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Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung mit einer Klinge zum Schneiden einer Probe und einer Lichtquelle, die einen Lichtstrahl aussendet.
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Des Weiteren betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Schneiden einer Probe mit einer Klinge.
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Zum Schneiden einer Probe mittels einer Schneidvorrichtung wie beispielsweise eines Mikrotoms oder eines Vibratoms gehört die Ausrichtung der zum Schneiden verwendeten Klinge (beispielsweise eines Mikrotommessers) relativ zur Probe, derart, dass Klinge und Probe vor dem Schneidvorgang so zueinander ausgerichtet bzw. positioniert werden, dass die Klinge bzw. die Schneide der Klinge die Probe gerade oder nahezu berührt. Beispielhaft sei hier die Ausrichtung der Klinge eines Mikrotoms zu einer Probe, beispielsweise parallel zu einem im Wesentlichen quaderförmigen Präparateblock (Präparat in einem Einbettmedium), genannt, so dass die Schneide einen Punkt der Oberfläche der Probe gerade berührt.
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Die Ausrichtung der Klinge in Bezug auf die Probe wird in vielen Fällen rein visuell ohne Hilfsmittel ausgeführt. Der Operator (Bediener) der Schneidvorrichtung versucht manuell die optimale Ausgangsposition für den Schneidvorgang zu finden. Dies führt insbesondere bei Proben, welche von einer Flüssigkeit umgeben sind (beispielsweise ist dies regelmäßig bei Vibratomen der Fall), zu Schwierigkeiten einzuschätzen, ob die Klinge der Schneidvorrichtung die gewünschte Position relativ zur Probe besitzt. Durch eine falsche Ausrichtung der Klinge durch den Operator der Schneidvorrichtung kann es zu mangelhaften Schnitten kommen oder die Probe kann beschädigt oder zerstört werden. Auch kann sich die Probe von einem ggf. benutzten Probenträger/Probenhalter ablösen.
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Nachteilig an vielen bekannten Schneidvorrichtungen wie Mikrotomen ist es des Weiteren, dass es für den Operator schwierig ist, die Schnittdistanz (die Strecke, über die der Schneidvorgang durchgeführt wird) optimal zu wählen ist, da Anfang und Ende des Schneidvorganges typischerweise manuell festgelegt und nicht durch die Länge der Probe in Schnittrichtung bestimmt werden können. Die Wahl einer optimalen Schnittdistanz, also einer Schnittdistanz, die der Länge der Probe in Schnittrichtung entspricht, ermöglicht eine zeitliche Beschleunigung des Schneidvorganges.
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Insgesamt ergeben sich folglich bei der Bedienung von vielen Schneidvorrichtungen, beispielsweise Mikrotomen und hier insbesondere Vibratomen, für den Operator der Schneidvorrichtung verschiedene Bedienungsschwierigkeiten. Auch sind die Automatisierungsmöglichkeiten durch die oben beschriebenen Problematiken stark eingeschränkt.
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Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren der eingangs genannten Art anzugeben und weiterzubilden, durch welches die vorgenannten Probleme überwunden werden. Insbesondere soll eine Vorrichtung und ein Verfahren angegeben werden, die es ermöglichen, die Relativposition zwischen Probe und Klinge einer Schneidvorrichtung zu bestimmen, insbesondere um eine gewünschte Relativposition dieser beiden Elemente, wie beispielsweise eine geeignete Ausgangsposition für den Schneidvorgang, einzustellen.
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Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Lehre des Patentanspruchs 1 gelöst. Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Erfindung gehen aus den Unteransprüchen hervor.
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Erfindungsgemäß ist die Vorrichtung der eingangs genannten Art dadurch gekennzeichnet, dass zur Relativpositionsbestimmung zwischen der Probe und der Klinge ein Lichtstrahl einer Lichtquelle derart ausgerichtet ist, dass er teilweise sowohl auf die Klinge als auch auf die Probe trifft, so dass sowohl von der Klinge als auch von der Probe Licht des Lichtstrahls gestreut und/oder reflektiert wird.
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Eine Probe im Sinne der vorliegenden Beschreibung ist ein lokal begrenzter Körper bzw. eine Struktur aus einer Masse (Materie), der bzw. die geschnitten werden kann (schneidbarer Körper). Beispiele hierfür sind Gesteine, Kristalle, Mineralien, Borkerne (beispielsweise aus Gestein oder Eis), Kunststoffe, Metalle, Metalllegierungen, Halbleiter und insbesondere biologische Körper bzw. Systeme wie Tiere, Pflanzen, Pilze oder Gewebe bzw. Präparate davon sowie aus biologischen Systemen hergestellte Erzeugnisse (wie beispielsweise Lebensmittel oder Holz). Eine Probe kann eine beliebige Geometrie und Form aufweisen. Es sei betont, dass der Begriff Probe im Rahmen dieser Beschreibung so zu verstehen ist, dass auch Teile einer Probe wiederum eine Probe sein können. So kann eine Probe ein Präparat mit umgebenen Einbettmedium sein, eine weitere Probe ist aber auch das Präparat selbst oder auch nur Teile des Präparates. Die Erfindung beschränkt sich insbesondere nicht auf die Relativpositionsbestimmung zwischen Probe und Klinge, wenn die Probe ein schneidbarer Körper ist, der von einem Gas oder einer Flüssigkeit umgeben ist, sondern umfasst auch schneidbare Körper, die in anderen schneidbaren Körpern eingelagert sind bzw. sich in solchen befinden. Eine (mögliche) Probe besitzt zumindest eine Eigenschaft, die dazu führt, dass das eingestrahlte Licht an ihr selbst bzw. an der Grenzschicht zur umgebenen Materie gestreut/reflektiert wird und nicht (substantiell) an der umgebenen Materie. Beispielsweise kann ein Teil eines biologischen Präparates mit einem Fluorophor versehen sein, der mit diesem Fluorophor versehene Teil kann nun die Probe sein, obwohl er sich ansonsten nicht (substantiell) von dem restlichen Teil des Präparates unterscheidet.
