DE102017106867B4

DE102017106867B4 - Method for producing a portion unit

Info

Publication number: DE102017106867B4
Application number: DE102017106867.8A
Authority: DE
Inventors: Jean Marc Josse; Martin GAJEWSKI; Mario Arangio; Eduard Woizenko
Original assignee: Hamilton Bonaduz AG
Current assignee: Hamilton Bonaduz AG
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2017-03-30
Publication date: 2021-12-02
Anticipated expiration: 2037-03-31
Also published as: DE102017106867A1; WO2018177914A1; CH714874B1; CH714874B8

Abstract

Verfahren zur Herstellung einer Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, das Verfahren umfassend die Schritte:
a) Bereitstellen eines fließfähigen, verfestigbaren Gemischs, das das Trägermaterial und die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell umfasst, bei einer ersten Reaktionsbedingung,
b) Einbringen einer vorbestimmten Menge des Gemischs in eine Pipettenspitze mit einem Längsende mit einer Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid, wobei die Öffnung groß genug ist, um die Portionseinheit durch die Öffnung auszubringen,
c) Verfestigen des Gemischs in der Pipettenspitze durch Inkubieren des Längsendes der Pipettenspitze bei einer zweiten Reaktionsbedingung, bei der sich das Gemisch verfestigt, so dass sich die Portionseinheit bildet, und
d) Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze.A method for producing a portion unit from a gel-like carrier material with at least one biological cell which is embedded in the carrier material or at least one cell organelle which is embedded in the carrier material, the method comprising the steps:
a) providing a flowable, solidifiable mixture which comprises the carrier material and the at least one cell or the at least one cell organelle, under a first reaction condition,
b) introducing a predetermined amount of the mixture into a pipette tip with a longitudinal end with an opening for introducing and discharging fluid, the opening being large enough to dispense the portion unit through the opening,
c) solidifying the mixture in the pipette tip by incubating the longitudinal end of the pipette tip under a second reaction condition in which the mixture solidifies so that the portion unit is formed, and
d) Removal of the portion unit from the pipette tip.

Description

Gebiet der ErfindungField of invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist. Die Erfindung betrifft weiter eine Portionseinheit, erhältlich durch das Verfahren. Die Erfindung betrifft ferner verschiedene Verwendungen der Portionseinheit.The invention relates to a method for producing a portion unit from a gel-like carrier material with at least one biological cell that is embedded in the carrier material or at least one cell organelle that is embedded in the carrier material. The invention further relates to a portion unit obtainable by the method. The invention also relates to various uses of the portion unit.

Hintergrund der ErfindungBackground of the invention

Bei der Entstehung von Krebs spielen häufig größere strukturelle Veränderungen der Chromosomen, sogenannte Chromosomen- bzw. DNA-Rearrangements, eine entscheidende Rolle. Beispiele für DNA-Rearrangements sind Duplikationen, Translokationen, Inversionen und Deletionen von bestimmten Chromosomenabschnitten sowie DNA-Strangbrüche und anschließende Fusionen der DNA-Stränge in veränderter Anordnung. Die Identifizierung von DNA-Rearrangements wird zur Diagnose von Krebs eingesetzt und kann als Grundlage für eine personalisierte Krebstherapie dienen.Major structural changes in the chromosomes, so-called chromosome or DNA rearrangements, often play a decisive role in the development of cancer. Examples of DNA rearrangements are duplications, translocations, inversions and deletions of certain chromosome sections as well as DNA strand breaks and subsequent fusions of the DNA strands in a different arrangement. The identification of DNA rearrangements is used to diagnose cancer and can serve as the basis for personalized cancer therapy.

Um DNA-Rearrangements zu identifizieren, wird ein als „molecular combing“ (molekulares Kämmen) bekanntes Verfahren eingesetzt. Für das „molecular combing“ sind intakte, lange DNA-Fragmente erforderlich, die auf eine Glasoberfläche gekämmt werden. Durch das Kämmen werden die DNA-Fragmente ausgerichtet und gedehnt. Dadurch ist es anschließend möglich, die DNA-Fragmente mit Hybridisierungssonden in Kontakt zu bringen und durch eine Bildanalyse der hybridisierten Sonden DNA-Rearrangements zu identifizieren. Dementsprechend wird das „molecular combing“ häufig mit Hybridisierungstechniken wie beispielsweise Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) kombiniert. Das „molecular combing“ ist beispielsweise in Kaykov, A. et al. „Molecular Combing of Single DNA Molecules on the 10 Megabase Scale“, Scientific Reports 6:19636, 2016 näher beschrieben.A process known as “molecular combing” is used to identify DNA rearrangements. “Molecular combing” requires intact, long DNA fragments that are combed onto a glass surface. Combing it aligns and stretches the DNA fragments. This then makes it possible to bring the DNA fragments into contact with hybridization probes and to identify DNA rearrangements by image analysis of the hybridized probes. Accordingly, “molecular combing” is often combined with hybridization techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH). The “molecular combing” is for example in Kaykov, A. et al. "Molecular Combing of Single DNA Molecules on the 10 Megabase Scale", Scientific Reports 6: 19636, 2016 described in more detail.

Für das „molecular combing“ werden DNA-Fragmente mit einer Länge von mehr als 1000 Kilobasenpaaren benötigt. Solche DNA-Fragmente werden als hochmolekulare DNA bezeichnet und gewinnen auch für andere molekularbiologische Techniken wie beispielsweise das Next Generation Sequencing zunehmend an Bedeutung.For “molecular combing”, DNA fragments with a length of more than 1000 kilobase pairs are required. Such DNA fragments are referred to as high molecular weight DNA and are also becoming increasingly important for other molecular biological techniques such as next generation sequencing.

Um hochmolekulare DNA aus Zellen bzw. Zellkernen zu isolieren, muss die DNA während ihrer Isolierung vor Scherkräften geschützt werden. Scherkräfte können dazu führen, dass die DNA in kleine Fragmente zerbricht, die eine Bildanalyse zur Detektion von DNA-Rearrangements unmöglich machen würden. Zum Schutz vor Scherkräften wird die DNA während der Isolierung aus Zellen immobilisiert, beispielsweise in Agarose. Die Zellen werden manuell in Agarose eingebettet. Dazu werden die Zellen zunächst mit einer fließfähigen Agaroselösung gemischt. Eine bestimmte Menge des Gemischs wird in ein Zielgefäß gegeben und dort verfestigt, bevor mit der Isolierung der hochmolekularen DNA begonnen wird. Das verfestigte Gemisch kann als Portionseinheit bezeichnet werden.In order to isolate high molecular weight DNA from cells or cell nuclei, the DNA must be protected from shear forces during its isolation. Shear forces can cause the DNA to break into small fragments that would make image analysis to detect DNA rearrangements impossible. To protect against shear forces, the DNA is immobilized during isolation from cells, for example in agarose. The cells are manually embedded in agarose. To do this, the cells are first mixed with a flowable agarose solution. A certain amount of the mixture is placed in a target vessel and solidified there before the isolation of the high molecular weight DNA begins. The solidified mixture can be referred to as a portion unit.

Für den Einsatz von „molecular combing“ in Krebsdiagnoseverfahren ist eine Standardisierung aller Verfahrensschritte und eine hohe Präzision erforderlich, um falsche Ergebnisse oder Misinterpretationen zu verhindern. Das manuelle Herstellen der Portionseinheiten kann diesen Anforderungen nicht durchgehend gerecht werden, da es eine schlechte Reproduzierbarkeit aufweist. Zum einen lässt sich eine gewisse Variabilität der Portionseinheiten von Person zu Person aufgrund von Unterschieden im individuellen Umgang mit den Portionseinheiten nicht vermeiden. Zum anderen sind die Portionseinheiten sehr fragil. Aus diesem Grund können selbst dann Unterschiede zwischen den Portionseinheiten auftreten, wenn sie von ein- und derselben Person hergestellt wurden. Somit ist es schwierig, standardisierte Portionseinheiten für eine Vielzahl von Proben manuell herzustellen. Folglich kommt es auch zu Unterschieden in der Menge und Qualität der hochmolekularen DNA, die aus den Zellen in den Portionseinheiten isoliert wird.The use of “molecular combing” in cancer diagnosis procedures requires standardization of all procedural steps and a high level of precision in order to prevent false results or misinterpretations. The manual production of the portion units cannot consistently meet these requirements, since it has poor reproducibility. On the one hand, a certain variability of the portion units from person to person cannot be avoided due to differences in the individual handling of the portion units. On the other hand, the portion units are very fragile. For this reason, there may be differences between the portion units even if they were made by one and the same person. Thus, it is difficult to manually produce standardized portion units for a large number of samples. As a result, there are also differences in the amount and quality of the high molecular weight DNA that is isolated from the cells in the serving units.

Es besteht daher ein Bedarf an einem automatisierbaren Verfahren zur Herstellung der Portionseinheiten.There is therefore a need for an automatable method for producing the portion units.

In der WO 2012/034871 A2 ist ein Verfahren zum Herstellen von Wirkstoff-Beads mit einem gelartigen Trägermaterial wie beispielsweise Agarose und mit einem biologisch aktiven Material wie beispielsweise Krebszellen, das in das Trägermaterial eingebettet ist, beschrieben. In dem Verfahren wird eine fließfähige, verfestigbare Mischung, die das Trägermaterial und das biologisch aktive Material umfasst, in eine Pipettierspitze eingebracht und eine vorbestimmte Menge der fließfähigen Mischung über die Pipettieröffnung als Tropfen in ein Fluidbad ausgestoßen. Durch das Einbringen in das Fluidbad findet das Verfestigen der fließfähigen Mischung statt. Der Bead wird anschließend aus dem Fluidbad entnommen.In the WO 2012/034871 A2 describes a method for producing active substance beads with a gel-like carrier material such as agarose and with a biologically active material such as cancer cells, which is embedded in the carrier material. In the method, a flowable, solidifiable mixture, which comprises the carrier material and the biologically active material, in a Inserted the pipette tip and ejected a predetermined amount of the flowable mixture through the pipette opening as drops into a fluid bath. When it is introduced into the fluid bath, the flowable mixture solidifies. The bead is then removed from the fluid bath.

Zusammenfassung der ErfindungSummary of the invention

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, das Verfahren umfassend die Schritte:

a) Bereitstellen eines fließfähigen, verfestigbaren Gemischs, das das Trägermaterial und die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell umfasst, bei einer ersten Reaktionsbedingung,
b) Einbringen einer vorbestimmten Menge des Gemischs in eine Pipettenspitze mit einem Längsende mit einer Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid, wobei die Öffnung groß genug ist, um die Portionseinheit durch die Öffnung auszubringen,
c) Verfestigen des Gemischs in der Pipettenspitze durch Inkubieren des Längsendes der Pipettenspitze bei einer zweiten Reaktionsbedingung, bei der sich das Gemisch verfestigt, so dass sich die Portionseinheit bildet, und
d) Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze.

The present invention relates to a method for producing a portion unit from a gel-like carrier material with at least one biological cell that is embedded in the carrier material or at least one cell organelle that is embedded in the carrier material, the method comprising the steps:

a) providing a flowable, solidifiable mixture which comprises the carrier material and the at least one cell or the at least one cell organelle, under a first reaction condition,
b) introducing a predetermined amount of the mixture into a pipette tip with a longitudinal end with an opening for introducing and discharging fluid, the opening being large enough to dispense the portion unit through the opening,
c) solidifying the mixture in the pipette tip by incubating the longitudinal end of the pipette tip under a second reaction condition in which the mixture solidifies so that the portion unit is formed, and
d) Removal of the portion unit from the pipette tip.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, erhältlich durch ein Verfahren gemäß der Erfindung.The present invention further relates to a portion unit made of a gel-like carrier material with at least one biological cell that is embedded in the carrier material or at least one cell organelle that is embedded in the carrier material, obtainable by a method according to the invention.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Isolierung einer Nukleinsäure.The present invention also relates to the use of a portion unit according to the invention for isolating a nucleic acid.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Isolierung eines Proteins.The present invention also relates to the use of a portion unit according to the invention for isolating a protein.

