DE102015219313B3

DE102015219313B3 - Herzklappenmechanobioreaktor

Info

Publication number: DE102015219313B3
Application number: DE102015219313.6A
Authority: DE
Inventors: Jan Saam; Hendrik Erfurth
Original assignee: Ospin GmbH
Current assignee: Ospin GmbH
Priority date: 2015-10-06
Filing date: 2015-10-06
Publication date: 2016-09-29
Anticipated expiration: 2035-10-07
Also published as: EP3359638A1; WO2017060081A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein neuartiges tissue engineering-Bioreaktorsystem speziell geeignet für den Aufbau eines in vitro-Herzklappenkonstrukts zur Bereitstellung eines biogenen Herzklappenersatzes sowie Verfahren und Anwendungen dieses Bioreaktorsystems.The invention relates to a novel tissue engineering bioreactor system especially suitable for the construction of an in vitro heart valve construct for providing a biogenic heart valve replacement as well as methods and applications of this bioreactor system.

Description

Die Erfindung betrifft ein neuartiges tissue engineering-Bioreaktorsystem speziell geeignet für den Aufbau eines in vitro-Herzklappenkonstrukts zur Bereitstellung eines biogenen Herzklappenersatzes sowie Verfahren und Anwendungen dieses Bioreaktorsystems. The invention relates to a novel tissue engineering bioreactor system especially suitable for the construction of an in vitro heart valve construct for providing a biogenic heart valve replacement as well as methods and applications of this bioreactor system.

Die Herstellung eines biogenen Organersatzes im Rahmen des tissue engineering umfasst die Gewinnung und Isolierung geeigneter biologischer Zellen, idealerweise aus dem Gewebe des Organempfängers, die Bereitstellung eines mit diesen Zellen besiedelbaren biokompatiblen Gerüst und die Besiedlung des Gerüsts mit den Zellen sowie die Kultivierung der Zellen an dem Gerüst, sodass diese konditioniert werden und gegebenenfalls differenzieren, um ein organtypisches Gewebe auszubilden, das schließlich die Organfunktion des zu ersetzenden Organs übernehmen kann. Eine häufig getrennte Besiedelung mit verschiedenen Zelltypen erlaubt, dass mehrschichtige organtypische Gewebeverbände erzeugt werden können. In der nachfolgenden Konditionierungsphase müssen die Zellen an dem sich ausbildenden in vitro-Gewebekonstrukt in der Regel noch physikalischen und/oder chemischen Faktoren ausgesetzt werden, welche die Ausbildung organtypischer Funktionen und/oder Morphologien ermöglichen. Vor allem physikalisch-mechanische Faktoren wie Dehnungsbelastung, Scherstress und Druckbeanspruchung können in bestimmten Zellpopulationen zur Ausbildung der gewünschten Gewebe- oder Organfunktionen beitragen oder diese überhaupt erst ermöglichen. Da die Kultivierung der Zellen und der in vitro-Organe in Bioreaktoren in Kontakt mit Kulturmedien stattfindet, werden Maßnahmen und Mittel entwickelt, um die konditionierenden mechanischen Faktoren in den Bioreaktoren auf die darin kultivierten Zellen und Geweben einwirken zu lassen. The production of a biogenic organ replacement in the context of tissue engineering involves the recovery and isolation of suitable biological cells, ideally from the tissue of the organ recipient, providing a biocompatible scaffold that can be colonized with these cells and colonizing the scaffold with the cells and cultivating the cells on the cells Scaffold, so that they are conditioned and possibly differentiate to form an organotypic tissue, which can eventually take over the organ function of the organ to be replaced. Frequently separated colonization with different cell types allows multi-layered organtypic tissue associations to be generated. In the subsequent conditioning phase, the cells on the forming in vitro tissue construct usually still have to be exposed to physical and / or chemical factors which allow the formation of organtypischer functions and / or morphologies. Above all, physical-mechanical factors such as strain load, shear stress and compressive stress can contribute to the formation of the desired tissue or organ functions in certain cell populations or even make this possible in the first place. Since the cultivation of the cells and the in vitro organs in bioreactors is in contact with culture media, means and means are developed to allow the conditioning mechanical factors in the bioreactors to act on the cells and tissues cultured therein.

Zur Herstellung eines biogenen Herzklappenersatzes, beginnt man mit einer entsprechend vorgeformten porösen Gerüststruktur aus biokompatiblem Material, die der Herzklappe ihre Grundform und primäre mechanische Eigenschaften gibt. Meist ist dies eine mehr oder weniger lange Röhre, die als Ansatzstück fungiert, in deren Mitte die eigentlichen Klappentaschen-Strukturen bzw. Klappensegel-Strukturen ausgebildet sind. Dieses Gerüst wird nun unter Kulturbedingungen mit Endothelzellen, glatten Muskelzellen sowie Bindegewebszellen besiedelt, wobei die Zellen an der Oberfläche anhaften und/oder in die Matrix des Gerüsts einwandern sollen. Während der nachfolgenden Konditionierung wird das besiedelte, noch nicht vollständig ausgebildete in vitro-Klappenkonstrukt in einem Mechanobioreaktor mit Zellkulturmedium pulsatil perfundiert. Der Scherstress des vorbeifließenden Mediums dient den Endothelzellen dabei als Positionsinformation, dass sie sich an der Oberfläche des Konstrukts befinden, und ist ein wichtiger Einflussfaktor bei der Ausbildung eines geschlossenen Endothels. Die Dehnungsbelastung, die die Klappenelemente bei einer pulsatilen Durchströmung erfahren, dient den glatten Muskelzellen und den Fibroblasten dort vor allem als Signal für die räumliche Ausrichtung und die Bildung von zweckmäßigen Zugfasern. Typischerweise wird nach der Besiedelung mit der Perfusion behutsam begonnen und diese langsam gesteigert. Am Ende der Konditionierungsphase steht idealerweise ein Betrieb unter physiologischen Bedingungen. Darunter versteht man regelmäßig den Ruhepuls eines gesunden Erwachsenen (60 Schläge pro Minute, Diastole: 80 mmHg, Systole: 120 mmHg). Unter diesen Bedingungen wird dann meist noch für einige Tage oder Wochen kultiviert, um eine entsprechende Gewebereife zu erreichen (Reifungsphase). To produce a biogenic heart valve replacement, one begins with a correspondingly preformed porous framework structure of biocompatible material that gives the heart valve its basic shape and primary mechanical properties. Usually this is a more or less long tube, which acts as an extension, in the middle of which the actual flap pocket structures or flap sail structures are formed. This framework is now colonized under culture conditions with endothelial cells, smooth muscle cells and connective tissue cells, whereby the cells should adhere to the surface and / or migrate into the matrix of the framework. During the subsequent conditioning, the colonized, not yet fully formed in vitro valve construct is perfused in a pulsed manner in a mechanobioreactor with cell culture medium. The shear stress of the passing medium serves as an indication to the endothelial cells that they are located on the surface of the construct and is an important factor in the formation of a closed endothelium. The strain load experienced by the valve elements in a pulsatile flow is used by the smooth muscle cells and the fibroblasts primarily as a signal for the spatial orientation and the formation of appropriate tension fibers. Typically, perfusion is gently started after colonization and slowly increased. At the end of the conditioning phase ideally an operation is under physiological conditions. This is usually taken to mean the resting heart rate of a healthy adult (60 beats per minute, diastole: 80 mmHg, systole: 120 mmHg). Under these conditions, it is then usually cultivated for a few days or weeks in order to achieve appropriate tissue maturation (maturation phase).

Die Funktion einer Herzklappe eines menschlichen Herzens ist im Wesentlichen mechanischer Natur. Die Herzklappe stellt rein technisch ein Rückschlagventil dar, das den Rückfluss des Blutes verhindert – im Falle einer Aortenklappe aus der Aorta zurück in den Ventrikel, aus dem es gepumpt worden ist. Das Blutgefäßsystem des Organismus stellt sowohl ein Dämpfungsglied als auch einen Flusswiderstand dar. Die Dämpfung geschieht – im Falle einer Aortenklappe – vor allem durch die Elastizität der Aorta und anderer großer Arterien (Windkesseleffekt). Der Flusswiderstand im Blutkreislauf wird wesentlich durch den peripheren Gefäßwiderstand, hauptsächlich verantwortet durch Arteriolen und Kapillaren, bestimmt. Ein Bioreaktorsystem zur Herzklappenkonditionierung muss also sowohl den peripheren Gefäßwiderstand simulieren als auch ein entsprechendes Dämpfungsglied enthalten. Wichtig ist dabei der korrekte Druckverlauf auf beiden Seiten der Herzklappe. Die Herzklappe muss, während sie geschlossen ist, den Druckunterschied zwischen Aorta und Ventrikel aushalten. The function of a heart valve of a human heart is essentially mechanical in nature. The heart valve is technically a check valve that prevents the return of blood - in the case of an aortic aortic valve back into the ventricle from which it has been pumped. The blood vessel system of the organism represents both an attenuator and a flow resistance. The attenuation occurs - in the case of an aortic valve - mainly by the elasticity of the aorta and other large arteries (Windkesseleffekt). Flow resistance in the bloodstream is significantly determined by peripheral vascular resistance, mainly due to arterioles and capillaries. A bioreactor system for heart valve conditioning must therefore both simulate the peripheral vascular resistance and contain a corresponding attenuator. The important thing is the correct pressure curve on both sides of the heart valve. The heart valve must withstand the pressure difference between the aorta and the ventricle while it is closed.