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Unter einer Klinge im Sinne der vorliegenden Beschreibung ist eine Schneide, die die Probe schneidet, und damit gegebenenfalls verbundene Elemente zu verstehen. Ein Beispiel für eine solche Klinge ist ein Mikrotom-Messer. Unter einem Lichtstrahl im Sinne der vorliegenden Beschreibung ist ein gerichtetes, vorzugsweise kollimiertes oder gaußförmiges, Lichtbündel zu verstehen, beispielsweise ein Laserstrahl. Licht im Sinne der vorliegenden Beschreibung kann elektromagnetische Strahlung im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums, aber auch IR- und UV-Strahlung sein, wobei der Lichtstrahl kein monochromatisches Licht zu sein braucht. Eine Relativpositionsbestimmung im Sinne der vorliegenden Beschreibung kann eine genaue Abstandsbestimmung meinen (beispielsweise zwischen einem bestimmten Punkt der Probe, wie ihrem geometrische Zentrum oder einen Punkt der Probenoberfläche, und einem Punkt der Klinge), aber insbesondere auch einfach eine grobe Unterscheidung der Lage von Probe und Klinge zueinander, insbesondere in dem Sinne, dass festgestellt werden kann, ob Probe und Klinge sich berühren/nahezu berühren oder ob dies nicht der Fall ist. Die mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu schneidende Probe kann auch aus einem mehrschichtigen System (Mehrschichtsystem) bestehen, in dem Sinne, dass das eigentliche zu untersuchende Präparat in Einbettmedien wie beispielsweise Paraffin, Polyethylenglykol, Celloidin, Gelatine, Agar oder Kunstharz eingebettet ist.
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Erfindungsgemäß ist zunächst erkannt worden, dass eine einfache und kostengünstige Möglichkeit der Relativpositionsbestimmung darin besteht, einen Lichtstrahl so auszurichten, dass dieser sowohl die Klinge als auch die Probe trifft. Hierbei kann beispielsweise durch einen menschlichen Betrachter bzw. Operator bei Einsatz eines im sichtbaren Bereich des Spektrums liegenden, sich vorzugsweise deutlich von der Umgebung abhebenden Lichtstrahls (beispielsweise einer Lichtquelle wie ein Laser bzw. eine Laserdiode, wobei auch spektral breitbandige Lichtquellen eingesetzt werden können) eine einfache visuelle Einschätzung der Relativposition dieser beiden Elemente erfolgen, da sich im Falle eines Kontaktes oder Beinahekontaktes zwischen Probe und Klinge das reflektierte und/oder gestreute Licht von Probe und Klinge nahezu aus derselben Richtung bzw. aus etwa derselben räumlichen Position in das Auge des Betrachters fällt. Die Ausrichtung des Lichtstrahles erfolgt also insbesondere so, dass der Lichtstrahl die Klinge teilweise trifft und teilweise an ihr vorbeigeht und auf die Probe fällt. Insbesondere ist es denkbar, dass die Lichtquelle für den Lichtstrahl bei Bewegung der Klinge mit dieser mitbewegt wird und/oder an dieser befestigt, also starr verbunden, ist (sich also beispielsweise am Mikrotomschlitten befindet). Auch der Einsatz einer Lichtquelle ist möglich, die unabhängig von der Klingenposition bewegt wird, beispielsweise um die Lichtquelle in eine geeignete Position zu bewegen, ohne die Klinge bewegen zu müssen oder auch um zusätzliche Informationen durch andere Einfallsrichtungen des Lichtstrahls zu erhalten. Ebenso ist der Einsatz mehrerer Lichtquellen, die direkt nebeneinander oder auch aus verschiedenen Richtungen auf die Probe gerichtet sein können denkbar, beispielsweise um die Relativposition zwischen Probe und Klinge für mehrere Stellen der Probe zu ermitteln. Eine Lichtquelle kann auch mehrere Lichtstrahlen gleichzeitig aussenden. Des Weiteren ist es denkbar, dass die Probe selbst oder Teile der Probe und/oder eine eventuell die Probe umgebene Flüssigkeit wie Wasser oder Puffer Fluorophore enthalten, die durch den Lichtstrahl angeregt werden, um eine einfachere Lokalisation der Probe und der Position der Klinge zu ermöglichen.
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Besonders bevorzugt wird das an der Klinge und der Probe gestreute und/oder reflektierte Licht zumindest teilweise von einer Detektionseinheit aufgenommen. Eine Detektionseinheit, die an einer geeigneten Position angeordnet ist, mit welcher zumindest teilweise das reflektierte und/oder gestreute Licht des Lichtstrahls aufgenommen bzw. detektiert werden kann, ermöglicht eine genaue Relativpositionsbestimmung von Klinge und Probe.
