DE102015116272A1

DE102015116272A1 - Polychromatische Elektronenmikroskopie

Info

Publication number: DE102015116272A1
Application number: DE102015116272.5A
Authority: DE
Inventors: Rudolph Reimer; Dennis Eggert; Oliver Bruns; Heinrich Hohenberg
Original assignee: Heinrich Pette Institute of Leibniz Institute for Experimental Virology
Current assignee: Heinrich Pette Institute of Leibniz Institute for Experimental Virology
Priority date: 2015-09-25
Filing date: 2015-09-25
Publication date: 2017-03-30

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein elektronenmikroskopisches Verfahren zur Erzeugung einer mehrfarbigen, also polychromatischen Darstellung einer Probe, auf eine Darstellung der erzielten Bilddaten, sowie ein System und Computerprogrammprodukt zu dessen Ausführung. Insbesondere betrifft die Erfindung ein elektronenmikroskopisches Verfahren zur Erzeugung einer mehrfarbigen Darstellung einer Probe, bei dem man mehrere Aufnahmen der Probe bei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugt und den bei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugten Aufnahmen jeweils eine verschiedene Farbe zuordnet. Dabei ergibt eine Überlagerung der erzeugten Aufnahmen eine mehrfarbige Darstellung.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein elektronenmikroskopisches Verfahren zur Erzeugung einer mehrfarbigen, also polychromatischen Darstellung einer Probe, auf eine Darstellung der erzielten Bilddaten, sowie ein System und Computerprogrammprodukt zu dessen Ausführung. Insbesondere betrifft die Erfindung ein elektronenmikroskopisches Verfahren zur Erzeugung einer mehrfarbigen Darstellung einer Probe, bei dem man mehrere Aufnahmen der Probe bei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugt und den bei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugten Aufnahmen jeweils eine verschiedene Farbe zuordnet. Dabei ergibt eine Überlagerung der erzeugten Aufnahmen eine mehrfarbige Darstellung.
Bildgebung mittels elektronenmikroskopischer Verfahren wird in einer Vielfalt an Fachbereichen angewendet, um Informationen bezüglich eines Materials und/oder einer Probe zu gewinnen. Kennzeichnend für ein solches Verfahren ist, dass zunächst ein Elektronenstrahl mit Primärelektronen erzeugt wird und dieser mittels Elektronenoptik auf eine Probe gerichtet und fokussiert wird.
Die Elektronen stoßen auf im Material der Probe vorhandene Atome, wobei eine Wechselwirkung auftritt. Abhängig von unter anderem der Dichte, Struktur und/oder Zusammensetzung der Probe werden dabei Elektronen zurückgestreut, sogenannte Backscattered-Elektronen, es werden Elektronen gestreut, sogenannte Sekundärelektronen, und/oder es werden Elektronen durch die Probe transmittiert, sogenannte transmittierte Elektronen. Diese von der Probe ausgehenden Elektronen werden dabei mit unterschiedlichen Sensoren und/oder Detektoren detektiert, wonach diese verarbeitet werden und Informationen bezüglich Probeneigenschaften auf einem Computersystem wiedergegeben werden können.
Für die Darstellung der probeninternen Ultrastruktur wird vor allem Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) angewendet, wobei von einem Objekt, beispielsweise einer Probe, der Durchgang von Strahlelektronen bzw. Primärelektronen detektiert wird. Die Dicke des Objekts ist dabei vor allem durch die verwendete Beschleunigungsspannung, welche die Bewegung und die Geschwindigkeit der Elektronen bestimmt, begrenzt. Die Dicke des Objekts liegt dabei üblicherweise zwischen 10 und 100 Nanometern, in manchen Fällen bis zu einem Mikrometer. Hierbei bemisst sich die erzielte Auflösung ebenfalls nach der Objektdicke und der Beschleunigungsspannung. Üblicherweise werden Beschleunigungsspannungen zwischen 80 und 400 kV, bevorzugt zwischen 80 und 120 kV für biologische Proben verwendet und Auflösungen in der Größenordnung von einigen Nanometern erzielt. In der Materialwissenschaft wurden allerdings bereits höhere Auflösungen bis 0,05 Nanometer erreicht.
Ein für die Darstellung von Oberflächenbeschaffenheit verwendetes Verfahren ist die Rasterelektronenmikroskopie, im Englischen bekannt als „Scanning Electron Microscopy“ (SEM). Im Gegensatz zu Transmissionselektronenmikroskopie werden bei der Rasterelektronenmikroskopie nicht die durchgestrahlten Primärelektronen, sondern die gestreuten Sekundärelektronen detektiert. Sekundärelektronen (SE1) werden von Primärelektronen angeregt und können dadurch aus einem schwach gebundenen Zustand aus dem Material bzw. aus der Probe austreten. Dadurch, dass die Sekundärelektronen eine sehr niedrige kinetische Energie (in der Regel unter 50 eV) aufweisen, können sie das Material nur an der Oberfläche verlassen: tiefer im Material würden sie weiter kollidieren und schließlich einen nächsten schwach gebundenen Zustand annehmen. Die Beschleunigungsspannung wird, im Vergleich zu TEM, entsprechend viel niedriger gewählt: bevorzugt zwischen 1 und 30 kV. Die Primärelektronen werden zudem derart gebündelt, dass sie an einem einzelnen Punkt an der Oberfläche des Materials fokussiert werden. Die Sekundärelektronen verlassen das Material in der Regel an demselben Punkt und werden von einem Detektor detektiert. Somit kann dem detektierten Signal ein Punkt auf der Objektoberfläche zugeordnet werden. Je flacher die Primärelektronen auf die Oberfläche fallen, desto mehr Sekundärelektronen können das Material verlassen und detektiert werden. Entsprechend kann durch Anpassen des Detektorwinkels, Integrationszeit und Messung der Intensität die Oberflächenstruktur punktuell bestimmt werden. Durch Ablaufen eines Rasters für eine Vielzahl an Punkten wird folglich ein gerastertes Bild der Oberflächenstruktur erzeugt. Entsprechend ist das Ziel der Rasterelektronenmikroskopie, die Oberflächenstruktur darzustellen.
