DE102017203452B4

DE102017203452B4 - Fluoreszenzbeobachtungssystem

Info

Publication number: DE102017203452B4
Application number: DE102017203452.1A
Authority: DE
Inventors: Susanne Kohlhammer; Alois Regensburger; Jonathan Essig
Original assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Current assignee: Carl Zeiss Meditec AG
Priority date: 2017-03-02
Filing date: 2017-03-02
Publication date: 2021-09-09
Anticipated expiration: 2037-03-03
Also published as: DE102017203452A1; DE102017203452B9

Abstract

Fluoreszenzbeobachtungssystem, umfassend:einen Strahlteiler, einen ersten Kameradetektor und einen zweiten Kameradetektor;wobei der Strahlteiler in einem ersten Strahlengang zwischen einer Objektposition und dem ersten Kameradetektor angeordnet ist, in einem zweiten Strahlengang zwischen der Objektposition und dem zweiten Kameradetektor angeordnet ist und für eine gegebene Wellenlänge ein Teilungsverhältnis aufweist, welches ein Verhältnis zwischen einer Intensität von in den ersten Strahlengang geleitetem Licht der gegebenen Wellenlänge zu einer Intensität von in den Strahlteiler geleitetem Licht der gegebenen Wellenlänge angibt;wobei der Strahlteiler so konfiguriert ist,- dass ein erstes mittleres Teilungsverhältnis in einem Wellenlängenbereich zwischen einer ersten Wellenlänge und einer zweiten Wellenlänge, die größer als die erste Wellenlänge ist, einen ersten Wert aufweist,- dass ein zweites mittleres Teilungsverhältnis in einem Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und einer dritten Wellenlänge, die größer als die zweite Wellenlänge ist, einen zweiten Wert aufweist, und- dass ein drittes mittleres Teilungsverhältnis in einem Wellenlängenbereich zwischen der dritten Wellenlänge und einer vierten Wellenlänge, die größer als die dritte Wellenlänge ist, einen dritten Wert aufweist,wobei das erste Teilungsverhältnis größer als 0,8 ist;wobei das zweite Teilungsverhältnis um mehr als 0,2 kleiner ist als das erste Teilungsverhältnis;wobei das dritte Teilungsverhältnis kleiner als 0,2 ist und um mehr als 0,2 kleiner ist als das zweite Teilungsverhältnis; undwobei eine Differenz zwischen der dritten und der zweiten Wellenlänge größer als 30 nm, insbesondere größer als 50 nm und insbesondere größer als 70 nm ist.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Fluoreszenzbeobachtungssystem zum Detektieren einer oder mehrerer Fluoreszenzen. Das Mikroskopiesystem kann insbesondere als ein Operationsmikroskop ausgeführt sein, welches im Rahmen von chirurgischen Eingriffen eingesetzt wird.
Ein herkömmliches Mikroskopiesystem zur Detektion von einer Fluoreszenz oder gleichzeitig mehreren Fluoreszenzen ist aus der DE 10 2015 011 441 A1 der Anmelderin bekannt, deren Offenbarung vollumfänglich in die vorliegende Anmeldung aufgenommen wird. Die mehreren Fluoreszenzen umfassen beispielsweise Fluoreszenzen der Fluoreszenzfarbstoffe Protoporphyrin IX (PpIX), Fluorescein und Indocyaningrün (ICG). Diese Fluoreszenzfarbstoffe werden im medizinischen Bereich, insbesondere zur Einfärbung von biologischem Material, Blutzellen, Tumoren oder anderen Geweben beispielsweise auch im Labor verwendet.
Protoporphyrin IX bzw. dessen Vorläufer 5-Aminolävolinsäure (5-ALA) sind hochwirksame Marker für bestimmte Gewebearten. Deshalb ist es wünschenswert, die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX auch bei niedriger Intensität beobachten zu können. Mit dem vorangehend erläuterten herkömmlichen Mikroskopiesystem ist dies noch nicht zur vollen Zufriedenheit der Anwender möglich.
Entsprechend ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Fluoreszenzbeobachtungssystem vorzuschlagen, um eine oder mehrere Fluoreszenzen auch bei niedriger Intensität beobachten zu können.
Gemäß Ausführungsformen der Erfindung umfasst ein Fluoreszenzbeobachtungssystem einen Strahlteiler, einen ersten Kameradetektor und einen zweiten Kameradetektor, wobei der Strahlteiler in einem ersten Strahlengang zwischen einer Objektposition und dem ersten Kameradetektor angeordnet ist, in einem zweiten Strahlengang zwischen der Objektposition und dem zweiten Kameradetektor angeordnet ist und für eine gegebene Wellenlänge ein Teilungsverhältnis aufweist, welches ein Verhältnis zwischen einer Intensität von in den ersten Strahlengang geleitetem Licht der gegebenen Wellenlänge zu einer Intensität von in den Strahlteiler geleitetem Licht der gegebenen Wellenlänge angibt, wobei der Strahlteiler so konfiguriert ist, dass ein erstes mittleres Teilungsverhältnis in einem ersten Wellenlängenbereich zwischen einer ersten Wellenlänge und einer zweiten Wellenlänge, die größer als die erste Wellenlänge ist, einen ersten Wert aufweist, dass ein zweites mittleres Teilungsverhältnis in einem zweiten Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und einer dritten Wellenlänge, die größer als die zweite Wellenlänge ist, einen zweiten Wert aufweist, und dass ein drittes mittleres Teilungsverhältnis in einem dritten Wellenlängenbereich zwischen der dritten Wellenlänge und einer vierten Wellenlänge, die größer als die dritte Wellenlänge ist, einen dritten Wert aufweist, wobei das erste Teilungsverhältnis größer als 0,8 ist, wobei das zweite Teilungsverhältnis um mehr als 0,2 kleiner ist als das erste Teilungsverhältnis; wobei das dritte Teilungsverhältnis kleiner als 0,2 ist und um mehr als 0,2 kleiner ist als das zweite Teilungsverhältnis; und wobei eine Differenz zwischen der dritten und der zweiten Wellenlänge größer als 30 nm, insbesondere größer als 50 nm und insbesondere größer als 70 nm ist.