Ein fortschrittlicheres Konditionierungsprogramm für ein verbessertes in vitro-Herzklappenkonstrukt soll außerdem sowohl Ruhe- als auch Aktivitätsphasen des Körpers enthalten. Auch soll die Druckbelastung im Herzen abhängig von der Körperhaltung (z.B. Stehen oder Liegen) nachgeahmt werden. Um diese Vielfalt physiologischer Situationen an einem in vitro-Herzklappenkonstrukt abbilden zu können, werden bekannte Bioreaktoren zur Kultivierung von in vitro-Herzklappenkonstrukten in umfangreiche Perfusionskreisläufe eingebaut, die verschiedene Funktionselemente des menschlichen oder tierischen Kreislaufsystems modellieren. Dies beinhaltet aber systembedingt meist volumenintensive Mittel wie Windkesselanordnungen, Durchflussbegrenzer und separate Pumpanordnungen. Nachteilig ist dabei, dass der Bedarf an Medienvolumen, aber auch der Raumbedarf solcher Anlagen durch die Verschaltung der Funktionselemente und vor allem die zur Ausbildung physiologischer Bedingungen erforderlichen geometrischen Abmessungen dieser bekannten Elemente groß sind. Daneben sind regelmäßig drucklose Bereiche im Perfusionskreislauf, besonders im Rücklaufzweig, notwendig, die ebenfalls volumenintensiv sind und ein nachteiliges Ausgasen der Kulturflüssigkeit begünstigen. Solche Apparaturen haben hohen Medienverbrauch und sind im Ganzen schlecht oder nur aufwändig temperierbar und insbesondere auch nicht befriedigend reinig- und sterilisierbar. Eine gewünschte Automatisierung der Handling-Operationen und der Einsatz von leicht austauschbaren universellen Einweg-Modulen in solchen Apparaturen nur schwer erreichbar. Außerdem ist bei solchen Bioreaktoren und Perfusionssystemen eine genauere Einstellung oder Modellierung einer bestimmten gewünschten physiologischen Bedingung oft gar nicht möglich oder es muss meist aus einer kleinen Zahl mechanisch und fluidisch fest vorgegebener Zustände des komplexen Perfusionskreislaufs vorab ausgewählt werden. Diese diskreten Zustände sind oft nicht unmittelbar und trägheitslos ineinander überführbar, oder das System muss zur Umschaltung in einen anderen Betriebszustand geöffnet und außer Betrieb gesetzt werden. A more advanced conditioning program for an improved in vitro heart valve construct should also include both rest and activity phases of the body. The pressure load in the heart should also be imitated depending on the posture (eg standing or lying down). To map this variety of physiological situations to an in vitro heart valve construct, known bioreactors for culturing in vitro heart valve constructs are incorporated into extensive perfusion circuits that model various functional elements of the human or animal circulatory system. However, this usually involves system-intensive means such as wind turbine arrangements, flow restrictors and separate pumping arrangements. The disadvantage here is that the need for media volume, but also the space requirement of such systems by the Interconnection of the functional elements and especially the necessary for the formation of physiological conditions geometric dimensions of these known elements are large. In addition, regularly depressurized areas in the perfusion circuit, especially in the return branch, are necessary, which are likewise volume-intensive and favor a disadvantageous outgassing of the culture fluid. Such apparatuses have high media consumption and are on the whole poor or only costly temperable and in particular not satisfactorily cleanable and sterilizable. A desired automation of handling operations and the use of easily replaceable universal disposable modules in such equipment difficult to achieve. In addition, in such bioreactors and perfusion systems, a more accurate setting or modeling of a particular desired physiological condition is often not possible, or it must usually be pre-selected from a small number of mechanically and fluidly fixed states of the complex perfusion circuit. These discrete states are often not directly and inertially interconvertible, or the system must be opened and shut down to switch to another operating state.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem bestand in der Bereitstellung eines Bioreaktorsystems zur verbesserten Kontrolle oder Einstellbarkeit einer gewünschten modellierten physiologischen Bedingung für die Konditionierung eines in vitro-Herzklappenkonstrukts bei gleichzeitig geringem Medienbedarf und insbesondere leichter Sterilisierbarkeit oder Austauschbarkeit der Teile. Besonders sollte das Bioreaktorsystem eine flexible universale pulsatile Perfusion des in vitro-Konstrukts mit über einen großen Bereich dynamisch einstellbarem oder regelbarem Druckverlauf an der Herzklappe ermöglichen. The technical problem underlying the present invention was to provide a bioreactor system for the improved control or adjustability of a desired modeled physiological condition for the conditioning of an in vitro heart valve construct with simultaneously low media requirements and in particular easy sterilization or interchangeability of the parts. In particular, the bioreactor system should allow for flexible universal pulsatile perfusion of the in vitro construct with a dynamically adjustable or regulatable pressure curve across the heart valve over a wide range.

Zusätzlich und von dem vorstehend skizzierten Problem, und davon unabhängig, besteht in bekannten Herzklappenbioreaktoren das Problem, dass zwischen Zellbesiedelungsphase und Konditionierungs- und Reifungsphase eine zeitliche Unterbrechung und insbesondere räumliche Trennung liegen muss. In bekannten Systemen muss die Besiedelung des Gerüsts mit der Zellsuspension in einem weiteren Kulturgefäß, außerhalb der Reaktorkammer, welche nur für die nachfolgende Konditionierungs- und Reifungsphase vorgesehen ist, durchgeführt werden, was einen Transfer des besiedelten Gerüsts erforderlich macht, oder die Verschaltung des gesamten Bioreaktorsystems muss zwischen diesen Phasen geändert werden, da für die Phasen jeweils ganz unterschiedliche Anforderungen an den Medienfluss und die Druckverhältnisse gestellt werden, die in bekannten Systemen nicht alle gleichzeitig erfüllt werden können. Dadurch besteht aber die Gefahr unerwünschter Kontaminationen, und das Gesamtverfahren wird schon wegen des nötigen komplexen Handlings störungsanfällig und aufwendig. Dies vermindert die Ausbeute oder Qualität der Herzklappenkonstrukte und führt zu geringer Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Eine weitere Herausforderung ist die effiziente Herstellung unter Vermeidung von Kontaminationen. Während der gesamten Herstellung muss die Herzklappe und alles, was mit ihr in Berührung kommen kann, aseptisch gehalten werden. Jeder offene Prozessschritt stellt dabei, auch wenn er in einer Sterilkammer durchgeführt wird, ein Kontaminationsrisiko und erheblichen manuellen Aufwand dar. Die Anzahl offener Prozessschritte ist also möglichst zu minimieren. In addition, and independently of the problem outlined above, and independently thereof, there is the problem in known heart valve bioreactors that there must be a temporal interruption and in particular spatial separation between the cell colonization phase and the conditioning and maturation phase. In known systems, the settlement of the scaffold with the cell suspension must be carried out in another culture vessel, outside the reactor chamber, which is intended only for the subsequent conditioning and maturation phase, which requires a transfer of the populated scaffold, or the interconnection of the entire bioreactor system must be changed between these phases, since for the phases respectively very different demands on the media flow and the pressure conditions are set, which can not all be met simultaneously in known systems. As a result, however, the risk of undesirable contamination, and the overall process is prone to failure and complex because of the necessary complex handling. This reduces the yield or quality of the heart valve constructs and leads to poor reproducibility of the results. Another challenge is efficient production while avoiding contamination. Throughout the manufacturing process, the heart valve and anything that may come into contact with it must be kept aseptic. Every open process step, even if carried out in a sterile chamber, poses a risk of contamination and considerable manual effort. The number of open process steps should therefore be minimized as far as possible.

Es soll daher ein integrales Bioreaktorsystem bereitgestellt werden, das zur Zellbesiedelung und Konditionierung/Reifung des in vitro-Herzklappenkonstrukts gleichermaßen geeignet ist, wodurch eine Unterbrechung des Ablaufs, zusätzliche Handling-Schritte vermieden und besonders die Gefahr von Kontaminationen und Unsterilitäten verringert oder dadurch ausgeschlossen werden soll. It is therefore an integral bioreactor system should be provided, which is equally suitable for cell colonization and conditioning / maturation of the in vitro heart valve construct, thereby interrupting the process, avoid additional handling steps and especially the risk of contamination and non-sterility should be reduced or excluded ,

Damit im Zusammenhang steht auch das technische Problem, dass regelmäßig in der Praxis die Zellsuspensionen bei ausreichender Zellkonzentration nur in kleinen Mengen (Volumen) vorliegen, vor allem bei humanem oder gar allogenem Spendermaterial. Related to this is also the technical problem that in practice the cell suspensions are only present in small amounts (volume) with sufficient cell concentration, especially in the case of human or even allogeneic donor material.

Bekannte Perfusions- oder Mechanoreaktoren für die Konditionierung oder Funktionsprüfung eines Gewebes sind jedoch funktionsbedingt so ausgestaltet, dass für eine Besiedelung mit Zellen in dem Reaktor selbst zu große Totvolumina im System vorhanden sind. Bei der Besiedelung ist bisher auch problematisch, dass die Zellen aus der Suspension ungleichmäßig auf das Gerüstmaterial sedimentieren und auf dem in vivo-Konstrukt unerwünschte Zonen unterschiedlicher Zelldichte oder früher Konfluenz entstehen oder Zellen sich an den Wänden oder Fluidkanälen des Bioreaktorsystems niederschlagen und damit für die Besiedelung des in vitro-Konstrukts verloren sein können. Known perfusion or mechano-reactors for the conditioning or functional testing of a tissue are, however, functionally designed so that there are too large dead volumes in the system for colonization with cells in the reactor itself. In the colonization is so far problematic that the cells from the suspension settle unevenly on the scaffold material and on the in vivo construct undesirable zones of different cell density or early confluence arise or cells precipitate on the walls or fluid channels of the bioreactor system and thus for colonization of the in vitro construct.

Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem bestand damit auch in der Bereitstellung eines solchen integralen Bioreaktorsystems, das eine verbesserte Besiedelung von Gerüstmaterial mit Zellen aus einer Zellsuspension ermöglicht und insbesondere bei einem geringen Volumen an Zellsuspension eine effiziente und gleichmäßige Besiedelung des Gerüsts bei geringem Zellverlust und Zelluntergang erlaubt. The technical problem underlying the present invention was thus also in the provision of such an integral bioreactor system, which enables improved colonization of scaffold material with cells from a cell suspension and, especially with a small volume of cell suspension, an efficient and uniform colonization of the scaffold with low cell loss and cell death allowed.

Die Erfindung löst die vorgenannten technischen Probleme und befriedigt die Anforderungen an eine effiziente automatische Herstellung von biogenen Herzklappenpräparaten durch ein neuartiges integrales Bioreaktorsystem zur Besiedelung, Kultivierung und, insbesondere gerichteten, druckgesteuerten Perfusion eines in vitro-Herzklappenkonstrukts. Dieses enthält erfindungsgemäß zumindest die im Folgenden gelisteten und charakterisierten Komponenten oder besteht in bevorzugter Ausgestaltung ausschließlich daraus:

1. mindestens eine oder genau eine Reaktorkammer (20) mit bei primärer Strömungsrichtung der Perfusion durch das in vitro-Herzklappenkonstrukt im Perfusionsbetrieb stromaufwärts liegendem (ventrikulärem) Medienport und bei primärer Strömungsrichtung der Perfusion durch das in vitro-Herzklappenkonstrukt stromabwärts liegendem (aortalem) Medienport, und mindestens einer oder genau einer in der Reaktorkammer anordenbaren und im Funktionszustand darin angeordneten Haltevorrichtung, die zumindest ein ventrikuläres Anschlussstück (Anschlussnippel oder -muffe) und ein aortales Anschlussstück (Anschlussnippel oder -muffe) aufweist, die geeignet sind zur Aufnahme und Fixierung des in vitro-Herzklappenkonstrukts,
2. mindestens eine oder genau eine stromaufwärts liegende (ventrikelseitige) Pumpanordnung (10) mit einer, insbesondere durch Pressluft oder Druckgas, wechselnd steuerbar druckbeaufschlagbaren Arbeitskammer und einer davon durch eine bewegliche, insbesondere elastische Membran abgetrennten stromabwärts liegenden (ventrikulären) Medienkammer (Ventrikelkammer), die mit dem (stromaufwärts liegenden) ventrikulären Abschnitt oder Pol des Konstrukts über den stromaufwärts liegenden (ventrikulären) Medienport der Reaktorkammer und das ventrikuläre Anschlussstück der Haltevorrichtung in Fluidverbindung bringbar ist und mit dieser im Funktionszustand in direkter, insbesondere fluiddichter Medienverbindung steht, und
3. mindestens eine oder genau eine stromabwärts liegende (aortenseitige) Pumpanordnung (30) mit einer, insbesondere durch Pressluft oder Druckgas, wechselnd steuerbar druckbeaufschlagbaren Arbeitskammer und einer davon durch eine bewegliche, insbesondere elastische Membran abgetrennten stromabwärts liegenden Medienkammer (Aortenkammer), die mit dem aortalen Abschnitt oder Pol des Konstrukts über den stromabwärts liegenden (aortalen) Medienport der Reaktorkammer und das aortale Anschlussstück der Haltevorrichtung in Fluidverbindung bringbar ist und mit dieser im Funktionszustand in direkter, insbesondere fluiddichter Fluidverbindung steht.