Aus US 2011/0266440 A1 ist ein Verfahren bekannt, bei dem unterschiedliche Beschleunigungsspannungen verwendet werden, um Informationen aus unterschiedlichen Tiefen bzw. Schichten des Materials zu erhalten. Hierzu werden die zurückgestreuten Elektronen (d.h. die Backscattered-Elektronen, BSE) bei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen detektiert. Die erhaltenen Aufnahmen werden dann mittels Dekonvolution oder Entfaltung voneinander getrennt bzw. einer Schicht zugeordnet, wodurch die Auflösung der erhaltenen Aufnahmen und somit des Bildstapels erhöht wird. Ziel dieses Verfahrens ist es, ein dreidimensionales Bild zu schaffen, um beispielsweise Unterschiede in der Dichte des Materials zu erkennen und/oder zu analysieren, wobei die durch den üblicherweise tropfenförmigen Eintritt der Primärelektronen in das Material verursachte Vermischung der aus verschiedenen Tiefen kommenden Signale aufgetrennt wird, um die Darstellung der tiefenspezifischen Informationen zu verbessern.
Die oben beschriebenen elektronenmikroskopischen Verfahren erzeugen detaillierte Informationen bezüglich des verwendeten Objekts bzw. der verwendeten Probe. Während diese einerseits, beispielsweise zur Qualitätsprüfung, Informationen bezüglich der Homogenität in einem Material ermitteln können, können diese andererseits wesentliche Strukturen der Oberfläche bestimmen. Dies ist insbesondere in der Materialforschung und der medizinischen und biologischen Forschung von Bedeutung, wobei beispielsweise biologische, biochemische, und/oder anatomische Strukturen einer Probe und entsprechend Eigenschaften und/oder zell- oder gewebetypische Eigenschaften und Interaktionen bestimmt werden können. Dies kann unter anderem vorteilhaft sein, um einen pathophysiologischen Zustand zu bestimmen und/oder zu beschreiben. Weiterhin können Informationen bezüglich der Oberflächenstruktur beispielsweise auch für Biomaterialien von wesentlicher Bedeutung sein, beispielsweise zum Bestimmen der Oberflächenrauhigkeit und der entsprechenden Gewebeintegration, Empfänglichkeit für Haftung von Mikroben und/oder Entwicklung eines Biofilms. Insbesondere kann dies für Endoprothesen und Implantate von klinischer Bedeutung sein.
Nachteil eines elektronenmikroskopischen Verfahrens ist jedoch, dass bisherige Verfahren eine direkte Nutzung von Farben nicht ermöglichen. Dies ist rein aus physikalischer Sicht bereits zu begründen, weil das Verfahren nicht auf der Anwendung von Licht verschiedener Farben, sondern auf einem Elektronenstrahl beruht.
Herkömmliche, auf Licht basierende Verfahren beruhen auf dem Prinzip, dass bei einer Bestrahlung mit einer vorgegebenen Wellenlänge eine materialspezifische und/oder für biologische Moleküle spezifische Absorption und/oder Emission sichtbaren Lichts stattfindet. Aus US 6,650,357 B1 oder Land et al. (1949, Science 109:371–374) ist beispielsweise ein mikroskopisches Verfahren bekannt, wobei eine Probe mit unterschiedlichen Wellenlängen im UV-Bereich durchstrahlt wird und wobei das von der Probe ausgehende transmittierte Licht detektiert wird. Dadurch, dass die Materialien für eine unterschiedliche Wellenlänge entsprechend eine unterschiedliche Absorption aufweisen, können funktionelle Informationen über die Zusammensetzung erhalten und in einer farbigen Darstellung gekennzeichnet werden. Ebenfalls werden biologische Proben häufig angefärbt, beispielsweise mittels immunzytochemischer Methoden, wobei spezifische Antikörper mit einem Fluorochrom konjugiert werden, welches entsprechend für eine Anregungswellenlänge jeweils eine spezifische Absorption und Emission aufweist.
Solche Verfahren sind mit Elektronenmikroskopie nicht kompatibel. Zunächst erfordert die für eine Wellenlänge spezifische Detektion unter anderem eine Absorption und Emission des Lichts, welche bei Verwendung von einem Elektronenstrahl nicht stattfindet. Entsprechend bleibt auch die mit spezifischen, z.B. immunfluoreszenten Färbungen von biologischen Proben übliche Detektion bei Anregung mit einem Elektronenstrahl aus.
Folglich werden mit elektronenmikroskopischen Verfahren üblicherweise Graustufenbilder erhalten. Auch wenn diese, im Vergleich zu optischen Verfahren, eine bessere Auflösung aufweisen, sind Unterschiede zwischen Graustufenbildern oft nicht oder nur mit Bildverarbeitung erkennbar.
Es sind farbige rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen bekannt, wobei dabei im Wesentlichen zwei Verfahren genutzt werden (Diller, 2010, Mikrokosmos 99, 6, 367–371): zum einen kann in Bildbearbeitungsprogrammen eine Nachkolorierung vorgenommen werden, die jedoch aufwändig ist und wegen der subjektiv hinzugefügten Farbinformationen eine rein ästhetische Bedeutung hat, und zum anderen ist die technisch ebenfalls aufwändige Nutzung mehrerer Detektoren möglich, wobei den von den verschiedenen Detektoren erhaltenen Graustufenbildern jeweils eine Farbe zugewiesen wird ( US 4,041,311 A1 , WO 93/03491 A1 ). Auch eine Kombination dieser beiden Techniken ist möglich. Auch durch Einsatz von Energiefiltern in der TEM (Energiefilterungs-Transmissionselektronenmikroskopie (EFTEM)) können farbige Bilder erstellt werden, um die Verteilung mehrerer Elemente in einer Probe darzustellen (F. Hofer, P. Warbichler, 2004 „EFTEM elemental mapping in materials science". In „Transmission Electron Energy Loss Spectrometry in Materials Science and the EELS Atlas". C. C. Ahn (Ed.). Wiley-VCH, Berlin. S. 181–233).