Somit wird Licht aus dem ersten Wellenlängenbereich zu einem großen Teil dem ersten Kameradetektor zugeleitet und zu einem wesentlich kleineren Teil dem zweiten Kameradetektor zugeleitet. Licht des dritten Wellenlängenbereichs wird zu einem großen Teil dem zweiten Kameradetektor zugeleitet und zu einem wesentlich kleineren Teil dem ersten Kameradetektor. Licht aus dem zweiten Wellenlängenbereich wird hingegen beiden Kameradetektoren zugeleitet.
Eine Differenz zwischen der zweiten und der ersten Wellenlänge kann beispielsweise größer als 50 nm, insbesondere größer als 80 nm und insbesondere größer als 100 nm sein. Eine Differenz zwischen der vierten und der dritten Wellenlänge kann beispielsweise größer als 50 nm, insbesondere größer als 80 nm und insbesondere größer als 100 nm sein.
Gemäß beispielhaften Ausführungsformen wird die zweite Wellenlänge, welche den ersten Wellenlängenbereich von dem zweiten Wellenlängenbereich trennt, oder die dritte Wellenlänge, welche den zweiten Wellenlängenbereich von dem dritten Wellenlängenbereich trennt, so gewählt, dass ein Fluoreszenzspektrum eines Fluoreszenzfarbstoffs, sowohl bei Wellenlängen, welche kleiner sind als die zweite Wellenlänge, als auch bei Wellenlängen, welche größer sind als die zweite Wellenlänge, oder sowohl bei Wellenlängen, welche kleiner sind als die dritte Wellenlänge, als auch bei Wellenlängen, welche größer sind als die dritte Wellenlänge, signifikante Intensitäten aufweist. Damit wird zum einen erreicht, dass Fluoreszenzlicht auf beide Kameradetektoren fällt und von beiden Kameradetektoren detektiert wird, und zum anderen wird erreicht, dass die beiden Kameradetektoren unterschiedliche Anteile des Fluoreszenzlichts in jeweils zwei verschiedenen Wellenlängenbereichen detektieren. Hierdurch ist es insbesondere möglich, die Intensitäten des Fluoreszenzlichts relativ zu anderen Strahlungsarten, die zu dem ersten und/oder dem zweiten Kameradetektor gelangen, zu separieren und insbesondere die Intensität der Fluoreszenz relativ zu den anderen Strahlungsarten zu quantifizieren. Die anderen Strahlungsarten können beispielsweise Fluoreszenzen anderer Fluoreszenzstoffe, Autofluoreszenzen oder Umgebungslicht sein.
Die dritte Wellenlänge kann beispielsweise in einem Bereich zwischen 650 nm und 680 nm oder zwischen 660 nm und 670 nm liegen. Diese Wahl der dritten Wellenlänge kann vorteilhaft sein wenn die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX beobachtet werden soll.
Die zweite Wellenlänge kann aus einem Bereich zwischen 580 nm und 620 nm oder 590 nm und 610 nm ausgewählt werden. Es gelangt dann im Wesentlichen der gesamte Anteil des Fluoreszenzlichts von Protoporphyrin IX, dessen Wellenlänge größer als die dritte Wellenlänge ist, in beide Strahlengänge und kann durch beide Kameradetektoren detektiert werden.
Die erste Wellenlänge kann hierbei beispielsweise kleiner als 500 nm sein, so dass ein großer Teil des sichtbaren Spektrums in den ersten Strahlengang gelangt und von dem ersten Kameradetektor detektiert wird. Die vierte Wellenlänge kann größer als 750 nm gewählt werden, so dass das Fluoreszenzlicht von Protoporphyrin IX, dessen Wellenlängen größer sind als die dritte Wellenlänge, zum größten Teil in den zweiten Strahlengang gelangt und damit von dem zweiten Kameradetektor detektiert wird.
Gemäß beispielhaften Ausführungsformen umfasst das Fluoreszenzbeobachtungssystem ferner einen ersten Filter, welcher in dem ersten Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem ersten Kameradetektor anordenbar ist und für eine gegebene Wellenlänge eine Transmission aufweist, wobei der erste Filter so konfiguriert ist, dass ein Produkt aus einer mittleren Transmission des ersten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der ersten Wellenlänge und der zweiten Wellenlänge und dem ersten mittleren Teilungsverhältnis des Strahlteilers in dem Wellenlängenbereich zwischen der ersten Wellenlänge und der zweiten Wellenlänge einen ersten Wert aufweist, und dass ein Produkt aus einer mittleren Transmission des ersten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und der dritten Wellenlänge und dem zweiten mittleren Teilungsverhältnis des Strahlteilers in dem Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und der dritten Wellenlänge einen zweiten Wert aufweist, wobei ein Verhältnis aus dem ersten Wert und dem zweiten Wert größer als 0,6 und kleiner als 1,7, insbesondere größer als 0,7 und kleiner als 1,4, insbesondere größer als 0,8 und kleiner als 1,25 und insbesondere größer als 0,9 und kleiner als 1,1 ist.
Hierdurch kann erreicht werden, dass die wellenlängenabhängige Transmission der in dem ersten Strahlengang vor dem ersten Kameradetektor angeordneten Komponenten für Wellenlängen in einem Wellenlängenbereich zwischen der ersten Wellenlänge und der dritten Wellenlänge, d. h. in dem ersten Wellenlängenbereich und dem zweiten Wellenlängenbereich, sich vergleichsweise wenig ändert. Hierdurch ist es möglich, dass der erste Kameradetektor vergleichsweise farbtreue Bilder des Objekts aufnehmen kann, da die Transmission der im Strahlengang vor dem ersten Kameradetektor angeordneten Komponenten nicht bestimmte Wellenlängen gegenüber anderen Wellenlängen bevorzugt transmittiert.
Gemäß beispielhaften Ausführungsformen umfasst das Fluoreszenzbeobachtungssystem ferner einen ersten Filter, welcher in dem ersten Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem ersten Kameradetektor anordenbar ist und für eine gegebene Wellenlänge eine Transmission aufweist, wobei der erste Filter so konfiguriert ist, dass ein Produkt aus einer mittleren Transmission des ersten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der ersten Wellenlänge und der zweiten Wellenlänge und dem ersten mittleren Teilungsverhältnis des Strahlteilers in dem Wellenlängenbereich zwischen der ersten Wellenlänge und der zweiten Wellenlänge einen ersten Wert aufweist, und dass ein Produkt aus einer mittleren Transmission des ersten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und der dritten Wellenlänge und dem zweiten mittleren Teilungsverhältnis des Strahlteilers in dem Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und der dritten Wellenlänge einen zweiten Wert aufweist, wobei ein Verhältnis aus dem ersten Wert und dem zweiten Wert größer als 0,6 und kleiner als 1,7, insbesondere größer als 0,7 und kleiner als 1,4, insbesondere größer als 0,8 und kleiner als 1,25 und insbesondere größer als 0,9 und kleiner als 1,1 ist.