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Unter einer Detektionseinheit ist hierbei ein System zu verstehen, dass die Abbildung und/oder Verarbeitung und/oder Betrachtung des von der Klinge als auch von der Probe gestreuten und/oder reflektierten Lichts ermöglicht. Eine solche Detektionseinheit kann optische Elemente wie beispielsweise Linsen bzw. ein Linsensystem, Filter, Strahlteiler, Objektive und Okulare beinhalten, beispielsweise zum Vergrößern der Probe, und insbesondere auch Detektoren bzw. eine Detektorvorrichtung. Eine Umsetzungsmöglichkeit einer solchen Detektionseinheit ist insbesondere auch ein einfaches Sichtfenster oder ein Filterglas für einen menschlichen Betrachter in Verbindung mit seinen Augen. Bei einer Detektionseinheit kann es sich beispielsweise auch um ein Mikroskop bzw. Makroskop mit entsprechend großem Arbeitsabstand handeln. Die Detektionseinheit sollte so relativ zur Probe und zur Klinge platziert sein, dass eine Bewegung der Klinge oder der Probe eine deutlich sichtbare Bewegung des sowohl an der Klinge als auch an der Probe gestreuten und/oder reflektierten Lichts des Lichtstrahls zur Folge hat. Insbesondere sollte der Lichtstrahl nicht identisch sein mit der Detektionsrichtung der Detektionseinheit, also Detektionseinheit, Probe und Lichtquelle nicht auf einer Linie liegen. Unter einer Detektorvorrichtung im Sinne der vorliegenden Beschreibung sind Anordnungen mit ein oder mehreren Detektoren, auch räumlich getrennt, zur Detektion von Licht zu verstehen. Nur beispielhaft seien hier Zeilendetektoren, Zeilenkameras, Flächendetektoren, Flächenkameras, Videokameras und Anordnungen von Photodioden genannt. Auch der Einsatz mehrerer Detektionseinheiten ist denkbar, um weitere und/oder genauere Informationen beispielsweise über die Position des gestreuten/reflektierten Lichtes zu erhalten. Auch ist eine bewegliche Detektionseinheit möglich, deren Position vor bzw. nach und/oder während des Schneidvorganges verändert werden kann und/oder mit der Klinge mitbewegt wird, beispielsweise indem die Detektionseinheit starr mit der Klinge verbunden ist. Eine solche starre Verbindung, beispielsweise durch eine Befestigung am Mikrotomschlitten, ist besonders vorteilhaft, da die Detektionseinheit bzw. die Detektorvorrichtung das reflektierte und/oder gestreute Licht auf diese Weise unabhängig von der relativen Position der Klinge zur Probe besonders zuverlässig und in definierter Art aufnehmen kann.
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Ganz besonders bevorzugt beinhaltet die Detektionseinheit eine Detektorvorrichtung, die elektrische Ausgangssignale generiert, die ausgewertet werden, um eine Relativposition zwischen Klinge und Probe zu bestimmen. Eine solche Auswertung kann beispielsweise durch eine an die Detektorvorrichtung angeschlossene elektronische Schaltung (Auswerteelektronik), beispielsweise umgesetzt mittels eines FPGAs (Field Programmable Gate Array), mittels eines Mikrocontrollers oder mittels eines Computers bzw. einer auf diesem laufenden Auswertesoftware (Auswerteprogramm) erfolgen. Es können auch Kombinationen mehrerer Auswertetechniken bzw. Auswerteansätze benutzt werden, um die Ausgangssignale auszuwerten, beispielsweise ein FPGA kombiniert mit einem Computer und darauf laufender Auswertesoftware. Im Falle der Verwendung einer Kamera o.ä. kann auch eine Auswertung beispielsweise mittels einer Software erfolgen, die eine Bildanalyse der aufgenommen Bilder durchführt. Eine elektronische Auswertung der Ausgangssignale ermöglicht beispielsweise zu bestimmen, ob die Klinge sich für den Schneidvorgang in einer geeigneten Position befindet, und auch eine Ermittlung der optimalen Schnittdistanz, also einer Schnittdistanz, die der Länge der Probe in Schnittrichtung entspricht. Die gewonnenen Informationen können der Steuerung der Schneidvorrichtung dienen und/oder an den Operator der Schneidvorrichtung ausgegeben werden. Alternativ oder parallel kann eine Auswertung und Beurteilung der gegebenenfalls elektronisch weiterverarbeiteten Ausgangssignale (wie beispielsweise Messdaten, Bilddaten), insbesondere bei Einsatz einer Kamera, auch rein visuell durch einen menschlichen Betrachter, beispielsweise durch den Operator der Schneidvorrichtung, durchgeführt werden, wenn die Daten beispielsweise mittels eines Monitors oder sonstigen Anzeigegerätes visualisiert oder wiedergegeben werden. Eine solche Ausführung erlaubt es dem Operator ebenfalls, die Relativposition von Klinge und Probe zu beurteilen und eine optimale Schnittposition zu finden. Zusätzlich zur Relativpositionsbestimmung kann die Detektorvorrichtung dazu dienen, weitere Informationen über die Probe zu gewinnen, beispielsweise mittels der Aufnahme von Bildern und anschließender Bildanalyse.
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Insbesondere ist eine bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung darin zu sehen, dass die Relativpositionsbestimmung anhand einer räumlichen Verteilung der an der Klinge und an der Probe gestreuten und/oder reflektierten Lichts erfolgt.
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Eine räumliche Verteilung der reflektierten Lichtanteile im Sinne der vorliegenden Beschreibung meint eine zumindest ungefähre zumindest eindimensionale Zuordnung der Lage des detektierten gestreuten Lichtes. Essentiell ist also, dass die Detektorvorrichtung eine zumindest grobe zumindest eindimensionale räumliche Lokalisation des an der Klinge und der Probe gestreuten/reflektierten Lichts erlaubt. Beispielsweise könnte die an die Detektorvorrichtung angeschlossene Auswerteelektronik und/oder Auswertesoftware bei Verwendung eines Zeilendetektors oder Flächendetektors beispielsweise die räumliche Position der beiden durch den Lichtstrahl generierten Lichtflecken (also des typischerweise an der Klinge und der Probe gestreuten/reflektierten Lichts aus Sicht des oder der Detektoren) anhand der generierten Ausgangssignale bestimmen. Auf Basis der Position bzw. des Abstandes dieser Lichtflecken in Kombination mit weiterem Wissen um bestimmte Maße der Schneidvorrichtung und der Probenposition lassen sich mittels einfacher geometrischer Betrachtungen Maße weiterer Distanzen bzw. Informationen über den aktuellen Betriebszustandes der Schneidvorrichtung gewinnen. Beispielsweise kann aus der Ausrichtung des Lichtstrahls zur Probenoberfläche (Winkel Lichtstrahl zur Probenoberfläche) und dem Abstand der detektierten Lichtflecken bei im Wesentlichen paralleler Ausrichtung des Detektors bzw. der Detektoren zur Probenoberfläche (Abstand der detektierten Lichtflecken entspricht in dem Fall dem horizontalen Abstand zwischen Klinge und Probe) der vertikale Abstand zwischen Probenoberfläche und Klinge ermittelt werden. Um weitere und/oder genauere Informationen über die Relativposition zu gewinnen (beispielsweise für Positionsbestimmung mittels einer Triangulation), ist auch der Einsatz mehrerer Lichtstrahlen bzw. Lichtquellen, verschiedenfarbiger Lichtquellen und/oder Detektionseinheiten bzw. Detektoren möglich, die die Probe aus mehreren Richtungen beleuchten bzw. das gestreute/reflektierte Licht aus mehreren Richtungen detektieren. Auch die Verwendung von beweglichen Lichtquellen und Detektionseinheiten, deren Position vor bzw. nach und/oder während des Schneidvorganges geändert werden kann, ist denkbar.