Dem gegenüber besteht ein Bedarf, technisch einfachere und verbesserte elektronenmikroskopische Verfahren bereitzustellen, um eine sowohl technisch aussagekräftige als auch intuitive Analyse eines Objekts bzw. einer Probe zu ermöglichen.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren sowie ein System und ein Computerprogrammprodukt gemäß den Ansprüchen gelöst.
Die Erfindung stellt ein elektronenmikroskopisches Verfahren zur Erzeugung einer mehrfarbigen Darstellung einer Probe zur Verfügung, bei dem man mehrere Aufnahmen der Probe bei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugt und den bei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugten Aufnahmen jeweils eine verschiedene Farbe zuordnet, wobei eine Überlagerung der erzeugten Aufnahmen eine mehrfarbige Darstellung ergibt.
Unter Beschleunigungsspannung ist die Spannung zu verstehen, mit der die bei dem elektronenmikroskopischen Verfahren eingesetzten Primärelektronen beschleunigt werden.
Die Aufnahmen werden mit zumindest zwei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugt, so dass mindestens zwei Aufnahmen mit zwei verschiedenen zugeordneten Farben, und damit eine mehrfarbige Darstellung, entstehen. Bevorzugt werden Aufnahmen mit drei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugt. So können Elektronen mit unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen materialspezifisch gestreut werden. Entsprechend können beispielsweise Unterschiede im Vorhandensein einer chemischen Komponente bereits mit einer Beschleunigungsspannung detektiert werden, jedoch hat das Verwenden von mindestens zwei Beschleunigungsspannungen unter anderem den Vorteil, dass zwischen verschiedenen chemischen Komponenten unterschieden werden kann und zudem, dass die Genauigkeit der materialspezifischen Detektion erhöht wird.
Es sind auch mehr als drei Beschleunigungsspannungen möglich, z.B. vier Beschleunigungsspannungen. Allerdings wird die Zahl der verwendeten Beschleunigungsspannungen durch die in einer Darstellung erkennbaren Farbkombinationen beschränkt. Es können aber auch mehrere mehrfarbige Darstellungen erstellt werden, um eine größere Anzahl an Beschleunigungsspannungen (z.B. 5 –8 bei zwei mehrfarbeigen Darstellungen) und entsprechend mehr oder genauere Informationen bezüglich der Zusammensetzung der Probe zu erhalten.
In dem erfindungsgemäßen elektronenmikroskopischen Verfahren liegen die unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen z.B. im Bereich von 0,05 bis 500 kV, bevorzugt 1 bis 200 kV, wobei bei TEM bevorzugt Beschleunigungsspannungen von 60 bis 200 kV, und bei SEM bevorzugt Beschleunigungsspannungen von 0,1 bis 30 kV verwendet werden. Üblicherweise wird der Bereich, aus dem die Beschleunigungsspannungen ausgewählt werden, an das verwendete elektronenmikroskopische Verfahren angepasst, auch die Art der Probe kann ihn jedoch beeinflussen. Die Beschleunigungsspannung kann auch je nach gewünschter Genauigkeit und/oder Auflösung angepasst werden. Wenn beispielsweise die Probe geschont werden sollte, kann entsprechend ein niedriger Bereich der Beschleunigungsspannungen gewählt werden.
In dem erfindungsgemäßen elektronenmikroskopischen Verfahren unterscheiden sich die unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen um jeweils 0,1 bis 100 kV, optional um 1 bis 10 kV oder um 1 bis 2 kV. Wenn mehr als zwei Beschleunigungsspannungen eingesetzt werden, können die Abstände gleichmäßig sein, müssen es aber nicht. Beispielsweise können die Unterschiede zwischen den verwendeten Beschleunigungsspannungen, wenn die Beschleunigungsspannungen in einem elektronenmikroskopischen Verfahren beispielsweise im Bereich zwischen 10 und 90 kV liegen, 10–70 kV sein. Bei Verwendung von drei Beschleunigungsspannungen können diese dann beispielsweise 10 kV, 20 kV und 90 kV aufweisen.
Erfindungsgemäß können transmittierte Elektronen, Sekundärelektronen und/oder Backscattered-Elektronen bei verschiedenen Beschleunigungsspannungen detektiert werden. In einer Ausführungsform werden dabei jeweils nur transmittierte Elektronen, Sekundärelektronen oder Backscattered-Elektronen bei verschiedenen Beschleunigungsspannungen detektiert. Es sind aber auch Kombinationen möglich.
In einer Ausführungsform werden z.B. zurückgestreute Elektronen mit einem Backscattered-Elektronen-Detektor detektiert. Die Signalintensität ist dabei nicht nur abhängig von der Atomgröße der im Material vorhandenen Moleküle, sondern auch von der verwendeten Beschleunigungsspannung.
Es ist auch möglich, in einem erfindungsgemäßen elektronenmikroskopischen Verfahren zusätzlich für mindestens eine weitere Aufnahme die Sekundärelektronen und/oder transmittierten Elektronen zu detektieren. Dabei kann dieser mindestens einen Aufnahme eine Farbe zugeordnet werden. Dabei fließt diese mindestens eine Aufnahme ebenfalls in eine Überlagerung der erzeugten Aufnahmen. So können weitere Informationen, die durch die Messung von Sekundärelektronen und/oder transmittierten Elektronen zugänglich sind, in der mehrfarbigen Darstellung mit zugänglich gemacht werden.
