBoost, Support Vector Machines (SVM) und Random Forest (RF) 4. Kleine Datensätze sind häufig anfällig für Überanpassungen, deshalb wurden Klassifikatoren verwendet, die für das Training mit kleinen Datensätzen geeignet sind, um Merkmale zu vergleichen, für die nur wenig T raining erforderlich ist, und der jeweils am besten geeignete Algorithmus bzw. eine Kombination von Algorithmen wurde entsprechend der Genauigkeit und Robustheit gegen Überanpassung ausgewählt 5. Überwachte ML-Modelle wurden zehnfach kreuzvalidiert und durch sogenannte „Receiver Operating Characteristic“ (ROC) Kurven für binäre Klassifizierungen verglichen. „Principal Component Analysis“ (PCA), „t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding“ (t-SNE) und „Uniform Manifold Approximation and Projection“ (UMAP) wurden zur nicht-überwachten ML-Klassifizierung und nicht linearen Dimensionsreduktion verwendet67
2 Ergebnisse - Identifikation von Biomarkern, die als potenzielle Marker für die Überwachung der Herzzelltherapie verwendet werden können Ein auf Maschinellem Lernen (ML) basierender Ansatz zur Merkmalsauswahl wurde angewendet, um die Wichtigkeit der identifizierten signifikant unterschiedlich exprimierten Biomarker unabhängig zu bewerten8. Das resultierende ML-Modell wurde kreuzvalidiert und erhielt eine sehr gute Prognoseleistung von 91 ,6% AUC („AUC“ = Fläche unter der Kurve, englisch: Area Under the Curve).
Um die identifizierten Biomarker zu verstehen, die für die Zelltransplantation wichtig sind und um den möglichen zugrunde liegenden Mechanismus zu verstehen, wurden die mit Zellen behandelten Mäuse mit den unbehandelten Mäusen verglichen und eine hohe Korrelation der jeweiligen Genexpression mit der Zelltransplantation festgestellt, was auf 20 Transkripte (Biomarker) hindeutete als wichtige Faktoren für den Wirkmechanismus von transplantierten Kardiomyozyten, die nachfolgend in Tabelle 1 gelistet sind. Es war ersichtlich, dass der Algorithmus nicht gegen die Mausstämme voreingenommen war, so dass keines dieser Transkripte signifikant mit den Unterschieden zwischen den Mauslinien korrelierte (BL6 und RAG2del).
Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (Ml) aus Herzgewebe bestimmten Vielfachen des Expressionswerts sind für den jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle 1 zusammengefasst. Die einzelnen Mittelwerte sind aus jeweils drei entsprechenden Messungen gemittelt. Die Werte der Rag2del Mäuse stellen dabei den Vergleich dar, bei welchem keine Verbesserung der Herzfunktion auf die Transplantation zu verzeichnen war. Der Vergleich innerhalb der jeweiligen Mausgruppe (BL6 Ml, MIC bzw. RAG2delMI, MIC) bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar. Tabelle 1
Identifizierte 20 Biomarker im Herzen - Überwachung
Figure imgf000015_0001
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Grau hinterlegt: mittels „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv anhand ihres Informationsgehaltes zur
Klassifikation der Gruppen gewichtete und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählte Marker
Fett formatiert: zwischen Mensch und Maus konservierte Marker
Im Herzen schlossen die 20 Biomarker dies die Beteiligung von Npas2, Med13 als Transkriptionsfaktoren ein; Slc41a3 als mitochondrialer Mg2+-Transporter zusammen mit CCL7, auch bekannt als MCP-3 als Chemokin für die Makrophageninfiltration und andere ncRNSs als wichtige Ziele. Die meisten dieser Ziele unterschieden sich auch nach der Transplantation von Kardiomyozyten nur in den C57BL / 6J-Mäusen signifikant, was möglicherweise ihre überlegene Wirksamkeit bei der Funktionsverbesserung im Vergleich zu Rag2deLMäusen erklärt. Nur drei Transkripte (Mfge8, Angptl7 und ncRNS: TC0900002242) korrelieren positiv mit der Kardiomyozyten-Transplantation, während die anderen 17 Ziele negativ korrelieren. Mit der Kombination der Transkripte Mfge8, CCL7, der Vorläufer-miRNS (Gm24643) und der ncRNS (TC0600000166) konnte mit einer Genauigkeit von 92,4% (AUC 91,6%) vorhergesagt werden, dass die Transplantation von Kardiomyozyten durch ihre Wirkung beeinflusst auf diese Ziele im Herzen wurde. Interessant waren auch die relativen Expressionswerte dieser Transkripte. Gm24643 wies nur eine gering vorhergesagte Konservierungsrate und keine mir-ähnlichen Haarnadelregionen auf, lag jedoch interessanterweise in der Nähe der vorhergesagten Bindungsstellen von Statl , Gatal, Foxil und Foxd3. Die ncRNS (TC0600000166) bezog sich jedoch auf das KCND2-Transkript Dtassium Voltage Gated Channel Subfamily, D-Mitglied 2) beim Menschen, einschließlich der vorhergesagter mir-ähnlicher Haarnadelstrukturen.