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Kultivierung oder Kokultivierung von Zellen.The present invention also relates to the use of a portion unit according to the invention for the cultivation or cocultivation of cells.

Detaillierte Beschreibung der ErfindungDetailed description of the invention

In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, das Verfahren umfassend die Schritte:

In a first aspect, the invention relates to a method for producing a portion unit from a gel-like carrier material with at least one biological cell that is embedded in the carrier material or at least one cell organelle that is embedded in the carrier material, the method comprising the steps:

Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, hergestellt. Der Begriff „Portionseinheit“ wie hier verwendet bezeichnet eine verfestigte vorbestimmte Menge des Trägermaterials, in dem die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell eingebettet ist. Die Zelle oder das Zellorganell ist dabei von dem Trägermaterial umschlossen. Da das Trägermaterial der Portionseinheit verfestigt ist, ist die Zelle oder das Zellorganell in dem Trägermaterial der Portionseinheit immobilisiert. Aufgrund des gelartigen Trägermaterials ist die Portionseinheit elastisch. Das bedeutet, dass die Portionseinheit unter Krafteinwirkung ihre Form verändern und bei Wegfall der einwirkenden Kraft in ihre ursprüngliche Form zurückkehren kann.By means of the method according to the invention, a portion unit is produced from a gel-like carrier material with at least one biological cell that is embedded in the carrier material or at least one cell organelle that is embedded in the carrier material. The term “portion unit” as used here denotes a solidified predetermined amount of the carrier material in which the at least one cell or the at least one cell organelle is embedded. The cell or the cell organelle is enclosed by the carrier material. Since the carrier material of the portion unit is solidified, the cell or the cell organelle is immobilized in the carrier material of the portion unit. Due to the gel-like carrier material the portion unit is elastic. This means that the portion unit can change its shape under the influence of force and can return to its original shape when the force is removed.

Der Begriff „biologische Zelle“ wie hier verwendet bezeichnet eine Zelle eines Tieres, einer Pflanze, eines Pilzes, eines Bakteriums oder eines Archaeons. Das Tier ist beispielsweise ein Säugetier, vorzugsweise ein Mensch. Eine biologische Zelle weist eine Zellmembran auf, die das Zytoplasma und die darin enthaltenen weiteren Bestandteile der Zelle wie beispielsweise Zellorganellen umgibt. Der Begriff „Zellorganell“ wie hier verwendet bezeichnet einen Bestandteil einer Zelle, der von einer einfachen oder einer doppelten Membran umgeben ist. Zu den Zellorganellen zählen beispielsweise Zellkern und Mitochondrium.The term “biological cell” as used here refers to a cell of an animal, a plant, a fungus, a bacterium or an archaeon. The animal is, for example, a mammal, preferably a human. A biological cell has a cell membrane that surrounds the cytoplasm and the other components of the cell contained therein, such as cell organelles. The term “cell organelle” as used here refers to a component of a cell that is surrounded by a single or a double membrane. The cell organelles include, for example, the nucleus and mitochondrion.

Für das erfindungsgemäße Verfahren wird zunächst ein fließfähiges, verfestigbares Gemisch, das das Trägermaterial und die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell umfasst, bei einer ersten Reaktionsbedingung bereitgestellt. Als Trägermaterial ist jedes gelartige Material geeignet, das in Abhängigkeit einer Reaktionsbedingung als fließfähige, verfestigbare Masse oder in verfestigter Form vorliegt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Trägermaterial Agarose. Wenn das Trägermaterial als fließfähige Masse vorliegt, können die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell in das Trägermaterial eingemischt werden. In dem resultierenden Gemisch, das das Trägermaterial und die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell umfasst, bleiben die Eigenschaften des Trägermaterials erhalten, so dass das Gemisch ebenfalls fließfähig und verfestigbar ist.For the method according to the invention, a flowable, solidifiable mixture which comprises the carrier material and the at least one cell or the at least one cell organelle is first provided under a first reaction condition. Any gel-like material that is present as a flowable, solidifiable mass or in solidified form, depending on a reaction condition, is suitable as a carrier material. In a preferred embodiment, the carrier material is agarose. If the carrier material is in the form of a flowable mass, the at least one cell or the at least one cell organelle can be mixed into the carrier material. In the resulting mixture, which comprises the carrier material and the at least one cell or the at least one cell organelle, the properties of the carrier material are retained, so that the mixture is likewise flowable and solidifiable.

Der Begriff „Reaktionsbedingung“ wie hier verwendet bezeichnet mindestens einen Parameter oder eine Kombination von Parametern, bei dem/der mindestens einer der Verfahrensschritte durchgeführt wird. Die Parameter umfassen vorzugsweise eine Temperatur, eine Salzkonzentration, eine lonenstärke, einen pH-Wert und/oder einen Zusatz von Reagenzien. Die Wahl der Reaktionsbedingung hängt insbesondere davon ab, welches Trägermaterial in dem Verfahren eingesetzt wird. Die Reaktionsbedingung ist insbesondere eine Temperatur.The term “reaction condition” as used here denotes at least one parameter or a combination of parameters in which at least one of the method steps is carried out. The parameters preferably include a temperature, a salt concentration, an ionic strength, a pH value and / or an addition of reagents. The choice of the reaction condition depends in particular on which support material is used in the process. The reaction condition is, in particular, a temperature.

Die erste Reaktionsbedingung ist die Reaktionsbedingung, bei der das fließfähige, verfestigbare Gemisch, das das Trägermaterial und die mindestens eine Zelle oder das mindestens eine Zellorganell umfasst, bereitgestellt wird. Die erste Reaktionsbedingung wird daher so gewählt, dass das Gemisch in einem fließfähigen, verfestigbaren Zustand vorliegt. Dazu wird die erste Reaktionsbedingung so gewählt, dass das Trägermaterial in einem fließfähigen, verfestigbaren Zustand vorliegt. Die erste Reaktionsbedingung wird demzufolge in Abhängigkeit der Geliertemperatur des eingesetzten Trägermaterials gewählt. Die Geliertemperatur ist die Temperatur, bei der sich das Trägermaterial zu einem Gel oder zu einem gelartigen Körper verfestigt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erste Reaktionsbedingung eine Temperatur von etwa 45°C.The first reaction condition is the reaction condition in which the flowable, solidifiable mixture, which comprises the carrier material and the at least one cell or the at least one cell organelle, is provided. The first reaction condition is therefore chosen so that the mixture is in a flowable, solidifiable state. For this purpose, the first reaction condition is chosen such that the carrier material is in a flowable, solidifiable state. The first reaction condition is therefore selected as a function of the gelling temperature of the carrier material used. The setting temperature is the temperature at which the carrier material solidifies to form a gel or a gel-like body. In a preferred embodiment, the first reaction condition comprises a temperature of about 45 ° C.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird anschließend eine vorbestimmte Menge des Gemischs in eine Pipettenspitze mit einem Längsende mit einer Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingebracht. Eine Pipettenspitze weist zwei einander gegenüberliegende Längsenden mit jeweils einer Öffnung auf, von denen das eine Längsende zum Einbringen und Ausbringen von Fluid und das andere Längsende zum Aufstecken der Pipettenspitze auf einen Pipettenschaft einer Pipette oder auf einen Pipettierkopf eines Pipettierroboters eingerichtet ist. Bei bekannten Pipettenspitzen hat das Längsende zum Einbringen und Ausbringen von Fluid typischerweise die Form eines Kegelstumpfs, dessen Durchmesser sich zur Öffnung des Längsendes hin verringert. Diese Pipettenspitzen sind für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Des Weiteren sind Pipettenspitzen mit einem zylindrischen Längsende zum Einbringen und Ausbringen von Fluid für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet.In the method according to the invention, a predetermined amount of the mixture is then introduced into a pipette tip with a longitudinal end with an opening for introducing and discharging fluid. A pipette tip has two opposite longitudinal ends, each with an opening, of which one longitudinal end is designed for introducing and discharging fluid and the other longitudinal end for attaching the pipette tip to a pipette shaft of a pipette or to a pipetting head of a pipetting robot. In known pipette tips, the longitudinal end for introducing and discharging fluid typically has the shape of a truncated cone, the diameter of which decreases towards the opening of the longitudinal end. These pipette tips are suitable for the method according to the invention. Furthermore, pipette tips with a cylindrical longitudinal end for introducing and discharging fluid are suitable for the method according to the invention.

Die Öffnung der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid ist groß genug, um die Portionseinheit durch die Öffnung aus der Pipettenspitze auszubringen. Aufgrund des gelartigen Trägermaterials ist die Portionseinheit elastisch. Durch die Elastizität lässt sich die Portionseinheit vorübergehend verformen. Somit kann die Portionseinheit während des Ausbringens aus der Pipettenspitze verformt werden und nach dem Ausbringen in ihre ursprüngliche Form zurückkehren. Das Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze erfolgt also unter Beibehaltung der ursprünglichen Form der Portionseinheit.The opening of the pipette tip for introducing and dispensing fluid is large enough to dispense the portion unit through the opening from the pipette tip. Due to the gel-like carrier material, the portion unit is elastic. Due to the elasticity, the portion unit can be temporarily deformed. Thus, the portion unit can be deformed while being dispensed from the pipette tip and can return to its original shape after dispensing. The portion unit is removed from the pipette tip while maintaining the original shape of the portion unit.

Eine vorübergehende Verformung der Portionseinheit während des Ausbringens aus der Pipettenspitze tritt beispielsweise auf, wenn das Längsende der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid die Form eines Kegelstumpfs hat. In diesem Fall ist die Portionseinheit auch kegelstumpfförmig und der dem Inneren der Pipettenspitze zugewandte Teil der Portionseinheit muss sich beim Ausbringen aus der Pipettenspitze verformen, damit die Portionseinheit durch die Öffnung der Pipettenspitze gebracht werden kann.A temporary deformation of the portion unit during the discharge from the pipette tip occurs, for example, when the longitudinal end of the pipette tip for introducing and discharging fluid has the shape of a truncated cone. In this case, the portion unit is also frustoconical and that part of the portion unit facing the interior of the pipette tip must deform when it is removed from the pipette tip so that the portion unit can be brought through the opening of the pipette tip.

Das Verformen der Portionseinheit kann beispielsweise durch Ausüben eines Drucks auf die Portionseinheit in Richtung der Pipettenspitzenöffnung hervorgerufen werden. Je elastischer die Portionseinheit ist, umso weniger Druck ist für das Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze bei gleicher Größe der Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid erforderlich. Der Druck ist vorzugsweise gleichmäßig über die dem Inneren der Pipettenspitze zugewandte Oberfläche der Portionseinheit verteilt.The deformation of the portion unit can be brought about, for example, by exerting pressure on the portion unit in the direction of the pipette tip opening. The more elastic the portion unit, the less pressure is required to dispense the portion unit from the pipette tip with the same size of the opening for introducing and dispensing fluid. The pressure is preferably evenly distributed over the surface of the portion unit facing the interior of the pipette tip.