Beispielsweise können in einem Rasterelektronenmikroskop detektierte Sekundärelektronen zum einen eine Darstellung der Oberflächenstruktur der Probe, welche eine Beschichtung, beispielsweise eine Goldbeschichtung, aufweisen kann, erzeugen, und zum anderen kann mit dem erfindungsgemäßen elektronenmikroskopischen Verfahren das Vorhandensein beispielsweise von verschiedenen chemischen Komponenten mittels einer farbigen Darstellung und Überlagerung auf die Darstellung der Oberflächenstruktur der Probe projiziert werden
Bei dem erfindungsgemäßen elektronenmikroskopischen Verfahren kann jeder der Aufnahmen jeweils eine monochromatische Farbe (z.B. eine Primärfarbe) zuordnet werden. Bevorzugt werden jeweils sich ergänzende monochromatische Farben aus einem Farbmodell ausgewählt. Dabei sind die Farben bei drei Farben bevorzugt monochromatische Farben aus einem RGB-Farbmodell, bei vier Farben aus einem RGBY-Farbmodell (vor allem bei einer Bildschirmdarstellung) oder einem CMY bzw. CMYK-Farbmodell (vor allem beim Druck). Alternativ können die Farben auch aus einem Adobe RGB-, sRGB-. scRGB-, CIE RGB-, YUV-, YCC, YPP oder Lab-Farbmodell gewählt werden.
Die Farben der Aufnahmen können additiv oder subtraktiv überlagert werden, wobei dies optional gemäß einem Berechnungsmodell und/oder einem Algorithmus korrigiert geschehen kann. Dabei kann eine additive Überlagerung beispielsweise für eine sehr helle Darstellung und eine subtraktive Überlagerung zur farblichen Abgrenzung bei einer relativ niedrigen detektierten Intensität vorteilhaft sein. Auch kann beispielsweise ein Algorithmus vorgesehen sein, welcher beispielsweise eine lineare Vermischung der detektierten Intensitäten für die Überlagerung korrigiert. Hintergrundsignale und/oder Bildrauschen können entsprechend minimiert und die Bildqualität somit erhöht werden.
Das erfindungsgemäße elektronenmikroskopische Verfahren kann in einem Transmissionselektronenmikroskop, Rasterelektronenmikroskop, oder Raster-Transmissionselektronenmikroskop ausgeführt werden. Ein environmental scanning electron microscope (ESEM) kann genauso verwendet werden wie ein atmosphärisches Rasterelektronenmikroskop (ASEM). Die mögliche Anwendung des Verfahrens in einer Vielfalt von Elektronenmikroskopen erlaubt eine Anpassung an die jeweilige Probe.
Die Probe bzw. das Objekt kann jede Art von Objekt sein, beispielsweise Materialien, welche zur Homogenitätsprüfung, Qualitätsprüfung, und/oder Bestimmen der chemischen Zusammensetzung eines Objekts geeignet sind. Dies ist z.B. bei Baustoffen oder in den Materialwissenschaften oft von Interesse, etwa bei einer Materialprüfung von Beton. Die Probe kann auch von einer biologischen Probe abgeleitet sein. Sie kann z.B. ein Organ, ein Gewebe, eine Zelle, ein Virus und/oder ein Makromolekül umfassen. Makromoleküle sind z.B. Lipide, Polysaccharide, Nukleinsäuren (Desoxyribonukleinsäure und/oder Ribonukleinsäure) und Proteine. Die biologische Probe kann natürlichen Ursprungs sein, etwa aus einer Biopsie oder sonstigen Gewebeprobe, z.B. ein Zahn oder eine Blutprobe, aber auch künstlichen Ursprungs, etwa aus einer Zell- oder Gewebekultur oder eine künstliche Struktur, welche Makromoleküle umfasst.
Bevorzugt ermöglicht oder erleichtert die farbige Darstellung dabei das Erkennen und/oder Unterscheiden von biologischen Strukturen, wie Viren, Bakterien, verschiedenen Zellbestandteilen wie Zellkern, Zellmembran, Golgi, ER, Mitochondrien, Zellwand, Chloroplasten, Vakuolen, aber auch von Makromolekülen wie Lipiden, Polysacchariden, Nukleinsäuren, und/oder Proteinen.
Die Probe kann vor dem elektronenmikroskopischen Verfahren behandelt werden, etwa mittels eines Beschichtungsverfahrens (z.B. mit Kohle) und/oder Kontrastmittels. Durch die Behandlung der Probe können Signale für ein Gewebe oder eine Komponente verstärkt und spezifischer erzeugt werden, wodurch sich eine genauere farbliche Darstellung mit verbesserter Auflösung ergeben kann. Beispielsweise können als Kontrastmittel Osmiumtetroxid für Lipide, Rutheniumrot für Polysaccharide und/oder Uranylacetat für Proteine und Chromatin verwendet werden. Daher umfasst die Probe optional ein Kontrastmittel oder eine Beschichtung, was die Erkennung eines Makromoleküls ermöglicht oder erleichtert.
Es können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren mehrere Serien von mehrfarbigen Darstellungen erstellt werden, welche verschiedene Ebenen eines Objekts wiedergeben, z.B. 2 bis 50 Ebenen. Dies kann durch Untersuchung von mehreren, z.B. Schnitten durch das Objekt geschehen, welche jeweils eine Probe darstellen. Alternativ oder zusätzlich können durch Verwendung verschiedener Beschleunigungsspannungen verschiedene Ebenen einer Probe untersucht werden, so dass z.B. in einer Serie (z.B. mit SEM) Beschleunigungsspannungen von 10, 20 und 30 kV und in einer zweiten Serie Beschleunigungsspannungen von 1, 3 und 8 kV verwendet werden. In einer TEM-Serie können z.B. Beschleunigungsspannungen von 60, 90 und 120 kV und in einer zweiten Serie Beschleunigungsspannungen von 140, 170 und 200 kV verwendet werden.. Dies kann unter anderem vorteilhaft sein, wenn detaillierte Eigenschaften für verschiedene Schichten bestimmt werden sollten und/oder, wenn sich dies aus der Dicke der Probe ergibt, beispielsweise für dickere anatomische Strukturen, wobei in diesem Fall die Probe bevorzugt in verschiedene Schnitte unterteilt wird. Es ist möglich, aus solchen Serien an mehrfarbigen Darstellungen eine dreidimensionale mehrfarbige Darstellung des Objekts zu erzeugen.