Blut identifizierte die Analyse einen anderen Satz von 20 Biomarkern, von denen diev.ehrheit ncRNSn waren. Die 20 identifizierten Biomarker sind nachfolgend in Tabelle 2 aufgelistet. Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (Ml) aus Blut bestimmten Vielfachen des Expressionswerts sind für den jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle 2 dargestellt. Die einzelnen Mittelwerte sind aus jeweils drei entsprechenden Messungen gemittelt. Die Werte der Rag2del Mäuse stellen dabei den Vergleich da, bei welchem keine Verbesserung der Herzfunktion auf die Transplantation zu verzeichnen war. Der Vergleich innerhalb der jeweiligen Mausgruppe (BL6 Ml, MIC bzw. RAG2delMI, MIC) bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar. Tabelle 2
Identifizierte 20 Biomarker im Blut - Überwachung
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Grau hinterlegt: mittels „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv anhand ihres Informationsgehaltes zur
Klassifikation der Gruppen gewichtete und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählte Marker
Fett formatiert: zwischen Mensch und Maus konservierte Marker
Dies eröffnete einen neuen Weg, wie eine lokale Behandlung im Herzen eine globale Reaktion im Blut und den Zusammenhang zwischen den verschiedenen Prozessen zwischen Herz und Blut hervorruft. Mit der Kombination von Pamrl , Mir3098 und dem Vorläufer der reifen miRNS (Gm25732) konnte der Wirkungsmechanismus transplantierter Kardiomyozyten im Blut durch ihre Wirkung auf diese Targets mit einer Genauigkeit von 90,2% ausreichend vorhergesagt werden (AUC 91 ,6%). Mir3098 enthält eine 5p- (MIMAT0014917) und eine 3p- (MIMAT0014918) Region sowie eine Mir-artige Haarnadelstruktur, die gut konserviert ist. Potentiell vorhergesagte Transkriptionsfaktorbindungsstellen in der Nähe der miRNS umfassten wiederum Foxd3 und Foxil . Die Vorläufer-miRNS (Gm25732) hatte keine spezifischen Treffer in Bezug auf Haarnadelstruktur oder -konservierung, aber laut Blastn- Anteilen ebenfalls eine Sequenzhomologie von 91% mit MAPK1 (Mitogen-akti vierte Proteinkinase 1) und 91% mit SPEG (gestreifte muskelangereicherte Proteinkinase).
Aus den für Herzgewebe-Proben ermittelten 20 Biomarkern wurden durch einen sog. „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv Marker anhand ihres Informationsgehaltes zur Klassifikation der Gruppen gewichtet und bezüglich der größten rhersagegenauigkeit ausgewählt.
3 für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne irdiomyozyten-Transplantation (Ml) aus Herzgewebe bestimmten Vielfachen des pressionswerts sind für die mittels „Feature selection“ ermittelten jeweiligen Biomarker lachfolgend in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3
Biomarker im Herzgewebe - Überwachung
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Fett formatiert: zwischen Mensch und Maus konserviert Die humanen Analoga von Gm24643, Mfge8, TC0600000166 und Ccl7 bzw. deren Kombination sind somit bevorzugte Biomarker für die Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation nach Myokard-Infarkt, insbesondere wenn Herzgewebe- Proben (eines Probanden, bevorzugt in vitro, untersucht werden). Da insbesondere Mfge8, TC0600000166, Ccl7 im Vergleich zum Menschen konservierte RNS sind, ist insbesondere diese Gruppe, einzelne dieser Marker und Kombinationen von zwei oder mehr, für die Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation nach Myokard-Infarkt im Menschen einsetzbar.