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Die durch Materialkombinationen bzw. Mehrschichtsysteme/Mehrphasensysteme gegebenenfalls entstehenden Grenzflächen können gegebenenfalls weitere Lichtflecken generieren, die durch die Detektorvorrichtung detektiert werden und durch Reflexion und/oder Streuung an diesen Grenzflächen entstehen. Solche Lichtflecken müssen im Rahmen der Auswertung, beispielsweise auf Basis ihrer Reihenfolge oder ihrer Intensität, verworfen werden. Bei der Auswertung der Ausgangssignale ist also beispielsweise zu berücksichtigen, ob sich die Probe in einer Flüssigkeit (beispielsweise Wasser oder Puffer) oder einem Gas oder Gasgemisch (beispielsweise Luft) oder einem Festkörper (beispielsweise einem Einbettmedium) befindet, da die Grenzflächen zwischen den Materialen/Phasen gegebenenfalls weitere Lichtflecken erzeugen können. Dasselbe gilt für die Klinge. Ebenso muss berücksichtigt werden, ob die Probe selbst ein Mehrschichtsystem bzw. Mehrphasensystem (beispielsweise Präparat mit Einbettmedium) ist oder in einem solchen eingebettet ist, in dem Sinne, dass verschiedene Schichten oder Grenzflächen innerhalb bzw. außerhalb der Probe bestehen, an denen der eingestrahlte Lichtstrahl reflektiert und/oder gestreut werden könnte.
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Des Weiteren sind bei der Bestimmung der Relativposition eventuell vorhandene Brechungsindex-Übergänge auf Grund der gegebenenfalls verschiedenen, die Probe umgebenen Materialien berücksichtigen, da diese zu einer Brechung des eingestrahlten und des gestreuten/reflektierten Lichtes führen, die die Auswertung verfälschen könnte: So müssen beispielsweise in dem Fall, dass sich die Klinge und die Probe in einer Flüssigkeit, beispielsweise Wasser oder Puffer befinden, für die Flüssigkeit/Luft-Grenzflächen (Flüssigkeitsoberfläche) die gegebenenfalls verschiedenen Brechungsindizes berücksichtigt werden. Analoges gilt für die Beleuchtung mit dem oder den Lichtstrahlen, auch hier ist bei der Auswertung der Daten gegebenenfalls eventuelle Brechungsindex-Übergänge zu berücksichtigen, die zu einer Brechung des bzw. der Lichtstrahlen führen. Um die Notwendigkeit solcher Betrachtungen für die Flüssigkeit/Luft-Grenzflächen für die Detektion zu vermeiden, ist es vorteilhaft den Detektor bzw. die Detektoren im Wesentlichen parallel zur Flüssigkeitsoberfläche zu platzieren.
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Bevorzugt wird die Klinge und/oder die Probe vorzugsweise unter Benutzung und/oder Auswertung der elektrischen Ausgangssignale der Detektorvorrichtung in eine gewünschte Relativposition gebracht. Dies könnte mittels eines beispielsweise mechanischen und/oder elektrischen und/oder pneumatischen und/oder piezoelektrischen Antriebs erfolgen.
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Eine gewünschte Relativposition kann beispielsweise eine Position von Klinge und Probe sein, bei der sich die Klinge nahe der Probe oder im direkten Kontakt mit der Probe befindet. Insbesondere kann es sich bei der gewünschten Relativposition um eine Position von Klinge und Probe handeln, von der aus der Schneidvorgang der Probe begonnen werden kann (Anfangs-Schnittposition). Ein weiteres Beispiel wäre die Position der Klinge zur Probe nachdem ein Schneidvorgang beendet wurde.