The invention solves the aforementioned technical problems and satisfies the requirements for an efficient automatic production of biogenic heart valve preparations by a novel integral bioreactor system for colonization, cultivation and, in particular directed, pressure-controlled perfusion of an in vitro heart valve construct. According to the invention, this contains at least the components listed and characterized below or, in a preferred embodiment, consists exclusively of:

1. at least one or exactly one reactor chamber ( 20 ) with the perfusion in the primary flow direction through the in vitro heart valve construct in perfusion mode upstream (ventricular) media port and in the primary flow direction of perfusion through the in vitro heart valve construct downstream (aortic) media port, and at least one or just one in the reactor chamber can be arranged and a holding device arranged therein in the functional state, which has at least one ventricular connection piece (connection nipple or sleeve) and an aortic connection piece (connection nipple or sleeve) which are suitable for receiving and fixing the in vitro heart valve construct,
2. at least one or exactly one upstream (ventricle-side) pumping arrangement ( 10 ) with a, in particular by compressed air or compressed gas, alternately controllable pressurizable working chamber and one of which through a movable, in particular elastic membrane separated downstream (ventricular) medium chamber (ventricle chamber) with the (upstream) ventricular portion or pole of the construct on the upstream (ventricular) media port of the reactor chamber and the ventricular connection piece of the holding device can be brought into fluid communication and with this in the functional state is in direct, in particular fluid-tight media connection, and
3. at least one or exactly one downstream (aortic) pumping arrangement ( 30 ) with one, in particular by compressed air or compressed gas, alternately controllable pressurizable working chamber and one of which by a movable, in particular elastic membrane separated downstream media chamber (aortic chamber) with the aortic portion or pole of the construct via the downstream (aortic) media port of Reactor chamber and the aortic fitting of the holding device can be brought into fluid communication with this and is in the functional state in direct, in particular fluid-tight fluid connection.

Die Erfindung wird hierin am Beispiel der Herstellung einer Aortenklappe erklärt, und es werden daher die dafür zutreffenden Begrifflichkeiten der Orientierung der Bioreaktorelemente und des Herzklappenkonstrukts verwendet, ohne dass diese beschränkend zu verstehen wären. Die Erfindung ist ebenso geeignet zur Herstellung einer Pulmonalklappe sowie auch einer Bikuspidalklappe und Mitralklappe oder Trikuspidalklappe. Daher bedeuten im Zusammenhang mit dieser Erfindung – abweichend vom anatomischen Sprachgebrauch dieser Begriffe „ventrikulär“, „ventrikelseitig“ oder „Ventrikel-“ „stromaufwärts liegend“, und „aortal“, „aortenseitig“ oder „Aorten-“ stromabwärts liegend“, und zwar jeweils in Bezug auf die primäre Strömungsrichtung der Perfusion durch das in vitro-Herzklappenkonstrukt im Perfusionsbetrieb. The invention is explained herein by the example of the production of an aortic valve, and therefore the appropriate terms of the orientation of the bioreactor elements and the heart valve construct are used without them being restrictive. The invention is also suitable for producing a pulmonary valve as well as a bicuspid valve and mitral valve or tricuspid valve. Thus, in the context of this invention, other than anatomical usage, these terms "ventricular," "ventricle-side," or "ventricle" mean "upstream," and "aortic," "aortic," or "aortic" are "downstream." each with respect to the primary flow direction of perfusion through the in vitro heart valve construct in perfusion mode.

Die beiden stromaufwärts und stromabwärts liegenden Pumpanordnungen vermitteln erfindungsgemäß zumindest sowohl – in der Funktion einer Membranpumpe – aktiv die pulsatile Perfusion des Konstrukts in der Reaktorkammer, das heißt besonders den Medientransport durch das Bioreaktorsystem, als auch – in der Funktion eines einstellbaren Windkessels (compliance chamber) – die komplette Drucksteuerung zur Simulation physiologischer Druckverläufe zur Konditionierung und Reifung des Konstrukts. Durch die erfindungsgemäße doppelte Pumpanordnung beiderseits des zu perfundierenden Konstrukts wird eine einfache und flexible Steuerung der Druckverläufe, und insbesondere der Druckdifferenz zwischen dem Ventrikelpol und dem Aortenpol des Konstrukts, die der wesentliche Faktor für die Konditionierung, aber auch für eine Funktionsprüfung des Herzklappengewebes ist, ermöglicht, wobei der apparative Aufwand und die Medienvolumen im System klein gehalten werden können. Die Drucksteuerung in den beiden Pumpanordnungen erfolgt durch zeitliche Kontrolle oder Steuerung des Drucks in der jeweiligen Arbeitskammer über eine rechner- und programmgestützte ventilgesteuerte Druckbeaufschlagung oder Entlüftung. Die Arbeitskammern können mit Gas oder Flüssigkeit betrieben werden, wobei der Betrieb mit Gas, Inertgas oder Luft bevorzugt ist. Die individuellen zeitlichen Druckverläufe in beiden Pumpanordnungen spielen zusammen, um den gewünschten physiologischen Druckverlauf zur Konditionierung und Reifung des Konstrukts zu simulieren. Eine erfindungsgemäße dritte Funktion beider Pumpanordnungen entsteht im Zusammenspiel mit der benachbarten Reaktorkammer und wird weiter unten näher beschrieben. The two upstream and downstream pump assemblies mediate according to the invention at least both - in the function of a membrane pump - actively the pulsatile perfusion of the construct in the reactor chamber, that is especially the media transport through the bioreactor system, as well - in the function of an adjustable wind chamber (compliance chamber) - The complete pressure control for the simulation of physiological pressure curves for the conditioning and maturation of the construct. By means of the double pumping arrangement according to the invention on both sides of the construct to be perfused, a simple and flexible control of the pressure profiles, and in particular the pressure difference between the ventricular pole and the aortic pole of the construct, which is the essential factor for the conditioning but also for functional testing of the heart valve tissue, is made possible , whereby the expenditure on equipment and the volume of medium in the system can be kept small. The pressure control in the two pumping arrangements is carried out by time control or control of the pressure in the respective working chamber via a computer and program-based valve-controlled pressurization or venting. The working chambers may be operated with gas or liquid, with operation with gas, inert gas or air being preferred. The individual temporal pressure profiles in both pumping arrangements work together to simulate the desired physiological pressure course for conditioning and maturation of the construct. A third function of both pumping arrangements according to the invention arises in interaction with the adjacent reactor chamber and will be described in more detail below.

Die Membran ist vorzugsweise eine flache Scheibe aus Elastomermaterial, die in das Gehäuse der Pumpanordnung gespannt, besonders zwischen Gehäusehälften geklemmt, wobei die Elastomermembran dann zusätzlich als Dichtung zwischen den Gehäuseelementen dienen kann. Bevorzugtes Membranmaterial ist ein insbesondere leicht sterilisierbares biokompatibles Elastomer oder oberflächenfunktionalisiertes Elastomer, bevorzugt ausgewählt aus: Silikonkautschuk, besonders RTV-Silikon, PU, LDPE und Latex. Neben rein gummielastischen Membranen können alternativ Materialverbünde oder Balgenkonstruktionen als bewegliche Membranen eingesetzt werden. The membrane is preferably a flat disc made of elastomeric material, which is stretched in the housing of the pump assembly, especially clamped between housing halves, wherein the elastomeric membrane can then additionally serve as a seal between the housing elements. Preferred membrane material is a particularly easily sterilizable biocompatible elastomer or surface-functionalized elastomer, preferably selected from: silicone rubber, especially RTV silicone, PU, LDPE and latex. In addition to pure Elastomeric membranes can alternatively be used as mobile membranes composite materials or bellows constructions.

Diese drei Hauptkomponenten in ihrer spezifischen erfindungsgemäßen Ausgestaltung bilden ein integrales und kompaktes Bioreaktormodul, wobei die einzelnen Komponenten durch die erfindungsgemäße Anordnung zu einander zu einer ergänzenden Funktionalität des Bioreaktorsystems führen, die über eine lose Verschaltung der Einzelkomponenten, besonders in räumlicher Trennung voneinander hinausgeht. Die Erfindung sieht dabei besonders eine unmittelbare Anordnung dieser Komponenten zueinander vor. Die Verschaltung der Komponenten erfolgt in Bezug auf die primäre Strömungsrichtung der Perfusion durch das in vitro-Herzklappenkonstrukt bevorzugt ausschließlich in folgender Reihenfolge: An die stromaufwärts liegende Pumpanordnung (10) schließt sich die Reaktorkammer (20) mit der Haltevorrichtung an, auf welche die stromabwärts liegende Pumpanordnung (30) folgt. In einer bevorzugten Variante der Erfindung sind diese drei Komponenten zu einem integralen Gehäuseblock zusammengefügt, bevorzugt werden die Gehäuse der Komponenten aneinander fixiert oder sie sind zusammen in einem einstückigen (einteiligen oder mehrteiligen) Fluidblock ausgebildet. Bevorzugt besteht der Block des Bioreaktorsystems ausschließlich aus diesen drei Komponenten. These three main components in their specific embodiment of the invention form an integral and compact bioreactor module, the individual components lead to a complementary functionality of the bioreactor by the inventive arrangement to each other, which goes beyond a loose interconnection of the individual components, especially in spatial separation from each other. The invention provides in particular a direct arrangement of these components to each other. The interconnection of the components takes place with respect to the primary flow direction of the perfusion through the in vitro heart valve construct, preferably exclusively in the following sequence: to the upstream pumping arrangement (FIG. 10 ) closes the reactor chamber ( 20 ) with the holding device to which the downstream pumping arrangement ( 30 ) follows. In a preferred variant of the invention, these three components are joined together to form an integral housing block, preferably the housings of the components are fixed to one another or they are formed together in a one-piece (one-part or multi-part) fluid block. The block of the bioreactor system preferably consists exclusively of these three components.

Selbstverständlich können in den einzelnen Komponenten oder Kompartimenten des vorgenannten Kernsystems oder Blocks Zugänge (Ports) in an sich bekannter Weise und Funktionalität vorgesehen sein, die insbesondere den Zugang in das geschlossene System für Medienwechsel, zum Einbringen von Wirkstoffen oder Zellsuspensionen erlauben oder in Form von Entlüftungen für blasenfreien Betrieb sorgen können. Of course, in the individual components or compartments of the aforementioned core system or block access (ports) in a conventional manner and functionality may be provided, in particular allow access to the closed system for media change, for the introduction of active ingredients or cell suspensions or in the form of vents ensure bubble-free operation.

In einer erfindungsgemäß besonders bevorzugten Ausgestaltung davon sind die stromaufwärts liegende Pumpanordnung (10) und die stromabwärts liegende Pumpanordnung (30) zum Rückfluss des Perfusionsmediums, insbesondere direkt, das heißt ohne Umwege, über eine separate Rücklaufkomponente (60) verbunden, so dass ein geschlossener Medienkreislauf entsteht. Diese Rücklaufkomponente ist besonders als mindestens ein insbesondere außerhalb der Reaktorkammer verlaufender Fluidkanal ausgebildet. In einer bevorzugten Variante sind diese vier Komponenten zu einem integralen Gehäuseblock zusammengefügt oder sie sind zusammen in einem einstückigen (einteiligen oder mehrteiligen) Fluidblock ausgebildet. Bevorzugt besteht der Block des Bioreaktorsystems ausschließlich aus diesen vier Komponenten. In a particularly preferred embodiment according to the invention, the upstream pumping arrangement ( 10 ) and the downstream pumping arrangement ( 30 ) to the reflux of the perfusion medium, in particular directly, that is without detours, via a separate reflux component ( 60 ), so that a closed media cycle is created. This reflux component is designed in particular as at least one fluid channel extending in particular outside the reactor chamber. In a preferred variant, these four components are assembled into an integral housing block or they are formed together in a one-piece (one-piece or multi-part) fluid block. The block of the bioreactor system preferably consists exclusively of these four components.