Aus den für Blut-Proben ermittelten 20 Biomarkern wurden durch einen sog. „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv Marker anhand ihres Informationsgehaltes zur Klassifikation der Gruppen gewichtet und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählt.
Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (Ml) aus Blut bestimmten Vielfachen des Expressionswerts id für die mittels „Feature selection“ ermittelten jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle largestellt. belle 4 omarker im Blut - Überwachung
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Fett formatiert: zwischen Mensch und Maus konserviert
Die humanen Analoga von Gm25732, Mir3098 und Pamrl bzw. deren Kombinationen sind somit bevorzugte Biomarker für die Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten- Transplantation nach Myokard-Infarkt, insbesondere wenn Blut-Proben (eines Probanden, bevorzugt in vitro, untersucht werden). Da nur Mir3098 und Pamrl im Vergleich zum Menschen konserviert sind, sind insbesondere einer oder mehrere dieser Biomarker für die Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation nach Myokard-Infarkt im Menschen einsetzbar.
3 Ergebnisse - Identifikation von Biomarkern, die als potenzielle diagnostische bzw. prädiktive Marker für die Vorhersage der Erfolgsaussichten einer Herzzelltherapie verwendet werden können bzw. für die Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist
Um die Biomarker zu verstehen, die für die Erklärung der beobachteten Unterschiede zwischen C57BL / 6J- und Rag2deLMäusen unter ischämischen Bedingungen und bei der Transplantation von Kardiomyozyten wichtig sind, wurden die C57BL / 6J-Mäuse mit den Rag2deLMäusen unabhängig von ihrem Behandlungsstatus (mit induziertem Myokardinfarkt (Ml) oder mit induziertem Myokardinfarkt und transplantierten Kardiomyozyten (MIC) verglichen. Diese könnten als potenzielle diagnostische Marker zur Messung des nachteiligen Umbaus des Herzens und der Wirksamkeit der Kardiomyozyten-Transplantation und damit zur Schichtung der für Zelltransplantationsstudien geeigneten Patienten verwendet werden, da die Mausmodelle deutlich unterschiedliche funktionelle Ergebnisse aufweisen. Jeweils 20 Biomarker wurden in Herzgewebe und in Blut identifiziert und sind nachfolgend in Tabelle 5 und Tabelle 6 gelistet, deren Expression mit den Unterschieden zwischen den Mäusen C57BL / 6J und Rag2del korrelierte - diese Ziele wurden als mögliche Ursachen für Variationen zwischen diesen Mausmodellen festgestellt. Es war ersichtlich, dass keines dieser Merkmale mit den Unterschieden korrelierte, die allein aufgrund einer Kardiomyozyten-Transplantation (Zellen) beobachtet wurden.
Im Herzgewebe umfassten die 20 Biomarker eine Zusammenführung von Transkripten, die an Prozessen beteiligt sind, die von Apoptoseregelung (Pinkl , Ivnslabp und Ifi27), Antigenverarbeitung (Ifi30), mitochondrialen lonenkanälen (Vdac3) und Transkriptions regulation (Zfp97) reichen. ATPase-Aktivität (Atp1 b3), Immunzellaktivierung sowie Regulation (Lgals9, Pik3ap1 , Ighv7-1) und lysosomale Funktion (Grn) zusammen mit anderen nicht- kodierenden RNSRNSn.
Im Blut wurden verschiedene kleine RNSn und nicht-kodierende RNSn identifiziert, die als wertvolle diagnostische Marker dienen könnten. Interessanterweise ist Atp1b3 auch ein Marker im Blut. Abgesehen davon sind Slc46a3, das am Transmembrantransport beteiligt ist, und Serpl , das an der ER-Translokation beteiligt ist, wichtige Indikatoren im Blut. Zwei weitere vielversprechende Ziele, die im Blut identifiziert wurden, sind Snord35b (kleine nukleolare RNS) und mt-Th (mitochondriale tRNS).
Aus den für Herzgewebe-Proben ermittelten 20 Biomarkern wurden durch einen sog. „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv Marker anhand ihres Informationsgehaltes zur Klassifikation der Gruppen gewichtet und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählt.
Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (Ml) aus Herzgewebe bestimmten Vielfachen des Expressionswerts sind für den jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle 7 zusammengefasst. Die einzelnen Mittelwerte sind aus jeweils drei entsprechenden Messungen gemittelt. Die Werte der Rag2del Mäuse stellen dabei den Vergleich da, bei welchem keine Verbesserung der Herzfunktion auf die Transplantation zu verzeichnen war. Der Vergleich RAG2del Ml vs. BL6MI stellt die Unterschiede in der Expression dieser Marker dar, um die Probanden (vor der Transplantation) zu identifizieren, die wahrscheinlich nicht positiv auf die Transplantation reagieren werden; der Vergleich bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar. Der Vergleich RAG2del MIC vs. BL6MIC stellt die Unterschiede in der Expression dieser Marker dar, um festzustellen, ob die Probanden positiv oder negativ auf die Kardiomyozytentransplantation reagieren; der Vergleich bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar.
Die „Feature selection“ auf Basis der 20 Biomarker aus dem Herzgewebe ergab die Kombination von Ivnslabp und Vorläufer-miRNS (Gm25035), welche als diagnostischer Marker identifiziert werden konnte, anhand dessen das Ergebnis einer Kardiomyozyten- Transplantation im Herzen mit einer Genauigkeit von 93,7% (AUC 91 ,9%) vorhersagbar ist.
Aus den für Blut-Proben ermittelten 20 Biomarkern wurden ebenfalls durch einen sog. „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv Marker anhand ihres Informationsgehaltes zur Klassifikation der Gruppen gewichtet und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählt.
Die für die jeweiligen myokardinfarkt-induzierten Mäuse, jeweils mit (MIC) und ohne Kardiomyozyten-Transplantation (Ml) aus Blut bestimmten Vielfachen des Expressionswerts sind für den jeweiligen Biomarker nachfolgend in Tabelle 8 zusammengefasst. Die einzelnen Mittelwerte sind aus jeweils drei entsprechenden Messungen gemittelt. Die Werte der Rag2del Mäuse stellen dabei den Vergleich da, bei welchem keine Verbesserung der Herzfunktion auf die Transplantation zu verzeichnen war. Der Vergleich RAG2del Ml vs. BL6MI stellt die Unterschiede in der Expression dieser Marker dar, um die Probanden (vor der Transplantation) zu identifizieren, die wahrscheinlich nicht positiv auf die Transplantation reagieren werden; der Vergleich bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar. Der Vergleich RAG2del MIC vs. BL6MIC stellt die Unterschiede in der Expression dieser Marker dar, um festzustellen, ob die Probanden positiv oder negativ auf die Kardiomyozytentransplantation reagieren; der Vergleich bzgl. der Vervielfältigung der Expression bzw. die Differenz der jeweiligen Vielfachen der Expression stellt das relevante Vielfache dar.
Die „Feature selection“ auf Basis der 20 Biomarker aus Blut ergab die Kombination von Mir3471-2, Atp1b3, Snord35b, mt-Th und nicht-kodierende RNS (LOC100861878), welche als diagnostischer Marker identifiziert werden konnte, anhand dessen das Ergebnis einer Kardiomyozyten-Transplantation im Herzen mit einer Genauigkeit von 86,6 % (AUC 70,7%) vorhersagbar ist.
abelle 5 iomarker aus Herzgewebe - Prädiktion
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rau hinterlegt: mittels „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv anhand ihres Informationsgehaltes zur
Klassifikation der Gruppen gewichtete und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählte Marker ett formatiert: zwischen Mensch und Maus konservierte Marker
abelle 6 iomarker aus Blut - Diagnose
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Figure imgf000029_0001
rau hinterlegt: mittels „Feature selection“ Algorithmus (AdaBoost und Random Forest) selektiv anhand ihres Informationsgehaltes zur
Klassifikation der Gruppen gewichtete und bezüglich der größten Vorhersagegenauigkeit ausgewählte Marker ett formatiert: zwischen Mensch und Maus konservierte Marker
Tabelle 7
Biomarker aus Herzgewebe - Prädiktion
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Fett formatiert: zwischen Mensch und Maus konservierte Marker Tabelle 8
Biomarker aus Blut - Prädiktion
Figure imgf000030_0002
Fett formatiert: zwischen Mensch und Maus konservierte Marker
Zitierte Literatur
WO 2015/061568 A1 US 9,663,764 B2 WO 2014/078414 A1 US 8,415,155 B2 EP 3 105350 A2
S. Lohmann et al., Methode 59 (2013) 10-19
1. Koczan D, Fitzner B, Zettl UK, Hecker M. Microarray data of transcriptome shifts in blood cell subsets during S1P receptor modulator therapy. Sc7£ / 2018;5:180145.