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Um die gewünschte Position bzw. Relativposition von Probe bzw. Probenoberfläche und Klinge zu erreichen, ist eine Verschiebung bzw. Bewegung von Probe und/oder Klinge denkbar. Die Relativposition zwischen Klinge und Probe kann während einer solchen Verschiebung von Probe und/oder Klinge kontinuierlich oder zu bestimmten Zeitpunkten und/oder nach bestimmten Zeitintervallen aus den Signalen der Detektorvorrichtung bestimmt werden. Bei Erreichen der gewünschten Relativposition kann die Verschiebung gestoppt werden. Ein solches Vorgehen erlaubt eine weitgehende Automatisierung des Schneidvorganges, da sowohl der Anfangspunkt als auch der Endpunkt des Schneidvorganges durch die erfindungsgemäße Vorrichtung eindeutig detektierbar bzw. feststellbar sind. Es kann somit auch der Schneidvorgang mit der optimalen Schnittdistanz durchgeführt werden. Dies erlaubt beispielsweise auch die einfache Herstellung von Bildstapeln einer Probe, ohne genaue Kenntnisse über die Dimension und Position der Probe vor Beginn der Bildaufnahmen: So kann vor, während oder nach einem Schneidvorgang eine oder mehrere Aufnahmen der Probe mittels der Detektorvorrichtung und/oder einer gegebenenfalls vorhandenen weiteren Vorrichtung zur Bildgebung, beispielsweise eines Mikroskops oder einer Flächenkamera oder einer Zeilenkamera, vorgenommen werden. Die gemessene Relativposition von Probenoberfläche und Klinge kann hierbei dazu ausgenutzt werden, die Detektorvorrichtung und/oder die weitere Vorrichtung zur Bildgebung automatisch auf die Oberfläche der Probe zu fokussieren. Nach einer solchen Aufnahme und Beendigung des Schneidvorganges kann die Schneidvorrichtung eine weitere Schicht der Probe abtragen bzw. abschneiden. Des Weiteren ist es auch denkbar, während des eigentlichen Schneidvorganges die Position der Klinge und/oder der Probe unter Benutzung der Ausgangssignale der Detektorvorrichtung kontinuierlich oder in bestimmten Zeitabständen anzupassen bzw. zu regeln und so einem Oberflächenprofil der Probe zu folgen, das von einer Ebene abweicht. Die Detektorvorrichtung und/oder eine gegebenenfalls vorhandene weitere Vorrichtung zur Bildgebung, insbesondere eine Zeilenkamera, kann dabei während des eigentlichen Schneidvorganges derart mitbewegt werden, dass bei zeitgleicher Bildaufnahme durch die Detektorvorrichtung bzw. Vorrichtung zur Bildgebung der Fokus zu dem Oberflächenprofil optimal eingestellt bleibt und das so entstehende Gesamtbild ein tiefenscharfes Bild ohne unscharfe Zonen ergibt. Positioniert man die Klinge knapp oberhalb der Probenoberfläche, so lässt sich, insbesondere bei Benutzung mehrerer Lichtquellen bzw. Lichtstrahlen und/oder bei Benutzung parallel zur Schneide der Klinge beweglicher Lichtquellen bzw. Lichtstrahlen (wobei für jede Lichtquelle der jeweilige Lichtstrahl zumindest zeitweise sowohl auf die Klinge als auch auf die Probe trifft, so dass sowohl von der Klinge als auch von der Probe Licht des Lichtstrahls gestreut und/oder reflektiert und durch die Detektorvorrichtung detektiert wird), auch ein Scan der Oberflächenstruktur der Probe oder Teilen der Probe durchführen und somit ein Höhenprofil der Probe oder Teilen der Probe erstellen, indem die Klinge bei ihrer Bewegung auf Basis der elektrischen Ausgangssignale der Detektorvorrichtung automatisiert in einem konstanten Abstand oberhalb der Oberfläche gehalten wird (Nachregelung des Abstandes). Alternativ lässt sich die Klinge auch ohne eine solche Nachregelung des Abstandes, also konstant in einer Ebene über die Probe bewegen, und auf Grundlage der elektrischen Ausgangssignale der Detektorvorrichtung ein Höhenprofil erstellen. Die automatische Positionierung und Bewegung der Klinge erfolgt mittels des Antriebes unter Ausnutzung der Detektorsignale. Bei einer solchen Erstellung eines Höhenprofils ist wie oben erwähnt der Einsatz von mehreren Lichtquellen bzw. beweglicher Lichtquellen besonders vorteilhaft, da somit die Probe nicht nur punktuell betrachtet werden kann. Es wird stattdessen eine flächenhafte Abtastung der Oberflächenstruktur der Probe ermöglicht.
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Eine gewünschte Position von Schneide und Klinge ist insbesondere dann erreicht, wenn das an der Probe und der Klinge gestreute und/oder reflektierte Licht von der Detektorvorrichtung nicht räumlich auflösbar ist.
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Von der Detektorvorrichtung nicht räumlich auflösbar meint hier, dass die Detektorvorrichtung für das detektierte Licht, dass an der Probe und der Klinge gestreut und/oder reflektiert wurde, keine dem jeweiligen Lichtanteil (Probe oder Klinge) eindeutig zuordenbaren elektrischen Ausgangssignale hinsichtlich der Position der Lichtanteile auf der Detektorfläche generiert. Anders formuliert lässt sich also anhand des Detektorsignals nicht feststellen, welcher Anteil des Signales durch das an der Probe reflektierte Licht und welcher Anteil durch das an der Klinge reflektierte Licht erzeugt wird: Die auf der Detektoroberfläche durch das reflektierte/gestreute Licht erzeugten Lichtflecken gehen ineinander über bzw. verschmelzen miteinander.
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Eine solche Auswertungsweise ermöglicht ein sehr einfaches Vorgehen bei der Datenanalyse, sowohl elektronisch als auch bei einer eventuellen Bildanalyse per Software: Es ist häufig nur notwendig die Anzahl der detektierten Lichtflecken bzw. Signalpeaks zu zählen bzw. diese hinsichtlich ihrer Reihenfolge zu analysieren. Im einfachsten Fall (unter der Voraussetzung, dass das Licht des Lichtstrahls Probe und Klinge trifft und die Einstrahlung beispielsweise schräg auf die Probe erfolgt, die Detektion aber senkrecht zur Probenoberfläche durchgeführt wird, und keine weiteren Grenzflächen neben der Probenoberfläche bestehen, an denen Lichtflecken generiert werden) berühren sich Probe und Klinge zumindest nahezu, wenn nur noch ein Lichtfleck durch die Detektorvorrichtung detektiert wird. Können zwei Lichtflecken detektiert werden, so befindet sich die Probe in diesem einfachsten Fall eindeutig noch nicht in Kontakt mit der Klinge. In komplexeren Fällen, in denen mehrere Grenzflächen, an denen Lichtflecken generiert werden können, zusätzlich zu der Probenoberfläche vorhanden sind (beispielsweise auf Grund einer Flüssigkeitsoberfläche, wenn sich die Probe in einer Flüssigkeit befindet, oder eines Mehrschichtsystems/Mehrphasensystems als Probe), kann beispielsweise anhand der Reihenfolge der Lichtflecken und/oder ihrer Intensität (Höhe/Stärke der Signalpeaks) und/oder ihrer spektralen Zusammensetzung eine Zuordnung der Lichtflecken zu den verschieden Grenzflächen erfolgen.