Damit gelangt Licht, dessen Wellenlänge kleiner ist als die zweite Wellenlänge ist, in lediglich geringem Umfang zu dem zweiten Detektor, während Licht mit Wellenlängen, welche größer als die zweite Wellenlänge sind und welches von dem Strahlteiler dem zweiten Strahlengang zugeführt wird, zu einem großen Teil zu dem zweiten Detektor gelangt.
Gemäß beispielhaften Ausführungsformen umfasst das Fluoreszenzbeobachtungssystem ferner einen zweiten Filter, welcher in dem zweiten Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem zweiten Kameradetektor anordenbar ist und für eine gegebene Wellenlänge eine Transmission aufweist, wobei der zweite Filter so konfiguriert ist, dass eine mittlere Transmission des zweiten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der ersten Wellenlänge und der zweiten Wellenlänge einen Wert aufweist, der kleiner als 0,2 und insbesondere kleiner als 0,1 ist, und dass eine mittlere Transmission des zweiten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und der dritten Wellenlänge einen Wert aufweist, der größer als 0,8 und insbesondere größer als 0,9 ist.
Gemäß beispielhaften Ausführungsformen umfasst das Fluoreszenzbeobachtungssystem ferner einen dritten Filter, welcher in dem ersten Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem ersten Kameradetektor anordenbar ist und für eine gegebene Wellenlänge eine Transmission aufweist, wobei der dritte Filter so konfiguriert ist, dass eine mittlere Transmission des ersten Filters in einem Wellenlängenbereich zwischen einer fünften Wellenlänge und einer sechsten Wellenlänge einen Wert aufweist, der kleiner als 0,2 und insbesondere kleiner als 0,1 ist, wobei die sechste Wellenlänge kleiner als die erste Wellenlänge ist, die fünfte Wellenlänge kleiner als die sechste Wellenlänge ist, eine Differenz zwischen der ersten und der sechsten Wellenlänge größer als 30 nm ist und eine Differenz zwischen der sechsten und der fünften Wellenlänge größer als 10 nm ist, und dass eine mittlere Transmission des ersten Filters in einem Wellenlängenbereich zwischen der sechsten Wellenlänge und der ersten Wellenlänge einen Wert aufweist, der größer als 0,8 und insbesondere größer als 0,9 ist.
Hierdurch kann erreicht werden, dass Licht zur Anregung der Fluoreszenz von Protoporphyrin IX in nur sehr geringem Umfang zu dem ersten Kameradetektor gelangt, so dass, wenn lediglich diese Fluoreszenz beobachtet werden soll, ein Störeinfluss auf das Detektionsergebnis vermieden werden kann.
Gemäß beispielhaften Ausführungsformen ist der dritte Filter als ein von dem vorangehend erwähnten ersten Filter separates Bauteil ausgeführt, welches unabhängig von dem ersten Filter in dem ersten Strahlengang anordenbar ist. Gemäß hierzu alternativen beispielhaften Ausführungsformen ist der dritte Filter mit dem vorangehend erwähnten ersten Filter zu einem gemeinsamen Filter integriert, welcher die Eigenschaften des ersten und des dritten Filters gemeinsam erfüllt und als ein Bauteil ausgeführt ist, welches in dem ersten Strahlengang anordenbar ist.
Nachfolgend werden Ausführungsformen der Erfindung anhand von Figuren näher erläutert. Hierbei zeigt

1 eine schematische Darstellung eines Fluoreszenzbeobachtungssystems gemäß einer Ausführungsform;
2 einen Graphen, welcher ein Emissionsspektrum eines Fluoreszenzfarbstoffs und wellenlängenabhängige Eigenschaften eines Strahlteilers und von Filtern des in 1 gezeigten Fluoreszenzbeobachtungssystems schematisch darstellt.

1 zeigt eine beispielhafte Ausführungsform eines Fluoreszenzbeobachtungssystems, wobei das Fluoreszenzbeobachtungssystem als ein Mikroskopiesystem ausgeführt ist, welches Bilder und insbesondere vergrößerte Bilder eines Objekts erzeugen kann. Diese Bilder sollen insbesondere fluoreszierende Bereiche des Objekts sichtbar machen.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst wenigstens eine Lichtquelle 3, welche Licht erzeugt, um einen Lichtstrahl 5 auf einen Objektbereich 7 zu richten. In dem Objektbereich 7 ist ein Objekt 9 angeordnet, welches wenigstens einen Fluoreszenzfarbstoff enthält. In dem hier erläuterten Beispiel umfasst der wenigstens eine Fluoreszenzfarbstoff Protoporphyrin IX und eine der beobachteten Fluoreszenzen ist die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX. Das Objekt 9 kann beispielsweise menschliche oder tierische Zellen umfassen, welche in einer Zellkultur gehalten werden oder in einem Körpergewebe integriert sind. Das Protoporphyrin IX wird in den Zellen als ein Stoffwechselprodukt aus 5-ALA erzeugt.
Neben der Lichtquelle 3 umfasst das Mikroskopiesystem 1 eine Beleuchtungsoptik 11 aus einer oder mehreren Linsen, um einen auf den Objektbereich 7 gerichteten Lichtstrahl 5 zu erzeugen. In dem Strahlengang zwischen der Lichtquelle 3 und dem Objektbereich 7 ist ein optischer Filter 15 anordenbar. Die Lichtquelle 3 wird von einer Steuerung 43 über eine Steuerleitung 45 betrieben. Es kann ferner ein Aktuator, wie beispielsweise ein Motor, vorgesehen sein, der den optischen Filter 15 wahlweise in dem Strahlengang zwischen der Lichtquelle 3 und dem Objektbereich 7 anordnet oder den optischen Filter 15 aus diesem Strahlengang entfernt. Dieser Aktuator kann ebenfalls von der Steuerung 43 kontrolliert sein. Beispielsweise kann die Lichtquelle 3 weißes Licht erzeugen, um das Objekt 9 in dem Objektbereich 7 mit diesem weißen Licht zu beleuchten, so dass das Objekt 9 mit dem Auge direkt betrachtet werden kann oder Bilder von dem Objektbereich 7 aufgenommen werden können, welche das Objekt 9 mit einem natürlichen Farbeindruck zeigen. Ist der optische Filter 15 in dem Strahlengang zwischen der Lichtquelle 3 und dem Objektbereich 7 angeordnet, so kann er das Spektrum des Beleuchtungslichts in dem Strahl 5 so formen, dass im Wesentlichen nur Licht aus einem Wellenlängenbereich zu dem Objektbereich gelangt, welches der Anregung der Fluoreszenzen dient. Soll die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX angeregt werden, so liegt dieses Anregungslicht beispielsweise in einem Wellenlängenbereich zwischen 350 nm und 470 nm.