2. Ritchie ME, Phipson B, Wu D, Hu Y, Law CW, Shi W, Smyth GK. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nuc/eic Acids Res 2015;43:e47-e47.
3. Kuhn M. Building Predictive Models in R Using the caret Package. J Stat Softw2QQQ\ 28. 4. Forman G, Cohen I. Learningfrom Little: Comparison of Classifiers Given Little Training.
2004. p. 161-172.
5. Saeb ATM, Al-Naqeb D. The Impact of Evolutionary Driving Forces on Human Complex Diseases: A Population Genetics Approach. Scientifica (Cairo) 2016;2016:1-10.
6. Mclnnes L, Healy J, Melville J. UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction. 2018;
7. Maaten L van der, Hinton G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn /?es2008;9.
8. Steinhoff G, Nesteruk J, Wolfien M, Kundt G, PERFECT Trial Investigators Group, Börgermann J, David R, Garbade J, Große J, Haverich A, Hennig H, Kaminski A, Lotz J, Mohr F-W, Müller P, Oostendorp R, Ruch U, Sarikouch S, Skorska A, Stamm C, Tiedemann G, Wagner FM, Wolkenhauer O. Cardiac Function Improvement and Bone
Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133+ Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine 2017;22:208-224.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Überwachung des Verlaufs einer Kardiomyozyten-Transplantation umfassend: ii) Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus NPAS2, Seq-ID Nr. 1, Seq-ID Nr. 2, ANGPTL7, Kcnd2, SLC41A3, MFGE8, Zbtb16, Seq-ID Nr. 3, Seq-ID Nr. 4, Seq-ID Nr. 5, Nkain2, CCL7, Seq-ID Nr. 6, MED13, Seq-ID Nr. 7, Seq-ID Nr. 8, Seq-ID Nr. 9, Cdh2, Seq-ID Nr. 10, Seq-ID Nr. 11, Seq-ID Nr. 12, Seq-ID Nr. 13, Seq-ID Nr. 14, Seq-ID Nr. 15, Seq-ID Nr. 16, Seq-ID Nr. 17, Seq-ID Nr. 18, Seq-ID Nr. 19, Seq-ID Nr. 20, Seq-ID Nr. 21, Seq-ID Nr. 22, Seq-ID Nr. 23, DHRSX, Seq-ID Nr. 24, PAMR1 , Seq-ID Nr. 24a, Seq- ID Nr. 25, Seq-ID Nr. 26, und Seq-ID Nr. 27 in einer Probe eines Probanden nach einer Kardiomyozyten-T ransplantation; ii) Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei der Referenzwert ein Wert ist, welcher anhand einer Probe des gleichen Probanden vor der Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wurde.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Proband einen Myokard-Infarkt erlitten hat.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Referenzwert ein vorbekannter Wert ist, welcher bevorzugt für mindestens einen anderen Probanden vor einer Kardiomyozyten-Transplantation bestimmt wurde, wobei für diesen mindestens einen anderen Probanden nach der Kardiomyozyten-Transplantation deren erfolgreicher Verlauf festgestellt wurde.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Vervielfachung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Gm25732 (human:SEQ ID Nr. 1), Gm24643 (human: SEQ ID Nr. 9), Mfge8 (human: MFGE8), TC0600000166 (human: Kcnd2) und Ccl7 (human: CCL7) um mindestens 0,01, bevorzugt um mindestens 0,1 , weiter bevorzugt um mindestens 0,2; und/oder, bevorzugt und, bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (ii) bestimmten Vervielfachung der Expression mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 23 und PAMR1 um weniger als 0,2, bevorzugt von weniger als 0,1, weiter bevorzugt von <0,01, ein positiver Verlauf der Kardiomyozyten-Transplantation festgestellt wird.