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Um sicherzugehen, dass der Lichtstrahl die Probe trifft, kann des Weiteren vorgesehen sein, dass eine Auswertung der Intensität des detektierten Lichtes bzw. der Intensität der detektierten Lichtflecken durchgeführt wird: Trifft der Lichtstrahl die Probe nicht oder nicht mehr, so wird typischerweise eine deutlich verringerte Intensität im Vergleich zu dem Fall, dass die Klinge die Probe berührt, gemessen. Hierdurch kann auch der Endpunkt des Schneidvorganges bestimmt werden um beispielsweise den Schneidvorgang mit der optimalen Schnittdistanz durchzuführen.
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Im Falle von Luft/Flüssigkeits-Grenzflächen oder einer Probe, die ein Mehrschichtsystem bildet (beispielsweise bestehend aus Präparat und Einbettmedium), ist des Weiteren zu berücksichtigen, dass typischerweise mehr als zwei Lichtflecken generiert bzw. detektiert werden. Anhand der Reihenfolge und Anzahl der Lichtflecken lässt sich unter Wissen der Anzahl der Schichten manuell oder automatisch eine Zuordnung der Lichtflecken zu den einzelnen Grenzflächen treffen. Dadurch ist eine genaue Beurteilung der Klingenposition innerhalb dieser Materialschichten möglich. Dies gilt auch für den weiter oben beschriebenen Fall der rein visuell durch den Operator der Schneidvorrichtung vorgenommenen Relativpositionsbestimmung ohne Detektorvorrichtung. Falls die Probe oder nur ein Teil der Probe und/oder die die Probe gegebenenfalls umgebene Flüssigkeit Fluorophore aufweist, kann anhand der spektralen Zusammensetzung des detektierten Lichts ermittelt werden, ob Lichtflecken von der Probe bzw. von dem Teil der Probe oder der Flüssigkeit oder einem Einbettmedium stammen. Denkbar ist es, für die gegebenenfalls vorhandene Flüssigkeit und/oder Teile der Probe (wie beispielweise Präparat, Einbettmedium, aber auch nur Teile des Präparates) unterschiedliche Fluorophore einzusetzen, die auch bei Anregung mit derselben Wellenlänge (also mit Licht derselben Lichtquelle) Licht unterschiedlicher Wellenlänge freisetzen bzw. streuen, so dass eine deutliche Zuordnung der Lichtflecken zu den unterschiedlichen Teilen der Probe bzw. zu Klinge und/oder Flüssigkeit erfolgen kann. Auch können Fluorophore mit unterschiedlichen Absorptionsspektren verwendet werden, wobei eine polychromatische Lichtquelle und/oder mehreren monochromatische Lichtquellen mit unterschiedlichen Emissionswellenlängen eingesetzt werden können.
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Eine besonders bevorzugte und einfache Umsetzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst eine Detektorvorrichtung, die eine Kamera aufweist. Eine solche Kamera (beispielsweise ein einfacher Fotoapparat oder eine handelsübliche Videokamera) ermöglicht eine kostengünstige Umsetzung der Erfindung und eine schnelle und einfache visuelle Auswertung durch einen menschlichen Operator, wobei es zur weiteren Vereinfachung der Bedienung der Schneidvorrichtung denkbar ist, dass eine Übertragung der aufgenommenen Bilder in Echtzeit an einen Monitor vorgenommen werden kann. Zusätzlich kann eine softwaregestützte Auswertung der Bildaufnahmen durchgeführt werden, um die Schneidvorrichtung und/oder den Schneidvorgang zu steuern. Ein Abspeichern der aufgenommenen Bilddaten kann eine (auch nachträglich) Dokumentation des Schneideprozesses ermöglichen.
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Eine ganz besonders bevorzugte Umsetzungsmöglichkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht darin, den Lichtstrahl derart auszurichten, dass er teilweise auf die Schneide der Klinge trifft, so dass von der Schneide gestreutes und/oder reflektiertes Licht der Lichtquelle von der Detektionseinheit aufgenommen wird. Da die Schneide der Klinge vor dem Schneidvorgang die Probe üblicherweise zuerst berührt und die Schneide häufig Licht besonders gut reflektiert/streut (also besonderes wenig Licht absorbiert), liefert das an der Schneide gestreute und/oder reflektierte Licht in der Regel ein gut auswertbares Detektionssignal.
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Besonders bevorzugt kann die Erfindung im Fall eines Mikrotoms, insbesondere eines Vibratoms, eingesetzt werden: Im Falle von Vibratomen ist es gebräuchlich, die Probe in einer Flüssigkeit, beispielsweise einem Wasser- oder Pufferbad zu schneiden, die Probe befindet sich also unter der Flüssigkeitsoberfläche, was eine exakte Positionierung der Klinge relativ zur Probe ohne Hilfsmittel deutlich erschwert. Die Flüssigkeitsoberfläche und die Probe generieren Lichtflecken und liefern damit ein detektierbares Signal, das zur Relativpositionsbestimmung zwischen Klinge und Probe genutzt werden kann, wobei hierbei gegebenenfalls die Brechung des eingestrahlten und/oder des detektierten Lichts an der Flüssigkeitsoberfläche berücksichtigt werden muss.