Gegenstand der Erfindung ist also auch ein erfindungsgemäßes elektronenmikroskopische Verfahren, bei dem mehrfarbige Darstellungen verschiedener Ebenen eines Objekts zu einer mehrfarbigen dreidimensionalen Darstellung kombiniert werden.
Ebenfalls können den Aufnahmen der jeweiligen Schnitte jeweils unterschiedliche Farben zugeordnet werden. Dies kann beispielsweise vorteilhaft sein, wenn Intensitäten im unteren Detektionsbereich gemessen werden und/oder wenn mit wenig Überlagerung der Farben, beispielsweise aus struktureller und/oder chemischer Sicht, zu rechnen ist. Entsprechend kann ein erster Schnitt beispielsweise die Farben Rot, Grün und Blau aufweisen, wobei ein zweiter Schnitt die Farben Magenta, Cyan und Gelb aufweist. Dies kann beispielsweise für eine räumliche Trennung, ein genaueres Bestimmen der chemischen und/oder biologischen Struktur, und/oder eine Abgrenzung bzw. ein Verhindern einer Verwechslung der verschiedenen Ebenen vorteilhaft sein.
Der Ablauf des elektronenmikroskopischen Verfahrens kann automatisch und/oder nach einer Benutzeranforderung erfolgen. Bevorzugt erfolgt das Verfahren automatisch, wobei es beispielsweise ohne manuelle Eingaben oder nach nur wenigen manuellen Eingaben startet und wobei sich am Ende des Verfahrens die mehrfarbige Darstellung automatisch ergibt. Beispielsweise gibt der Benutzer dabei Eckdaten wie Probenummer, Zahl und Höhe der gewünschten Beschleunigungsspannungen, optional auch eine evtl. geschätzte Dicke des Materials und/oder weitere Daten ein, wonach das Verfahren automatisch erfolgt. Es können jedoch auch Standardeinstellungen verwendet werden, die gegebenenfalls für bestimmte Proben optimiert sind. Diese Einstellungen können bevorzugt auch gespeichert, geladen und/oder geändert werden.
Weiterhin kann der Ablauf des Verfahrens nach einem Algorithmus erfolgen, wobei die erste Aufnahme der Probe ein Feedbacksignal für den Algorithmus erzeugt. Der Algorithmus kann die Höhe und optional die Reihenfolge der weiteren anzuwendenden Beschleunigungsspannung(en) bestimmen, beispielsweise anhand von detektierten Intensitäten bei der jeweiligen Beschleunigungsspannung. Dabei kann die Differenz zwischen den unterschiedlichen Höhen der anzuwendenden Beschleunigungsspannungen konstant oder dynamisch sein. Beispielsweise können die anzuwendenden Beschleunigungsspannungen durch eine konstante und/oder lineare Erhöhung der Beschleunigungsspannung bestimmt werden. Alternativ kann diese auch durch eine dynamische Iteration bestimmt werden. Dies hat unter anderem den Vorteil, dass die anzuwendenden Beschleunigungsspannungen für einen unbekannten Detektionsbereich, beispielsweise, wenn die chemische Zusammensetzung unbekannt ist, schneller bestimmt werden können. Optional kann auch die Empfindlichkeit und/oder die Position des Backscattered-Elektronen-Detektors den anzuwendenden Beschleunigungsspannungen entsprechend angepasst werden.
Zum Beispiel kann eine erste vorgegebene Beschleunigungsspannung als Testspannung bestimmt werden und für eine erste Aufnahme verwendet werden, welche beispielsweise ein sehr hohes Signal zeigt. Der Algorithmus kann entsprechend eine niedrigere Beschleunigungsspannung bestimmen und zudem optional die Reihenfolge derart bestimmen, dass die schwächsten Aufnahmen zuerst erhalten werden, um unerwünschtes Bildrauschen bei niedrigeren Beschleunigungsspannungen zu verhindern oder zumindest zu reduzieren. Alternativ oder zusätzlich kann der Algorithmus auch bestimmen, dass bei einem, beispielsweise durch einen Benutzer, vorgegeben Bereich der Beschleunigungsspannungen die Höhe der Beschleunigungsspannung, ausgehend von dem niedrigsten Wert, nachfolgend in einer Reihe von Beschleunigungsspannungen erhöht und verwendet wird, wobei die zu verwendenden Beschleunigungsspannungen derart bestimmt werden, dass ein minimaler Schwellenwert der detektierten Intensität überschritten und ein maximaler Schwellenwert der detektierten Intensität nicht überschritten wird. Dies kann alternativ oder zusätzlich auch abhängig von einer zu detektierenden Materialeigenschaft, beispielsweise das Vorhandensein einer bestimmten chemischen und/oder biologischen Komponente, erfolgen, wobei die Komponenten beispielsweise in einer Datenbank mit zugeordneten Beschleunigungsspannungen hinterlegt sind und als Parameter eingegeben oder automatisch gewählt werden können.
Das erfindungsgemäße elektronenmikroskopische Verfahren macht in der mehrfarbigen Darstellung Informationen bezüglich (i) des dreidimensionalen Aufbaus der Probe, (ii) der Dichte der Probe und/oder (iii) zur chemischen Zusammensetzung der Probe zugänglich.