Erfindungsgemäß weist der mindestens eine Rückkanal ein Rückschlagventil auf oder enthält ausschließlich dieses, um ein unerwünschtes Rückströmen von Medium von der ventrikulären Medienkammer (Hochdruckseite) in die aortale Medienkammer (Niederdruckseite) über den Rückkanal in bestimmten Druckphasen im pulsatilen Perfusionsbetrieb zu unterbinden. Der Rückkanal enthält dabei bevorzugt zusätzlich ein verstellbares Drosselventil, das bevorzugt dem Rückschlagventil in Rückströmungsrichtung nachgeschaltet ist. Der Rückkanal enthält bevorzugt ausschließlich das Rückschlagventil und das Drosselventil und verbindet dabei bevorzugt unmittelbar die beiden Medienkammern der aortalen und ventrikulären Pumpanordnungen. Das Drosselventil dient erfindungsgemäß im Perfusionsbetrieb zur Begrenzung des effektiven Strömungsquerschnitts in dem Rückkanal und damit dem gezielt einstellbaren Druckabfall im Rücklauf. Dadurch wird insbesondere ein völlig druckloser Abschnitt (Atmosphärendruck), beispielsweise in Form eines bekannten drucklosen Medienvorratsgefäßes, in dem Perfusionssystem überflüssig. Die erfindungsgemäße Anordnung und Ausgestaltung des Rückkanals erlaubt einen druckgesteuerten Perfusionsbetrieb unter Beachtung und Einstellung der dynamischen Druckdifferenz allein an der Herzklappe des in vitro-Herzklappenkonstrukts, unabhängig von den absoluten Drücken. According to the invention, the at least one return channel to a check valve or contains only this, to prevent unwanted backflow of medium from the ventricular medium chamber (high pressure side) in the aortic medium chamber (low pressure side) via the return channel in certain pressure phases in the pulsatile perfusion mode. The return channel preferably additionally contains an adjustable throttle valve, which is preferably connected downstream of the check valve in the return flow direction. The return channel preferably contains only the non-return valve and the throttle valve and preferably connects directly the two media chambers of the aortic and ventricular pumping arrangements. The throttle valve according to the invention is used in perfusion mode to limit the effective flow cross section in the return channel and thus the specifically adjustable pressure drop in the return. As a result, in particular a completely depressurized section (atmospheric pressure), for example in the form of a known pressureless medium storage vessel, becomes superfluous in the perfusion system. The arrangement and design of the return channel according to the invention allows a pressure-controlled perfusion operation, taking into account and setting the dynamic pressure difference only at the heart valve of the in vitro heart valve construct, regardless of the absolute pressures.

Die unmittelbar aneinander angrenzende Anordnung der drei Komponenten erlaubt im Zusammenspiel eine automatisierbare Zusatzfunktion der primär als Medienpumpen und zur Drucksteuerung einsetzbaren beiden Pumpanordnungen, wodurch die Reaktorkammer nahtlos zwischen einem Besiedelungsbetrieb und einem pulsatilen Perfusionsbetrieb unmittelbar und gegebenenfalls mehrfach umgeschaltet werden kann, und zwar ohne zusätzliche bauliche Umbaumaßnahmen, Transfer des Konstrukts oder sonstige Betriebsunterbrechungen. Dazu sieht die Erfindung vor, dass beide Pumpanordnungen jeweils unmittelbar benachbart an der Reaktorkammer angeordnet sind, so dass die beweglichen, insbesondere elastischen, Membranen beider Pumpanordnungen durch entsprechende Druckbeaufschlagung der jeweiligen Arbeitskammern derart auslenkbar sind, dass sie jeweils mit den beiden (ventrikulären und aortalen) Medienports der Reaktorkammer dichtend in Eingriff kommen und diese abschließen können. Dadurch kann vorteilhafterweise insbesondere zumindest das luminale Kompartiment des Konstrukts für die Dauer dieser Druckbeaufschlagung abgeschlossen und spezifisch jeweils von dem Rest-Volumen der beiden Medienkammern der Pumpanordnungen und des übrigen Perfusionssystems abgetrennt werden. Die bewegliche Membran ist dazu bevorzugt zumindest auf der den Medienports der Reaktorkammer zugewandten Seite mit einer elastisch dichtenden und/oder hydrophoben Schichtung versehen oder besteht aus einem solchen Material. The directly adjacent arrangement of the three components allows in interaction an automatable additional function of the two pumping arrangements that can be used primarily as media pumps and for pressure control, whereby the reactor chamber can be switched seamlessly between a colonization operation and a pulsatile perfusion operation directly and optionally multiple times, without additional structural alteration measures , Transfer of the construct or other business interruptions. For this purpose, the invention provides that both pumping arrangements are each arranged directly adjacent to the reactor chamber, so that the movable, in particular elastic, membranes of both pumping arrangements can be deflected by corresponding pressurization of the respective working chambers such that they are in each case connected to the two (ventricular and aortic) Media ports of the reactor chamber can sealingly engage and lock them. As a result, in particular, at least in particular the luminal compartment of the construct for the duration of this pressurization can be completed and specifically separated in each case from the residual volume of the two media chambers of the pumping arrangements and the rest of the perfusion system. The movable membrane is for this purpose preferably at least on the media ports of the reactor chamber side facing with a provided elastically sealing and / or hydrophobic layering or consists of such a material.

In dem Besiedelungsbetrieb des Bioreaktors kann das in vitro-Herzklappenkonstrukt vorteilhafterweise mit dort eingebrachten Zellen in Form einer Zellsuspension besiedelt werden und anschließend nahtlos in den (pulsatilen) Perfusionsbetrieb umgeschaltet werden. Ein kompliziertes Handling und ein Öffnen des Reaktorkreislaufs sind nicht erforderlich, wodurch Arbeitsweisen vereinfacht und automatisierbar werden und dabei eine Kontamination vermieden werden kann. Besonders erlaubt der automatisierbare Verschluss der Reaktorkammer eine vorteilhafte Minimierung des für die Besiedelung erforderlichen Volumens, wodurch die Menge an Zellsuspension klein gehalten und/oder die Zellkonzentration in der Suspension hoch gehalten werden kann, ohne dass ein hoher Zellverbrauch an Spendermaterial stattfindet. Die automatisierbare Besiedelung innerhalb des erfindungsgemäßen Bioreaktorsystems ist daher höchst ressourcenschonend. Diese Besiedelungsfunktion des erfindungsgemäßen Bioreaktorsystems ist dabei unabhängig von der tatsächlichen Anordnung und Betriebsweise eines angeschlossenen Perfusionssystems, wobei die Perfusion nicht ausschließlich auf die integralen Pumpanordnungen gestützt zu sein braucht, so dass weitere Pumpsysteme, wie Schlauchpumpen und oder Kolbenpumpen und/oder Beutelpumpen, sowie weitere Systeme zur Modellierung eines physiologischen Druckverlaufs an dem Konstrukt, wie Windkesselanordnungen oder ähnliche vorgesehen sein können. Bevorzugt ist im Sinne der Erfindung aber eine integrale Ausgestaltung des Bioreaktorsystems, wobei die pulsatile druckgesteuerte Perfusion im Perfusionsbetrieb ausschließlich durch die beiden Pumpanordnungen in Verbindung mit dem hierin beschriebenen Rückkanals mit Rückschlagventil und Drosselventil erfolgt und der Besiedelungsbetrieb durch Interaktion derselben beiden Pumpanordnungen in Verbindung mit der unmittelbar dazwischen angeordneten Reaktorkammer erfolgt. In the colonization operation of the bioreactor, the in vitro heart valve construct can advantageously be colonized with cells introduced there in the form of a cell suspension and then switched seamlessly into the (pulsatile) perfusion mode. Complicated handling and opening of the reactor cycle is not required, which simplifies and automates operations while avoiding contamination. In particular, the automatable occlusion of the reactor chamber permits an advantageous minimization of the volume required for the colonization, whereby the amount of cell suspension can be kept small and / or the cell concentration in the suspension can be kept high, without a high cell consumption of donor material taking place. The automatable colonization within the bioreactor system according to the invention is therefore extremely resource-friendly. This colonization function of the bioreactor system according to the invention is independent of the actual arrangement and operation of a connected perfusion system, the perfusion need not be based exclusively on the integral pumping arrangements, so that other pumping systems, such as peristaltic pumps and or piston pumps and / or bag pumps, and other systems for modeling a physiological pressure gradient on the construct, such as wind turbine arrangements or the like may be provided. In the context of the invention, however, an integral embodiment of the bioreactor system is preferred, wherein the pulsatile pressure-controlled perfusion takes place exclusively by the two pumping arrangements in conjunction with the return channel with check valve and throttle valve described herein and the colonization operation by interaction of the same two pumping arrangements in conjunction with the immediate interposed reactor chamber takes place.

Der erfindungsgemäße Bioreaktor enthält eine zur Besiedelung als auch zur Perfusion des in vitro-Herzklappenkonstrukts besonders geeignete Haltevorrichtung (Klappenhalter). Diese dient der Aufnahme und insbesondere fluiddichten Fixierung des an sich tubulären Konstrukts und ist bevorzugt so ausgestaltet, dass das durch die dichte Fixierung des Konstrukts in der Haltevorrichtung gebildete Lumen (luminales Kompartiment) von dem äußeren, das Konstrukt umgebenden extraluminalen Bereich (extraluminales Kompartiment) fluidisch getrennt ist. Bevorzugt ist die Haltevorrichtung mehrteilig ausgebildet und weist ein Rahmenteil und beidseits darin eingesetzte, aber davon trennbare Anschlussstücke zur Aufnahme des Konstrukts auf. The bioreactor according to the invention contains a holding device (flap holder) which is particularly suitable for colonization as well as for perfusion of the in vitro heart valve construct. This serves to receive and in particular fluid-tight fixation of the intrinsically tubular construct and is preferably designed such that the lumen (luminal compartment) formed by the dense fixation of the construct in the holding device from the outer, surrounding the construct extraluminal region (extraluminal compartment) fluidly is disconnected. Preferably, the holding device is designed in several parts and has a frame part and on both sides inserted therein, but separable connecting pieces for receiving the construct.