Das Mikroskopiesystem 1 umfasst ferner ein Objektiv 17, welches mehrere Linsen 27, 29 und 31 aufweist. Das Objektiv 17 dient dazu, einen von dem Objektbereich 7 ausgehenden Strahlengang 25 bereitzustellen, um den Objektbereich 7 auf zwei Kameradetektoren 21 und 23 abzubilden. Hierzu ist in dem Strahlengang 25 hinter dem Objektiv 17 ein Strahlteiler 32 angeordnet, der den Strahlengang 25 in einen ersten Strahlengang und einen zweiten Strahlengang aufteilt, wobei der erste Strahlengang von dem Objektbereich 7 zu dem ersten Kameradetektor 23 verläuft und der zweite Strahlengang von dem Objektbereich 7 zu dem zweiten Kameradetektor 21 verläuft.
In dem in 1 gezeigten Beispiel ist der Strahlteiler 32 in den Strahlengängen zwischen dem Objektiv 17 und den beiden Kameradetektoren 21 bzw. 23 angeordnet. Alternativ hierzu ist es möglich, dass der Strahlteiler nicht im Strahlengang hinter einem Objektiv angeordnet ist sondern vor einem solchen. Dann teilt der Strahlteiler den von dem Objektbereich ausgehenden Strahlengang in zwei Teilstrahlengänge auf, wobei in einem ersten Strahlengang ein erstes Objektiv und der erste Kameradetektor angeordnet ist und in dem zweiten Strahlengang ein zweites Objektiv und der zweite Kameradetektor angeordnet ist.
Der Strahlteiler 32 ist ein dichroitischer Strahlteiler, was bedeutet, dass er für den ersten und den zweiten Strahlengang verschiedene wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristiken bereitstellt, wie sie nachfolgend im Zusammenhang mit der 2 erläutert werden.
Ein erster optischer Filter 35 ist lediglich in dem ersten Strahlengang zwischen dem Objekt 9 und dem ersten Kameradetektor 23 angeordnet, ein zweiter optischer Filter 34 ist lediglich in dem ersten Strahlengang zwischen dem Objekt 9 und dem zweiten Kameradetektor 21 angeordnet, und ein dritter optischer Filter 37 ist ebenfalls lediglich in dem ersten Strahlengang zwischen dem Objekt 9 und dem ersten Kameradetektor 23 angeordnet. Die optischen Filter 34, 35 und 37 können jeweils fest in den Strahlengängen angeordnet sein oder wahlweise in den Strahlengängen angeordnet werden und aus diesen entfernt werden, wobei hierzu wiederum Aktuatoren vorgesehen sein können, welche von der Steuerung 43 kontrolliert werden. Auch die Filter 34, 35 und 37 stellen wellenlängenabhängige Durchlasscharakteristiken bereit, wie sie nachfolgend im Zusammenhang mit der 2 erläutert werden.
In 2 repräsentiert eine Linie 51 das Emissionsspektrum von Protoporphyrin IX in willkürlichen Einheiten. Es ist ersichtlich, dass das Emissionsspektrum zwei Peaks aufweist, die links bzw. rechts eines Minimums angeordnet sind, welches zwischen einem ersten Maximum bei etwa 640 nm und einem zweiten Maximum bei etwa 700 nm liegt. Das Minimum liegt bei etwa 660 nm.
Eine Linie 53 in 2 repräsentiert ein durch den Strahlteiler 32 für den ersten und den zweiten Strahlengang bereitgestelltes Teilungsverhältnis. Das Teilungsverhältnis gibt an, in welchem Verhältnis von dem Objekt 9 in den Strahlteiler 32 eintretendes Licht einer gegebenen Wellenlänge λ in den ersten Strahlengang ausgegeben wird. In dem anhand der 2 erläuterten Beispiel wird Licht mit Wellenlängen, die kleiner sind als eine Wellenlänge λ₂, von dem Strahlteiler 32 im Wesentlichen zu 100 % in den ersten Strahlengang, d. h. hin zu dem ersten Kameradetektor 23 ausgegeben. Insbesondere weist das Teilungsverhältnis des Strahlteilers 32 in einem ersten Wellenlängenbereich zwischen einer Wellenlänge \ und der Wellenlänge λ₂ einen Mittelwert von nahezu 1,0 auf. Der Mittelwert des Teilungsverhältnisses in einem gegebenen Wellenlängenbereich wird auf übliche Weise durch Integration des wellenlängenabhängigen Teilungsverhältnisses über den Wellenlängenbereich berechnet.
Bei Wellenlängen, die größer sind als eine Wellenlänge λ₃ weist das Teilungsverhältnis Werte von im Wesentlichen 0,0 auf. Dies bedeutet, dass im Wesentlichen das gesamte Licht in diesem Wellenlängenbereich in den zweiten Strahlengang gelangt und somit hin zu dem zweiten Kameradetektor 21 ausgegeben wird. Insbesondere weist das Teilungsverhältnis in einem Wellenlängenbereich zwischen der Wellenlänge λ₃ und einer Wellenlänge λ₄ einen Mittelwert von fast 0,0 auf.