Die erfindungsgemäße farbige Darstellung kann etwa das Bestimmen und/oder Analysieren der Atomart, der Molekülart, der chemischen Zusammensetzung, der biologischen Zusammensetzung und/oder Aktivität, der pathologischen Entwicklung, der Struktur, insbesondere der Oberflächenstruktur, und/oder der Homogenität eines Materials der Probe ermöglichen. Beispielsweise können unterschiedliche Farben das Vorhandensein eines Proteins, beispielsweise eines Enzyms, Liganden oder Matrixproteins, und eines Polysaccharids darstellen. Dies hat den Vorteil, dass, beispielsweise im Falle eines Implantats, etwa die Bildung eines Biofilms festgestellt werden kann, oder, im Falle einer Biopsie, das Vorhandensein z.B. von Zellen und/oder Proteinen, oder etwa von arteriosklerotischen Ablagerungen, festgestellt werden kann. Auch können, beispielsweise im Falle einer Qualitätsprüfung eines Materials, chemische Verunreinigungen auf diese Weise festgestellt und/oder beurteilt werden.
Die Erfindung stellt damit ein elektronenmikroskopisches Verfahren zur Analyse der chemischen Zusammensetzung einer Probe zur Verfügung, bei dem man ein erfindungsgemäßes elektronenmikroskopisches Verfahren durchführt, wobei die Probe optional ein Kontrastmittel umfasst, welches die Erkennung von Makromolekülen ermöglicht. Im Zusammenhang mit der Erfindung wird der unbestimmte Artikel „ein“ „einer“, „eine“ so verstanden, dass auch eine Mehrzahl (z.B. 2 oder 3) umfasst ist, sofern dies nicht explizit ausgeschlossen ist. So kann die Probe etwa selbstverständlich auch zwei oder drei verschiedene Kontrastmittel umfassen.
Die Erfindung stellt damit auch ein elektronenmikroskopisches Verfahren zur Analyse der chemischen Zusammensetzung einer Probe zur Verfügung, bei dem man die Anwesenheit und oder Verteilung von spezifischen Makromolekülen, z.B. eines Lipids, Polysaccharids, einer Nukleinsäure oder eines Proteins detektiert und bildlich darstellt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann z.B. zur Diagnostik einer Infektion, z.B. mit Pilzen oder Bakterien, verwendet werden.
Die erzeugte mehrfarbige Darstellung kann auf einem Speichermedium gespeichert werden. Das Speichermedium kann sowohl analog, beispielsweise ein zum farblichen Ausdrucken geeignetes Material, als auch digital sein. Unter digitalen Speichermedien sind vor allem Speichermedien von Computersystemen zu verstehen, insbesondere USB-Sticks und Festplatten, beispielsweise SSD- oder HDD Festplatten, geteilte Netzwerkfestplatten, oder an einem lokalen Netzwerk angeschlossene (Massen-)Speichereinheiten, aber auch cloudbasierte Speichermedien, DVD oder CD.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Computerprogrammprodukt, welches bevorzugt auf einem nicht-vorübergehenden computerlesbaren Medium gespeichert ist, zum Verwenden auf einem Computersystem mit computerausführbaren Programmieranweisungen zum Ausführen eines erfindungsgemäßen elektronenmikroskopischen Verfahrens zur mehrfarbigen Darstellung einer Probe. Nicht-vorübergehende Medien umfassen bevorzugt Speichermedien wie USB-Sticks und Festplatten, beispielsweise SSD- oder HDD Festplatten, geteilte Netzwerkfestplatten, oder an einem lokalen Netzwerk angeschlossene (Massen-)Speichereinheiten, aber auch cloudbasierte Speichermedien, DVD oder CD.
Die Erfindung stellt auch ein System zum Ausführen eines elektronenmikroskopischen Verfahrens bereit. Dieses umfasst

a) ein Elektronenmikroskop;
b) einen Backscattered-Elektronen-Detektor oder eine Kamera für TEM;
c) ein Computersystem mit einem Speichermedium; und
d) das erfindungsgemäße Computerprogrammprodukt.
e) Optional umfasst das System auch eine Probe, bevorzugt eine von einer biologischen Probe abgeleitete Probe. Diese kann z.B. ein Organ, ein Gewebe, eine Zelle, ein Virus und/oder ein Makromolekül, z.B. Lipide, Polysaccharide, Desoxyribonukleinsäure, Ribonukleinsäure und Proteine, umfassen. Dabei umfasst die Probe bevorzugt ein Kontrastmittel, welches die Erkennung eines solchen Makromoleküls ermöglicht, z.B. Osmiumtetroxid. Das System ist eingerichtet, um ein erfindungsgemäßes elektronenmikroskopisches Verfahren zur mehrfarbigen Darstellung einer Probe auszuführen.

Bevorzugt umfasst das System ein Rasterelektronenmikroskop mit regelbarer Beschleunigungsspannung, einem BSE Detektor und einem Computersystem mit dem erfindungsgemäßen Computerprogrammprodukt.
Vorteilhafterweise ist das erfindungsgemäße Verfahren in bereits vorhandene elektronenmikroskopische Systeme implementierbar, sofern ein erfindunsgemäßes Computerprogrammprodukt integriert wird. Außerdem ist nur ein Backscattered-Elektronen-Detektor nötig, um eine erfindungsgemäße Darstellung zu erhalten, so dass auf eine Vielzahl von Backscattered-Elektronen-Detektoren verzichtet werden kann. Entsprechend ist das System einfacher, weniger fehlerbehaftet und stellt keine kostenintensiven Anforderungen.
Anhand der Zeichnungen und Beispiele wird die Erfindung nachstehend eingehend erläutert. Diese sollen die Erfindung jedoch nicht eingrenzen. Soweit anwendbar, können alle einzelnen Merkmale, die in den einzelnen Ausführungsbeispielen dargestellt sind, miteinander kombiniert und/oder ausgetauscht werden, ohne den Bereich der Erfindung zu verlassen.