Die Öffnung der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid muss also eine bestimmte Mindestgröße haben, damit sich die Portionseinheit durch die Öffnung aus der Pipettenspitze ausbringen lässt. Diese Mindestgröße hängt von der Elastizität und der Größe der Portionseinheit ab. Beispielsweise kann die Öffnung der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid umso kleiner sein, je elastischer die Portionseinheit ist. Die Elastizität der Portionseinheit hängt in erster Linie von der Art und Zusammensetzung des Trägermaterials ab.The opening of the pipette tip for introducing and discharging fluid must therefore have a certain minimum size so that the portion unit can be discharged from the pipette tip through the opening. This minimum size depends on the elasticity and the size of the portion unit. For example, the opening of the pipette tip for introducing and discharging fluid can be smaller, the more elastic the portion unit is. The elasticity of the portion unit depends primarily on the type and composition of the carrier material.

Die Öffnung der Pipettenspitze muss groß genug sein, um die Portionseinheit unbeschädigt durch die Öffnung auszubringen. Die Portionseinheit darf während des Ausbringens aus der Pipettenspitze nicht beschädigt werden, damit die Portionseinheit nach dem Ausbringen wieder ihre ursprüngliche Form annimmt. Nimmt die Portionseinheit nach dem Ausbringen aus der Pipettenspitze wieder ihre ursprüngliche Form an, so ist davon auszugehen, dass die Zelle oder das Zellorganell und deren/dessen Bestandteile, insbesondere DNA, während des Ausbringens der Portionseinheit aus der Pipettenspitze vor Scherkräften geschützt gewesen sind.The opening of the pipette tip must be large enough to dispense the portion unit undamaged through the opening. The portion unit must not be damaged while it is being dispensed from the pipette tip so that the portion unit returns to its original shape after dispensing. If the portion unit returns to its original shape after being removed from the pipette tip, it can be assumed that the cell or cell organelle and its / its components, in particular DNA, were protected from shear forces while the portion unit was being removed from the pipette tip.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat die Öffnung der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid einen Innendurchmesser von 2 mm bis 5 mm, vorzugsweise von 3 mm bis 4 mm.In a preferred embodiment, the opening of the pipette tip for introducing and discharging fluid has an internal diameter of 2 mm to 5 mm, preferably 3 mm to 4 mm.

Um eine Kontamination der Portionseinheit zu vermeiden, ist die Pipettenspitze vorzugsweise eine Einweg-Pipettenspitze.In order to avoid contamination of the portion unit, the pipette tip is preferably a disposable pipette tip.

Das Einbringen der vorbestimmten Menge des Gemischs in die Pipettenspitze kann auf verschiedene Weisen erfolgen, beispielsweise durch Einsaugen der vorbestimmten Menge des Gemischs in die Pipettenspitze mit Unterdruck oder durch Eintauchen des Längsendes zum Einbringen und Ausbringen von Fluid in ein Gefäß, das das Gemisch enthält. Beim Eintauchen der Pipettenspitze in das Gemisch in dem Gefäß wird das Gemisch durch Kapillarkräfte in die Pipettenspitze eingebracht. Dabei ist die Menge des eingebrachten Gemischs von der Dauer des Eintauchens der Pipettenspitze abhängig, so dass die vorbestimmte Menge des Gemischs durch eine vorbestimmte Eintauchdauer erreicht werden kann.The predetermined amount of the mixture can be introduced into the pipette tip in various ways, for example by sucking the predetermined amount of the mixture into the pipette tip with negative pressure or by immersing the longitudinal end for introducing and discharging fluid into a vessel containing the mixture. When the pipette tip is immersed in the mixture in the vessel, the mixture is introduced into the pipette tip by capillary forces. The amount of the mixture introduced depends on the duration of the immersion of the pipette tip, so that the predetermined amount of the mixture can be achieved by a predetermined immersion time.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Verfestigen des Gemischs in der Pipettenspitze, so dass sich die Portionseinheit bildet. Dieser Verfahrensschritt erfolgt durch Inkubieren des Längsendes der Pipettenspitze bei einer zweiten Reaktionsbedingung, bei der sich das Gemisch verfestigt. Dazu wird die zweite Reaktionsbedingung so gewählt, dass sich das Trägermaterial verfestigt. Die zweite Reaktionsbedingung wird demzufolge in Abhängigkeit der Geliertemperatur des eingesetzten Trägermaterials gewählt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die zweite Reaktionsbedingung eine Temperatur von etwa 4°C.The method according to the invention further comprises solidifying the mixture in the pipette tip so that the portion unit is formed. This process step is carried out by incubating the longitudinal end of the pipette tip under a second reaction condition in which the mixture solidifies. For this purpose, the second reaction condition is chosen so that the carrier material solidifies. The second reaction condition is therefore selected as a function of the gelling temperature of the carrier material used. In a preferred embodiment, the second reaction condition comprises a temperature of about 4 ° C.

Das Gemisch, das in das Längsende der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingebracht wurde, wird in der Pipettenspitze verfestigt, so dass sich die Portionseinheit in der Pipettenspitze bildet. Die Portionseinheit entsteht durch das Verfestigen der vorbestimmten Menge des Gemischs.The mixture, which was introduced into the longitudinal end of the pipette tip for introducing and discharging fluid, is solidified in the pipette tip, so that the portion unit is formed in the pipette tip. The portion unit is created by solidifying the predetermined amount of the mixture.

Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiter das Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze. Das Ausbringen der Portionseinheit kann auf verschiedene Weisen erfolgen, beispielsweise durch Ausblasen oder Ausklopfen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze oder durch Zerstören der Pipettenspitze. Das Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze erfolgt unter Beibehaltung der ursprünglichen Form der Portionseinheit. Dabei ist es möglich, dass sich die Portionseinheit während des Ausbringens aus der Pipettenspitze verformt und nach dem Ausbringen in ihre ursprüngliche Form zurückkehrt. Alternativ wird die Portionseinheit während des Ausbringens aus der Pipettenspitze nicht verformt.The method according to the invention further comprises removing the portion unit from the pipette tip. The portion unit can be dispensed in various ways, for example by blowing or knocking the portion unit out of the pipette tip or by destroying the pipette tip. The portion unit is discharged from the pipette tip while maintaining the original shape of the portion unit. It is possible that the portion unit deforms while being dispensed from the pipette tip and returns to its original shape after dispensing. Alternatively, the portion unit is not deformed while it is being dispensed from the pipette tip.

Das verfestigte Trägermaterial schützt die darin eingebettete Zelle oder das darin eingebettete Zellorganell und deren/dessen Bestandteile, insbesondere DNA, vor Scherkräften.The solidified carrier material protects the cell embedded therein or the cell organelle embedded therein and its / its components, in particular DNA, from shear forces.

Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass die Portionseinheit in der Pipettenspitze gebildet wird. Es ist bekannt, das verfestigbare Gemisch in ein Zielgefäß einzubringen und das Gemisch in dem Zielgefäß zu verfestigen, so dass sich die Portionseinheit in dem Zielgefäß bildet. Allerdings haftet die Portionseinheit dann auf dem Boden und an den Wänden des Zielgefäßes, so dass die für Reagenzien zugängliche Oberfläche der Portionseinheit verringert ist und für bestimmte Verwendungen der Portionseinheit nicht ausreicht. Im Unterscheid dazu wird die Portionseinheit in dem erfindungsgemäßen Verfahren in der Pipettenspitze gebildet und anschließend aus der Pipettenspitze ausgebracht. Dadurch ist die Portionseinheit von allen Seiten für Reagenzien zugänglich. Dadurch können Reaktions- und/oder Waschschritte im Rahmen der weiteren Verwendung der Portionseinheit effizienter durchgeführt werden.One advantage of the method according to the invention is that the portion unit is formed in the pipette tip. It is known to introduce the solidifiable mixture into a target vessel and to solidify the mixture in the target vessel so that the portion unit is formed in the target vessel. However, the portion unit then adheres to the bottom and to the walls of the target vessel, so that the reagents accessible surface of the portion unit is reduced and is insufficient for certain uses of the portion unit. In contrast to this, in the method according to the invention, the portion unit is formed in the pipette tip and then discharged from the pipette tip. This means that the portion unit is accessible for reagents from all sides. As a result, reaction and / or washing steps can be carried out more efficiently as part of the further use of the portion unit.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, dass das Verfahren automatisierbar ist, so dass die Portionseinheit automatisiert hergestellt werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Portionseinheit daher automatisiert hergestellt. Aufgrund der Automatisierbarkeit kann das Verfahren teilweise oder auch vollständig von einem Pipettierroboter ausgeführt werden. Der Pipettierroboter ist vorzugsweise eingerichtet, die von ihm auszuführenden Verfahrensschritte zu vorbestimmten Zeitpunkten durchzuführen. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verfahrensschritte daher zu vorbestimmten Zeitpunkten durchgeführt.Another advantage of the method according to the invention is that the method can be automated so that the portion unit can be produced in an automated manner. In a preferred embodiment, the portion unit is therefore produced in an automated manner. Because it can be automated, the method can be carried out partially or completely by a pipetting robot. The pipetting robot is preferably set up to carry out the method steps to be carried out by it at predetermined times. In a preferred embodiment, the method steps are therefore carried out at predetermined times.

Ein automatisiertes Ausführen des Verfahrens ermöglicht die parallele Herstellung einer Vielzahl von Portionseinheiten. Dadurch kann das erfindungsgemäße Verfahren auch in Hochdurchsatz-Anwendungen angewendet werden. Beispielsweise kann das Gemisch in einer Mikrotiterplatte mit 96 oder 384 Wells (Näpfchen) bereitgestellt werden.Automated execution of the method enables the parallel production of a large number of portion units. As a result, the method according to the invention can also be used in high throughput applications. For example, the mixture can be provided in a microtiter plate with 96 or 384 wells (wells).