6. Methode zur Bestimmung, ob ein Proband für einer Kardiomyozyten-Transplantation geeignet ist bzw. ob eine Kardiomyozyten-Transplantation bei einem Probanden Aussicht auf Erfolg hat, umfassend: a) Bestimmung der Expressionsmenge mindestens eines Biomarkers ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IVNS1ABP, Seq-ID Nr. 28, Seq-ID Nr. 29, Seq-ID Nr. 30, Seq-ID Nr. 31 , Seq-ID Nr. 32, Seq-ID Nr. 33, PINK1 , Seq-ID Nr. 34, VDAC1P5,
IFI30, ATP1B3, Seq-ID Nr. 35, GRN, LGALS9, IFI27, Seq-ID Nr. 36, Zfp97,
Pik3ap1, Seq-ID Nr. 38, Seq-ID Nr. 39, SNORA79, Seq-ID Nr. 40, Seq-ID Nr. 41, SNORD35B, Seq-ID Nr. 42, ATP1 B3, Seq-ID Nr. 42, Seq-ID Nr. 44, Seq-ID Nr. 45,
SERP1 , SLC46A3, RABGAP1 L, Seq-ID Nr. 46, Seq-ID Nr. 47, Seq-ID Nr. 48, MT- TH, Seq-ID Nr. 49, Seq-ID Nr. 50 und Seq-ID Nr. 51 in einer Probe eines Probanden mit Myokard-Infarkt; b) Vergleich der in (i) bestimmten Expressionsmenge mit einem Referenzwert.
7. Methode nach Anspruch 6, wobei der Referenzwert ein vorbekannter Wert ist, welcher bevorzugt für mindestens einen anderen Probanden vor einer Kardiomyozyten- Transplantation bestimmt wurde, wobei für diesen mindestens einen anderen Probanden nach der Kardiomyozyten-Transplantation deren erfolgreicher Verlauf festgestellt wurde.
8. Methode gemäß Anspruch 6 oder 7, wobei bei einer im Vergleich mit dem Referenzwert gemäß (b) bestimmten Änderung der Expression mindestens eines Biomarkers um mindestens 0,01, bevorzugt um mindestens 0,1, der Proband als geeignet für eine Kardiomyozyten-T ransplantation bestimmt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Methode nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Probe eines Probanden ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Vollblut-Probe, Blutserum-Probe, Blutplasma-Probe und Gewebe-, insbesondere Herzgewebe-, Probe, wobei die Probe bevorzugt eine Vollblut-, Blutserum- oder Blutplasma-Probe, weiter bevorzugt eine Vollblut-Probe, ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Methode nach einem der Ansprüche 6 bis 8, welche(s) ein in vitro Verfahren bzw. eine in vitro Methode, ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Methode nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der Proband ein Säugetier, bevorzugt ein Mensch oder eine Maus, ist.
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Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006122295A2 (en) * 2005-05-11 2006-11-16 Expression Diagnostics, Inc. Methods of monitoring functional status of transplants using gene panels
EP1767652A1 (de) * 2004-06-02 2007-03-28 Keio University Genmarker und dessen verwendung
EP2292786A2 (de) * 2002-04-24 2011-03-09 XDx, Inc. Diagnose und Überwachung von Herztransplantatabstossung mittels Markerexpressionsniveaus
US20120101001A1 (en) * 2009-03-13 2012-04-26 Manikkam Suthanthiran Method to assess human allograft status from microrna expression levels
US8415155B2 (en) 2009-10-19 2013-04-09 Cellular Dynamics International, Inc. Cardiomyocyte production
WO2014078414A1 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Joseph Wu Chemically defined production of cardiomyocytes from pluripotent stem cells
WO2015061568A1 (en) 2013-10-23 2015-04-30 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Reprogramming cardiomyocytes with one transcription factor
WO2015179771A2 (en) * 2014-05-22 2015-11-26 The Scripps Research Institute Molecular signatures for distinguishing liver transplant rejections or injuries
EP3105350A2 (de) 2014-02-12 2016-12-21 Instytut Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk Transkriptomische biomarker, verfahren zur bestimmung davon und verwendung von transkriptomischen biomarkern zur individuellen risikobeurteilung der entwicklung einer herzinsuffizienz nach einem infarkt
US9663764B2 (en) 2011-10-13 2017-05-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells
WO2019016156A1 (en) * 2017-07-18 2019-01-24 Universität Rostock Zentrale Universitätsverwaltung Referat 1.1 Recht METHOD FOR PREDICTING THE RESPONSE TO CARDIOVASCULAR REGENERATION