Die zitierten Veröffentlichungen werden durch die Bezugnahme vollumfänglich in das Dokument aufgenommen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen elektronenmikroskopischen Verfahrens zur farbigen Darstellung einer Probe mit Beispiel. A Erzeugen von drei SEM (Rasterelektronenmikroskopischen) Aufnahmen bei verschiedenen Beschleunigungsspannungen (10 kV, 20 kV, 30 kV), Detektion der Backscattered Elektronen (BSE). B Zuweisen von je einer Grundfarbe (rot, grün, blau) zu je einer SEM-Aufnahme C Zusammenfügen der Farbkanäle zu einem mehrfarbigen Bild
2 ESEM-Aufnahmen einer polierten Zahnoberfläche mit aufgetragenem Haftvermittler. Die polychromatische Aufnahme zeigt sowohl die Haftvermittler-Schicht, als auch die darunter liegende Zahnoberfläche mit Schleifspuren. Das hierfür verwendete Philips XL30 ESEM (Philips, Eindhoven, Niederlande) Mikroskop wurde bei 200 Pa mit Wasser als Abbildungsgas betrieben. Als Detektor wurde ein Solid State BSE Detektor (Philips, Eindhoven, Niederlande) verwendet. A Mehrfarbige Darstellung B roter Farbkanal, 30 kV Beschleunigungsspannung; C grüner Farbkanal, 20 kV Beschleunigungsspannung, D blauer Farbkanal, 10 kV Beschleunigungsspannung.
3 ESEM-Aufnahmen einer unkontrastierten biologischen Probe: Entenmilz, fixiert mit 2,5% Glutaraldehyd. Ein durch die Präparation mit einem Skalpell übertragenes Stückchen Muskelgewebe (Pfeil) ist deutlich als Fremdgewebe zu erkennen. Für die polychromatische Überlagerung wurden drei Bilder mit 30, 20 und 10 kV aufgenommen. Das hierfür verwendete Philips XL30 ESEM Mikroskop wurde bei 400 Pa mit Wasser als Abbildungsgas betrieben. Als Detektor wurde ein Large Field BSE Detektor (Point Electronic, Halle, Deutschland) verwendet. A Mehrfarbige Darstellung; B roter Farbkanal, 30 kV Beschleunigungsspannung; C grüner Farbkanal, 20 kV Bescheunigungsspannung; D blauer Farbkanal, 10 kV Beschleunigungsspannung.
4 ESEM-Aufnahmen einer Maus-Aorta mit arteriosklerotischen Ablagerungen. Die Probe wurde mit 2,5% Glutaraldehyd fixiert und mit 1% Osmiumtetroxid kontrastiert. Einzelne, unter das Endothel eingewanderte Schaumzellen sind deutlich zu erkennen. Für die polychromatische Überlagerung wurden drei Bilder mit 30, 20 und 12 kV aufgenommen. Das hierfür verwendete Philips XL30 ESEM (Philips, Eindhoven, Niederlande) Mikroskop wurde bei 400 Pa mit Wasser als Abbildungsgas betrieben. Als Detektor wurde ein Solid State BSE Detektor (Philips, Eindhoven, Niederlande) verwendet. A Mehrfarbige Darstellung; B roter Farbkanal, 30kV Beschleunigungsspannung; C grüner Farbkanal, 20 kV Beschleunigungsspannung; D blauer Farbkanal, 12 kV Beschleunigungsspannung.
Beispiele
Alle hier gezeigten Beispielaufnahmen wurden mittels eines environmental Rasterelektronenmikroskops (XL30ESEM, Philips, Eindhoven) erstellt. Die Proben mussten deshalb nicht aufwendig vorbereitet werden (Dehydrierung, Kritisch-Punkt-Trocknung) sondern konnten im nativen Feuchtezustand direkt abgebildet werden. Für die Darstellung der Zahnoberfläche (2) wurde ein humaner Zahn zugeschnitten und poliert. Nach dem Auftragen und Trocknen des Haftvermittlers wurde die Oberfläche im ESEM unter Benutzung von Wasser als Abbildungsgas bei 200 Pa untersucht. Für die Erstellung der polychromatischen Abbildung wurden drei Aufnahmen bei Beschleunigungsspannungen von 30, 20 und 10 kV gemacht. Als Detektor wurde ein Solid State BSE Detektor (Philips, Eindhoven, Niederlande) verwendet. Den einzelnen Aufnahmen wurden die Farben rot, grün und blau zugeordnet. Die Farbkanäle wurden in Adobe Photoshop ausgerichtet und final eine Tonwertkorrektur durchgeführt.
Die Entenmilz-Biopsie wurde in 2,5 % Glutaraldehyd in Phosphatpuffer (PBS) für 60 min immersionsfixiert, 3 × 5 min mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen und anschließend direkt im ESEM bei 400 Pa untersucht. Als Detektor wurde ein Large Field BSE Detektor (Point Electronic, Halle, Deutschland) verwendet. Für die Erstellung der polychromatischen Abbildung (3) wurden drei Aufnahmen bei Beschleunigungsspannungen von 30, 20 und 10 kV gemacht. Den einzelnen Aufnahmen wurden die Farben rot, grün und blau zugeordnet. Die Farbkanäle wurden in Adobe Photoshop ausgerichtet und final eine Tonwertkorrektur durchgeführt.
