DE102015011552A1

DE102015011552A1 - Verfahren und Anordnung zur Lichteinkopplung in ein Multifokales Konfokalmikroskop

Info

Publication number: DE102015011552A1
Application number: DE102015011552.9A
Authority: DE
Inventors: Peter Kaiser
Original assignee: Visitron Systems GmbH
Current assignee: Visitron Systems GmbH
Priority date: 2015-09-02
Filing date: 2015-09-02
Publication date: 2017-03-02

Abstract

Multifokale Konofalmikroskope nutzen häufig eine Mikrolinsenscheibe 11, um einen möglichst großen Anteil des aus einer Monomodenfaser 7 austretenden Anregungslichtes 10 durch eine Lochblendenscheibe 12 zu transmittieren. Das gaußförmige Intensitätsprofil, der Monomodenfaser 7 erlaubt keine homogene Ausleuchtung der Probenebene. Eine Lösung ist die Verwendung von Multimodefasern 7, was jedoch zu erhöhten Streuverlusten an der Lochblendenscheibe 12 und damit zu verringertem Signal zu Rausch Verhältnis des führt. Eine homogene Probenausleuchtung eines Multifokalen Konfokalmikroskops bei gleichzeitiger Minimierung der Streuverluste an der Lochblendenscheibe 12 soll erreicht werden. Eine achromatische refraktive Strahlformungsoptik 21a–c wird zwischen der kohärenten Strahlungsquelle 1 und der Mikrolinsenscheibe 11 platziert. Hierdurch wird die Einfallende Intensitätsverteilung des Anregungslichtes 10 in eine radial rechteckförmige Intensitätsverteilung umgewandelt. Zum anderen wird die Phasenfront so geformt, dass das Anregungslicht 10 kollimiert auf die Mikrolinsenscheibe 11 auftrifft. Dadurch ergeben sich minimale Streuverluste an der Lochblendenscheibe bei homogener Ausleuchtung der Probenebene. Die Anordnung erlaubt hochauflösende Aufnahmen ausgedehnter mikroskopischer Präparate bei minimaler Varianz der Bildhelligkeit über das Sehfeld und maximalem Signal zu Rausch Verhältnis.