Ein automatisiertes Ausführen des Verfahrens ermöglicht nicht nur die Parallelisierung des Verfahrens, durch die Zeit eingespart wird, sondern auch eine weitreichende Kontrolle und Überwachung der einzelnen Verfahrensschritte. Dadurch wird eine reproduzierbare Herstellung der Portionseinheit ermöglicht. Die Kontrolle und Überwachung der Verfahrensschritte ist insbesondere für den Schritt b) vorteilhaft, da ein Pipettierroboter kontrollieren kann, ob die vorbestimmte Menge des Gemischs in die Pipettenspitze eingebracht wurde, beispielsweise durch Überwachen der aus der Pipettenspitze verdrängten Luft. Durch das kontrollierte und reproduzierbare Einbringen der vorbestimmten Menge des Gemischs in die Pipettenspitze lässt sich im Gegensatz zur manuellen Durchführung des Verfahrensschritts eine reproduzierbare Größe der Portionseinheit sicherstellen. Die reproduzierbare Größe der Portionseinheit ist insbesondere bei molekularbiologischen Untersuchungen von Bedeutung, da die Untersuchungsergebnisse häufig nur unter dieser Voraussetzung korrekt interpretiert werden können. Des Weiteren kann die Geschwindigkeit vorgegeben werden, mit der das Einbringen der vorbestimmten Menge des Gemischs in die Pipettenspitze erfolgt. Dadurch lässt sich die vorbestimmte Menge des Gemischs auf kontrollierte Weise in die Pipettenspitze einbringen. Ferner kann dadurch ein etwaiges Eindringen von Luftblasen in das Gemisch während Schritt b) vermieden werden. Auch das korrekte und vollständige Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze kann von einem Pipettierroboter verifiziert werden. Durch diese technischen Möglichkeiten lässt sich die korrekte und reproduzierbare Herstellung der Portionseinheit sicherstellen, so dass standardisierte Portionseinheiten für eine Vielzahl von Proben von Zellen oder Zellorganellen hergestellt werden können.Automated execution of the process enables not only the parallelization of the process, which saves time, but also extensive control and monitoring of the individual process steps. This enables reproducible production of the portion unit. The control and monitoring of the method steps is particularly advantageous for step b), since a pipetting robot can control whether the predetermined amount of the mixture has been introduced into the pipette tip, for example by monitoring the air displaced from the pipette tip. By means of the controlled and reproducible introduction of the predetermined amount of the mixture into the pipette tip, in contrast to the manual implementation of the method step, a reproducible size of the portion unit can be ensured. The reproducible size of the portion unit is particularly important in molecular biological examinations, since the examination results can often only be correctly interpreted under this condition. Furthermore, the speed at which the predetermined amount of the mixture is introduced into the pipette tip can be specified. This allows the predetermined amount of the mixture to be introduced into the pipette tip in a controlled manner. Furthermore, any penetration of air bubbles into the mixture during step b) can thereby be avoided. The correct and complete discharge of the portion unit from the pipette tip can also be verified by a pipetting robot. These technical possibilities allow the correct and reproducible production of the portion unit to be ensured, so that standardized portion units can be produced for a large number of samples of cells or cell organelles.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt vor Schritt a) ein Mischen des fließfähigen, verfestigbaren Trägermaterials mit der mindestens einen Zelle oder dem mindestens einem Zellorganell bei der ersten Reaktionsbedingung, um das Gemisch herzustellen. Vorzugsweise liegt die Zelle oder das Zellorganell vor dem Einmischen in das Trägermaterial bereits bei der ersten Reaktionsbedingung vor, um ein Verfestigen des Trägermaterials bei Zugabe der Zelle oder des Zellorganells zu vermeiden. Beispielsweise kann die Zelle oder das Zellorganell auf die gleiche Temperatur wie das fließfähige Trägermaterial vorgewärmt oder vorgekühlt werden.In a preferred embodiment, prior to step a), the flowable, solidifiable carrier material is mixed with the at least one cell or the at least one cell organelle under the first reaction condition in order to produce the mixture. The cell or the cell organelle is preferably already present in the first reaction condition before being mixed into the carrier material in order to avoid solidification of the carrier material when the cell or the cell organelle is added. For example, the cell or the cell organelle can be preheated or precooled to the same temperature as the flowable carrier material.

Eine Suspension von Zellen oder Zellorganellen wird beispielsweise im Verhältnis 1:1 (v/v) mit dem Trägermaterial gemischt. Beispielsweise werden 50 µl einer Zellsuspension mit 50 µl einer Lösung von 2% Agarose als Trägermaterial gemischt. Der Anteil an Trägermaterial in dem Gemisch kann erhöht werden, um festere und damit mechanisch stabilere Portionseinheiten zu erhalten. Alternativ kann die Konzentration des Trägermaterials erhöht werden, um festere Portionseinheiten herzustellen.A suspension of cells or cell organelles is mixed with the carrier material in a ratio of 1: 1 (v / v), for example. For example, 50 μl of a cell suspension are mixed with 50 μl of a solution of 2% agarose as the carrier material. The proportion of carrier material in the mixture can be increased in order to obtain stronger and thus mechanically more stable portion units. Alternatively, the concentration of the carrier material can be increased in order to produce more solid serving units.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt Schritt b) durch Einsaugen der vorbestimmten Menge des Gemischs in die Pipettenspitze mit Unterdruck. Dazu kann beispielsweise eine gewöhnliche Mikroliter- oder Kolbenhubpipette, auf der die Pipettenspitze aufgesteckt ist, eingesetzt werden. In diesem Fall zieht ein beweglicher Kolben in der Aufwärtsbewegung die unter ihm liegende Luftsäule mit sich nach oben und dadurch auch das Gemisch in die aufgesteckte Pipettenspitze.In a preferred embodiment, step b) takes place by sucking the predetermined amount of the mixture into the pipette tip with negative pressure. For this purpose, for example, an ordinary microliter or piston-operated pipette, onto which the pipette tip is attached, can be used. In this case, a movable piston pulls the column of air below it upwards with it in its upward movement and thereby also pulls the mixture into the attached pipette tip.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt Schritt b) bei einer Flussrate von 1 µl/s bis 300 µl/s, vorzugsweise von 1 µl/s bis 100 µl/s. Die Flussrate wird in Abhängigkeit der Viskosität des Gemischs, der in die Pipettenspitze einzubringenden vorbestimmten Menge des Gemischs und des Durchmessers der Öffnung des Längsendes der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid gewählt. Durch die Wahl der Flussrate lässt sich die vorbestimmte Menge des Gemischs auf kontrollierte Weise in die Pipettenspitze einbringen. Die Flussrate wird vorzugsweise ausreichend niedrig gewählt, um ein etwaiges Auftreten von Luftblasen in dem Gemisch während Schritt b) zu vermeiden.In a preferred embodiment, step b) takes place at a flow rate of 1 μl / s to 300 μl / s, preferably from 1 μl / s to 100 μl / s. The flow rate is a function of the viscosity of the mixture that is in the Pipette tip to be introduced predetermined amount of the mixture and the diameter of the opening of the longitudinal end of the pipette tip for introducing and discharging fluid selected. By choosing the flow rate, the predetermined amount of the mixture can be introduced into the pipette tip in a controlled manner. The flow rate is preferably chosen to be sufficiently low in order to avoid any occurrence of air bubbles in the mixture during step b).

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die vorbestimmte Menge des Gemischs etwa 5 µl bis etwa 300 µl, weiter bevorzugt etwa 10 µl bis etwa 250 µl, weiter bevorzugt etwa 50 µl bis etwa 200 µl, am meisten bevorzugt etwa 75 µl bis etwa 150 µl. Die vorbestimmte Menge des Gemischs wird in Abhängigkeit der verfügbaren Menge an Zellen oder Zellorganellen und/oder der beabsichtigten Verwendung der Portionseinheit gewählt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die vorbestimmte Menge des Gemischs etwa 100 µl.In a preferred embodiment, the predetermined amount of the mixture is about 5 µl to about 300 µl, more preferably about 10 µl to about 250 µl, more preferably about 50 µl to about 200 µl, most preferably about 75 µl to about 150 µl. The predetermined amount of the mixture is selected depending on the available amount of cells or cell organelles and / or the intended use of the portion unit. In a particularly preferred embodiment, the predetermined amount of the mixture is about 100 μl.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Inkubieren des Längsendes der Pipettenspitze bei der zweiten Reaktionsbedingung durch Einbringen des Längsendes der Pipettenspitze in eine Lösung, die die Temperatur der zweiten Reaktionsbedingung hat. Das Längsende der Pipettenspitze kann beispielsweise in eine Lösung, die eine Temperatur von etwa 4°C hat, eingetaucht werden.In a preferred embodiment, the longitudinal end of the pipette tip is incubated in the second reaction condition by placing the longitudinal end of the pipette tip in a solution which has the temperature of the second reaction condition. The longitudinal end of the pipette tip can, for example, be immersed in a solution which has a temperature of about 4 ° C.

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt Schritt d) durch Ausblasen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze. Dazu kann beispielsweise eine gewöhnliche Mikroliter- oder Kolbenhubpipette, auf der die Pipettenspitze aufgesteckt ist, eingesetzt werden. In diesem Fall verdrängt ein beweglicher Kolben beim Herunterdrücken die unter ihm liegende Luftsäule, so dass die Portionseinheit aus der Pipettenspitze ausgeblasen wird.In a preferred embodiment, step d) is carried out by blowing the portion unit out of the pipette tip. For this purpose, for example, an ordinary microliter or piston-operated pipette, onto which the pipette tip is attached, can be used. In this case, a movable piston displaces the column of air below when it is pressed down, so that the portion unit is blown out of the pipette tip.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Portionseinheit in ein Zielgefäß mit einer Reaktionslösung oder auf eine feste Oberfläche ausgebracht. Dies hängt vor allem von der beabsichtigten weiteren Verwendung der Portionseinheit ab. Wird die Portionseinheit in ein Zielgefäß mit einer Reaktionslösung ausgebracht, so wird die Reaktionslösung in Abhängigkeit der weiteren Verwendung der Portionseinheit gewählt. Die Reaktionslösung kann beispielsweise ein Lysepuffer zum Lysieren der Zelle oder des Zellorganells in der Portionseinheit sein.In a preferred embodiment, the portion unit is dispensed into a target vessel with a reaction solution or onto a solid surface. This mainly depends on the intended further use of the portion unit. If the portion unit is applied to a target vessel with a reaction solution, the reaction solution is selected depending on the further use of the portion unit. The reaction solution can, for example, be a lysis buffer for lysing the cell or the cell organelle in the portion unit.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Längsende der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid zylindrisch, wobei das zylindrische Längsende eine vorbestimmte Höhe hat, so dass die dem Inneren der Pipettenspitze zugewandte freie Oberfläche des Gemischs nicht über das zylindrische Längsende der Pipettenspitze hinaus ragt. Somit hängt die minimale vorbestimmte Höhe des zylindrische Längsendes von der vorbestimmten Menge des Gemischs, das in die Pipettenspitze eingebracht wird, und vom dem Durchmesser des zylindrischen Längsendes ab. Das zylindrische Längsende erleichtert das Ausbringen der Portionseinheit aus der Pipettenspitze, da die Portionseinheit während des Ausbringens nicht verformt werden muss.In a preferred embodiment, the longitudinal end of the pipette tip for introducing and discharging fluid is cylindrical, the cylindrical longitudinal end having a predetermined height so that the free surface of the mixture facing the interior of the pipette tip does not protrude beyond the cylindrical longitudinal end of the pipette tip. Thus, the minimum predetermined height of the cylindrical longitudinal end depends on the predetermined amount of the mixture that is introduced into the pipette tip and on the diameter of the cylindrical longitudinal end. The cylindrical longitudinal end facilitates the dispensing of the portion unit from the pipette tip, since the portion unit does not have to be deformed during dispensing.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Trägermaterial Agarose. Agarose ist ein Polysaccharid, das kostengünstig und einfach in der Handhabung ist. Agarose wird typischerweise als Pulver erworben. Das Pulver wird in eine geeignete wässrige Pufferlösung gegeben und für etwa 1 bis etwa 5 Minuten aufgekocht, um die Agarose zu lösen. Vor der weiteren Verwendung wird die gelöste Agarose in der Regel auf etwa 50°C bis etwa 60°C gekühlt oder abkühlen gelassen. Die Geliertemperatur von Agarose, bei der sich die Agarose zu einem Gel verfestigt, liegt je nach der Quelle, aus der die Agarose stammt, im Bereich von etwa 34°C bis etwa 42°C bei 1,5% Agarose. Im verfestigten Zustand liegt Agarose als ein Gel vor, das Poren aufweist. Die Poren ermöglichen den Zugang von Reagenzien zu der in der Portionseinheit eingebetteten Zelle oder dem in der Portionseinheit eingebetteten Zellorganell. Dies ist für die weitere Verwendung der Portionseinheit von Nutzen.In a preferred embodiment, the carrier material comprises agarose. Agarose is a polysaccharide that is inexpensive and easy to use. Agarose is typically purchased as a powder. The powder is placed in a suitable aqueous buffer solution and boiled for about 1 to about 5 minutes to dissolve the agarose. The dissolved agarose is typically cooled to about 50 ° C to about 60 ° C or allowed to cool before further use. The setting temperature of agarose, at which the agarose solidifies to form a gel, is in the range of about 34 ° C to about 42 ° C for 1.5% agarose, depending on the source from which the agarose originates. In the solidified state, agarose is in the form of a gel that has pores. The pores allow reagents to access the cell embedded in the portion unit or the cell organelle embedded in the portion unit. This is useful for further use of the portion unit.