Die Anschlussstücke sind so ausgestaltet und dimensioniert, dass sie jeweils ein tubuläres Ende des Herzklappenkonstrukts aufnehmen und bevorzugt fluiddicht fixieren können. In einfacher Ausgestaltung sind die Anschlussstücke im Klemmsitz in das Rahmenteil einsetzbar und werden dort gehalten. Die Trennbarkeit der Anschlussstücke von dem Rahmenteil der Haltevorrichtung erlaubt ein einfacheres Handling bei der Fixierung des Gerüsts oder beim Abnehmen des reifen Konstrukts, das dadurch leicht automatisierbar wird. Sie erlaubt außerdem, die Reinigung und Sterilisierung des Reaktorsystems zu vereinfachen, da allein die abnehmbaren Anschlussstücke mit dem Konstrukt in Kontakt kommen und nach Verwendung einfach ausgetauscht werden können. Weiter erlaubt sie die einfache Anpassung der Haltevorrichtung an die Größe des gewünschten Konstrukts dadurch, dass Anschlussstücke in mehreren Größen (Außendurchmesser) vorgelegt werden und daraus ausgewählt werden kann. Sie erlaubt weiter, dass allein das Anschlussstück aus einem hoch biokompatiblen Material gefertigt zu sein braucht, weil nur dieses mit dem Konstrukt dauerhaft in Kontakt stehen muss. Dabei kann das Material des Anschlussstücks in an sich bekannter Weise spezifisch beschaffen sein, um ein Einwachsen von biologischen Gewebestrukturen zu ermöglichen oder zu begünstigen, um die Fluiddichtheit zwischen Konstrukt und Perfusionskreislauf zu erzielen oder über die gesamte Kultivierungsphase hinweg dauerhaft aufrecht zu erhalten. In einer Variante davon ist vorgesehen, dass die Anschlussstücke an den beiden Polen des Konstrukts bereits integraler Bestandteil des vorgegebenen Gerüsts zur Besiedelung sind und zusammen mit diesem in die Haltevorrichtung eingesetzt werden können. The connecting pieces are designed and dimensioned such that they can each receive a tubular end of the heart valve construct and preferably fix it in a fluid-tight manner. In a simple embodiment, the fittings can be used in a press fit in the frame part and are held there. The separability of the fittings of the frame part of the holding device allows easier handling in the fixation of the framework or when removing the mature construct, which is thereby easily automated. It also allows to simplify the cleaning and sterilization of the reactor system, since only the removable connectors come into contact with the construct and can be easily replaced after use. Further, it allows the fixture to be easily adapted to the size of the desired construct by providing fittings in multiple sizes (outer diameter) and can be selected therefrom. It further allows that only the connector needs to be made of a highly biocompatible material, because only this has to be permanently in contact with the construct. In this case, the material of the connection piece can be designed specifically in a manner known per se in order to facilitate or promote ingrowth of biological tissue structures in order to achieve fluid tightness between the construct and the perfusion circuit or to maintain it permanently over the entire cultivation phase. In a variant thereof it is provided that the connecting pieces at the two poles of the construct are already an integral part of the predetermined framework for colonization and can be used together with this in the holding device.

Die Haltevorrichtung ist vorteilhafterweise von der Reaktorkammer körperlich getrennt und insbesondere zum Zwecke des Einspannens des Gerüsts zu Beginn der Herstellung als auch der Gewinnung der reifen Herzklappe aus der Reaktorkammer entnehmbar. Die Haltevorrichtung ist dabei so ausgestaltet und dimensioniert, das sie im Funktionszustand des Reaktors dichtend mit dem Inneren der Reaktorkammer in Eingriff kommt, so dass in Verbindung mit dem fixierten Konstrukt ein luminales Kompartiment und ein extraluminales Kompartiment in der Reaktorkammer gebildet werden. Diese sind bevorzugt durch entsprechende Zugänge (Ports), die an der Reaktorkammer ausgebildet sind, bevorzugt getrennt voneinander von außen zugänglich. Im Besiedelungsbetrieb bzw. in der Besiedelungsphase können durch diese Zugänge Zellsuspensionen jeweils getrennt an die luminale Seite oder die extraluminale Seite des Konstrukts gebracht werden, um diese getrennt mit Zellen zu besiedeln. Ebenso sind im Perfusionsbetrieb bzw. während der Konditionierungs- oder Reifungsphase, luminale und extraluminale Seite des Konstrukts getrennt für die Applikation von Wirkstoffen und/oder eine getrennte Perfusion zugänglich. Die getrennte Perfusion der beiden Kompartimente erlaubt auch eine getrennte Drucksteuerung und/oder Flusssteuerung in beiden Kompartimenten, beispielsweise für die Etablierung eines transmuralen Druckgefälles im Rahmen der Konditionierung von Gefäßabschnitten oder Gefäßanteilen einer Herzklappe. The holding device is advantageously physically separated from the reactor chamber and in particular for the purpose of clamping the scaffold at the beginning of production as well as the recovery of the mature heart valve from the reactor chamber removed. The holding device is designed and dimensioned such that in the functional state of the reactor it sealingly engages the interior of the reactor chamber so that a luminal compartment and an extraluminal compartment are formed in the reactor chamber in connection with the fixed construct. These are preferably accessible from the outside by suitable entrances (ports) which are formed on the reactor chamber, preferably separately from one another. In colonization or in the colonization phase, cell suspensions can be separately brought to the luminal side or the extraluminal side of the construct by these accesses in order to colonize them separately with cells. Similarly, in the perfusion mode or during the conditioning or ripening phase, luminal and extraluminal side of the construct are separated for the Application of drugs and / or a separate perfusion accessible. The separate perfusion of the two compartments also allows separate pressure control and / or flow control in both compartments, for example, for the establishment of a transmural pressure gradient in the context of the conditioning of vessel sections or vessel portions of a heart valve.

In einer bevorzugten Ausgestaltung liegen die beiden Medienports an sich gegenüberliegenden Wänden der Reaktorkammer. Bevorzugt ist die Haltevorrichtung zwischen diese Wände einspannbar. Bevorzugt ist im Bereich der Medienports, zumindest aber auf der ventrikulären, das heißt auf der stromaufwärts liegenden Hochdruckseite, ein separates Dichtmittel in Form einer einfachen oder mehrteilige Dichtlippe, eines Federrings oder einer Labyrinthdichtung vorgesehen. In einer alternativen Variante ist eine hinreichende Abdichtung der Perfusion zwischen Haltevorrichtung und Reaktorkammerwand durch Passung erreicht, wobei sich bevorzugt ein reibungsmindernder Flüssigkeitsfilm zwischen den Wänden bildet der durch Kapillar- und Benetzungskräfte dort gehalten wird. In a preferred embodiment, the two media ports are located on opposite walls of the reactor chamber. Preferably, the holding device between these walls is clamped. Preferably, in the region of the media ports, but at least on the ventricular, that is on the upstream high-pressure side, a separate sealing means in the form of a simple or multi-part sealing lip, a spring ring or a labyrinth seal is provided. In an alternative variant, a sufficient sealing of the perfusion between the holding device and the reactor chamber wall is achieved by fitting, whereby a friction-reducing liquid film preferably forms between the walls, which is held there by capillary and wetting forces.

In einer besonderen Variante ist mindestens ein Bypasskanal in der Reaktorkammer und insbesondere in der Haltevorrichtung vorgesehen, die einen gezielten Austausch zwischen luminalem und extraluminalem Kompartiment erlaubt. Dadurch kann vorteilhafterweise erreicht werden, dass zu dem primären luminalen Perfusionskreislauf ein Nebenzweig gebildet ist, wodurch das extraluminale Kompartiment versorgt wird und somit auch dort ein Medienaustausch stattfinden kann. Durch einen einzigen Perfusionskreislauf kann so das gesamte Konstrukt in der Reaktorkammer beidseits dauerhaft versorgt werden. Um eine getrennte Zellbesiedelung auf beiden Seiten des Konstrukts zu ermöglichen und/oder um eine zelluläre oder mikrobiologische Kontamination über die Kompartimentgrenze hinweg zu unterbinden, ist der Bypasskanal mit zellabweisenden Oberfläche und/oder zelldichten Membran oder Fritte versehen. In a particular variant, at least one bypass channel is provided in the reactor chamber and in particular in the holding device, which allows a targeted exchange between the luminal and extraluminal compartments. As a result, it can advantageously be achieved that a secondary branch is formed to the primary luminal perfusion circuit, whereby the extraluminal compartment is supplied and thus there can also be a media exchange there. By means of a single perfusion circuit, the entire construct in the reactor chamber can be permanently supplied on both sides. To facilitate separate cell colonization on either side of the construct and / or to prevent cellular or microbiological contamination across the compartment boundary, the bypass channel is provided with a cell repellent surface and / or cell-tight membrane or frit.

Das Konstrukt ist in der Reaktorkammer bevorzugt in horizontaler Längsausrichtung angeordnet, das heißt die gedachte Längsachse von Ventrikelpol zu Aortenpol verläuft in etwa im rechten Winkel zum Schwerkraftvektor. Bevorzugt ist die gesamte Bioreaktoranordnung, und spezifisch der Reaktorblock mit der Reaktorkammer, horizontal angeordnet. Spezifisch zum Zwecke der Zellbesiedelung des Gerüsts in der Reaktorkammer ist die Haltevorrichtung innerhalb der Reaktorkammer besonders um die gedachte Längsachse von Ventrikelpol zu Aortenpol des Konstrukts mechanisch rotierbar. Die bevorzugt horizontale Rotationsachse verläuft bevorzugt unmittelbar durch die beiden in die Reaktorkammer an gegenüberliegenden Seiten mündenden Medienports. Dadurch wird vorteilhafterweise die schwerkraftgestützte Besiedelung des Gerüsts aus der Zellsuspension heraus (Sedimentation) verbessert und eine gleichmäßige Besiedelung des Konstrukts mit einheitlicher Zelldichte ermöglicht. Durch die Rotation des Konstrukts mit der Haltevorrichtung in der Reaktorkammer während der Besiedelungsphase bzw. im Besiedelungsbetrieb wird zum Einen eine unerwünschte frühe oder zu schnelle Zellsedimentation auf das Gerüst verhindert, weil die Zellsuspension durch die Bewegung bei der Rotation verwirbelt werden kann. Zum Anderen kann die gewünschte Sedimentation auf verschiedene Oberflächenabschnitte des Konstrukts gleichmäßig verteilt oder alternativ gezielt gerichtet werden. Dabei erlaubt eine spezifische Konstruktion des Antriebs besonders eine intermittierende sektorenweise Rotation mit Ruhephasen. Alternativ ist eine kontinuierliche Rotationsbewegung vorgesehen. The construct is preferably arranged in the reactor chamber in a horizontal longitudinal orientation, that is to say the imaginary longitudinal axis from ventricular pole to aortic pole runs approximately at right angles to the gravity vector. Preferably, the entire bioreactor assembly, and specifically the reactor block with the reactor chamber, is arranged horizontally. Specifically for the purpose of cell colonization of the scaffold in the reactor chamber, the holding device within the reactor chamber is mechanically rotatable, especially around the imaginary longitudinal axis from ventricular pole to aortic pole of the construct. The preferably horizontal axis of rotation preferably runs directly through the two media ports opening into the reactor chamber on opposite sides. This advantageously improves the gravity-assisted colonization of the scaffold from the cell suspension (sedimentation) and enables a uniform colonization of the construct with a uniform cell density. The rotation of the construct with the holding device in the reactor chamber during the colonization phase or in the colonization operation, on the one hand, prevents unwanted early or too rapid cell sedimentation on the framework because the cell suspension can be swirled by the movement during the rotation. On the other hand, the desired sedimentation can be uniformly distributed to different surface sections of the construct or alternatively targeted. In this case, a specific design of the drive allows in particular an intermittent sector-wise rotation with resting phases. Alternatively, a continuous rotational movement is provided.

Im Unterschied zur Besiedelung der Innenwand des Konstrukts kann es bei der Besiedelung der Außenseite des Konstrukts im extraluminalen Kompartiment zu einer unerwünschten Sedimentation der Zellen auf den Boden der (nicht rotierenden) Reaktorkammer kommen. Eine spezifische Variante der Haltevorrichtung enthält beiderseits kreisrunde Rahmenteile die über einzelne Längsstreben zueinander beabstandet sind. Die einzelnen Längsstreben bilden keine durchgehende Zylinderwand. Dies erlaubt vorteilhafterweise, dass die Zellen, die auf die Reaktorkammerwand gesunken sind, durch Verwirbelungen an den Längsstreben bei der Rotation resuspendiert und bevorzugt zusätzlich spezifisch auf die äußere Oberfläche des zu besiedelten Konstrukts – nach der Art eines Schaufelrades oder einer Waschtrommel – geführt werden. Unlike colonization of the inner wall of the construct, colonization of the outside of the construct in the extraluminal compartment may result in undesirable sedimentation of the cells to the bottom of the (non-rotating) reactor chamber. A specific variant of the holding device contains on both sides of circular frame parts which are spaced apart by individual longitudinal struts. The individual longitudinal struts do not form a continuous cylinder wall. This advantageously allows the cells which have sunk onto the reactor chamber wall to be resuspended by turbulence on the longitudinal struts during rotation and preferably additionally guided specifically onto the outer surface of the populated construct, like a paddle wheel or a washing drum.