In dem Wellenlängenbereich zwischen der Wellenlänge λ₂ und der Wellenlänge λ₃ sinkt das Teilungsverhältnis von dem hohen Wert, den es in den Wellenlängenbereich zwischen λ₁ und λ₂ aufweist, auf den niedrigen Wert, den es in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₃ und λ₄ aufweist. In den in 2 dargestellten Beispiel erfolgt die Verringerung des Teilungsverhältnisses in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₂und λ₃ in zwei Stufen derart, dass das Teilungsverhältnis zunächst auf einen Wert von etwa 0,5 abfällt, dort über einen Wellenlängenbereich einer Breite von etwa 50 nm verbleibt und schließlich auf 0,0 abfällt. Varianten hiervon sind allerdings möglich. Beispielsweise kann das Teilungsverhältnis bei anderen Werten als 0,5 über einen gewissen Wellenlängenbereich auf einem in etwa konstanten Wert verweilen. Ferner ist es möglich, dass das Teilungsverhältnis in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₂ und λ₃ kontinuierlich von dem hohen Wert auf den niedrigen Wert abfällt. Allerdings soll das Teilungsverhältnis nicht innerhalb eines schmalen Wellenlängenbereichs, der eine Breite von weniger als 30 nm oder weniger als 20 nm aufweist, von dem hohen Wert auf den niedrigen Wert sinken. Diese Eigenschaft des Verlaufs des Teilungsverhältnisses in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₂ und λ₃ kann dadurch ausgedrückt werden, dass in diesem Bereich der Mittelwert des Teilungsverhältnisses um 0,2 kleiner ist als der Mittelwert des Teilungsverhältnisses in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₁ und λ₂ und um wenigstens 0,2 größer ist als das Teilungsverhältnis in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₃ und λ₄. Hierbei soll der Mittelwert des Teilungsverhältnisses in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₁ und λ₂ größer als 0,8 sein und es soll in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₃ und λ₄ kleiner als 0,2 sein.
In dem in 2 erläuterten Beispiel werden folgende Werte für die Wellenlängen verwendet: \ gleich 490 nm, λ₂ gleich 595 nm, λ₃ gleich 680 nm und λ₄ gleich 770 nm.
Durch diese Gestaltung des Teilungsverhältnisses des Strahlteilers 32 wird erreicht, dass Fluoreszenzlicht des zweiten Peaks mit Wellenlängen, die größer sind als die Wellenlänge des Minimums, im Wesentlichen dem Kameradetektor 21 zugeführt wird. Dieses Fluoreszenzlicht liegt im Infrarotbereich des Spektrums und ist mit dem Auge kaum wahrnehmbar. Der Kameradetektor 21 ist deshalb als Detektor für Licht im nahen Infrarot ausgelegt und kann für die Detektion von Licht aus diesem Wellenlängenbereich optimiert sein.
Durch die Gestaltung des Teilungsverhältnisses des Strahlteilers 32 wird ferner erreicht, dass Fluoreszenzlicht des ersten Peaks mit Wellenlängen, die kleiner sind als die Wellenlänge des Minimums, beiden Kameradetektoren 23 und 21 zugeführt wird. Dieses Licht liegt im roten Bereich des sichtbaren Spektrums und kann von einer Farbkamera, die farbtreue Bilder eines Objekts liefert, detektiert werden. Deshalb ist der Kameradetektor 23 der Kameradetektor einer Farbkamera, welche Licht des gesamten sichtbaren Bereichs des Spektrums detektieren kann. Hierzu kann der Kameradetektor 23 ein Feld von Detektorpixeln aufweisen, welche verschiedene spektrale Empfindlichkeiten aufweisen. Üblicherweise sind zu diesem Zweck vor den Detektorpixeln optische Filter mit verschiedenen Durchlasscharakteristiken in einem regelmäßigen Muster angeordnet. Eine Anordnung solcher Filter wird als Bayer-Pattern bezeichnet. Es ist jedoch auch möglich, dass der Strahlengang hinter dem Filter 37 durch weitere dichroitische Strahlteiler derart aufgeteilt wird, dass Licht verschiedener Wellenlängenbereiche auf verschiedene Kameradetektoren trifft und durch diese separat detektiert wird. Beispielsweise kann ein Kameradetektor für rotes Licht, ein Kameradetektor für grünes Licht und ein Kameradetektor für blaues Licht vorgesehen sein.
In sämtlichen Fällen sind die Kameradetektoren, welche in dem ersten Strahlengang und dem zweiten Strahlengang angeordnet sind, ortsauflösende Kameradetektoren, so dass sie ortsaufgelöste Bilder des Objekts detektieren können.
Eine Linie 55 in 2 zeigt die wellenlängenabhängige Transmission des Filters 35, welcher in dem ersten Strahlengang vor dem Kameradetektor 23 angeordnet ist. In dem in 2 gezeigten Beispiel weist die Transmission des Filters 35 einen Wert von 0,5 auf für Wellenlängen, die kleiner sind als λ₂ und bei denen das Teilungsverhältnis des Strahlteilers 32 den hohen Wert von nahezu 1,0 aufweist.
In dem Wellenlängenbereich zwischen λ₂ und λ₃ weist die Transmission des Filters 35 in weiten Bereichen einen maximalen Wert von nahezu 1,0 auf. Für Wellenlängen, die größer als λ₃ sind, weist die Transmission des Filters 35 Werte nahe 0,0 auf. Wesentlich hierbei ist, dass sich das Produkt aus der Transmission 55 des Filters 35 und dem Teilungsverhältnis 53 des Strahlteilers 32 in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₁ und λ₃ nicht stark ändert. Diese Änderung kann beispielsweise durch ein Verhältnis zwischen diesem Produkt in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₁ und λ₂ und dem Produkt in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₂ und λ₃ ausgedrückt werden. Hierbei wird das Produkt in dem jeweiligen Wellenlängenbereich durch Multiplizieren des Mittelwerts der Transmission in diesem Bereich mit dem Mittelwert des Teilungsverhältnisses in diesem Bereich berechnet. Das dann entstehende Verhältnis soll zwischen 0,6 und 1,7, insbesondere zwischen 0,7 und 1,4, insbesondere zwischen 0,8 und 1,25 und insbesondere zwischen 0,9 und 1,1 liegen.
Wenn der wellenlängenabhängige Verlauf des Teilungsverhältnisses des Strahlteilers 32 von dem in 2 gezeigten Verlauf abweicht, wird entsprechend der Verlauf der wellenlängenabhängige Transmission des Filters 35 so geändert, dass das oben beschriebene Verhältnis eingehalten wird.