Die Maus-Aorta wurde in 2,5 % Glutaraldehyd in Phosphatpuffer (PBS) für 60 min immersionsfixiert, 3 × 5 min mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen und anschließend in 1% Osmiumtetroxid in Phosphatpuffer (PBS) für 30 min kontrastiert. Nach mehreren intensiven Wasch-Schritten in doppelt destilliertem Wasser konnte die Probe direkt im ESEM bei 400 Pa untersucht werden. Osmiumtetroxid kontrastiert Lipide, somit werden die lipidreichen Schaumzellen in den arteriosklerotischen Plaques angefärbt. Für die Erstellung der polychromatischen Abbildung (4) wurden drei Aufnahmen bei Beschleunigungsspannungen von 30, 20 und 12 kV gemacht. Die anschließende Bildvearbeitung erfolgte wie oben beschrieben.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 2011/0266440 A1 [0006]
US 6650357 B1 [0009]
US 4041311 A1 [0012]
WO 93/03491 A1 [0012]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Land et al. (1949, Science 109:371–374) [0009]
Diller, 2010, Mikrokosmos 99, 6, 367–371 [0012]
F. Hofer, P. Warbichler, 2004 „EFTEM elemental mapping in materials science“ [0012]
„Transmission Electron Energy Loss Spectrometry in Materials Science and the EELS Atlas“. C. C. Ahn (Ed.). Wiley-VCH, Berlin. S. 181–233 [0012]

Claims

Ein elektronenmikroskopisches Verfahren zur Erzeugung einer mehrfarbigen Darstellung einer Probe, bei dem man mehrere Aufnahmen der Probe bei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugt und den bei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugten Aufnahmen jeweils eine verschiedene Farbe zuordnet, wobei eine Überlagerung der erzeugten Aufnahmen eine mehrfarbige Darstellung ergibt.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Aufnahmen mit drei unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen erzeugt werden.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Beschleunigungsspannungen im Bereich von 0,1 bis 500 kV liegen, optional von 60 bis 200 kV oder von 0,5 bis 30 kV.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die sich unterschiedlichen Beschleunigungsspannungen um jeweils 0,1 bis 100 kV unterscheiden, optional um 1 bis 10 kV oder um 1 bis 2 kV.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man zurückgestreute Elektronen mit einem Backscattered-Elektronen-Detektor detektiert, wobei man optional ferner für mindestens eine weitere Aufnahme die Sekundärelektronen und/oder transmittierten Elektronen detektiert, und dieser mindestens einen Aufnahme eine Farbe zuordnet, wobei diese mindestens eine Aufnahme in eine Überlagerung der erzeugten Aufnahmen einfließt.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei man den Aufnahmen jeweils eine monochromatische Farbe zuordnet, bevorzugt eine monochromatische Farbe aus einem Farbmodell ausgewählt aus der Gruppe umfassend RGB, RGBY, CMY und CMYK.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Farben der Aufnahmen additiv oder subtraktiv überlagert werden, wobei dies optional gemäß einem Berechnungsmodell und/oder einem Algorithmus korrigiert geschehen kann.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das elektronenmikroskopische Verfahren in einem Transmissionselektronenmikroskop, Rasterelektronenmikroskop, Raster-Transmissionselektronenmikroskop, ASEM oder ESEM ausgeführt wird.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Probe von einer biologische Probe abgeleitet ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend ein Organ, ein Gewebe, eine Zelle, ein Virus und/oder ein Makromolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend Lipide, Polysaccharide, Desoxyribonukleinsäure, Ribonukleinsäure und Proteine, wobei die Probe optional ein Kontrastmittel umfasst, welches die Erkennung eines Makromoleküls ermöglicht.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Ablauf des Verfahrens nach einem Algorithmus erfolgt, wobei eine erste Aufnahme der Probe ein Feedbacksignal für den Algorithmus erzeugen, wonach der Algorithmus die Höhe der weiteren anzuwendenden Beschleunigungsspannung(en) bestimmt, wobei die Differenz zwischen den unterschiedlichen Höhen der anzuwendenden Beschleunigungsspannungen konstant oder dynamisch ist, und wobei optional die Empfindlichkeit und/oder die Position des Backscattered-Elektronen-Detektors den anzuwendenden Beschleunigungsspannungen entsprechend angepasst wird.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mehrfarbige Darstellungen verschiedener Ebenen eines Objekts zu einer mehrfarbigen dreidimensionalen Darstellung kombiniert werden; und/oder wobei die erzeugte mehrfarbige Darstellung auf einem Speichermedium gespeichert wird.
Das elektronenmikroskopische Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mehrfarbige Darstellung Informationen bezüglich (i) des dreidimensionalen Aufbaus der Probe, (ii) der Dichte der Probe und/oder (iii) zur chemischen Zusammensetzung der Probe zugänglich macht.
Ein elektronenmikroskopisches Verfahren zur Analyse der chemischen Zusammensetzung einer Probe, bei dem man ein elektronenmikroskopisches Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche durchführt, wobei die Probe optional ein Kontrastmittel umfasst, welches die Erkennung eines Makromoleküls ermöglicht.
Computerprogrammprodukt, welches optional auf einem nicht-vorübergehenden computerlesbaren Medium gespeichert ist, zum Verwenden auf einem Computersystem mit computerausführbaren Programmieranweisungen zum Ausführen eines elektronenmikroskopischen Verfahrens zur mehrfarbigen Darstellung einer Probe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13.
System zum Ausführen eines elektronenmikroskopischen Verfahrens, umfassend a) ein Elektronenmikroskop; b) einen Backscattered-Elektronen-Detektor oder eine Kamera; c) ein Computersystem mit einem Speichermedium; und d) das Computerprogrammprodukt nach Anspruch 14; und e) optional, eine Probe, bevorzugt von einer biologische Probe abgeleitete Probe, die ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend ein Organ, ein Gewebe, eine Zelle, ein Virus und/oder ein Makromolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend Lipide, Polysaccharide, Desoxyribonukleinsäure, Ribonukleinsäure und Proteine, wobei die Probe ein Kontrastmittel umfassen kann, welches die Erkennung eines Makromoleküls ermöglicht; wobei das System eingerichtet ist, um ein elektronenmikroskopisches Verfahren zur mehrfarbigen Darstellung einer Probe gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 auszuführen.