Description

Es ist bekannt, dass die Bildaufnahme eines konfokalen Mikroskops durch Verwendung einer Lochblendenscheibe statt einer einzelnen Lochblende beschleunigt werden kann ( EP 03 20 760 B1 ). Die in der Probenebene erreichbare Intensität des Anregungslichts solcher gemultiplexten konfokalen Systeme kann durch Verwendung einer zur Lochblendenscheibe konjugierten Fokussierungsoptik gesteigert werden ( EP 05 39 691 B1 , EP 13 59 452 B1 , EP 18 52 724 A3 , DE 10 2007 009 551 B3 ).
Eine weit verbreitete Ausgestaltung eines oben beschriebenen Multifokalen Konfokalmikroskops nutzt eine zur Lochblendenscheibe konjugierte Mikrolinsenscheibe, welche das in das Konfokalmikroskop einfallende Anregungslicht in den Öffnungen der Lochblendenscheibe fokussiert ( EP 0 539 691 B1 , US5717519 ). Verbreitete Realisierungen der eben genannten Anordnung werden derzeit vom Hersteller Yokogawa Electric Corp. unter den Produktnamen CSU-10, CSU-22, CSU-X1 und CSU-W1 produziert.
1 zeigt den schematischen Aufbau eines Multifokalen Konfokalmikroskops. Das aus einer oder mehreren kohärenten Strahlungsquellen 1 emittierte Licht wird über ein Teleskop vom Galilei-Typ, bestehend aus Linsen 2 und 3, über Strahlvereinigungsspiegel 4 durch eine Faserkopplungsoptik 5 geleitet und in das Faserende 6 eines Lichtwellenleiters 7 eingespeist. Das aus dem distalen Faserende 8 austretende Licht wird über eine Kollimatoroptik 9 als Anregungslichtstrahl auf die Mikrolinsenscheibe 11 geleitet, welche das Licht in die konjugierten Löcher innerhalb der Lochblendenscheibe 12 fokussiert. Eine nachgelagerte Mikroskopoptik 13, in der Regel bestehend aus Tubuslinse und Mikroobjektiv, bildet die Lochblendenscheibe in der Probenebene 14 ab. Das aus den multiplen Fokuspunkten in der Probenebene 14 reflektierte und/oder emittierte Licht 15 wird durch die Mikroskopoptik 13 gebündelt, an einem Strahlteilerspiegel 16 reflektiert und über eine Abbildungsoptik 17 auf einem Sensor 18, üblicherweise einer CCD, EMCCD oder sCMOS Kamera, detektiert. Durch Rotation der Anordnung aus Mikrolinsenscheibe 11 und Lochblendenscheibe 12 um die gemeinsame Achse 19 wird das Bild der Probenebene sequenziell erstellt. Typische Bildaufnahmezeiten liegen hierbei zwischen 0,5 ms und 100 ms.
Um eine optimale Fokussierung des Anregungslichtes 10 durch die Öffnungen Lochblendenscheibe zu erreichen, wird in den oben beschriebenen Multifokalen Konfokalmikroskopen eine Monomodenfaser als Lichtwellenleiter 7 verwendet. Das aus der Monomodenfaser am distalen Ende austretende Licht weist ein gaußförmiges Intensitätsprofil auf und kann über eine Kollimatoroptik 9 aufgeweitet und mit minimaler Verzerrung der Phasenfront des einfallenden Lichtes auf die Mikrolinsenscheibe 11 geleitet werden. Wie in 2 schematisch dargestellt, erlaubt die so erreichte minimale Divergenz des auf auf die Mikrolinsenscheibe 11 treffenden Anregungslichtes 10 eine nahezu Beugungsbegrenzte Fokussierung, wodurch maximaler Lichtdurchsatz und minimale Rückreflexionen erreicht werden. Das resultierende Intensitätsprofil 20 nach der Lochblendenscheibe 12 ist radial gaußförmig, wodurch keine gleichförmige Probenausleuchtung möglich ist.
Um eine gleichförmige Probenausleuchtung zu erreichen ist es möglich, statt einer Monomodenfaser eine Multimodefaser zu verwenden (EB 2 196 839 B1, EP2010 08 35 346 ). Das aus der Multimodefaser austretende Anregungslicht 10 weist eine höhere Etendue auf als Licht, das aus einer Monomodenfaser austritt, was mit einer nicht-ebenen Phasenfront des auf die Mikrolinsenscheibe 11 treffenden Lichtes gleichzusetzen ist. In 3 ist dies durch divergentes Anregungslicht 10 schematisch dargestellt. Hierdurch ergibt sich eine Aufweitung der Fokuspunkte der Mikrolinsenscheibe 11. Dies führt zu erhöhter Reflexion des Lichtes an der Lochblendenscheibe, was eine reduzierte Lichtleistung in der Probenebene 14 und eine erhöhte Streulichterzeugung bewirkt. Beide Effekte tragen zu einer Verringerung des auf dem Sensor 18 detektierten Signal zu Rausch Verhältnisses bei.
Der in den Patentansprüchen 1 und 2 angegebenen Erfindung liegt das Problem zu Grunde, in einem Multifokalen Konfokalmikroskop eine gleichförmige Probenausleuchtung über einen möglichst weiten Wellenlängenbereich bei minimaler Rückreflexion des Anregungslichtes an der Lochblendenscheibe zu erreichen.
Dieses Problem wird durch die im Patentanspruch 1 aufgeführten Merkmale gelöst. Die Verwendung eines refraktiven Strahlformungssystems 21a–c, das zwischen dem distalen Ende einer Monomodenfaser und einer Mikrolinsenscheibe 11 integriert wird, erlaubt eine Verbesserung der Gleichförmigkeit der Probenausleuchtung bei minimaler Reflexion des Anregungslichtes 10.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, dass Reflexionen an der Lochblendenscheibe minimiert werden können, jedoch gleichzeitig eine homogene Probenausleuchtung möglich wird. Dies erlaubt hochauflösende Aufnahmen ausgedehnter mikroskopischer Präparate bei minimaler Varianz der Bildhelligkeit über das Sehfeld und maximalem Signal zu Rausch Verhältnis. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind im Speziellen Lichtmikroskopische Analysen von Proben, die sich mindestens über ein Sehfeld der Kamera/Objektivkombination erstrecken. Beispiele für Proben sind unter anderem Gewebeschnitte, Embryonen von Modellorganismen oder Biofilme aus Pro- oder Eukaryontischen Zellen, die in zunehmendem Maße in der pharmazeutischen und biowissenschaftlichen Forschung untersucht werden.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist im Patentanspruch 2 gegeben und in 6 dargestellt. Die Weiterbildung nach Anspruch 2 ermöglicht es, Kopplungsverluste in eine Monomodenfaser zu vermeiden und durch geeignete Vorformung des Lichtstrahlprofils die Lichteffizienz des Gesamtsystems zu erhöhen.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist im Patentanspruch 3 gegeben und in 6 dargestellt. Durch Nutzung einer Teleskopoptik 22a–b kann die Ausleuchtung in der Probenebene 14 dem von einem Sensor 18 detektierten Sehfeld angepasst werden.
Es zeigen
1 Ein Schema eines Multifokalen Konfokalsystems gemäß dem Stand der Technik
2 Ein Schema zur Fokussierung des aus einer Monomodenfaser tretenden Anregungslichtes durch die Lochblendenscheibe gemäß dem Stand der Technik
3 Ein Schema zur Fokussierung des aus einer Multimodefaser tretenden Anregungslichtes durch die Lochblendenscheibe gemäß dem Stand der Technik
4 Ein Schema des Ausführungsbeispiels zur Fokussierung des Anregungslichtes durch die Lochblendenscheibe bei Verwendung einer refraktiven Strahlformungsoptik.
5 Ein Ausführungsbeispiel eines Multifokalen Konfokalsystems bei Verwendung einer refraktiven Strahlformungsoptik.
6 Vorteilhafte Ausgestaltungen eines Multifokalen Konfokalsystems bei Verwendung einer refraktiven Strahlformungsoptik: Direkte Einkopplung der kohärenten Lichtquelle ohne vorherige Einkopplung in eine Monomodenfaser, sowie Integration einer Teleskopoptik zur Anpassung des beleuchteten Bereichs in der Probenebene.
Ein Ausführungsbeispiel der Erfindung ist in 4 dargestellt. Das aus dem distalen Ende 8 einer Monomodenfaser 7 tretende Licht trifft nach Durchtritt durch die Kollimatorlinse 9 auf eine Linsengruppe 21a mit einer asphärischen Oberfläche und negativer Brennweite. Die asphärische Oberflächenform der Linse 21a führt zu einer Störung der Wellenfront, welche durch eine entsprechend optimierte asphärische Oberflächenform der Linse 21c derart korrigiert wird, dass bei gegebener Lichtverteilung auf der faserzugewandten Seite der Linse 21a ein nahezu rechteckförmiges Intensitätsprofil unter Beibehaltung einer ebenen Wellenfront, dargestellt durch unidirektionale Lichtpfeile des Anregungslichtes 10 erreicht wird. Dies erlaubt eine optimale Fokussierung des Anregungslichtes 10 durch die Mikrolinsenscheibe 11, wodurch Reflexionen an der Lochblendenscheibe 12 minimiert werden.
Die Optimierung der Oberflächenform, wie auch die Wahl Brechungsindizes der Linsen 21a, 21b und 21c kann abhängig vom verwendeten Wellenlängenbereich erfolgen und erstreckt sich vom ultravioletten bis in den infraroten Bereich des Wellenlängenspektrums (Fred M Dickey, Laser Beam Shaping – Theory and Techniques, Second Edition, 2 Rev ed. Boca Raton, Fla: CRC Press, 2014).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