In bevorzugter Ausgestaltung ist zur Vermittlung der Rotation der Haltevorrichtung eine berührungslose Krafteinkopplung der Haltevorrichtung über die Wand der Reaktorkammer hinweg von einer außenliegenden Antriebseinheit vorgesehen. Bevorzugt ist eine magnetische oder elektromagnetische Kopplung. In einer Variante weist dabei die Haltevorrichtung, besonders in dem Umfangsbereich des Rahmenteils Permanentmagnete auf. Die Antriebseinheit ist in einer ersten Variante eine um die Reaktorkammer umlaufende Struktur, besonders ein Kreisring, die Elemente zur magnetischen Kopplung der Haltevorrichtung zur Übertragung eines Drehmoments aufweist. Die Elemente sind ebenfalls Permanentmagnete, wobei die Antriebseinheit selbst rotiert und insbesondere über einen separaten (Elektro)Motor in an sich bekannter Weise über Riemen angetrieben wird. Alternativ ist die externe Antriebseinheit eine insbesondere statische Elektromagnet- oder Spulenanordnung (Stator), die zusammen mit der Haltevorrichtung als permanentmagnetischem Anker (Rotor) einen bürstenlosen Innenläufer oder einen Schrittmotor mit diskret ansteuerbaren Winkelstellungen bildet. In einer anderen Variante sind in der Haltevorrichtung an Stelle der Permanentmagnete magnetflussleitende Weicheisensegmente vorgesehen, welche in elektromagnetischer Wechselwirkung mit entsprechend segmentierten Statorwicklungen in der externen Antriebseinheit eine bevorzugt schrittweise Drehung mit diskret ansteuerbaren Winkelstellungen ermöglichen. In einer anderen Variante ist in der Haltevorrichtung an Stelle der Permanentmagnete eine Ringscheibe vorgesehen, welche in elektromagnetischer Wechselwirkung mit entsprechenden Feldspulen in der externen Antriebseinheit eine kontinuierliche Drehung durch Wirbelstromeffekte in der Ringscheibe ermöglichen. Es sind weitere Bauformen der Antriebseinheit und deren elektrischer Ansteuerung denkbar, wobei auf an sich bekannte Grundprinzipien wie Synchronantrieb, Asynchronantrieb, Reluktanzantrieb und ähnliche in Verbindung mit entsprechend getakteter Stromversorgung einschließlich variabler Frequenz oder elektronischer Kommutierung zurückgegriffen werden kann. In a preferred embodiment, a non-contact force coupling of the holding device over the wall of the reactor chamber away from an external drive unit is provided to mediate the rotation of the holding device. Preferred is a magnetic or electromagnetic coupling. In one variant, the holding device has permanent magnets, in particular in the peripheral region of the frame part. In a first variant, the drive unit is a structure revolving around the reactor chamber, in particular a circular ring which has elements for the magnetic coupling of the holding device for transmitting a torque. The elements are also permanent magnets, wherein the drive unit rotates itself and in particular via a separate (electric) motor in a conventional manner is driven by belt. Alternatively, the external drive unit is a particular static electromagnet or coil arrangement (stator), which together with the holding device as a permanent magnetic armature (Rotor) forms a brushless internal rotor or a stepper motor with discreetly controllable angular positions. In another variant, magnetic flux-conducting soft iron segments are provided in the holding device instead of the permanent magnets, which in electromagnetic interaction with correspondingly segmented stator windings in the external drive unit allow a preferably stepwise rotation with discretely controllable angular positions. In another variant, an annular disc is provided in the holding device in place of the permanent magnets, which allow in electromagnetic interaction with corresponding field coils in the external drive unit, a continuous rotation by eddy current effects in the annular disc. There are other types of drive unit and their electrical control conceivable, which can be used on known basic principles such as synchronous drive, asynchronous, reluctance and similar in conjunction with appropriately clocked power supply including variable frequency or electronic commutation.

Das erfindungsgemäße Bioreaktorsystem ist nicht ausschließlich auf die Verwendung mit einem in vitro-Herzklappenkonstrukt beschränkt. Die spezifisch ausgebildete Haltevorrichtung des Systems erlaubt auch die Besiedelung, Kultivierung und/oder Konditionierung anderer insbesondere tubulärer in vitro-Konstrukte, wie Gefäßpräparate oder andere Organersatzkonstrukte in denen vorallem eine luminale Perfusion unter flexibler Kontrolle des Druckverlaufs erforderlich ist. The bioreactor system of the present invention is not limited solely to use with an in vitro heart valve construct. The specifically designed holding device of the system also allows the colonization, cultivation and / or conditioning of other especially tubular in vitro constructs, such as vascular preparations or other organ replacement constructs in which a luminal perfusion under flexible control of the pressure curve is required.

Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung eines in vitro-Herzklappenkonstrukts unter Verwendung des erfindungsgemäßen Bioreaktorsystem mit den Schritten: a) Bereitstellen eines biokompatiblen Herzklappen-Trägergerüsts, b) Aufnehmen und Fixieren des Gerüsts in der Haltevorrichtung der Reaktorkammer und c) Besiedeln des Gerüsts mit biologischen Zellen durch Einbringen einer Zellsuspension in die Reaktorkammer, und gegebenenfalls zusätzlich d) pulsatiles Perfundieren des mit biologischen Zellen besiedelten Gerüsts (Konstrukts) mit Zellkulturmedium unter gezielter pulsatiler Druckbeanspruchung der Zellen, so dass ein konditioniertes und reifes in vitro-Herzklappenkonstrukt daraus gebildet wird, wobei die pulsatile Perfusion durch wechselnde aktive Druckbeaufschlagung der jeweiligen Arbeitskammer der beiden Pumpanordnungen erfolgt. The invention also relates to methods for producing an in vitro heart valve construct using the bioreactor system according to the invention, comprising the steps of: a) providing a biocompatible heart valve carrier scaffold, b) receiving and fixing the scaffold in the holding device of the reactor chamber and c) colonizing the scaffold with biological Cells by introducing a cell suspension into the reactor chamber, and optionally additionally d) pulsatile perfusion of the biological cell-populated scaffold (construct) with cell culture medium under targeted pulsatile compressive stress of the cells to form a conditioned and mature in vitro heart valve construct therefrom Pulsatile perfusion by changing active pressurization of the respective working chamber of the two pumping arrangements takes place.

Bevorzugt werden in Schritt (c) die Membranen der beiden Pumpanordnungen jeweils durch Druckbeaufschlagung der zugeordneten Arbeitskammern derart ausgelenkt, dass sie mit den Medienports der Reaktorkammer jeweils dichtend in Eingriff kommen und zwischen Ventrikelpol und Aortenpol des Gerüsts ein luminales Volumen abgegrenzt wird, das über einen luminalen Einlassport in der Reaktorkammer mit einer Zellsuspension beschickt wird. Preferably, in step (c), the membranes of the two pumping assemblies are each deflected by pressurizing the associated working chambers to sealingly engage the media ports of the reactor chamber and delimiting a luminal volume between the ventricular pole and the aortic pole of the framework Inlet port in the reactor chamber is charged with a cell suspension.

Bevorzugt wird in Schritt c) die Haltevorrichtung mit dem Gerüst in der Reaktorkammer in Gegenwart der eingebrachten Zellsuspension insbesondere intermittierend rotiert, um die Besiedelung des Gerüsts mit Zellen zu vergleichmäßigen. In step c), the holding device with the framework in the reactor chamber is preferably intermittently rotated in the presence of the introduced cell suspension, in order to uniformize the colonization of the framework with cells.

Bevorzugt folgt in Schritt d) die aktive Druckbeaufschlagung der Arbeitskammer der ventrikelseitigen Pumpanordnung im zeitlichen Verlauf einem vorgegebenen in vivo-Ventrikeldruckverlauf und die aktive Druckbeaufschlagung der Arbeitskammer der aortenseitigen Pumpanordnung folgt im zeitlichen Verlauf einem vorgegebenen in vivo-Aortendruckverlauf. Preferably, in step d), the active pressurization of the working chamber of the ventricle-side pumping arrangement over time follows a predetermined in vivo ventricular pressure curve, and the active pressurization of the working chamber of the aortic pumping device follows a predetermined in vivo aortic pressure profile over time.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden beschriebenen Figuren und Varianten weiter charakterisiert. The invention will be further characterized by the following described figures and variants.