Agarose liegt bei einer Temperatur von etwa 50°C bis etwa 60°C als fließfähige, verfestigbare Masse vor. Daher umfasst die erste Reaktionsbedingung bei der Verwendung von Agarose als Trägermaterial vorzugsweise eine Temperatur von etwa 50°C bis etwa 60°C, vorzugsweise von etwa 52°C.At a temperature of about 50 ° C. to about 60 ° C., agarose is present as a flowable, solidifiable mass. Therefore, when using agarose as carrier material, the first reaction condition preferably comprises a temperature of about 50 ° C to about 60 ° C, preferably about 52 ° C.

Bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 30°C liegt Agarose in verfestigter Form vor. Daher umfasst die zweite Reaktionsbedingung bei der Verwendung von Agarose als Trägermaterial vorzugsweise eine Temperatur von etwa 0°C bis etwa 30°C, weiter bevorzugt von etwa 0°C bis etwa 10°C, am meisten bevorzugt von etwa 4°C. Eine Temperatur von etwa 0°C bis etwa 10°C ist bevorzugt, da das Verfestigen von Agarose bei einer Temperatur von etwa 20°C bis etwa 30°C im Vergleich zu niedrigeren Temperaturen länger dauert und unkontrollierter ist. Bei 4°C reichen bereits einige Sekunden für das Verfestigen von Agarose und damit des Gemischs in der Pipettenspitze.At a temperature of about 0 ° C to about 30 ° C, agarose is in solidified form. Therefore, when using agarose as the carrier material, the second reaction condition preferably comprises a temperature of from about 0 ° C to about 30 ° C, more preferably from about 0 ° C to about 10 ° C, most preferably from about 4 ° C. A temperature of about 0 ° C to about 10 ° C is preferred because agarose takes longer to solidify at a temperature of about 20 ° C to about 30 ° C compared to lower temperatures and is more uncontrolled. At 4 ° C, a few seconds are enough for the agarose and thus the mixture to solidify in the pipette tip.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Trägermaterial von etwa 0,5% bis etwa 10% Agarose. Die Konzentrationsangaben für Agarose sind als Gewicht pro Volumen (w/v) angegeben. Beispielsweise werden für 1% Agarose 1,0 g Agarosepulver in 100 ml Pufferlösung gelöst. Je höher die Agarose konzentriert ist, desto kleiner sind die Poren, die die verfestigte Agarose in der Portionseinheit aufweist und desto fester ist die Portionseinheit. Die Konzentration der Agarose wird daher in Abhängigkeit der beabsichtigten weiteren Verwendung der Portionseinheit gewählt. Wird 0,5% Agarose als Trägermaterial eingesetzt, ist die Portionseinheit sehr weich. Bei höheren Agarosekonzentrationen wie beispielsweise von 0,75% bis 1% ist die Portionseinheit bereits fester und somit mechanisch stabiler, wodurch die Handhabung der Portionseinheit erleichtert wird.In a preferred embodiment, the carrier material comprises from about 0.5% to about 10% agarose. The concentration data for agarose are given as weight per volume (w / v). For example, for 1% agarose, 1.0 g of agarose powder is dissolved in 100 ml of buffer solution. The more concentrated the agarose, the smaller the pores that the solidified agarose has in the portion unit and the stronger the portion unit. The concentration of the agarose is therefore selected depending on the intended further use of the portion unit. If 0.5% agarose is used as the carrier material, the portion unit is very soft. At higher agarose concentrations, such as from 0.75% to 1%, the portion unit is already stronger and therefore more mechanically stable, which makes handling of the portion unit easier.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst das Trägermaterial 1,5% Agarose. Bei 1,5% Agarose ist die Portionseinheit mechanisch ausreichend stabil, so dass die Portionseinheit einfach handzuhaben ist, während die Porengröße der Agarose eine Vielzahl von weiteren Verwendungsmöglichkeiten der Portionseinheit erlaubt.In a particularly preferred embodiment, the carrier material comprises 1.5% agarose. In the case of 1.5% agarose, the portion unit is mechanically sufficiently stable so that the portion unit is easy to handle, while the pore size of the agarose allows a large number of other possible uses of the portion unit.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Agarose eine niedrigschmelzende Agarose. Niedrigschmelzende Agarose hat im Vergleich zu Standard-Agarose eine niedrigere Schmelztemperatur und auch eine niedrigere Geliertemperatur. Die Geliertemperatur von niedrigschmelzender Agarose liegt im Bereich von etwa 24°C bis etwa 30°C bei 1,5% Agarose. Somit liegt niedrigschmelzende Agarose auch noch bei einer Temperatur von etwa 40°C bis etwa 50°C als fließfähige, verfestigbare Masse vor. Daher umfasst die erste Reaktionsbedingung bei der Verwendung von niedrigschmelzender Agarose als Trägermaterial vorzugsweise eine Temperatur von etwa 40°C bis etwa 50°C, vorzugsweise von etwa 45°C. Dies ist vorteilhaft, da Temperaturen über 45°C zu einer Beschädigung der Zelle oder des Zellorganells in dem Gemisch oder zu einer Beschädigung der Pipettenspitze führen können.In a preferred embodiment, the agarose is a low-melting agarose. Low-melting agarose has a lower melting temperature and also a lower setting temperature compared to standard agarose. The gelling temperature of low melting point agarose is in the range of about 24 ° C to about 30 ° C for 1.5% agarose. Thus, low-melting agarose is still present as a flowable, solidifiable mass at a temperature of about 40 ° C to about 50 ° C. Therefore, when using low-melting agarose as the carrier material, the first reaction condition preferably comprises a temperature of about 40 ° C to about 50 ° C, preferably about 45 ° C. This is advantageous since temperatures above 45 ° C. can damage the cell or the cell organelle in the mixture or damage the pipette tip.

Ein weiterer Vorteil liegt darin, dass niedrigschmelzende Agarose auch bei Temperaturen, die bis zu 15°C unterhalb von 45°C liegen, noch flüssig bleibt. Dies ist für die Prozesssicherheit von Bedeutung, da es ein vorzeitiges Verfestigen des Gemischs, beispielsweise durch den Kontakt mit der Pipettenspitze, verhindert. Die Pipettenspitze wird vorzugsweise nicht auf die Temperatur des Gemischs vorgewärmt oder vorgekühlt, sondern ohne Vorwärmen bzw. Vorkühlen verwendet, so dass die Pipettenspitze in der Regel Raumtemperatur aufweist.Another advantage is that low-melting agarose remains liquid even at temperatures up to 15 ° C below 45 ° C. This is important for process reliability, as it prevents the mixture from solidifying prematurely, for example through contact with the pipette tip. The pipette tip is preferably not preheated or pre-cooled to the temperature of the mixture, but used without preheating or pre-cooling, so that the pipette tip is generally room temperature.

Bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 20°C liegt niedrigschmelzende Agarose in verfestigter Form vor. Daher umfasst die zweite Reaktionsbedingung bei der Verwendung von niedrigschmelzender Agarose als Trägermaterial vorzugsweise eine Temperatur von etwa 0°C bis etwa 20°C, weiter bevorzugt von etwa 0°C bis etwa 10°C, am meisten bevorzugt von etwa 4°C. Bei 4°C reichen bereits einige Sekunden für das Verfestigen von niedrigschmelzender Agarose und damit des Gemischs in der Pipettenspitze.At a temperature of about 0 ° C to about 20 ° C, low-melting agarose is in solidified form. Therefore, when using low-melting agarose as carrier material, the second reaction condition preferably comprises a temperature of about 0 ° C to about 20 ° C, more preferably about 0 ° C to about 10 ° C, most preferably about 4 ° C. At 4 ° C, a few seconds are enough for the low-melting agarose and thus the mixture to solidify in the pipette tip.

Im Unterschied zu Agarose, die bei höheren Temperaturen als fließfähige Masse und bei niedrigeren Temperaturen in verfestigtem Zustand vorliegt, gibt es auch Trägermaterialien, die bei niedrigeren Temperaturen als fließfähige Masse vorliegen und bei höheren Temperaturen ein Gel bilden. Ein Beispiel für ein solches Trägermaterial ist Gelatine. Gelatine liegt beispielsweise bei 4°C als fließfähige Masse vor. Die Geliertemperatur von Gelatine liegt im Bereich von etwa 35°C bis etwa 40°C, wobei verfestigte Gelatine durch weiteres Erwärmen, beispielsweise auf etwa 50°C, wieder flüssig wird.In contrast to agarose, which is present as a flowable mass at higher temperatures and in a solidified state at lower temperatures, there are also carrier materials which are present as a flowable mass at lower temperatures and form a gel at higher temperatures. Gelatin is an example of such a carrier material. Gelatin is, for example, a flowable mass at 4 ° C. The gelling temperature of gelatin is in the range from about 35 ° C. to about 40 ° C., solidified gelatin becoming liquid again by further heating, for example to about 50 ° C.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die mindestens eine Zelle eine tierische Zelle, vorzugsweise eine Säugerzelle, weiter bevorzugt eine humane Zelle.In a preferred embodiment, the at least one cell is an animal cell, preferably a mammalian cell, more preferably a human cell.

Die Zelle stammt vorzugsweise von einem Krebspatienten. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Portionseinheit eignet sich insbesondere zur Isolierung von hochmolekularer DNA aus der Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist. Die hochmolekulare DNA wird für die Identifizierung von DNA-Rearrangements zur Diagnose von Krebs benötigt. Darüber hinaus dient die Identifizierung der spezifischen DNA-Rearrangements, die in einem Krebspatienten vorliegen, als wesentliche Voraussetzung für eine personalisierte Krebstherapie.The cell is preferably from a cancer patient. The portion unit produced by the method according to the invention is particularly suitable for isolating high molecular weight DNA from the cell which is embedded in the carrier material. The high molecular weight DNA is required for the identification of DNA rearrangements for the diagnosis of cancer. In addition, the identification of the specific DNA rearrangements that exist in a cancer patient serves as an essential prerequisite for personalized cancer therapy.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Verfahren unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Dies kann beispielsweise von Vorteil sein, wenn die mindestens eine Zelle nach der Herstellung der Portionseinheit in derselben kultiviert werden soll.In a preferred embodiment, the method is carried out under sterile conditions. This can be advantageous, for example, if the at least one cell is to be cultivated in the same after the production of the portion unit.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt eine Konzentration der mindestens einen Zelle in dem Gemisch etwa 50.000 Zellen/ml bis etwa 5.000.000 Zellen/ml, vorzugsweise etwa 1.000.000 Zellen/ml. Die Konzentration der mindestens einen Zelle in dem Gemisch wird in Abhängigkeit der beabsichtigten weiteren Verwendung der Portionseinheit gewählt. Das gleiche gilt für das mindestens eine Zellorganell in dem Gemisch, dessen Konzentration in dem Gemisch vorzugsweise etwa 50.000 Zellorganellen/ml bis etwa 5.000.000 Zellorganellen/ml, vorzugsweise etwa 1.000.000 Zellorganellen/ml beträgt.In a preferred embodiment, a concentration of the at least one cell in the mixture is about 50,000 cells / ml to about 5,000,000 cells / ml, preferably about 1,000,000 cells / ml. The concentration of the at least one cell in the mixture is selected depending on the intended further use of the portion unit. The same applies to the at least one cell organelle in the mixture, the concentration of which in the mixture is preferably about 50,000 cell organelles / ml to about 5,000,000 cell organelles / ml, preferably about 1,000,000 cell organelles / ml.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Zellorganell ein Zellkern, ein Mitochondrium, ein Vesikel, ein endoplasmatisches Retikulum, ein Golgi-Apparat, ein Lysosom, ein Peroxisom, ein Chloroplast, ein Chromoplast, ein Leukoplast, eine Zellsaftvakuole, ein Melanosom oder ein Phagosom.In a preferred embodiment, the at least one cell organelle is a cell nucleus, a mitochondrion, a vesicle, an endoplasmic reticulum, a Golgi apparatus, a lysosome, a peroxisome, a chloroplast, a chromoplast, a leukoplast, a cell sap vacuole, a melanosome or a phagosome .