EP 0320760 B1 [0001]
EP 0539691 B1 [0001, 0002]
EP 1359452 B1 [0001]
EP 1852724 A3 [0001]
DE 102007009551 B3 [0001]
US 5717519 [0002]
EP 20100835346 [0005]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Fred M Dickey, Laser Beam Shaping – Theory and Techniques, Second Edition, 2 Rev ed. Boca Raton, Fla: CRC Press, 2014 [0019]

Claims

Verfahren zur homogenen Ausleuchtung der Probenebene eines Multifokalen Konfokalmikroskops, gekennzeichnet durch: a) Lichteinkopplung aus einem kohärenten Strahlungsquellenmodul in eine Monomodenfaser, b) Kollimation des aus der Monomodenfaser ankommenden Lichts, c) Formung des kollimierten Lichts mittels eines refraktiven achromatischen Strahlformungsmoduls zur Erreichung einer Lichtverteilung mit radial rechteckförmiger oder konkaver Intensitätsverteilung und ebener Phasenfront, d) Fokussierung des geformten Lichtes durch eine Lochblendenscheibe, e) Abbildung der Lochblendenscheibe in die Probenebene eines Mikroskopes.
Verfahren nach Anspurch 1, wobei das Strahlungsquellenmodul ohne vorherige Kopplung in eine Monomodenfaser in das refraktive Strahlformungsmodul gekoppelt wird.
Verfahren nach Anspurch 1 oder 2, wobei mittels einer Teleskopoptik eine Anpassung des Querschnittes des auf die Multifokal-Optik treffenden Lichtstrahls an das von einem Sensor detektierte Sehfeld durchgeführt wird.
Anordnung, umfassend: a) Multifokales Konfokamikroskop, b) Strahlungsquellenmodul, c) Einkoppeloptik zur Kopplung des aus dem Strahlungsquellenmodul kommenden Lichts in eine Monomodenfaser, d) Kollimatoroptik zur Anpassung des aus der Monomodenfaser emittierten Lichtstrahldurchmessers an das Strahlformungsmodul, e) Refraktives Strahlformungsmodul zur Umwandlung des von der Kollimatoroptik emittierten Lichtstrahls in einen Lichtstrahl mit radial rechteckförmigem Intensitätsprofil, welcher auf den Mikrolinsenarray des Multifokalen Konfokalmikroskps trifft.
Anordnung nach Anspruch 4, wobei Einkoppeloptik, Monomodenfaser und Kollimatoroptik entfallen.
Anordnung nach Anspruch 4 oder 5, wobei zwischen refraktivem achromatischem Strahlformungsmodul und Multifokaloptik eine Teleskopoptik integriert wird.