1 zeigt eine schematische Längsschnittsansicht einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Bioreaktorsystems zur Perfusion und insbesondere Konditionierung und/oder Besiedelung eines darin aufnehmbaren tubulären in vitro-Konstrukts (50). Das Bioreaktorsystem besteht aus einer ersten stromaufwärts liegenden Pumpanordnung (10), einer Reaktorkammer (20) und einer zweiten Pumpanordnung (30). Die Pumpanordnungen (10, 30) weisen jeweils eine bewegliche, verschiebliche, insbesondere elastische Membran (12, 32) auf, welche eine über Druckleitungen (14, 34) druckbeaufschlagbare Arbeitskammer (13, 33) von einer Medienkammer (11, 31) trennt. Die Reaktorkammer (20) ist über einen stromaufwärts liegenden Medienport (21) mit der oberen Medienkammer (11) direkt verbunden. Die Reaktorkammer (20) ist über einen stromabwärts liegenden Medienport (22) mit der unteren Medienkammer (31) direkt verbunden. Über einen separaten Rückkanal (60) ist der Medienkreislauf der Perfusion geschlossen. In das Innere der Reaktorkammer (20) ist eine separate Haltevorrichtung (40) eingesetzt, worin das zu perfundierende/zu kultivierende Konstrukt (50) gehalten ist. Die Haltevorrichtung (40) ist um die horizontale Längsachse des Konstrukts (50) in der im Querschnitt daher kreisrunden Reaktorkammer (20) durch Passung drehbar gelagert. Die Haltevorrichtung (40) weist beiderseits des Konstrukts (50) insbesondere kreisrunde oder radförmige Rahmenteile (44) auf, die über einzelne Abstandsbrücken (46) zueinander beabstandet gehalten sind. In den Rahmenteilen (44) sind davon trennbare obere und untere Anschlussstücke (41, 42) angeordnet, welche als Nippel oder Muffe ausgebildet sind und die dichte Fixierung des in vitro-Konstrukts (50) in der Haltevorrichtung (40) vermitteln. Zur Herstellung einer dichten Fluidverbindung sind zur Abdichtung der Medienports (21, 22) Dichtmittel (47) an den Rahmenteilen (44) vorgesehen. Zur Rotation der Haltevorrichtung (40) sind magnetische Koppelmittel (49) in dem Rahmenteil (44) vorhanden, welche ein Drehmoment von der externen Antriebseinheit (70) mit entsprechenden magnetischen Koppelmitteln (71) ermöglichen. In dem Rückkanal (60) sind ein (schematisch dargestelltes) Rückschlagventil (61) und ein (schematisch dargestelltes) verstellbares Drosselventil (64) integriert. Die dargestellte Ausführung enthält einen optionalen extraluminalen Belüftungsport (28) eines extraluminalen Kompartiments des Reaktors und einen optionalen luminalen Entlüftungsport (29) zur Entlüftung der Perfusion des Lumens des eingespannten Konstrukts (50) sowie einen luminalen Zugangsport (24) zum Lumen des Konstrukts (50) und einen extraluminalen Zugangsport (26) zu dem extraluminalen Kompartiment, d.h. zu der Außenseite des eingespannten Konstrukts (50). 1 1 shows a schematic longitudinal sectional view of an embodiment of the bioreactor system according to the invention for the perfusion and in particular conditioning and / or colonization of a tubular in vitro construct which can be accommodated therein ( 50 ). The bioreactor system consists of a first upstream pumping arrangement ( 10 ), a reactor chamber ( 20 ) and a second pumping arrangement ( 30 ). The pumping arrangements ( 10 . 30 ) each have a movable, displaceable, in particular elastic membrane ( 12 . 32 ), which one via pressure lines ( 14 . 34 ) pressurizable working chamber ( 13 . 33 ) from a media chamber ( 11 . 31 ) separates. The reactor chamber ( 20 ) is via an upstream media port ( 21 ) with the upper media chamber ( 11 ) directly connected. The reactor chamber ( 20 ) is via a downstream media port ( 22 ) with the lower media chamber ( 31 ) directly connected. Via a separate return channel ( 60 ) the medium circulation of the perfusion is closed. Into the interior of the reactor chamber ( 20 ) is a separate holding device ( 40 ) in which the construct to be perfused / cultured ( 50 ) is held. The holding device ( 40 ) is about the horizontal longitudinal axis of the construct ( 50 ) in the cross-section therefore circular reactor chamber ( 20 ) rotatably supported by fit. The holding device ( 40 ) shows on both sides of the construct ( 50 ), in particular circular or wheel-shaped frame parts ( 44 ), which are accessible via individual spacer bridges ( 46 ) are kept spaced from each other. In the frame parts ( 44 ) are separable upper and lower fittings ( 41 . 42 ), which are formed as a nipple or sleeve and the tight fixation of the in vitro construct ( 50 ) in the holding device ( 40 ) convey. To produce a tight fluid connection are for sealing the Media ports ( 21 . 22 ) Sealant ( 47 ) on the frame parts ( 44 ) intended. For rotation of the holding device ( 40 ) are magnetic coupling agents ( 49 ) in the frame part ( 44 ), which receives a torque from the external drive unit ( 70 ) with corresponding magnetic coupling means ( 71 ) enable. In the return channel ( 60 ) are a (schematically illustrated) check valve ( 61 ) and a (schematically illustrated) adjustable throttle valve ( 64 ) integrated. The illustrated embodiment includes an optional extraluminal ventilation port ( 28 ) of an extraluminal compartment of the reactor and an optional luminal vent port ( 29 ) for venting the perfusion of the lumen of the clamped construct ( 50 ) as well as a luminal access sport ( 24 ) to the lumen of the construct ( 50 ) and an extraluminal access port ( 26 ) to the extraluminal compartment, ie to the outside of the constrained construct ( 50 ).

In der in 1 dargestellten Arbeitsphase des Perfusionsbetriebs ist die Membran (12) der stromaufwärtigen Pumpanordnung (10) durch Druckbeaufschlagung der Arbeitskammer (13) ausgelenkt und pumpt Medium aus der oberen Medienkammer (11) von dem stromaufwärtigen (ventrikulären) Pol (51) des Konstrukts (50) durch die Herzklappe zu dessen stromabwärtigen (aortalen) Pol (52). Durch das dadurch in die untere Medienkammer (31) gepumpte Medium wird die Membran (32) der stromabwärtigen Pumpanordnung (30) ebenfalls ausgelenkt, wobei der Grad der Auslenkung, d.h. die Compliance der Membran, durch den Druck in der Arbeitskammer (33) frei bestimmbar ist. Das aus der stromabwärtigen Medienkammer (31) austretende Medium kann durch den Rückkanal (60) bei einem nächsten Arbeitshub in die stromaufwärtige Medienkammer (11) zurück fließen. Das einstellbare Drosselventil (64) im Rückkanal (60) dient der Aufrechterhaltung der Druckdifferenz und ermöglicht die steuerbare Kesselfunktion in der stromabwärtigen Pumpanordnung (30). In the in 1 shown working phase of the perfusion operation is the membrane ( 12 ) of the upstream pumping arrangement ( 10 ) by pressurizing the working chamber ( 13 ) and pumps medium from the upper media chamber ( 11 ) from the upstream (ventricular) pole ( 51 ) of the construct ( 50 through the heart valve to its downstream (aortic) pole (FIG. 52 ). By thereby into the lower medium chamber ( 31 ) pumped medium becomes the membrane ( 32 ) of the downstream pumping arrangement ( 30 ), wherein the degree of deflection, ie the compliance of the membrane, by the pressure in the working chamber ( 33 ) is freely determinable. That from the downstream media chamber ( 31 ) emerging medium can through the return channel ( 60 ) during a next working stroke into the upstream media chamber ( 11 ) flow back. The adjustable throttle valve ( 64 ) in the return channel ( 60 ) serves to maintain the pressure difference and allows the controllable boiler function in the downstream pumping arrangement ( 30 ).

Die 2A und 2B zeigen das Bioreaktorsystem nach 1 in für die Besiedelung des eingespannten tubulären in vitro-Konstrukts (50) spezifisch geeigneten Betriebszuständen. Dabei sind durch gleichartige Druckbeaufschlagung beider Arbeitskammern (13, 33) die jeweiligen Membranen (12, 32) derart ausgelenkt, dass sie die beiden Medienports (21, 22) dicht verschließen. In 2A kann dann in dem dadurch gebildeten luminalen Volumen (55) über den luminalen Port (24) Zellsuspension (80) eingebracht werden für eine spezifische Besiedelung der Innenwand des Konstrukts (50). Wie in 2B dargestellt, kann über den extraluminalen Port (26) gezielt Zellsuspension (80) in das extraluminale Kompartiment (25) gebracht werden, um gezielt die Außenseite des Konstrukts (50) zu besiedeln. Durch Rotation der Haltevorrichtung (40) in der Reaktorkammer (20) kann die Zellbesiedelung auf dem Konstrukt (50) jeweils vergleichmäßigt werden. Nach Ende der Besiedelungsphase kann durch entsprechende Drucksteuerung in den Arbeitskammern (13, 33) unmittelbar auf einen Perfusionsbetrieb umgeschaltet werden, wobei die Pumpanordnungen (10, 30) dann im Zusammenspiel wie Membranpumpe und Windkessel fungieren, um die Druckverhältnisse an dem perfundierten Konstrukt (50) zu steuern. The 2A and 2 B show the bioreactor system 1 in for the colonization of the clamped tubular in vitro construct ( 50 ) specifically suitable operating conditions. In this case, by similar pressurization of both working chambers ( 13 . 33 ) the respective membranes ( 12 . 32 ) are deflected in such a way that they divide the two media ports ( 21 . 22 ) close tightly. In 2A can then in the luminal volume formed thereby ( 55 ) via the luminal port ( 24 ) Cell suspension ( 80 ) are introduced for a specific colonization of the inner wall of the construct ( 50 ). As in 2 B represented by the extraluminal port ( 26 ) targeted cell suspension ( 80 ) into the extraluminal compartment ( 25 ) to target the outside of the construct ( 50 ) to colonize. By rotation of the holding device ( 40 ) in the reactor chamber ( 20 ) cell colonization on the construct ( 50 ) are equalized in each case. After the end of the colonization phase can be controlled by appropriate pressure control in the working chambers ( 13 . 33 ) are switched directly to a perfusion mode, wherein the pumping arrangements ( 10 . 30 ) then interact with each other, such as the membrane pump and the air chamber, to determine the pressure conditions on the perfused construct ( 50 ) to control.

Beispiele Examples

Den Hauptteil des Reaktors bildet ein röhrenförmiges, horizontal angeordnetes und mit Kulturmedium gefülltes Gefäß, in dessen Mitte sich in einer Halterung die Herzklappe befindet. An beiden Enden der Röhre befindet sich jeweils eine Luftkammer die über eine flexible Membran von der Flüssigkeitsphase getrennt ist. Die distalen Enden der Luftkammern sowie die die Membranen sind aus transparentem Material gefertigt, um die optische Beobachtung der Funktion des Gewebes zu ermöglichen. Durch dynamische Regelung des Drucks in den Luftkammern können die Membranen bewegt und somit Kräfte auf die Flüssigkeiten ausgeübt werden. Der Druck in den Flüssigkeitskammern auf beiden Seiten der Klappe wird kontinuierlich gemessen. Anschlüsse für Drucksensoren sind auf der ventrikulären und der aortalen Seite des Reaktors vorhanden. The main part of the reactor is a tubular, horizontally arranged and filled with culture medium vessel in the middle of which is located in a holder, the heart valve. At each end of the tube there is an air chamber which is separated from the liquid phase by a flexible membrane. The distal ends of the air chambers as well as the membranes are made of transparent material to allow visual observation of the function of the tissue. By dynamically controlling the pressure in the air chambers, the membranes can be moved and thus forces are exerted on the liquids. The pressure in the fluid chambers on both sides of the valve is continuously measured. Pressure sensor ports are located on the ventricular and aortic sides of the reactor.

Die beim Befüllen des Bioreaktors verdrängte Luft kann ebenso wie sich während des Betriebs bildende Gasblasen entweichen. Dies geschieht über spezielle Ports in den Pumpkammern die mit einem Deckel mit eingelassener hydrophober Sterilfiltermembran (wie sie z.B. in Zellkulturflaschen Verwendung finden). Der Durchmesser der Ports ist mindestens so groß, dass darin befindliches Wasser allein durch die Schwerkraft nach unten abfließen kann. Ist der Durchmesser zu klein gestaltet – wie etwa bei Luer Lock-basierten Spritzenvorsatzfiltern – so wird einmal hineingelangtes Wasser durch die Oberflächenspannung im Zugang gehalten und blockiert so die Gasdurchlässigkeit der Membran. The displaced during filling of the bioreactor air can escape as well as forming during operation gas bubbles. This is done via special ports in the pumping chambers, which have a lid with a hydrophobic sterile filter membrane (as used, for example, in cell culture bottles). The diameter of the ports is at least so large that water in them can flow down by gravity alone. If the diameter is too small - as in the case of Luer Lock-based syringe filters - water once held in is held in the access by the surface tension and thus blocks the gas permeability of the membrane.

Für die Besiedlung mit Zellen werden allgemein Zellsuspensionen mit hoher Zelldichte verwendet. Da die Vermehrung der Zellen bisweilen aufwändig und teuer sein kann, wird vermeiden, dass für die Besiedlung ein großes Volumen benötigt wird. Der Bioreaktor hat bedingt durch das Schlagvolumen eine Mindestgröße. Es sind aber die Pumpmembranen so angeordnet, dass sie, wenn sie unter ausreichend Druck gesetzt werden, den Raumbereich mit dem Klappenhalter dicht vom Rest des Bioreaktors abschließen. Dadurch steht für die Besiedlung ein deutlich kleinerer Raum zur Verfügung. For cell colonization, cell densities of high cell density are generally used. Since the multiplication of the cells can sometimes be costly and expensive, it will avoid that a large volume is needed for the colonization. The bioreactor has a minimum size due to the stroke volume. However, the pumping membranes are arranged so that, when placed under sufficient pressure, they seal the space area with the valve holder close to the rest of the bioreactor. As a result, a much smaller space is available for colonization.