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das mindestens eine Zellorganell ein Zellkern oder ein Mitochondrium, vorzugsweise ein Zellkern. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Portionseinheit eignet sich insbesondere zur Isolierung von hochmolekularer DNA. DNA ist in Zellkernen und in Mitochondrien, bei Pflanzen zudem in Chloroplasten zu finden. Für die meisten Anwendungen ist die in den Zellkernen vorliegende chromosomale DNA von Interesse, beispielsweise für die Identifizierung von DNA-Rearrangements bei Krebspatienten.In a particularly preferred embodiment, the at least one cell organelle is a cell nucleus or a mitochondrion, preferably a cell nucleus. The portion unit produced by the method according to the invention is particularly suitable for isolating high molecular weight DNA. DNA can be found in cell nuclei and mitochondria, and in plants in chloroplasts. The chromosomal DNA present in the cell nuclei is of interest for most applications, for example for the identification of DNA rearrangements in cancer patients.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Gemisch weiter Magnetpartikel. Dadurch wird eine Portionseinheit hergestellt, in der Magnetpartikel vorliegen. Die Vorliegen von Magnetpartikeln ist bei der weiteren Verwendung der Portionseinheit von Vorteil. Durch die Magnetpartikel ist es möglich, die Portionseinheit durch ein Magnetfeld an einer bestimmten Position zu halten. Dazu kann beispielsweise ein Magnet seitlich oder unterhalb eines Reaktionsgefäßes angebracht werden. Die Portionseinheit bewegt sich dann an die dem Magneten zugewandte Seite des Reaktionsgefäßes. Dadurch, dass die Position, an der sich die Portionseinheit befindet, bekannt ist, wird ein Beschädigen oder Zerstören der Portionseinheit während des Bewegens von Flüssigkeiten, beispielsweise während eines Waschens der Portionseinheit, vermieden. Somit können insbesondere Flüssigkeiten aus dem Reaktionsgefäß sicher abgesaugt werden, ohne die Portionseinheit zu beschädigen.In a preferred embodiment, the mixture further comprises magnetic particles. This produces a portion unit in which magnetic particles are present. The presence of magnetic particles is advantageous when the portion unit is used further. The magnetic particles make it possible to hold the portion unit in a certain position using a magnetic field. For this purpose, for example, a magnet can be attached to the side or below a reaction vessel. The portioning unit then moves to the side of the reaction vessel facing the magnet. Because the position at which the portion unit is located is known, damage or destruction of the portion unit while liquids are being moved, for example while the portion unit is being washed, is avoided. In this way, liquids in particular can be safely sucked out of the reaction vessel without damaging the portion unit.

In einer bevorzugten Ausführungsform interagieren die Magnetpartikel nicht mit Nukleinsäuren. Eine Interaktion der Magnetpartikel mit Nukleinsäuren könnte die Isolierung von Nukleinsäuren wie beispielsweise DNA aus der Zelle oder dem Zellorganell in der Portionseinheit stören.In a preferred embodiment, the magnetic particles do not interact with nucleic acids. An interaction of the magnetic particles with nucleic acids could interfere with the isolation of nucleic acids such as DNA from the cell or the cell organelle in the portion unit.

In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt eine mittlere Partikelgröße der Magnetpartikel etwa 10 nm bis etwa 1000 nm, vorzugsweise etwa 50 nm bis etwa 500 nm.In a preferred embodiment, an average particle size of the magnetic particles is approximately 10 nm to approximately 1000 nm, preferably approximately 50 nm to approximately 500 nm.

In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Portionseinheit aus einem gelartigen Trägermaterial mit mindestens einer biologischen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, oder mindestens einem Zellorganell, das in das Trägermaterial eingebettet ist, erhältlich durch ein Verfahren gemäß der Erfindung.In a second aspect, the invention relates to a portion unit made of a gel-like carrier material with at least one biological cell embedded in the carrier material or at least one cell organelle embedded in the carrier material, obtainable by a method according to the invention.

In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Isolierung einer Nukleinsäure. Die Nukleinsäure wird durch das Trägermaterial vor Scherkräften geschützt, so dass intakte, lange Nukleinsäure-Fragmente aus der Zelle oder dem Zellorganell isoliert werden können. Die Nukleinsäure kann DNA oder RNA sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure DNA, weiter bevorzugt hochmolekulare DNA. Der Begriff „hochmolekulare DNA“ wie hier verwendet bezeichnet DNA-Fragmente mit einer Länge von mehr als 1000 Kilobasenpaaren. Die DNA ist während der Isolierung in der Portionseinheit immobilisiert und vor Scherkräften geschützt. Dadurch ist die Portionseinheit zur Isolierung von hochmolekularer DNA besonders vorteilhaft. Hochmolekulare DNA ist für verschiedene molekularbiologische Verfahren erforderlich, insbesondere für das sogenannte „molecular combing“, das zur Identifizierung von DNA-Rearrangements bei der Diagnose von Krebs eingesetzt wird.In a third aspect, the invention relates to the use of a portion unit according to the invention for isolating a nucleic acid. The nucleic acid is protected from shear forces by the carrier material, so that intact, long nucleic acid fragments can be isolated from the cell or the cell organelle. The nucleic acid can be DNA or RNA. In a preferred embodiment, the nucleic acid is DNA, more preferably high molecular weight DNA. The term “high molecular weight DNA” as used here refers to DNA fragments with a length of more than 1000 kilobase pairs. During the isolation, the DNA is immobilized in the portion unit and protected from shear forces. This makes the portion unit particularly advantageous for isolating high molecular weight DNA. High molecular DNA is required for various molecular biological processes, in particular for so-called “molecular combing”, which is used to identify DNA rearrangements in the diagnosis of cancer.

Zur Isolierung von hochmolekularer DNA aus der mindestens einen Zelle, die in das Trägermaterial eingebettet ist, kann die Portionseinheit beispielsweise in ein Zielgefäß ausgebracht werden. Das Zielgefäß enthält vorzugsweise eine Pufferlösung. In einem nächsten Schritt wird die Zelle verdaut bzw. lysiert. Die Lyse der Zelle findet innerhalb der Portionseinheit statt, so dass die DNA weiter durch das Trägermaterial geschützt wird. Die Lyse der Zelle ist häufig temperaturabhängig, so dass dieser Schritt vorzugsweise bei einer konstant gehaltenen, vorbestimmten Temperatur durchgeführt wird. Die Temperatur beträgt beispielsweise 37°C. Der Lyseschritt wird beispielsweise über Nacht, das heißt für etwa 16 Stunden, durchgeführt.To isolate high molecular weight DNA from the at least one cell that is embedded in the carrier material, the portion unit can be dispensed into a target vessel, for example. The target vessel preferably contains a buffer solution. In a next step, the cell is digested or lysed. The cell is lysed within the portion unit so that the DNA is further protected by the carrier material. The lysis of the cell is often temperature-dependent, so that this step is preferably carried out at a predetermined temperature that is kept constant. The temperature is 37 ° C, for example. The lysis step is carried out, for example, overnight, that is to say for about 16 hours.

Es folgt ein Waschen der Portionseinheit, um das lysierte Zellmaterial, Zelltrümmer, Enzyme und sonstige Kontaminanten, die die weitere Verwendung der DNA stören könnten, aus der Portionseinheit zu entfernen. Beim Waschen der Portionseinheit muss die Portionseinheit vorsichtig mit der Waschlösung gemischt und in dieser bewegt werden, um ein effizientes Waschen der Portionseinheit zu gewährleisten, ohne dass die Portionseinheit dabei beschädigt oder zerstört wird. Würde die Portionseinheit beim Waschen beschädigt oder zerstört, wäre die DNA Scherkräften ausgesetzt, die die hochmolekulare DNA in kleine Fragmente brechen könnten. Um die Portionseinheit in der Waschlösung zu bewegen, kann das Zielgefäß zum Beispiel einmal oder mehrmals vorsichtig über Kopf und wieder nach oben zurück gedreht werden. Anschließend wird die Waschlösung entfernt. Das Waschen der Portionseinheit kann mehrmals wiederholt, beispielsweise 5 bis 50 Mal wiederholt werden. Vorzugsweise wird das Waschen der Portionseinheit 20 bis 50 Mal, weiter bevorzugt 50 Mal wiederholt.The portion unit is then washed in order to remove the lysed cell material, cell debris, enzymes and other contaminants which could interfere with the further use of the DNA from the portion unit. When washing the portion unit, the portion unit must be carefully mixed with the washing solution and moved in this in order to ensure efficient washing of the portion unit without the portion unit being damaged or destroyed in the process. If the portion unit were damaged or destroyed during washing, the DNA would be exposed to shear forces that could break the high molecular weight DNA into small fragments. To move the portion unit in the washing solution, the target vessel can be carefully turned upside down and back up again, for example, once or several times. The washing solution is then removed. The washing of the portion unit can be repeated several times, for example 5 to 50 times. The washing of the portion unit is preferably repeated 20 to 50 times, more preferably 50 times.

Nach dem Waschen wird das Trägermaterial der Portionseinheit entfernt. Dazu kann das Trägermaterial beispielsweise wieder in einen fließfähigen Zustand gebracht und/oder abgebaut werden. Dieser Schritt ist häufig temperaturabhängig und wird daher vorzugsweise bei einer konstant gehaltenen, vorbestimmten Temperatur durchgeführt. Der Abbau wird vorzugsweise durch einen enzymatischen Verdau des Trägermaterials erreicht. Agarose kann beispielsweise durch Inkubieren mit dem Enzym Beta-Agarase, vorzugsweise bei 42°C, abgebaut werden. Die isolierte hochmolekulare DNA steht nun zur weiteren Verwendung zur Verfügung. After washing, the carrier material of the portion unit is removed. For this purpose, the carrier material can, for example, be brought back into a flowable state and / or broken down. This step is often temperature-dependent and is therefore preferably carried out at a predetermined temperature that is kept constant. The degradation is preferably achieved by enzymatic digestion of the carrier material. Agarose can be broken down, for example, by incubating with the enzyme beta-agarase, preferably at 42 ° C. The isolated high molecular weight DNA is now available for further use.

Alle Schritte der DNA-Isolierung werden vorzugsweise mittels eines Pipettierroboters durchgeführt, um einen kontrollierten, präzisen und reproduzierbaren Verfahrensablauf zu gewährleisten.All steps of DNA isolation are preferably carried out by means of a pipetting robot in order to ensure a controlled, precise and reproducible process sequence.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Isolierung eines Proteins, vorzugsweise eines Proteins mit mindestens zwei Untereinheiten. Untereinheiten von Proteinen werden durch Wasserstoffbrücken, Van-der-Waals-Kräfte und Coulombsche Kräfte zusammengehalten. Das Trägermaterial der Portionseinheit bietet nicht nur Nukleinsäuren, sondern auch Proteinen Schutz vor Scherkräften. Dadurch ist die Portionseinheit auch zur Isolierung von Proteinen und Proteinkomplexen geeignet.In a further aspect, the invention relates to the use of a portion unit according to the invention for isolating a protein, preferably a protein with at least two subunits. Subunits of proteins are held together by hydrogen bonds, van der Waals forces and Coulomb forces. The carrier material of the portion unit offers protection against shear forces not only for nucleic acids but also for proteins. This means that the portion unit is also suitable for isolating proteins and protein complexes.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Kultivierung oder Kokultivierung von Zellen. Bei der Kokultivierung von Zellen werden mindestens zwei unterschiedliche Arten von Zellen, beispielsweise Krebszellen und Fibroblasten, gemeinsam kultiviert.In a further aspect, the invention relates to the use of a portion unit according to the invention for the cultivation or cocultivation of cells. When cells are co-cultivated, at least two different types of cells, for example cancer cells and fibroblasts, are cultivated together.