Da das Teilungsverhältnis des Strahlteilers 32 in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₂ und λ₃, welcher sichtbares rotes Licht enthält, von dem hohen Wert in dem Wellenlängenbereich zwischen \ und λ₂ auf den niedrigen Wert in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₃ und λ₄ abfällt, kann bei gewissen abgebildeten Objekten eine Situation entstehen, in der das von dem Kameradetektor 23 gelieferte Bild nicht als farbtreues Bild des Objekts erscheint, da rotes Licht in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₂ und λ₃ im Vergleich zu beispielsweise blauem und grünem Licht mit einem geringeren Anteil zu dem Kameradetektor 23 gelangt. Im Hinblick auf eine möglichst farbtreue Wiedergabe des Objekts in dem Bild kann es ferner ungünstig sein, wenn die Detektionseffizienz des ersten Kameradetektors für von dem Objekt ausgehendes Licht in dem Wellenlangenbereich des sichtbaren roten Teils des Spektrums im Wesentlichen ungleichförmig ist. Um diesen Effekt zu kompensieren ist der Filter 35 mit der durch die Linie 55 in 2 repräsentierten wellenlängenabhängigen Transmission vorgesehen. Der Filter 55 reduziert die Intensität des Lichts mit Wellenlängen, die kleiner sind als λ₂, und welches auf den Kameradetektor 23 trifft und kompensiert damit die farbverfälschende Wirkung des Strahlteilers 32.
Eine Linie 57 in 2 repräsentiert die wellenlängenabhängige Transmission des Filters 34 im zweiten Strahlengang vor dem Kameradetektor 21. Die Transmission des Filters 34 ist für Wellenlängen, die kleiner sind als λ₂, gering und liegt in dem 2 erläuterten Beispiel nahe bei 0,0. In dem Wellenlängenbereich zwischen λ₂und λ₃ ist die Transmission des Filters 34 erhöht und liegt nahe bei 1,0. Für Wellenlängen, die größer sind als λ₃ und insbesondere in dem Wellenlängenbereich zwischen λ₃ und λ₄ liegen, ist die Transmission des Filters 34 etwa 0,5. Hierdurch wird erreicht, dass das Fluoreszenzlicht der beiden Peaks zu gleichen Anteilen durch den Kameradetektor 21 detektiert wird.
Das Mikroskopiesystem 1 kann auf verschiedene Weisen benutzt werden. Zunächst kann das Mikroskopiesystem 1 dazu verwendet werden, ein farbtreues Bild des Objekts 9 zu erzeugen. Hierzu wird das von dem Kameradetektor 23 aufgenommene Bild verwendet. Wenn der Filter 35 im ersten Strahlengang angeordnet ist, führt dessen Wirkung dazu, dass Licht aus sämtlichen Wellenlängenbereichen des sichtbaren Lichts, d. h. beispielsweise rotes Licht, grünes Licht und blaues Licht, zu jeweils gleichen Anteilen zu dem Kameradetektor 23 gelangt.
Allerdings ist das Vorhandensein des Filters 35 in dem ersten Strahlengang optional, d. h. der Filter 35 kann aus dem Strahlengang entfernt sein oder an dem Mikroskopiesystem 1 gar nicht vorgesehen sein. Dann ist der Anteil von rotem Licht, welches zu dem Kameradetektor 23 gelangt, gegenüber den Anteilen von andersfarbigem Licht, beispielsweise grünem oder blauem Licht, aufgrund des wellenlängenabhängigen Teilungsverhältnisses des Strahlteilers 32 reduziert. Um dennoch ein weitgehend farbtreues Bild des Objekts 9 zu erzeugen, ist es möglich, die Intensität des detektierten roten Lichts in dem Farbbild durch elektronische Bildbearbeitung anzuheben. Dieser Vorgang wird üblicherweise als Farbkorrektur oder Farbkalibration bezeichnet. Wenn der Kameradetektor 23 Farbfilter vor den einzelnen Detektorpixeln nach Art eines Bayer-Patterns aufweist, ist es möglich, die Anzahl der Pixel, welche rotes Licht detektieren, im Vergleich zu der Anzahl der Pixel, welche andersfarbiges Licht wie beispielsweise grünes Licht oder blaues Licht detektieren, zu erhöhen.
Ferner kann das Mikroskopiesystem dazu verwendet werden, Fluoreszenzlicht von Protoporphyrin IX hochempfindlich zu detektieren. Hierzu wird der Filter 37 in den ersten Strahlengang eingeführt. Die wellenlängenabhängige Transmission des Filters 37 ist in 2 durch eine Linie 59 dargestellt und hat niedrige Werte in einem Wellenlängenbereich zwischen einer Wellenlänge λ₅ von etwa 400 nm und einer Wellenlänge λ₆ von etwa 430 nm. Außerhalb dieses Wellenlängenbereichs ist die Transmission des Filters 37 hoch und beispielsweise größer als 0,9. Damit verhindert der Filter 37, dass Licht zu dem Kameradetektor 23 gelangt, welches zur Anregung der Fluoreszenz verwendet wird. Hierbei kann auch der Filter 15 in den Beleuchtungsstrahlengang eingefügt sein, welcher so konfiguriert ist, dass er nur Licht aus dem Wellenlängenbereich zwischen λ₅ und λ₆ zu dem Objekt gelangen lässt, um die Fluoreszenz anzuregen.
Wie vorangehend erläutert, führt der gewählte Verlauf des Teilungsverhältnisses des Strahlteilers 32 dazu, dass die beiden Peaks der Fluoreszenzstrahlung durch die beiden Kameradetektoren 23 und 21 mit unterschiedlichen Anteilen detektiert werden. Dies führt dazu, dass die Fluoreszenz mit vergleichsweise hoher Genauigkeit quantifiziert werden kann. Insbesondere ist es hierdurch möglich, die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX von einer Autofluoreszenz des Objekts 9 zu separieren, wie dies nachfolgend erläutert wird.