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Erfindungsgemäß ist das Verfahren der eingangs genannten Art dadurch gekennzeichnet, dass zur Relativpositionsbestimmung zwischen der Probe und der Klinge der Lichtstrahl derart ausgerichtet ist, dass er teilweise sowohl auf die Klinge als auch auf die Probe trifft, so dass sowohl von der Klinge als auch von der Probe Licht gestreut und/oder reflektiert des Lichtstrahls wird.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zum Schneiden einer Probe mit einer Klinge, dient vorzugsweise zum Betreiben einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
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Ein auf dem vorliegenden Gebiet tätiger Fachmann wird – bei Kenntnis der oben beschriebenen Vorrichtungsmerkmale der erfindungsgemäßen Lösung – die den Vorrichtungsmerkmalen entsprechenden Verfahrensschritte zum Betreiben der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Vorrichtung entsprechend ausgestalten. Insoweit wird zur Vermeidung von Wiederholungen auf den vorangegangenen Teil der Beschreibung verwiesen.
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Es gibt nun verschiedene Möglichkeiten, die Lehre der vorliegenden Erfindung in vorteilhafter Weise auszugestalten und weiterzubilden. Dazu ist einerseits auf die dem Patentanspruch 1 nachgeordneten Patentansprüche und andererseits auf die nachfolgende Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung zu verweisen. In Verbindung mit der Erläuterung der bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung werden auch im Allgemeinen bevorzugte Ausgestaltungen und Weiterbildungen der Lehre erläutert. In der Zeichnung zeigen
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1 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Schneiden einer Probe.
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2 eine schematische Darstellung einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführung einer Vorrichtung zum Schneiden einer Probe.
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3 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Schneiden einer Probe bei seitlicher Sicht auf die Vorrichtung, wobei sich die Probe in einer Flüssigkeit befindet.
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4 eine schematische Darstellung der entstehenden Lichtflecken für verschiedenen Positionen der Klinge.
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1 zeigt eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Schneiden einer Probe 1. Zur Relativpositionsbestimmung zwischen der Probe 1 und einer Klinge 4, die an einer Klingenbefestigung 20 befestigt ist (einem Bauteil der Schneidvorrichtung, das unter anderem der Befestigung der Klinge 4 dient, beispielsweise ein Mikrotomschlitten), ist ein Lichtstrahl 3 einer Lichtquelle 2 (beispielsweise eines Lasers oder einer Laserdiode) derart ausgerichtet, dass er teilweise sowohl auf die Klinge 4 (in diesem Beispiel insbesondere die Schneide 5 der Klinge 4) als auch auf die Probe 1 trifft. Hierbei ist die Lichtquelle 2 in dieser Ausführungsvariante an der Klingenbefestigung 20 montiert. Das sowohl von der Klinge 4 als auch von der Probe 1 gestreute und/oder reflektierte Licht des Lichtstrahls 3 wird von einer Detektionseinheit 10, die in diesem Fall nur aus einem parallel zur Probenoberseite angeordneten Sichtfenster 13 besteht, aufgenommen. Insbesondere werden in diesem Beispiel insgesamt drei Lichtflecken generiert, da die Probe 1 ein in einem Einbettmedium 7 eingebettetes Präparat 6 beinhaltet: Die Probe 1 generiert also auf Grund der Streuung/Reflexion an den Grenzflächen zwischen den Medien (Luft/Einbettmedium/Präparat) zwei Lichtflecken, die Klinge 4 erzeugt einen Lichtfleck. Ein menschlicher Betrachter bzw. Operator der Schneidvorrichtung kann auf Grundlage der für ihn sichtbaren Lichtflecken, die durch das gestreute und/oder reflektierte Licht entstehen, das in sein Auge 12 fällt, eine visuelle Abschätzung der vertikalen Relativposition zwischen Klinge 4 und Oberfläche des Einbettmediums 7 sowie Präparat 6 vornehmen und die Klingenbefestigung 20 und damit die Klinge 4 der Schneidvorrichtung mittels eines Antriebes 22 in eine gewünschte Position, beispielsweise für einen Schneidvorgang, bewegen. Falls die der Lichtfleck, der der Klinge 4 zugeordnet ist, in einen anderen Lichtfleck übergeht bzw. nicht mehr visuell getrennt werden kann, befindet sich die Klinge 4 sehr nahe an der entsprechenden Grenzfläche (Grenzfläche Luft/Einbettmedium oder Grenzfläche Einbettmedium/Präparat) bzw. berührt diese sogar.
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2 zeigt eine schematische Darstellung einer weiteren erfindungsgemäßen Ausführung einer Vorrichtung zum Schneiden einer Probe, die zu Teilen der in 1 dargestellten Ausführung entspricht. Im Gegensatz zu der Ausführungsform aus 1 wird in diesem Fall jedoch als Detektionseinheit 10 eine Detektorvorrichtung 16 (die ein oder mehrere Detektoren beinhalten kann) in Kombination mit einem Linsensystem 14 zur Detektion des von der Klinge 4 als auch von der Probe 1 gestreuten und/oder reflektierten Lichts des Lichtstrahls 3 verwendet. Die generierten elektrischen Ausgangssignale werden an eine Auswerteelektronik und/oder einen Computer 18 weitergegeben. Diese Signale dienen der Relativpositionsbestimmung zwischen Klinge 4 und Probe 1 bzw. Klinge 4 und Einbettmedium 7 und Präparat 6 und können entweder für den Operator auf einem Monitor 19 ausgegeben bzw. visualisiert werden und/oder, beispielsweise zur Automatisierung des Schneidvorganges, in passende Steuersignale für den Antrieb 22 umgerechnet werden, die dann an diesen weitergleitet werden.