Durch die dreidimensionale Umgebung der Zellen in der Portionseinheit eignet sich die Portionseinheit insbesondere zur dreidimensionalen Kultivierung oder Kokultivierung von Zellen. Für diese Verwendung wird das Trägermaterial so gewählt, dass es bei der Reaktionsbedingung, bei der die Zellen kultiviert oder kokultiviert werden sollen, in einem verfestigten Zustand vorliegt. Menschliche Zellen und andere Säugerzellen werden typischerweise bei 37°C (Körpertemperatur) kultiviert, so dass das Trägermaterial vorzugsweise bei 37°C in einem verfestigten Zustand vorliegt. Das Trägermaterial liegt vorzugsweise bei niedrigeren Temperaturen, beispielsweise bei etwa 4°C, als fließfähige Masse vor. Geeignete Trägermaterialien zur dreidimensionalen Kultivierung oder Kokultivierung von Zellen sind bekannt. Beispielsweise können Hydrogele aus Strukturproteinen wie Kollagen oder Gelatine-Methacrylat als Trägermaterial eingesetzt werden. Das Trägermaterial wird in diesem Zusammenhang auch als Matrix bezeichnet und ähnelt in seiner Zusammensetzung vorzugsweise der natürlich vorkommenden, komplexen extrazellulären Umgebung von Zellen in Geweben.Due to the three-dimensional environment of the cells in the portion unit, the portion unit is particularly suitable for three-dimensional cultivation or co-cultivation of cells. For this use, the carrier material is selected such that it is in a solidified state under the reaction condition in which the cells are to be cultivated or co-cultivated. Human cells and other mammalian cells are typically cultured at 37 ° C (body temperature), so that the carrier material is preferably in a solidified state at 37 ° C. The carrier material is preferably present as a flowable mass at lower temperatures, for example at about 4 ° C. Suitable carrier materials for three-dimensional cultivation or cocultivation of cells are known. For example, hydrogels made from structural proteins such as collagen or gelatin methacrylate can be used as carrier material. In this context, the carrier material is also referred to as a matrix and its composition is preferably similar to the naturally occurring, complex extracellular environment of cells in tissues.

In einer bevorzugten Ausführungsform setzen die in der Portionseinheit kultivierten oder kokultivierten Zellen eine Verbindung frei, die durch das Trägermaterial diffundieren und so aus der Portionseinheit austreten kann. Die Zellen können beispielsweise Proteine sezernieren, die das Wachstum und/oder die Proliferation von Krebszellen hemmen. In diesem Fall kann die Portionseinheit zur Behandlung von Krebs eingesetzt werden.In a preferred embodiment, the cells cultivated or co-cultivated in the portion unit release a compound which can diffuse through the carrier material and thus emerge from the portion unit. For example, the cells can secrete proteins that inhibit the growth and / or proliferation of cancer cells. In this case, the serving unit can be used to treat cancer.

In einem weiteren Aspekt ist die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Freisetzung einer Verbindung in die Umgebung der Portionseinheit offenbart. Die Portionseinheit ist vorzugsweise von einem Fluid, beispielsweise von einem Medium, umgeben, in das die Verbindung aus der Portionseinheit freigesetzt wird. Wie oben beschrieben wird die Verbindung beispielsweise von der Zelle, die in dem Trägermaterial eingebettet ist, freigesetzt und diffundiert durch das Trägermaterial nach außen. In einer anderen Ausführungsform wird eine Lyse der Zelle, die in dem Trägermaterial eingebettet ist, oder des Zellorganells, das in dem Trägermaterial eingebettet ist, durchgeführt. Während der Lyse wird die Membran, die die Zelle oder das Zellorganell umgibt, aufgelöst, so dass der Inhalt der Zelle oder des Zellorganells in dem Trägermaterial freigesetzt wird und durch das Trägermaterial in die Umgebung der Portionseinheit diffundiert. Durch Steuern der Geschwindigkeit, mit der die Zelle oder das Zellorganell lysiert wird, kann die Geschwindigkeit, mit der die Verbindung in die Umgebung der Portionseinheit freigesetzt wird, gesteuert werden. Dies ermöglicht eine kontrollierte Freisetzung der Verbindung in die Umgebung der Portionseinheit, beispielsweise eine besonders langsame Freisetzung.In a further aspect, the use of a serving unit according to the invention for releasing a compound into the surroundings of the serving unit is disclosed. The portion unit is preferably surrounded by a fluid, for example by a medium, into which the compound is released from the portion unit. As described above, the compound is released, for example, from the cell, which is embedded in the carrier material, and diffuses to the outside through the carrier material. In another embodiment, a lysis of the cell that is embedded in the carrier material or of the cell organelle that is embedded in the carrier material is carried out. During the lysis, the membrane that surrounds the cell or the cell organelle is dissolved, so that the content of the cell or the cell organelle in the carrier material is released and diffuses through the carrier material into the vicinity of the portion unit. By controlling the rate at which the cell or cell organelle is lysed, the rate at which the connection is released into the vicinity of the portion unit, can be controlled. This enables a controlled release of the compound into the surroundings of the portion unit, for example a particularly slow release.

Für eine schnelle Freisetzung des Inhalts der Zelle oder des Zellorganells in die Umgebung der Portionseinheit kann das Trägermaterial der Portionseinheit während oder nach der Lyse der Zelle oder des Zellorganells abgebaut und/oder in einen fließfähigen Zustand gebracht werden, beispielsweise indem die Portionseinheit der ersten Reaktionsbedingung ausgesetzt wird.For a quick release of the contents of the cell or the cell organelle into the surroundings of the portion unit, the carrier material of the portion unit can be broken down and / or brought into a flowable state during or after the lysis of the cell or the cell organelle, for example by exposing the portion unit to the first reaction condition will.

In einem weiteren Aspekt ist die Verwendung einer Portionseinheit gemäß der Erfindung zur Freisetzung der Zelle oder des Zellorganells in die Umgebung der Portionseinheit offenbart. Dazu wird das Trägermaterial der Portionseinheit abgebaut und/oder in einen fließfähigen Zustand gebracht, beispielsweise indem die Portionseinheit der ersten Reaktionsbedingung ausgesetzt wird.In a further aspect, the use of a portion unit according to the invention for releasing the cell or the cell organelle into the surroundings of the portion unit is disclosed. For this purpose, the carrier material of the portion unit is degraded and / or brought into a flowable state, for example by exposing the portion unit to the first reaction condition.

In einem weiteren Aspekt ist eine Pipettenspitze mit einem zylindrischen Längsende zum Einbringen von Fluid offenbart, wobei das zylindrische Längsende so hoch ist, dass eine vorbestimmte Menge von Fluid in das zylindrische Längsende einbringbar ist. Somit hängt die minimale vorbestimmte Höhe des zylindrische Längsendes von der vorbestimmten Menge des Fluids, das in die Pipettenspitze eingebracht wird, und vom dem Durchmesser des zylindrischen Längsendes ab.In a further aspect, a pipette tip with a cylindrical longitudinal end for introducing fluid is disclosed, the cylindrical longitudinal end being so high that a predetermined amount of fluid can be introduced into the cylindrical longitudinal end. Thus, the minimum predetermined height of the cylindrical longitudinal end depends on the predetermined amount of fluid that is introduced into the pipette tip and on the diameter of the cylindrical longitudinal end.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die gesamte Pipettenspitze zylindrisch.In a preferred embodiment, the entire pipette tip is cylindrical.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Pipettenspitze eine Einweg-Pipettenspitze.In a preferred embodiment, the pipette tip is a disposable pipette tip.

BeispieleExamples

Beispiel 1example 1

Es wird eine Portionseinheit aus niedrigschmelzender Agarose mit Krebszellen, die in der niedrigschmelzenden Agarose eingebettet sind, hergestellt. Dazu werden Krebszellen, die aus einem Lungentumor eines Krebspatienten stammen, als Suspension mit einer Konzentration von 2.000.000 Zellen/ml in einer wässrigen Pufferlösung, die 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCI und 50 mM EDTA enthält, bereitgestellt. Die Zellsuspension wird für 5 Minuten auf 45°C vorgewärmt. Des Weiteren werden 1,5 g niedrigschmelzende Agarose in Pulverform in 100 ml einer wässrigen Pufferlösung, die ebenfalls 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCI und 50 mM EDTA enthält, gegeben und für etwa 3 Minuten aufgekocht, um die niedrigschmelzende Agarose zu lösen. Die Lösung wird dann auf 45°C abgekühlt. 100 µl der vorgewärmten Zellsuspension werden mit 100 µl der 1,5% Agarose bei 45°C gemischt. Das fließfähige Gemisch wird bei einer Temperatur von 45°C gehalten. 100 µl des Gemischs werden von einem Pipettierroboter mit einer Flussrate von 50 µl/s in eine Pipettenspitze mit einem zylindrischen Längsende zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingesaugt. Das zylindrische Längsende der Pipettenspitze ist so hoch, dass die dem Inneren der Pipettenspitze zugewandte freie Oberfläche der 100 µl des Gemischs nicht über das zylindrische Längsende der Pipettenspitze hinaus ragen. Das zylindrische Längsende der Pipettenspitze wird von dem Pipettierroboter für 20 Sekunden in eine vorgekühlte Pufferlösung, die eine Temperatur von 4°C hat, eingetaucht. Dadurch wird das Gemisch verfestigt, so dass sich die Portionseinheit bildet. Die Portionseinheit wird von dem Pipettierroboter aus der Pipettenspitze in ein Mikroreaktionsgefäß, das 500 µl Lysepuffer zum Lysieren der Zellen enthält, ausgeblasen. Anschließend wird die Portionseinheit zur Isolierung von hochmolekularer DNA aus den Krebszellen, die in der niedrigschmelzenden Agarose eingebettet sind, verwendet.A portion unit is made from low-melting agarose with cancer cells embedded in the low-melting agarose. For this purpose, cancer cells originating from a lung tumor of a cancer patient are provided as a suspension with a concentration of 2,000,000 cells / ml in an aqueous buffer solution containing 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl and 50 mM EDTA. The cell suspension is preheated to 45 ° C. for 5 minutes. Furthermore, 1.5 g of low-melting agarose in powder form are added to 100 ml of an aqueous buffer solution, which also contains 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl and 50 mM EDTA, and boiled for about 3 minutes in order to dissolve the low-melting agarose . The solution is then cooled to 45 ° C. 100 µl of the preheated cell suspension are mixed with 100 µl of the 1.5% agarose at 45 ° C. The flowable mixture is kept at a temperature of 45 ° C. 100 μl of the mixture are sucked in by a pipetting robot at a flow rate of 50 μl / s into a pipette tip with a cylindrical longitudinal end for introducing and discharging fluid. The cylindrical longitudinal end of the pipette tip is so high that the free surface of the 100 μl of the mixture facing the interior of the pipette tip does not protrude beyond the cylindrical longitudinal end of the pipette tip. The cylindrical longitudinal end of the pipette tip is immersed by the pipetting robot for 20 seconds in a pre-cooled buffer solution at a temperature of 4 ° C. This solidifies the mixture so that the portion unit is formed. The portion unit is blown out of the pipette tip by the pipetting robot into a microreaction vessel which contains 500 μl of lysis buffer for lysing the cells. The portion unit is then used to isolate high molecular weight DNA from the cancer cells that are embedded in the low-melting agarose.