Die ortsabhängige Fluoreszenzstärke der Fluoreszenz von Protoporphyrin IX kann die Steuerung 43 bestimmen, indem sie für mehrere Pixel oder mehrere Gruppen von Pixeln des Kameradetektors 21 bzw. des Kameradetektors 23 jeweils einen Wert bestimmt, der eine Fluoreszenzstärke an einem Ort in dem Objektbereich repräsentiert, der auf das jeweilige Pixeln bzw. die jeweilige Gruppe von Pixeln abgebildet wird. Dieser Wert kann basierend auf der von diesem Pixel bzw. dieser Gruppe von Pixeln des Kameradetektors 21 detektierten Strahlungsintensität, auf der wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz dieses Pixels bzw. dieser Gruppe von Pixeln, auf der von einem Pixel bzw. einer Gruppe von Pixeln des Kameradetektors 23, auf welche der Ort in dem Objektbereich abgebildet wird, detektieren Strahlungsintensität, auf der wellenlängenabhängigen Detektionseffizienz dieses Pixels bzw. dieser Gruppe von Pixeln, auf dem Fluoreszenzspektrum von Protoporphyrin IX und auf dem Fluoreszenzspektrum der Autofluoreszenz bestimmt werden.
Insbesondere kann dieser Wert nach folgender Formel bestimmt werden: $C_{F} (x, y) = \frac{U_{1 A} \cdot S_{2} (k . l) - U_{2 A} \cdot S_{1} (i, j)}{U_{2 F} \cdot U_{1 A} - U_{2 A} \cdot U_{1 F}}$
wobei

CF(x,y): der Wert ist, der die Fluoreszenzstärke Protoporphyrin IX an dem Ort x, y in der Objektebene repräsentiert,
S1 (i, j): die mit dem Pixel (i,j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes 21 detektierte Strahlungsintensität repräsentiert, wobei der Ort (x, y) mit dem ersten Strahlengang auf das Pixel (i, j) bzw. die Gruppe (i, j) von Pixeln abgebildet wird,
S2(k, l): die mit dem Pixel (k, l) bzw. der Gruppe (k, l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes 23 detektierte Strahlungsintensität repräsentiert, wobei der Ort (x, y) mit dem zweiten Strahlengang auf das Pixel (k, l) bzw. die Gruppe (k, l) von Pixeln abgebildet wird, und
U1F, U1A, U2F: und U_2A Größen sind, die von den wellenlängenabhängigen Detektionseffizienzen der Pixel bzw. Gruppe von Pixeln abhängen.

Die Größen U_1F, U_1A, U_2F und U_2A können wenigstens zum Teil experimentell bestimmt werden, indem eine Messung in einem Bereich des Objekts ausgeführt wird, von dem angenommen wird, dass beispielsweise Protoporphyrin IX in diesem Bereich mit keiner signifikanten Konzentration vorhanden ist.
Ferner können die Größen U_IF, U_1A, U_2F und U_2A wenigstens zum Teil durch Berechnung mit einer der nachfolgenden Gleichungen bestimmt werden: $U_{1 F} = \int_{λ min}^{λ max} S_{F} (λ) \cdot D_{1, i, j} (λ) \cdot d λ ist,$
$U_{2 F} = \int_{λ min}^{λ max} S_{F} (λ) \cdot D_{2, k, l} (λ) \cdot d λ ist,$
$U_{1 A} = \int_{λ min}^{λ max} S_{A} (λ) \cdot D_{1, i, j} (λ) \cdot d λ ist, und$
$U_{2 A} = \int_{λ min}^{λ max} S_{A} (λ) \cdot D_{2, k, l} (λ) \cdot d λ ist,$
wobei

SF(λ): das Fluoreszenzspektrum der ersten Fluoreszenz repräsentiert,
SA(λ): das Fluoreszenzspektrum der zweiten Fluoreszenz repräsentiert,
D1, i, j(λ): die von der Wellenlänge λ abhängige Detektionseffizienz des Pixels (i, j) bzw. der Gruppe (i,j) von Pixeln des ersten Detektorenfeldes 21 repräsentiert, und
D2, k, l(λ): die von der Wellenlänge λ abhängige Detektionseffizienz des Pixels (k, l) bzw. der Gruppe (k, l) von Pixeln des zweiten Detektorenfeldes 23 repräsentiert.

Die ortsabhängige Fluoreszenzstärke C_F (x, y) kann durch die Steuerung 43 auf einer Anzeigevorrichtung 49 (siehe 1) als Bild dargestellt werden.
Der in 2 gezeigte Verlauf der wellenlängenabhängigen Durchlasscharakteristik für den ersten Strahlengang führt dazu, dass verschiedene spektrale Anteile von den beiden Detektorenfeldern mit unterschiedlicher Effizienz detektiert werden. Deshalb weisen die Größen U_1F und U_1A, die durch Integration über die Detektionseffizienzen des ersten Detektorenfeldes bestimmt werden, voneinander verschiedene Werte auf, ebenso wie die Größen U_2F und U_2A, die durch Integration über die Detektionseffizienzen des zweiten Detektorenfeldes bestimmt werden. Diese vier unterschiedlichen Größen gehen in die obige Gleichung zur Bestimmung der Werte C_F(x, y) ein und ermöglichen es deshalb, die Anteile der beiden Fluoreszenzen voneinander durch Rechnung zu separieren und insbesondere die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX zu quantifizieren.
Das Mikroskopiesystem kann ferner dazu verwendet werden, gleichzeitig ein weitgehend farbtreues Bild des Objekts mit dem Kameradetektor 23 aufzunehmen und mit dem Kameradetektor 21 ein Bild aufzunehmen, welches die Fluoreszenz von Protoporphyrin IX darstellt. Hierzu sollte der vorangehend erläuterte Filter37 aus dem ersten Strahlengang entfernt werden. Ferner kann der Filter 15 aus dem Beleuchtungsstrahlengang entfernt werden und das Objekt mit Licht aus dem gesamten Bereich des sichtbaren Spektrums beleuchtet werden, welches ebenfalls das Licht zur Anregung der Fluoreszenz von Protoporphyrin IX enthält. Allerdings sollte ein Filter in dem ersten Strahlengang verbleiben, welcher Licht mit den Wellenlängen der Emission der Fluoreszenz aus blockiert, welche zu Detektion der Fluoreszenz verwendet werden.