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3 zeigt eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Schneiden einer Probe bei seitlicher Sicht auf die Vorrichtung, wobei sich die Probe 1 in einer Flüssigkeit 8 in einem Behälter 9 befindet und die Probe 1 aus einem Präparat 6 besteht, dass in einem Einbettmedium 7 eingebettet ist. Zur Relativpositionsbestimmung zwischen der Probe 1 und einer Klinge 4, ist ein Lichtstrahl 3 einer Lichtquelle 2 derart ausgerichtet, dass er teilweise sowohl auf die Klinge 4 als auch auf die Probe 1 trifft. Hierbei ist die Lichtquelle 2 mit der Klinge 4 starr verbunden. Die Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahls wird durch einen Pfeil x dargestellt. Das von der Klinge 4 als auch von der Probe 1 sowie der Flüssigkeitsoberfläche gestreute und/oder reflektierte Licht des Lichtstrahls 3 wird von einer Detektionseinheit 10 aufgenommen, die parallel zur Flüssigkeitsoberfläche angeordnet ist. In diesem Beispiel werden insgesamt vier Lichtflecken 50, 52, 54 und 56, generiert: Die Probe erzeugt auf Grund der Streuung/Reflexion an den Grenzflächen zwischen den Medien (Flüssigkeit/Einbettmedium/Präparat) zwei Lichtflecken 54 und 56, die Flüssigkeitsoberfläche (Grenzfläche Luft/Flüssigkeit) und die Klinge 4 erzeugen jeweils einen Lichtfleck (52 bzw. 50). Eine eventuell erfolgende Brechung des Lichtstrahls an der Flüssigkeitsoberfläche wurde in dieser Figur der Übersichtlichkeit halber nicht eingezeichnet.
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4 zeigt auf 3 aufbauend eine schematische Darstellung der Position der entstehenden Lichtflecken aus Sicht der Detektionseinheit aus 3 für verschiedene Positionen der Klinge und Situationen. Teilbild a gibt die Situation aus 3 wieder: Die Klinge befindet sich oberhalb der Flüssigkeitsoberfläche und damit auch oberhalb der Probe. Die in diesem Beispiel entstehenden insgesamt vier Lichtflecken 50 (Streuung/Reflexion an Klinge), 52 (Streuung/Reflexion an Flüssigkeitsoberfläche), 54 (Streuung/Reflexion an Grenzfläche Flüssigkeit/Einbettmedium) und 56 (Streuung/Reflexion an Grenzfläche Einbettmedium/Präparat) besitzen folglich die Reihenfolge 50, 52, 54, 56 bezogen auf die Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahles, hier wie in 3 dargestellt durch einen Pfeil x. Wird die Klinge nun in Richtung der Probe in die Flüssigkeit hinein bewegt, so dass der Lichtstrahl weiterhin teilweise sowohl auf die Klinge als auch auf die Probe trifft (in der 3 also nach unten und links entsprechend der Richtung des Pfeils x), so ist, sobald sich die Klinge unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche befindet, auch der durch die Klinge erzeugte Lichtfleck 50 zwischen den Lichtflecken 52 und 54 angeordnet, die der Flüssigkeitsoberfläche (Lichtfleck 52) und der Grenzfläche Flüssigkeit/Einbettmedium (Lichtfleck 54) entsprechen. Dies ist in Teilbild b dargestellt. Ob bzw. wie sich die Lichtflecken 52, 54, 56 bewegen, hängt von der eventuellen Bewegung der Detektionseinheit und des Lichtstrahls bzw. der Lichtquelle ab. Der Klarheit halber stellt diese Figur nur die Situation dar, dass die Position der Detektionseinheit konstant ist und die Lichtquelle zusammen mit der Klinge nur in Ausbreitungsrichtung (Pfeil x) des ausgesendeten Lichtstrahls bewegt wird (wie in 3) oder ebenfalls an einer konstanten Position gehalten wird. Wird die Klinge nun entlang des Lichtstrahls entsprechend der Richtung des Pfeils x weiterbewegt und trifft sie auf die Oberfläche des Einbettmediums, so gehen die Lichtflecken 52 und 54 ineinander über (Teilbild c). Analog stellt sich die Situation bei Kontakt der Klinge mit dem Präparat dar (Teilbild d) und auch bei Kontakt der Klinge mit der Flüssigkeitsoberfläche (nicht dargestellt). Teilbild e zeigt die Situation in dem Fall, dass der Lichtstrahl das Präparat nicht trifft, folglich sind nur die Lichtflecken 50, 52 und 54 sichtbar. Teilbild f schließlich gibt die Situation wieder, dass der Lichtstrahl auch nicht des Einbettmedium trifft, sondern allein die Klinge und die Flüssigkeitsoberfläche, wodurch ausschließlich die Lichtflecken 50 und 52 sichtbar sind. Die aktuelle Position der Klinge in Bezug auf das Einbettmedium, das Präparat und die Flüssigkeit lässt sich also folglich einfach durch die Anzahl der Lichtflecken und des Verhaltens der Lichtflecken bei Verschieben der Klinge bestimmen. Im Fall von Unsicherheiten bei der Zuordnung der Lichtflecken ist beispielsweise eine Betrachtung der Intensität der Lichtflecken und/oder deren spektraler Zusammensetzung und/oder die Verwendung von Fluorophoren zur Kennzeichnung von Präparat, Einbettmedium und/oder Flüssigkeit denkbar.
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Abschließend sei ganz besonders darauf hingewiesen, dass die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele lediglich zur Beschreibung der beanspruchten Lehre dienen, diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele einschränken. Insbesondere sind sämtliche, in dieser Beschreibung enthaltenen Merkmale und/oder deren Funktionen, Wirkungen und Eigenschaften für sich gesehen und/oder in Kombination miteinander als hierin offenbart anzusehen, die ein auf dem vorliegenden Gebiet tätiger Fachmann ggf. unter Hinzuziehung seines Fachwissens einzeln oder in Kombination zur Lösung der objektiven Aufgabe oder damit zusammenhängenden Problemstellungen vorsehen würde.