Beispiel 2Example 2

Es wird eine Portionseinheit aus niedrigschmelzender Agarose mit Zellkernen, die in der niedrigschmelzenden Agarose eingebettet sind, hergestellt. Dazu werden Zellkerne, die aus Leukämie-Zellen eines Leukämiepatienten stammen, als Suspension mit einer Konzentration von 4.000.000 Zellkernen/ml in einer wässrigen Pufferlösung, die 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCI und 50 mM EDTA enthält, bereitgestellt. Die Zellkernsuspension wird für 5 Minuten auf 45°C vorgewärmt. Des Weiteren werden 1,5 g niedrigschmelzende Agarose in Pulverform in 100 ml einer wässrigen Pufferlösung, die ebenfalls 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCI und 50 mM EDTA enthält, gegeben und für etwa 3 Minuten aufgekocht, um die niedrigschmelzende Agarose zu lösen. Die Lösung wird dann auf 45°C abgekühlt. 100 µl der vorgewärmten Zellkernsuspension werden mit 100 µl der 1,5% Agarose bei 45°C gemischt. Das fließfähige Gemisch wird bei einer Temperatur von 45°C gehalten. 75 µl des Gemischs werden von einem Pipettierroboter mit einer Flussrate von 50 µl/s in eine Pipettenspitze mit einem Längsende mit einer Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingesaugt. Das Längsende der Pipettenspitze hat die Form eines Kegelstumpfs und die Öffnung hat einen Innendurchmesser von 2 mm. Das Längsende der Pipettenspitze wird von dem Pipettierroboter für 10 Sekunden in eine vorgekühlte Pufferlösung, die eine Temperatur von 4°C hat, eingetaucht. Dadurch wird das Gemisch verfestigt, so dass sich die Portionseinheit bildet. Die Portionseinheit ist elastisch und wird von dem Pipettierroboter aus der Pipettenspitze in ein Mikroreaktionsgefäß, das 500 µl Lysepuffer zum Lysieren der Zellkerne enthält, ausgeblasen. Während des Ausblasens der Portionseinheit aus der Pipettenspitze verformt sich die Portionseinheit, um die Öffnung der Pipettenspitze zu passieren. Nach dem Ausblasen nimmt die Portionseinheit wieder ihre ursprüngliche Form an und wird zur Isolierung von hochmolekularer DNA aus den Zellkernen, die in der niedrigschmelzenden Agarose eingebettet sind, verwendet.A portion unit is made from low-melting agarose with cell nuclei that are embedded in the low-melting agarose. For this purpose, cell nuclei originating from leukemia cells of a leukemia patient are provided as a suspension with a concentration of 4,000,000 cell nuclei / ml in an aqueous buffer solution containing 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl and 50 mM EDTA. The cell nucleus suspension is preheated to 45 ° C. for 5 minutes. Furthermore, 1.5 g of low-melting agarose in powder form are added to 100 ml of an aqueous buffer solution, which also contains 10 mM Tris, pH 7.2, 20 mM NaCl and 50 mM EDTA, and boiled for about 3 minutes in order to dissolve the low-melting agarose . The solution is then cooled to 45 ° C. 100 µl of the preheated cell nucleus suspension are mixed with 100 µl of the 1.5% agarose at 45 ° C. The flowable mixture is kept at a temperature of 45 ° C. 75 µl of the mixture are poured into a pipette tip by a pipetting robot with a flow rate of 50 µl / s sucked in a longitudinal end with an opening for introducing and discharging fluid. The longitudinal end of the pipette tip is in the shape of a truncated cone and the opening has an inner diameter of 2 mm. The long end of the pipette tip is immersed by the pipetting robot for 10 seconds in a pre-cooled buffer solution at a temperature of 4 ° C. This solidifies the mixture so that the portion unit is formed. The portion unit is elastic and is blown out of the pipette tip by the pipetting robot into a microreaction vessel that contains 500 μl of lysis buffer for lysing the cell nuclei. While the portion unit is being blown out of the pipette tip, the portion unit deforms in order to pass the opening of the pipette tip. After blowing out, the portion unit returns to its original shape and is used to isolate high molecular weight DNA from the cell nuclei that are embedded in the low-melting agarose.

Beispiel 3Example 3

Es wird eine Portionseinheit aus Gelatine-Methacrylat mit Krebszellen, die in dem Gelatine-Methacrylat eingebettet sind, hergestellt. Dazu werden Krebszellen, die aus einem Brusttumor einer transgenen Maus stammen, als Suspension mit einer Konzentration von 2.000.000 Zellen/ml bereitgestellt. Die Zellsuspension wird für 5 Minuten auf 4°C vorgekühlt. 100 µl der vorgekühlten Zellsuspension werden mit 100 µl einer 4°C kalten Lösung von 5% (w/v) Gelatine-Methacrylat in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei 4°C gemischt. Das fließfähige Gemisch wird bei einer Temperatur von 4°C gehalten. 150 µl des Gemischs werden in eine Pipettenspitze mit einem zylindrischen Längsende zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingesaugt. Das zylindrische Längsende der Pipettenspitze ist so hoch, dass die dem Inneren der Pipettenspitze zugewandte freie Oberfläche der 150 µl des Gemischs nicht über das zylindrische Längsende der Pipettenspitze hinaus ragen. Das zylindrische Längsende der Pipettenspitze wird für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Dadurch wird das Gemisch verfestigt, so dass sich die Portionseinheit bildet. Die Portionseinheit wird in eine Zellkulturschale, die 5 ml Zellkulturmedium zur Kultivierung der Zellen enthält, ausgeblasen. Anschließend wird die Portionseinheit zur Kultivierung der Krebszellen, die in dem Gelatine-Methacrylat eingebettet sind, verwendet.A portion unit is made from gelatine methacrylate with cancer cells embedded in the gelatine methacrylate. For this purpose, cancer cells from a breast tumor of a transgenic mouse are provided as a suspension with a concentration of 2,000,000 cells / ml. The cell suspension is precooled to 4 ° C. for 5 minutes. 100 μl of the pre-cooled cell suspension are mixed with 100 μl of a 4 ° C. solution of 5% (w / v) gelatin methacrylate in phosphate-buffered saline (PBS) at 4 ° C. The flowable mixture is kept at a temperature of 4 ° C. 150 μl of the mixture are sucked into a pipette tip with a cylindrical longitudinal end for introducing and discharging fluid. The cylindrical longitudinal end of the pipette tip is so high that the free surface of the 150 μl of the mixture facing the inside of the pipette tip does not protrude beyond the cylindrical longitudinal end of the pipette tip. The cylindrical longitudinal end of the pipette tip is incubated for 5 minutes at 37 ° C. This solidifies the mixture so that the portion unit is formed. The portion unit is blown out into a cell culture dish which contains 5 ml of cell culture medium for culturing the cells. The portion unit is then used to cultivate the cancer cells that are embedded in the gelatin methacrylate.

Beispiel 4Example 4

Es werden Portionseinheiten mit Agarose oder niedrigschmelzender Agarose als Trägermaterial hergestellt. Die vorbestimmte Menge des Gemischs, die in eine Pipettenspitze mit einem Längsende mit einer Öffnung zum Einbringen und Ausbringen von Fluid eingebracht wird, beträgt jeweils 100 µl. Tabelle 1 gibt die Mindestgröße des Innendurchmessers der Öffnung der Pipettenspitze für unterschiedliche Konzentrationen von Agarose oder niedrigschmelzender Agarose in dem Gemisch an. Die Konzentration ist als Gewicht pro Volumen (w/v) angegeben. Tabelle 1: Konzentration von Agarose oder niedrigschmelzender Agarose in dem Gemisch (w/v) Mindestgröße des Innendurchmessers der Öffnung der Pipettenspitze zum Einbringen und Ausbringen von Fluid (mm) 0,25 1,8 0,5 2,0 0,75 2,2 1,0 2,5 1,5 3,0 2,0 3,5 2,5 4,0 3,0 4,5 3,5 5,0 4,0 6,0 Portion units are produced with agarose or low-melting agarose as the carrier material. The predetermined amount of the mixture that is introduced into a pipette tip with a longitudinal end with an opening for introducing and discharging fluid is in each case 100 μl. Table 1 gives the minimum size of the inner diameter of the opening of the pipette tip for different concentrations of agarose or low-melting agarose in the mixture. The concentration is given as weight per volume (w / v). Table 1: Concentration of agarose or low melting point agarose in the mixture (w / v) Minimum size of the inner diameter of the opening of the pipette tip for introducing and discharging fluid (mm) 0.25 1.8 0.5 2.0 0.75 2.2 1.0 2.5 1.5 3.0 2.0 3.5 2.5 4.0 3.0 4.5 3.5 5.0 4.0 6.0

Claims

A method for producing a portion unit from a gel-like carrier material with at least one biological cell which is embedded in the carrier material or at least one cell organelle which is embedded in the carrier material, the method comprising the steps: a) providing a flowable, solidifiable mixture which comprises the carrier material and the at least one cell or the at least one cell organelle, under a first reaction condition, b) introducing a predetermined amount of the mixture into a pipette tip with a longitudinal end with an opening for introducing and discharging fluid, the opening being large enough to dispense the portion unit through the opening, c) solidifying the mixture in the pipette tip by incubating the longitudinal end of the pipette tip under a second reaction condition in which the mixture solidifies so that the portion unit is formed, and d) Removal of the portion unit from the pipette tip.

Procedure according to Claim 1 , wherein step b) is carried out by sucking the predetermined amount of the mixture into the pipette tip with negative pressure.

Procedure according to Claim 1 or 2 , wherein step b) takes place at a flow rate of 1 μl / s to 300 μl / s, preferably 1 μl / s to 100 μl / s.

Method according to one of the Claims 1 until 3 , wherein the predetermined amount of the mixture is about 5 µl to about 300 µl, preferably about 100 µl.

Method according to one of the Claims 1 until 4th , wherein step d) is carried out by blowing the portion unit out of the pipette tip.

Method according to one of the Claims 1 until 5 , wherein the carrier material comprises agarose, preferably low-melting agarose.

Method according to one of the Claims 1 until 6th , wherein the at least one cell is an animal cell, preferably a mammalian cell, more preferably a human cell.

Method according to one of the Claims 1 until 6th , wherein the at least one cell organelle is a cell nucleus or a mitochondrion, preferably a cell nucleus.

Method according to one of the Claims 1 until 8th , wherein the mixture further comprises magnetic particles, which preferably do not interact with nucleic acids.

Procedure according to Claim 9 , wherein an average particle size of the magnetic particles is about 10 nm to about 1000 nm, preferably about 50 nm to about 500 nm.

Portion unit made of a gel-like carrier material with at least one biological cell that is embedded in the carrier material, or at least one cell organelle that is embedded in the carrier material, obtainable by a method according to one of the Claims 1 until 10 .

Use of the portion unit according to Claim 11 for isolating a nucleic acid.

Use of the portion unit according to Claim 11 to isolate a protein.

Use of the portion unit according to Claim 11 for the cultivation or cocultivation of cells.