Im Inneren des Bioreaktors befindet sich eine herausnehmbare Halterung zur Befestigung der Herzklappe. Die Vorrichtung ist dergestalt, dass sich ein Herzklappenmodell aufnähen, ankleben oder festklemmen lässt. Idealerweise ist das Herzklappenmodell röhrenförmig, während die Klappentaschen/-segel sich in etwa mittig innerhalb des Rohres befinden. Zum Herausnehmen des Klappenhalters kann das Reaktorgefäß in der Mitte getrennt und geöffnet werden. Befinden sich bereits Zellen auf der Herzklappe so muss diese Montage unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden. Der Klappenhalter enthält zwei Konnektoren (Anschlussstück), auf die die Herzklappe wahlweise aufgesteckt und festgeklemmt, angenäht, festgeklebt, etc. werden kann. Abstandshalter zwischen den beiden Konnektoren spannen die Klappe zwischen den Konnektoren auf. Inside the bioreactor is a removable holder for attaching the heart valve. The device is such that a heart valve model can be sewn on, adhered or clamped. Ideally, the valve model is tubular, while the valve pockets / sails are located approximately midway within the tube. To remove the damper holder, the reactor vessel can be separated and opened in the middle. If there are already cells on the heart valve, this assembly must be performed under aseptic conditions. The flap holder contains two connectors (connector) to which the heart valve can optionally be attached and clamped, sewn, glued, etc. can be. Spacers between the two connectors span the flap between the connectors.

Um den Prozessschritt des Umsetzens der besiedelten Klappe in den Reaktor zu vermeiden, wird die Besiedlung innerhalb des Bioreaktors durchgeführt. Für das Einbringen und Ablassen der Zellsuspension steht ein entsprechender Port zur Verfügung. Eine Drehung der Herzklappe um ihre Symmetrieachse begünstigt die gleichmäßige Besiedlung mit Zellen. Ein typisches Protokoll für die Besiedlung könnte wie folgt lauten:
Einfüllen der Zellen in den Reaktorraum; 30 min ruhen lassen (Zellen sedimentieren und haften an); Klappe um einen bestimmten Winkel drehen (z.B. 45°) wieder ruhen lassen; fortführen bis mindestens eine volle Drehung erreicht ist. In order to avoid the process step of converting the populated flap in the reactor, the colonization is carried out within the bioreactor. A suitable port is available for introducing and draining the cell suspension. A rotation of the heart valve around its symmetry axis favors the uniform colonization with cells. A typical protocol for colonization could be as follows:
Filling the cells in the reactor space; Rest for 30 minutes (cells sediment and adhere); Turn the flap by a certain angle (eg 45 °); continue until at least one full turn has been reached.

Alternativ können die Drehungen so durchgeführt werden, dass immer jeweils gegenüberliegende Seiten nacheinander besiedelt werden und das in einer Reihenfolge so dass immer die größten „Lücken“ zuerst gefüllt werden bis eine ausreichende Winkelabstufung erreicht ist: Einfüllen der Zellen, ruhen lassen; Drehung um 180°, ruhen lassen; Drehung um 90°, ruhen lassen; Drehung um 180°, ruhen lassen; Drehung um 135°, ruhen lassen; Drehung um 180°, ruhen lassen; Drehung um 90°, ruhen lassen; Drehung um 180°, ruhen lassen; etc. Alternatively, the rotations can be performed so that always opposite sides are populated one after the other and in an order so that always the largest "gaps" are filled first until a sufficient angle graduation is achieved: fill the cells, let them rest; Turn 180 °, let it rest; Turn 90 °, let it rest; Turn 180 °, let it rest; Turn 135 °, let it rest; Turn 180 °, let it rest; Turn 90 °, let it rest; Turn 180 °, let it rest; Etc.

Die Drehung des Klappenhalters erfolgt berührungsfrei von außen über magnetische Kopplung. In dem drehbaren Klappenhalter sind in ringförmiger Anordnung Magnete eingelassen. An der entsprechenden Stelle umgibt ein Ring mit Magneten den Reaktorzylinder von außen. Dieser äußere Ring kann von einem Motor gedreht werden und versetzt durch die magnetischen Kräfte den Klappenhalter ebenso in Rotationsbewegung. The rotation of the flap holder is non-contact from the outside via magnetic coupling. In the rotatable flap holder magnets are embedded in an annular arrangement. At the appropriate place surrounds a ring with magnets, the reactor cylinder from the outside. This outer ring can be rotated by a motor and offset by the magnetic forces the flap holder also in rotation.

Je nach verwendetem Gerüstmaterial und Migrationsfähigkeit der verwendeten Zellen kann es vorteilhaft sein die Herzklappe von der luminalen Seite und der Außenseite jeweils separat mit unterschiedlichen Zellen zu besiedeln. Beispielsweise werden Endothelzellen nur auf der luminalen Seite benötigt. Die Haltevorrichtung für die Herzklappe ist mit Hilfe von Dichtungen so gestaltet, dass Lumen und extraluminaler Außenraum getrennt sind. Es existieren jeweils separate Zugangsports und Entlüftungsfilter für beide Räume. Depending on the framework used and the migration capacity of the cells used, it may be advantageous to colonize the heart valve separately from the luminal side and the outside with different cells. For example, endothelial cells are needed only on the luminal side. The heart valve holder is gasketed to separate the lumen and extraluminal outer space. There are separate access ports and ventilation filters for both rooms.

Die durch die Herzklappe auf die Aortenseite geströmte Flüssigkeit gelangt durch einen Rückflusspfad wieder zurück auf die Ventrikelseite. Im Rückflusspfad befindet sich ein Rückschlagventil, welches verhindert, dass der Ventrikel durch den Pulsschlag sich durch den Rückflusspfad auf die Aortenseite fortpflanzt. Ein dynamisch einstellbares Quetschventil regelt den peripheren Gefäßwiderstand. Die Regelung der Drücke auf beiden Seiten der Klappe ist unabhängig und folgt jeweils ihrem eigenen Solldruck. Der periphere Gefäßwiderstand kann unabhängig eingestellt werden und bestimmt somit das Schlagvolumen und in Zusammenhang mit der Schlagfrequenz den mittleren Fluss (das Herzzeitvolumen). The fluid that has flowed through the heart valve to the aortic side returns to the ventricular side through a return path. In the return path is a check valve, which prevents the ventricle from propagating through the return path to the aortic side due to the pulse beat. A dynamically adjustable pinch valve regulates the peripheral vascular resistance. The regulation of the pressures on both sides of the flap is independent and follows each their own target pressure. The peripheral vascular resistance can be adjusted independently and thus determines the stroke volume and in connection with the beat frequency the mean flow (the cardiac output).

Claims

Bioreactor system for the cultivation and pressure-controlled perfusion of an in vitro heart valve construct ( 50 ) containing: - reactor chamber ( 20 ) with upstream media port ( 21 ) and downstream media port ( 22 ), - holding device ( 40 ) with a ventricular connection piece ( 41 ) and aortic fitting ( 42 ) for receiving and fixing the construct ( 50 ) in the reactor chamber ( 10 ), - upstream pumping arrangement ( 10 ) with pressurizable working chamber ( 13 ) and one of them by a movable membrane ( 12 ) separated ventricular media chamber ( 11 ) connected to the ventricular pole ( 51 ) of the construct ( 50 ) via the upstream media port ( 21 ) and the ventricular connector ( 41 ) is in direct fluid communication and - downstream pumping arrangement ( 30 ) with pressurizable working chamber ( 33 ) and one of them by a movable membrane ( 32 ) separated aortic media chamber ( 31 ) with the aortic pole ( 52 ) of the construct ( 50 ) via the downstream media port ( 22 ) and the aortic connector ( 42 ) is in direct fluid communication.

Bioreactor system according to claim 1, wherein the aortic medium chamber ( 31 ) with the ventricular media chamber ( 11 ) via a return channel ( 60 ) is in fluid communication to form a closed media loop, the return channel ( 60 ) a check valve ( 61 ) to prevent backflow of medium from the ventricular into the aortic medium chamber.

Bioreactor system according to claim 2, wherein the return channel ( 60 ) an adjustable throttle valve ( 64 ) for limiting the effective flow cross section in the return channel ( 60 )

Bioreactor system according to one of the preceding claims, wherein the upstream pumping arrangement ( 10 ) and downstream pumping arrangement ( 30 ) each immediately adjacent to the reactor chamber ( 20 ) are arranged so that the movable membranes ( 12 . 32 ) with appropriate pressurization of the working chambers ( 13 . 33 ) are deflectable in such a way that they are in each case connected to the upstream media port ( 21 ) and the downstream media port ( 22 ) of the reactor chamber ( 20 ) can sealingly engage one between the ventricular pole ( 51 ) and aortic pole ( 52 ) of the construct ( 50 ) enclosed volume ( 55 ) to build.

Bioreactor system according to one of the preceding claims, wherein the holding device ( 40 ) from the reactor chamber ( 20 ) is physically separate and at least in the field of media 21 . 22 ) sealingly against the wall of the reactor chamber ( 20 ) is present.

Bioreactor system according to claim 5, wherein the holding device ( 40 ) within the reactor chamber ( 20 ) about a horizontal connecting axis between ventricular pole ( 51 ) and aortic pole ( 52 ) is rotatable.

Bioreactor system according to claim 6, wherein the holding device ( 40 ) Magnetic elements ( 440 ) for non-contact coupling of a torque for rotation of the holding device via a to the reactor chamber ( 20 ) arranged magnetic or electromagnetic drive unit ( 70 ).

A method for producing an in vitro heart valve construct in the bioreactor system according to any one of the preceding claims, comprising the steps of: a) providing a biocompatible heart valve support framework, b) receiving and fixing the framework ( 50 ) in the holding device ( 40 ) of the reactor chamber ( 20 ) and c) colonizing the framework ( 50 ) with biological cells by introducing a cell suspension into the reactor chamber ( 20 ).

The method of claim 8, wherein in step c) the membranes ( 12 . 32 ) both of the reactor chamber ( 20 ) immediately adjacent pumping arrangements ( 10 . 30 ) by pressurizing the working chambers ( 11 . 31 ) to be deflected with the upstream media port ( 21 ) and the downstream media port ( 22 ) each sealingly engage and between Ventrikelpol ( 51 ) and aortic pole ( 52 ) of the scaffold ( 50 ) a luminal volume ( 55 ) and via a luminal inlet port ( 24 ) with a cell suspension ( 80 ) is charged.

The method of claim 8 or 9, wherein in step c) the holding device ( 40 ) with the framework ( 50 ) in the reactor chamber ( 20 ) in the presence of the incorporated cell suspension ( 80 ) is rotated intermittently.

Method according to one of claims 8 to 10 with the further step: d) pulsatile perfusion of the construct populated with biological cells ( 50 ) with cell culture medium under targeted pulsatile compressive stress of the cells, so that a conditioned and mature in vitro heart valve construct ( 50 ), wherein the pulsatile perfusion by interactive pressurization of the respective working chambers ( 13 . 33 ) of both pumping arrangements ( 10 . 30 ) he follows.

Method according to claim 11, wherein in step d) the active pressurization of the working chamber ( 13 ) of the upstream pumping arrangement ( 10 ) follows in time a predetermined in vivo ventricular pressure waveform and the active pressurization of the working chamber ( 33 ) of the downstream pumping arrangement ( 10 ) follows over time a predetermined in vivo aortic pressure curve.