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2292786A2 (de) * 2002-04-24 2011-03-09 XDx, Inc. Diagnose und Überwachung von Herztransplantatabstossung mittels Markerexpressionsniveaus
EP1767652A1 (de) * 2004-06-02 2007-03-28 Keio University Genmarker und dessen verwendung
WO2006122295A2 (en) * 2005-05-11 2006-11-16 Expression Diagnostics, Inc. Methods of monitoring functional status of transplants using gene panels
US20120101001A1 (en) * 2009-03-13 2012-04-26 Manikkam Suthanthiran Method to assess human allograft status from microrna expression levels
US8415155B2 (en) 2009-10-19 2013-04-09 Cellular Dynamics International, Inc. Cardiomyocyte production
US9663764B2 (en) 2011-10-13 2017-05-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of cardiomyocytes from human pluripotent stem cells
WO2014078414A1 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Joseph Wu Chemically defined production of cardiomyocytes from pluripotent stem cells
WO2015061568A1 (en) 2013-10-23 2015-04-30 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Reprogramming cardiomyocytes with one transcription factor
EP3105350A2 (de) 2014-02-12 2016-12-21 Instytut Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk Transkriptomische biomarker, verfahren zur bestimmung davon und verwendung von transkriptomischen biomarkern zur individuellen risikobeurteilung der entwicklung einer herzinsuffizienz nach einem infarkt
WO2015179771A2 (en) * 2014-05-22 2015-11-26 The Scripps Research Institute Molecular signatures for distinguishing liver transplant rejections or injuries
WO2019016156A1 (en) * 2017-07-18 2019-01-24 Universität Rostock Zentrale Universitätsverwaltung Referat 1.1 Recht METHOD FOR PREDICTING THE RESPONSE TO CARDIOVASCULAR REGENERATION

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN BIJUN ET AL: "Macrophage Smad3 Protects the Infarcted Heart, Stimulating Phagocytosis and Regulating Inflammation", CIRCULATION RESEARCH, vol. 125, no. 1, 16 May 2019 (2019-05-16), US, pages 55 - 70, XP055821822, ISSN: 0009-7330, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6681442/pdf/nihms-1529459.pdf> DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.119.315069 *
FORMAN GCOHEN I, LEARNING FROM LITTLE: COMPARISON OF CLASSIFIERS GIVEN LITTLE TRAINING, 2004, pages 161 - 172
KOCZAN DFITZNER BZETTL UKHECKER M: "Microarray data oftranscriptome shifts in blood cell subsets during S1 P receptor modulator therapy", SEI, vol. 5, 2018, pages 180145
KUHN M.: "Building Predictive Models in R Using the caret Package", J STAT SOFLW, 2008, pages 28
L. WEI ET AL: "Differential Expression of MicroRNAs During Allograft Rejection", AMERICAN JOURNAL OF TRANSPLANTATION, vol. 12, no. 5, 2 May 2012 (2012-05-02), pages 1113 - 1123, XP055134763, ISSN: 1600-6135, DOI: 10.1111/j.1600-6143.2011.03958.x *
LEMCKE HEIKO ET AL: "Mechanisms of stem cell based cardiac repair-gap junctional signaling promotes the cardiac lineage specification of mesenchymal stem cells", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 7, no. 1, 1 December 2017 (2017-12-01), XP055821714, Retrieved from the Internet <URL:https://www.nature.com/articles/s41598-017-10122-6.pdf> DOI: 10.1038/s41598-017-10122-6 *
MAATEN L VAN DERHINTON G: "Visualizing Data using t-SNE", J MACH LEARN RES, 2008, pages 9
MCLNNES LHEALY JMELVILLE J, UMAP: UNIFORM MANIFOLD APPROXIMATION AND PROJECTION FOR DIMENSION REDUCTION, 2018
RITCHIE MEPHIPSON BWU DHU YLAW CWSHI WSMYTH GK: "limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies", NUC/EIC ACIDS RES, vol. 43, 2015, pages e47 - e47
S. LOHMANN ET AL., METHODS, vol. 59, 2013, pages 10 - 19
SAEB ATMAI-NAQEB D: "The Impact of Evolutionary Driving Forces on Human Complex Diseases: A Population Genetics Approach", SCIENTIFICA (CAIRO, vol. 2016, 2016, pages 1 - 10
STEINHOFF GNESTERUK JWOLFIEN MKUNDT GBÖRGERMANN JDAVID R, GARBADE JGROSSE JHAVERICH AHENNIG HKAMINSKI A: "Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response-: Outcome Analysis ofthe Randomized PERFECT Phase 111 Clinical Trial of Intramyocardial CD133+ Application After Myocardial Infarction", EBIOMEDICINE, vol. 22, 2017, pages 208 - 224, XP002781037

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