Claims

Fluoreszenzbeobachtungssystem, umfassend: einen Strahlteiler, einen ersten Kameradetektor und einen zweiten Kameradetektor; wobei der Strahlteiler in einem ersten Strahlengang zwischen einer Objektposition und dem ersten Kameradetektor angeordnet ist, in einem zweiten Strahlengang zwischen der Objektposition und dem zweiten Kameradetektor angeordnet ist und für eine gegebene Wellenlänge ein Teilungsverhältnis aufweist, welches ein Verhältnis zwischen einer Intensität von in den ersten Strahlengang geleitetem Licht der gegebenen Wellenlänge zu einer Intensität von in den Strahlteiler geleitetem Licht der gegebenen Wellenlänge angibt; wobei der Strahlteiler so konfiguriert ist, - dass ein erstes mittleres Teilungsverhältnis in einem Wellenlängenbereich zwischen einer ersten Wellenlänge und einer zweiten Wellenlänge, die größer als die erste Wellenlänge ist, einen ersten Wert aufweist, - dass ein zweites mittleres Teilungsverhältnis in einem Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und einer dritten Wellenlänge, die größer als die zweite Wellenlänge ist, einen zweiten Wert aufweist, und - dass ein drittes mittleres Teilungsverhältnis in einem Wellenlängenbereich zwischen der dritten Wellenlänge und einer vierten Wellenlänge, die größer als die dritte Wellenlänge ist, einen dritten Wert aufweist, wobei das erste Teilungsverhältnis größer als 0,8 ist; wobei das zweite Teilungsverhältnis um mehr als 0,2 kleiner ist als das erste Teilungsverhältnis; wobei das dritte Teilungsverhältnis kleiner als 0,2 ist und um mehr als 0,2 kleiner ist als das zweite Teilungsverhältnis; und wobei eine Differenz zwischen der dritten und der zweiten Wellenlänge größer als 30 nm, insbesondere größer als 50 nm und insbesondere größer als 70 nm ist.
Fluoreszenzbeobachtungssystem nach Anspruch 1, wobei die zweite Wellenlänge aus einem Bereich zwischen 580 nm und 620 nm und insbesondere aus einem Bereich zwischen 590 nm und 610 nm ausgewählt ist.
Fluoreszenzbeobachtungssystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei die dritte Wellenlänge aus einem Bereich zwischen 650 nm und 680 nm und insbesondere aus einem Bereich zwischen 660 nm und 670 nm ausgewählt ist.
Fluoreszenzbeobachtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die erste Wellenlänge kleiner als 500 nm ist.
Fluoreszenzbeobachtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die vierte Wellenlänge größer als 750 nm ist.
Fluoreszenzbeobachtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 5, ferner umfassend einen ersten Filter, welcher in dem ersten Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem ersten Kameradetektor anordenbar ist und für eine gegebene Wellenlänge eine Transmission aufweist, wobei der erste Filter so konfiguriert ist, - dass ein Produkt aus einer mittleren Transmission des ersten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der ersten Wellenlänge und der zweiten Wellenlänge und dem ersten mittleren Teilungsverhältnis des Strahlteilers in dem Wellenlängenbereich zwischen der ersten Wellenlänge und der zweiten Wellenlänge einen ersten Wert aufweist, und - dass ein Produkt aus einer mittleren Transmission des ersten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und der dritten Wellenlänge und dem zweiten mittleren Teilungsverhältnis des Strahlteilers in dem Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und der dritten Wellenlänge einen zweiten Wert aufweist, wobei ein Verhältnis aus dem ersten Wert und dem zweiten Wert größer als 0,6 und kleiner als 1,7, insbesondere größer als 0,7 und kleiner als 1,4, insbesondere größer als 0,8 und kleiner als 1,25 und insbesondere größer als 0,9 und kleiner als 1,1 ist.
Fluoreszenzbeobachtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, ferner umfassend einen zweiten Filter, welcher in dem zweiten Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem zweiten Kameradetektor anordenbar ist und für eine gegebene Wellenlänge eine Transmission aufweist, wobei der zweite Filter so konfiguriert ist, - dass eine mittlere Transmission des zweiten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der ersten Wellenlänge und der zweiten Wellenlänge einen Wert aufweist, der kleiner als 0,2 und insbesondere kleiner als 0,1 ist, und - dass eine mittlere Transmission des zweiten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der zweiten Wellenlänge und der dritten Wellenlänge einen Wert aufweist, der größer als 0,8 und insbesondere größer als 0,9 ist.
Fluoreszenzbeobachtungssystem nach Anspruch 7, wobei der zweite Filter ferner so konfiguriert ist, dass eine mittlere Transmission des zweiten Filters in dem Wellenlängenbereich zwischen der dritten Wellenlänge und der vierten Wellenlänge einen Wert aufweist, der größer als 0,4, insbesondere größer als 0,5 ist, insbesondere größer als 0,6 ist, insbesondere größer als 0,7 ist und insbesondere größer als 0,8 ist.
Fluoreszenzbeobachtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, ferner umfassend einen dritten Filter, welcher in dem ersten Strahlengang zwischen dem Strahlteiler und dem ersten Kameradetektor anordenbar ist und für eine gegebene Wellenlänge eine Transmission aufweist, wobei der dritte Filter so konfiguriert ist, - dass eine mittlere Transmission des ersten Filters in einem Wellenlängenbereich zwischen einer fünften Wellenlänge und einer sechsten Wellenlänge einen Wert aufweist, der kleiner als 0,2 und insbesondere kleiner als 0,1 ist, wobei die sechste Wellenlänge kleiner als die erste Wellenlänge ist, die fünfte Wellenlänge kleiner als die sechste Wellenlänge ist, eine Differenz zwischen der ersten und der sechsten Wellenlänge größer als 30 nm ist und eine Differenz zwischen der sechsten und der fünften Wellenlänge größer als 10 nm ist, und - dass eine mittlere Transmission des ersten Filters in einem Wellenlängenbereich zwischen der sechsten Wellenlänge und der ersten Wellenlänge einen Wert aufweist, der größer als 0,8 und insbesondere größer als 0,9 ist.
Fluoreszenzbeobachtungssystem nach Anspruch 9, wobei die fünfte Wellenlänge in einem Bereich zwischen 380 nm und 410 nm liegt und/oder die fünfte Wellenlänge in einem Bereich zwischen 400 nm und 430 nm liegt.
Fluoreszenzbeobachtungssystem nach einem der Ansprüche 1 bis 10, ferner umfassend eine Objektivlinse, welche in dem ersten und dem zweiten Strahlengang zwischen der Objektposition und dem Strahlteiler angeordnet ist.
Verwendung des Fluoreszenzbeobachtungssystems nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Beobachtung einer Fluoreszenz von Protoporphyrin IX.